JPH09510699A - 人工的な抗イディオタイプインプリントの調製および適用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 この出願は、抗イディオタイプインプリントマトリックスを調製する手段としての、分子的インプリンティングの使用を開示する。この技術を用いれば、分子的にインプリントされたポリマーもしくは生物学的受容体、抗体もしくは酵素のような、認識部位を含む人工もしくは天然の分子のインプリントを調製することができる。前者の場合、引き続く重合段階において元のインプリントをキャストまたは型として用い、機能的に相補的なモノマーを優先的に利用することにより、形状および機能において元のインプリントと相補的な認識部位を含むが、組成の異なるインプリント材料を形成することができる。或いは、人工種もしくは生物種のイメージのインプリントを直接に得ることができる。こうして形成された調製物は、極めて広範な用途、例えば、新規な薬剤、阻害剤または親和性材料において用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】 人工的な抗イディオタイプインプリントの調製および適用 本発明は、分子的インプリンティング(molecular imprinting)により得られる 人工的イディオタイプ抗体の調製および適用に関する。 抗体がそれ自身に対する抗-抗体を生じ得ることは、自然界において知られて いる。このような抗-抗体または抗イディオタイプ抗体は、広く研究されている ［１］。抗イディオタイプ抗体の結合部位は、その起源である抗原（先の抗体） の「内部イメージ(intemal image)」である可能性をもった構造的特徴を示し得 る。また、最近では、酵素の活性部位の内部イメージであるモノクローナル抗- イディオタイプ抗体を製造する試みが記載されており、一つの事例では、コリン エステラーゼ活性をもった触媒抗体の形成が導かれている［２］。これは、酵素 （即ち、コリンエステラーゼ）に対して生成した抗体を注型し、上記の抗-抗体 を生じさせることによって行われた。 ごく最近開発された分子的インプリンティングの技術は、ここに説明する発明 の主要な要素である［３，４］。これは、特定の化合物（プリント分子）に対し て選択的なポリマーを調製する方法に与えられた名称である。この技術には、（ １）プリント分子およびモノマーを予め準備し、相補的な相互作用（非共有結合 的または可逆的共有結合的）を生じさせることと；（２）プリント分子／モノマ ー複合体の周りを重合させることと；（３）抽出によって、このポリマーからプ リント分子を除去することが含まれる。こうして、重合によりプリント分子に対 する相補性が保存され、得られたポリマーはプリント分子を選択的に吸収する。 以下、図面を参照して本発明を更に詳細に説明する。 図１は、分子的インプリンティングの原理を示している。プリント分子とモノ マーとの間の相補邸相互作用が生じる（ａ）；重合（ｂ）；ポリマーからのプリ ントの除去（ｃ）。Ｍはモノマー、ＰＭはプリント分子、ＣＲは架橋剤である。 図２は、本発明の一つの側面における原理を示している。 図３は、本発明の第二の側面を示している。 図４は、本発明の第三の側面を示している。 図５は、本発明の第四の側面を示している。 図６は、図４の４に対応した、選択的に更なる重合（インプリンティング）系 を伴った、抗イディオタイプインプリントの製造を示している。 分子的インプリントは、天然に存在する結合部位を模倣するように作用し得る ことが示されている［５］。更に、このようなインプリントは、広範な化合物の 認識部位を形成するように行うことができる。抗-イディオタイプ抗体に類似し て、斯かる起源物質のインプリントから得られたキャビティーは、抗-イディオ タイプインプリントまたは元のインプリントのイメージを与える、相補的な「娘 インプリント(daughter imprints)」として用いることができる。この得られた イメージは、形状および機能において、もとのインプリント種に類似しているで あろう。この原理は、図２に模式的に記載されている。 分子的インプリントは、工程Ａにおいて、化合物、例えば陽電荷を含む化合物 Ｒに対して、機能的にプリント分子に対して相補的なモノマー、例えば陰電荷を 含むモノマーを用いて作製される。インプリント分子の除去（Ｂ）の後に得られ るキャビティーは、引き続き、他の相補的な機能性（例えば重合性）のビルディ ングストーン、例えば陽電荷を帯びたモノマーを充填され、重合が行われる（Ｃ ）。次の工程において、元のインプリントを有するオリジナルのキャスト若しく は型が除去され（Ｄ）、抗-イディオタイプインプリントまたは元のインプリン トが遊離される。