JPH09511144A - Dna複製/検出アッセイにおけるバックグラウンド信号を減少させる方法 - Google Patents
Dna複製/検出アッセイにおけるバックグラウンド信号を減少させる方法Info
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- JPH09511144A JPH09511144A JP7525701A JP52570195A JPH09511144A JP H09511144 A JPH09511144 A JP H09511144A JP 7525701 A JP7525701 A JP 7525701A JP 52570195 A JP52570195 A JP 52570195A JP H09511144 A JPH09511144 A JP H09511144A
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Abstract
Description
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.デオキシヌクレオシド三リン酸、及びDNAサンプルのターゲット配列内 の少なくとも1つの鎖にハイブリダイズする1種以上のオリゴヌクレオチドプラ イマーを使用して複製しかつ該複製に引き続き前記ターゲットを検出ことにより DNAサンプル内のターゲットDNA配列を複製及び検出する方法において、D NAサンプルを複製工程の前に処理することによりプライマー・インデペンデン ト非特異的バックグラウンド減少させるに当たり、 (a)DNAサンプルを少なくとも1種のジデオキシヌクレオシド三リン酸及 びDNAポリメラーゼと、ジデオキシヌクレオシドをDNAサンプル内の3′末 端に共役結合させるために充分な温度及び時間接触させ、かつ (b)処理したDNAサンプルをジデオキシヌクレオシド三リン酸及びDNA ポリメラーゼから分離することを特徴とする、DNA複製/検出アッセイにおい てバックグラウンド信号を減少させる方法。 2.DNAサンプルの反対の鎖及びターゲットDNA配列の側面にハイブリダ イズするオリゴヌクレオチドプライマーを使用した、アニーリング/伸長及び変 性ステップの間のサーマル・サイクリングによるポリメラーゼ連鎖反応(PCR )増幅法及び該増幅後にタ ーゲット配列の検出を行うことによる二本鎖DNA内のターゲット配列を増幅及 び検出する方法において、DNAサンプルをPCR増幅法の前に処理することに よりプライマー・インデペンデント非特異的バックグラウンドを減少させるに当 たり、 (a)DNAサンプルを少なくとも1種のジデオキシヌクレオシド三リン酸及 びDNAポリメラーゼと、ジデオキシヌクレオシドをDNAサンプル内の3′末 端に共役結合させるために充分な温度及び時間接触させ、かつ (b)処理したDNAサンプルをジデオキシヌクレオシド三リン酸及びDNA ポリメラーゼから分離することを特徴とする、DNA複製/検出アッセイにおい てバックグラウンド信号を減少させる方法。 3.PCR増幅法が標識したデオキシヌクレオシド三リン酸を利用するin sit u PCR法であり、かつ処理したDNAサンプルのジデオキシヌクレオシド三リ ン酸及びDNAポリメラーゼからの分離を洗浄により行う、請求項2記載の方法 。 4.DNAサンプルが約37℃以上の高めた温度に曝した組織又は細胞培養内 に存在する、請求項2記載の方法。 5.DNAサンプルが約37℃以上の高めた温度に曝した組織又は細胞培養内 に存在する、請求項3記載の方法。 6.PCR増殖工程の前に処理すべきDNAサンプルが、固定、パラフィン化 及び解パラフィン化されたDNAサンプル内に存在する、請求項4記載の方法。 7.PCR増殖工程の前に処理すべきDNAサンプルが、固定、パラフィン化 及び解パラフィン化されたDNAサンプル内に存在する、請求項5記載の方法。 8.DNAサンプルをジデオキシヌクレオシド三リン酸及びDNAポリメラー ゼで少なくとも約37℃で少なくとも約1分間処理する、請求項2記載の方法。 9.DNAサンプルをジデオキシヌクレオシド三リン酸及びDNAポリメラー ゼで少なくとも約37℃で少なくとも約1分間処理する、請求項5記載の方法。 10.DNAサンプルをジデオキシヌクレオシド三リン酸及びDNAポリメラー ゼで少なくとも約37℃で少なくとも約1分間処理する、請求項7記載の方法。 11.DNAサンプルとジデオキシヌクレオシド三リン酸及びDNAポリメラー ゼとの接触を、 (a)約37℃〜約72℃で約10秒〜約1分間の第1段階、 (b)約80℃〜約105℃で約10秒〜約1分間の第2段階 からなる2段階の間のサーマル・サイクリングで行う、請求項2記載の方法。 12.DNAサンプルとジデオキシヌクレオシド三リン酸及びDNAポリメラー ゼとの接触を、 (a)約37℃〜約72℃で約10秒〜約1分間の第1段階、 (b)約80℃〜約105℃で約10秒〜約1分間の第2段階 からなる2段階の間のサーマル・サイクリングで行う、請求項5記載の方法。 13.DNAサンプルとジデオキシヌクレオシド三リン酸及びDNAポリメラー ゼとの接触を、 (a)約37℃〜約72℃で約10秒〜約1分間の第1段階、 (a)約80℃〜約105℃で約10秒〜約1分間の第2段階 からなる2段階の間のサーマル・サイクリングで行う、請求項7記載の方法。 14.DNAサンプルを2種以上のジデオキシヌクレオシド三リン酸と接触させ る、請求項2記載の方法。 15.DNAサンプルを2種以上のジデオキシヌクレオシド三リン酸と接触させ る、請求項5記載の方法。 16.DNAサンプルをジデオキシチミジン三リン酸、TaqDNAポリメラー ゼ、デオキシアデノシン三リン酸、デオキシシチジン三リン酸及びデオキシグア ノシン三リン酸と接触させる、請求項2記載の方法。 17.DNAサンプルをジデオキシチミジン三リン酸、TaqDNAポリメラー ゼ、デオキシアデノシン三リン酸、デオキシシチジン三リン酸及びデオキシグア ノシン三リン酸と接触させる、請求項5記載の方法。 18.DNAサンプルをDNAポリメラーゼ及びジデオキシヌクレオシド三リン 酸と約37℃〜約72℃で約1〜約15分間接触させる、請求項7記載の方法。 19.DNAサンプル内のターゲット配列を前記ターゲットDNA配列のポリメ ラーゼ連鎖反応(PCR)酵素合成により増幅及び検出する方法において、 (a)二本鎖DNAサンプルを用意し、該DNAサンプルを少なくとも1種の ジデオキシヌクレオシド三リン酸及びDNAポリメラーゼと、ジデオキシヌクレ オシドをDNAサンプル内の3′末端に共役結合させるために充分な温度及び時 間接触させ、かつ (b)処理したDNAサンプルをジデオキシヌクレオシド三リン酸及びDNA ポリメラーゼから分離し、かつその後 (c)分離した、処理したDNAサンプルのために:DNAポリメラーゼ、4 種のデオキシヌクレオシド三リン酸のそれぞれ、及びDNAサンプルの反対の鎖 及びターゲットDNA配列の側面にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプラ イマーの1組を用意し、その際、前記4種のデオキシヌクレオシド三リン酸の少 なくとも1つを標識しておき、 (d)DNAポリメラーゼ及び4種のデオキシヌクレオシド三リン酸を使用し て、DNAサンプルの反対の鎖への変性、変性した鎖へのプライマーのアニーリ ング、及びアニールしたプライマーの、標識したターゲットDNA配列を造るタ ーゲットDNA配列を指数関数的に増幅するDNAポリメラーゼによる伸長から なるPCRサイクリングステップの繰り返しシリーズを可能にする条件下で増幅 し、かつ (e)標識したターゲットDNA配列を検出及び/又は測定することにより、 DNAサンプル内のターゲットDNA配列の存在又は不在を確認する ことを特徴とする、DNAサンプル内のターゲット配列を増幅及び検出する方法 。 