得られた分子、即ち「フィラー」と呼ばれるＲ´は、形状およ び機能において、元のプリント分子に類似または相補的であるが、適用された「 充填材料」に依存して、その組成はＲとは異なっている。 この技術の拡張として、表面インプリンティングと称される下記の方法を想定 することができる（図３）。或る化合物、例えば陽電荷を帯びた化合物Ｘに対し て分子的インプリントが行われる。重合工程Ａにおいて、重合性基を有する機能 化されたマトリックス（Ｍ）が、その相補的モノマー、例えば陰電荷を帯びたモ ノマーと共に用いられる。プリント分子（Ｂ）を抽出すると、その形状および機 能が化合物Ｘに対して相補的であるような認識部位を有するポリマーが残る。こ れらの部位を、相補的モノマー類、例えば陽電荷を帯びたモノマー類を利用した 抗-イディオタイプ重合等における型もしくはキャストとして用い（Ｃ）、また 引 き続き第一のポリマーを除去することにより（Ｄ）、抗-イディオタイプインプ リントポリマー（Ｙ）は、もとの化合物Xを模倣することになる。こうして、元 の分子（Ｘ）の表面インプリントが調製され、これは構造的に関連した分子（Ｙ ）の製造に用いることができるであろう。この技術は、巨大分子について特に有 用である。 想定されるインプリントのための一つの要件は、もとのマトリックス、並びに 引き続き得られるマトリックスが、インプリントを製造できることである。他の 要件は、もとの、即ち最初のインプリント材料が、第二のインプリントの記憶能 力を妨害せずに除去できることである。実施例には、多くの可能な材料および方 法が与えられている。これらには、可逆的な架橋性モノマーの使用、例えば、シ ッフ塩基の結合を含む架橋剤の使用が含まれている［６］。後者のポリマーは容 易に溶解する。 シッフ塩基結合を含む架橋剤 もう一つの可能性は、２−メルカプトエタノールで溶解するジスルフィドを含 むビスアクリルアミドの類縁体、例えば、ビス−アクリルシスタミンの使用であ る。 ビス−アクリリルシスタミン 開裂できる他の架橋剤は、Ｎ，Ｎ−ジアリル酒石酸アミド［８］、またはＮ， Ｎ´−（１，２−ジヒドロキシメチレン）ビス−アクリルアミド［９］である。 Ｎ，Ｎ−ジアリル酒石酸アミド Ｎ，Ｎ´−（１，２−ジヒドロキシメチレン）ビス−アクリルアミド もう一つの可能な方法は、第一または第二のインプリントとして、アガロース またはシリカのような完全に異なったマトリックスを使用することであり、後者 はシランの重合によって調製される。引き続くマトリックスの溶解により第一の インプリントを除去する別の方法としては、このような可逆的に溶解するモノマ ーを用いることにより、第二のインプリントを取り外してもよい。その際、第二 のインプリントマトリックスの認識特性を保護するように注意を要する。このよ うな溶解を容易にする他のアプローチには、インプリント分子を有する磁性ビー ズを使用することが含まれる。このようなマトリックスは、重合の後に、マトリ ックスに磁場を適用することによって分離することができる。もう一つ別のアプ ローチには、界面重合が含まれる。 インプリントを得るための更に別の方法は、後者の活性部位または結合部位を モノマーで充填した後、形成されたマトリックスを第二のインプリント工程にお ける型またはキャストとして用いることにより、生体分子のインプリントを直接 に作製することである。これによって、図４に記載されているように、第一の予 備形成されたインプリントの抗-イディオタイプインプリントの形成が導かれる であろう。特定の結合種は、例えばアガロースのような分解可能なマトリックス （１）に固定され、工程Ａにおいて、機能的に相補的なモノマーを含む重合性混 合物が添加される。重合に続き、工程Ｂではマトリックスが溶解され、新たに形 成された重合体の抗-イディオタイプ結合部位（３）がアクセス可能になる。こ のように調製されたものは、例えば、フィルムもしくは薄膜または小ユニットと して構成された人工的な阻害剤または受容体として用いることができるであろう 。更に、図４に示すように、３のインプリントを用いて３から工程Ｃを経由し、 工程Ｄを経ることにより、１に類似したプラスチック製のインプリント４を得る ことができる。 更に、上記の直接的インプリントの代わりに、図５に概略を示したように、例 えば生体分子の表面または活性部位に沿って、モノマーまたは他の分子を配列さ せることを想定することができる。前者は、工程Ａにおいて分子１の官能基と相 互作用し、続いて縮合を生じる。工程Ｃにおいて１を除去することにより、１の 薄層インプリントの形成が導かれる。或いは、まず生体分子の官能基を誘導し、 続いてその縮合を行う。 このようなインプリント（＝フィラー分子）の潜在的な用途は次の通りである 。 （１）新規な酵素阻害剤、新規な薬剤、細胞親和性材料のような新規な親和性 リガンド、抗-抗体および新規な触媒を導くことができる。 （２）ペプチド、ヌクレオチド、糖鎖、または他の生物学的材料を、有機ポリ マーのような他の材料で代替えすることができる。 （３）機能的にはインプリント種と同一もしくは類似であるが、より安定かつ 安価に製造できる新規可能物を導くことができる。 （４）更なる拡大として、インプリンティングにより得られたキャビティー内 または表面上に、新規な酵素様触媒を得ることができる。 （５）このようなキャビティーは、それがキラルであれば、新規なキラル分子 を製造するための足場材料として用いることができる。 （６）第一のインプリントから得られたキャビティーは、種々の有機分子もし くは無機分子の組合せライブラリーを利用した新規分子を創製するために用いる ことができる。 （７）抗-イディオタイプ抗体の類似物。実施例１ アセチルコリンは、改良された標準プロトコールを用いて分子的インプリント を行うことができる。即ち、アセチルコリンは、クロロホルム中のメタクリル酸 、選択的に開裂できる架橋剤（例えばビス−アクリリルシスタミン）を含む異な った種類の架橋剤、および開始剤（アゾ−イソブチロニトリル、ＡＩＢＮ）と共 に重合される。形成されたインプリントは、形状、電荷、並びに水素結合能力に おいて、アセチルコリンに対して相補的である。インプリント分子は、メタノー ル／酢酸（９：１）を用いてポリマーから抽出される。続いて、架橋剤を含むか 又は含まない少量の重合性モノマーのカクテルを、形成されたキャビティー内に 添加して重合させる。形成された最初のマトリックスを溶解する薬剤、例えばＳ Ｈを有する化合物を添加し、娘インプリントをアクセス可能にする。得られたア セチルコリンの抗-イディオタイプ類縁体の結合能力は、遊離アセチルコリンに 対する拮抗アッセイで試験することができる。実施例２ トリプシン阻害剤、即ちｐ−アミノベンズアミジンに対する分子的インプリン トを調製する。適切なモノマー（例えばメタクリル酸）および開裂可能な架橋剤 （例えばビス−アクリリルシスタミン）と共に、インプリント分子を重合する。 ｐ−アミノベンズアミジンの抽出に続いて、このｐ−アミノベンズアミジンのイ ンプリントを新たな重合工程におけるキャストとして用いることにより、抗-イ デ ィオタイプインプリントを製造する。最初のインプリント材料を溶解することに より、自由に適用可能な鏡像インプリントが残される。こうして形成された抗- イディオタイプインプリント材料は、トリプシン阻害剤を模倣しているので、ト リプシンに対する親和性試験またはウシ膵臓トリプシン阻害剤（ＢＰＴＩ）の様 な巨大トリプシン阻害剤に対する拮抗試験によって分析することができる。実施例３ トリプシンをアガロースビーズに固定化する。適切なモノマーカクテルおよび 適切な架橋剤の重合により、先の実施例と同様にして、アガロースビーズの表面 に抗-イディオタイプインプリントを調製する。酸性溶液の添加によって、アガ ロースビーズの溶解が導かれ、抗-イディオタイプインプリントがアクセス可能 になる。この抗-イディオタイプインプリント材料をトリプシンに対する親和性 マトリックスに用いて、分析を行うことができる。実施例４ 先ず、シリコン表面またはマイクロスライドを酸化し、次いで、水溶液中のア ミノプロピルトリエトキシシランで一晩シラン化した。次に、このスライドをｐ Ｈ６の無水コハク酸で一晩処理し、表面に遊離カルボキシ基のみを残存させた。 次の工程において、このスライドをジオキサンで十分に洗浄して無水条件を達成 し、更にジオキサン中のＮ−ヒドロキシコハク酸イミドおよびＮ，Ｎ´−ジシク ロヘキシルカルボジイミドと２時間反応させて、カルボキシ基をＮ-ヒドロキシ コハク酸イミドエステルに変換した。更に洗浄した後に、このスライドを、0.1 ＭＮａＨＣＯ₃（ｐＨ9.2）中のインスリンで一晩処理した。これらの条件下で、 リジンＢ２９のアミノ基を、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステルと特異的に 反応させる。成いは、ｐＨ6.4において、Ｂ１フェニルアラニンの末端アミノ基 を介しての結合を達成してもよい。 結合したインスリン量の測定は、エリプソメトリー(ellipsometry)によって行 った。 インスリンは、固定部位（Ｂ２９）に由来する構造の反対部位のＢ１０に、表 面の亜鉛結合ヒスチジン(a surface,zinc binding histidine)を有している(Bl et al.,Biopolymers 23(1984),391-395)。この表面には、等電点5.5未満で陽性 に帯電し、スルホネート基と結合する他の５つの塩基性アミノ酸が存在している (Matsuura et al,JACS 115(1993),1261-1264)。