20.PCR増幅法が標識したデオキシヌクレオシド三リン酸を利用するin sit u 法であり、かつ処理したDNAのジデオキシヌクレオシド三リン酸及びDNA ポリメラーゼからの分離を洗浄により行う、請求項19記載の方法。 21.DNAサンプルが約37℃以上の高めた温度に曝した組織又は細胞培養内 に存在する、請求項20記載の方法。 22.PCR増殖工程の前に処理すべきDNAサンプルが、固定、パラフィン化 及び解パラフィン化されたDNAサンプル内に存在する、請求項21記載の方法 。 23.DNAサンプルを2種以上のジデオキシヌクレオシド三リン酸と接触させ る、請求項19記載の方法。 24.DNAサンプルを2種以上のジデオキシヌクレオシド三リン酸と接触させ る、請求項22記載の方法。 25.DNAサンプルをジデオキシチミジン三リン酸、TaqDNAポリメラー ゼ、デオキシアデノシン三リン酸、デオキシシチジン三リン、デオキシチミジン 三リン酸酸及びデオキシグアノシン三リン酸と接触させる、請求項19記載の方 法。 26.DNAサンプルがジデオキシチミジン三リン酸、TaqDNAポリメラー ゼ、デオキシアデノシン三リン酸、デオキシシチジン三リン酸、デオキシチミジ ン三リン酸酸及びデオキシグアノシン三リン酸と接触させる、請求項22記載の 方法。 27.DNAサンプルをDNAポリメラーゼ及びジデオキシヌクレオシド三リン 酸と約37℃〜約72℃で約1〜15分間接触させる、請求項19記載の方法。 28.DNAサンプルをDNAポリメラーゼ及びジデオキシヌクレオシド三リン 酸と約37℃〜約72℃で約1〜15分間接触させる、請求項22記載の方法。 29.DNAサンプルのジデオキシヌクレオシド三リン酸及びDNAポリメラー ゼとの接触を、 (a)約37℃〜約72℃で約10秒〜約1分間の第1段階、 (b)約80℃〜約105℃で約10秒〜約1分間の第2段階 からなる2段階の間のサーマル・サイクリングで行う、請求項19記載の方法。 30.DNAサンプルのジデオキシヌクレオシド三リン酸及びDNAポリメラー ゼとの接触を、 (a)約37℃〜約72℃で約10秒〜約1分間の第1段階、 (b)約80℃〜約105℃で約10秒〜約1分間の第2段階 からなる2段階の間のサーマル・サイクリングで行う、請求項22記載の方法。 31.デオキシヌクレオシド三リン酸、及びDNAサンプルのターゲット配列内 の少なくとも1つの鎖にハイブリダイズする1種以上のオリゴヌクレオチドプラ イマーを使用して複製しかつ該複製に引き続き前記ターゲットを検出ことにより DNAサンプル内のターゲットDNA配列を複製及び検出する方法においてプラ イマー・インデペンデント非特異的バックグラウンドを減少させるために使用す るキットにおいて、複製法の前にジデオキシヌクレオシドをDNAサンプル内の 3′末端に共役結合させるために前記DNAサンプルを前処理する際に使用する ための少なくとも1種のジデオキシヌクレオシド三リン酸及びDNAポリメラー ゼからなることを特徴とする、DNA複製検出アッセイにおけるバックグラウン ド信号を減少させるキット。 32.2種以上のジデオキシヌクレオシド三リン酸からなる、請求項31記載の 方法。 33.ジデオキシヌクレオシド三リン酸及びTaqDNAポリメラーゼからなる 、請求項31記載のキット。 34.更に4種のデオキシヌクレオシド三リン酸を有する、請求項31記載のキ ット。 35.更に4種のデオキシヌクレオシド三リン酸を有する、請求項32記載のキ ット。 36.更に4種のデオキシヌクレオシド三リン酸を有する、請求項33記載のキ ット。
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