こうして、インプリンティングは、ｉ）キ レート化モノマーであるＮ−（５−メタクリルアミド−１−カルボキシペンチル ）イミノジ酢酸、ＣｕＳＯ₄、スチレンスルホネート、アクリルアミドおよびピ レラジン−ビスアクリルアミドの水溶液（ｐＨ４、５℃）を用い、かつ光開始剤 としてメチレン青を用いて、或いは ｉｉ）イミドジ酢酸Ｎ−（４−ビニル）− ベンジル（ＶＢＩＤＡ）、ＣｕＳＯ₄、メタクリル酸（ＭＡＡ）およびエチレン グリコールジメタクリレート（ＥＧＤＭＡ）の有機溶媒溶液を用い、ＡＩＢＮを 開始剤として用いることにより、実施することができる。 上記のインプリンティングは安定なフィルムを形成し、該フィルムは、手作業 または溶解により、それが形成された表面から分離させることができる。 この固定化されたインスリンは、バイオアッセイにおいて、細胞による脂質生 成を促進することが示された。実施例５ 実施例４に記載したのと同様の方法に従い、下記のａ），ｂ）により、ペニシ リンＧをマイクロスライドに結合させた。 ａ）アクリレート誘導。乾燥アセトン中の１重量％の３−（トリエトキシシリ ルプロピル）メタクリレートを、確立された方法によって、スライドと反応させ る。 ｂ）アミノ誘導。濡れたスライドに、アミノシランゾル（Ｈ₂Ｏ中の10％アミ ノプロピルトリエトキシシラン、ｐＨは3.5に調節する）を添加する。8.8mgのペ ニシリンＧ、25mgのＥＤＡＣ、25mlのＰ（ｐＨ7.0）を溶解し、室温に３０分間 放置し、続いてアミノスライド（ペトリ皿当たり４枚、広げる）を添加し、各ス ライドに２mlのペニシリンＧカップリングゾルを添加し、該スライドが完全に覆 われるようにし、室温で一晩放置する。実施例６ 実施例５に記載した何れか一方に類似した方法に従い、テオフィリンをマイク ロスライドにカップリングさせる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．人工分子または天然分子の模倣物を製造する方法であって：第一の重合工 程において、前記分子の存在下でモノマー類および架橋剤類を重合させることに より、前記分子のインプリントを有するマトリックスを形成することと；該マト リックスから前記分子を分離することと；第二の重合工程において、モノマー類 および架橋剤類（これは第一の重合工程におけるモノマーおよび架橋剤と同じで あっても異なってもよい）を、前記マトリックスのインプリント内で重合させる ことにより、前記分子と同じ機能および／または形状を有する前記分子の摸倣物 を作製することと；次いで、該模倣物を前記マトリックスのインプリントから分 離することとを特徴とする方法。 ２．表面に結合した分子の模倣物を製造する方法であって：第一の重合工程に おいて、前記表面に結合した分子のインプリントを有するフィルムの形成下に、 モノマー類および架橋剤類を重合することと；このインプリントされたフィルム を分離することと；第二の重合工程において、モノマー類および架橋剤類（これ は第一の重合工程におけるモノマーおよび架橋剤と同じであっても異なってもよ い）を、前記インプリントされたフィルム上で重合させることにより、前記表面 に結合した分子と同じ機能および／または形状を有する前記表面結合分子の模倣 物を作製することと；次いで、該模倣物から前記インプリントされたフィルムを 分離することとを特徴とする方法。 ３．表面に結合した分子の模倣物を製造する方法であって：前記表面結合分子 のインプリントを有するフィルムの形成下に、モノマー類および架橋剤類を重合 させることと；次いで、このインプリントされたフィルムを前記表面結合分子か ら分離することとを特徴とする方法。 ４．請求項１〜３の何れかに記載の方法の使用であって、分子インプリント、 受容体、抗体、酵素などのような、人工のまたは天然の結合部位を含む成分の抗 -イディオタイプ様インプリント（該抗-イディオタイプ様インプリントは前記成 分と同じ機能および／または形状を有する）を製造するための使用。 ５．人工的または天然の結合部位を含む成分の分子的インプリンティングによ り作製されたキャビティー内で、添加されたモノマー類および架橋剤類を重合さ せることによって抗-イディオタイプ様分子を製造するための分子的インプリン トの使用であって、前記添加された重合性モノマーおよび架橋剤がそれ自身で、 重合に先立って前記部位内で配向する使用。 ６．請求項５に記載の使用であって、前記重合性モノマーがアクリルモノマー 、シラン、またはアジドのような他の連結分子である使用。 ７．抗-イディオタイプ様インプリントを製造するための分子的インプリンテ ィングの使用であって、選択的に重合可能なモノマー類または架橋剤類を利用し て、生体分子または他の分子の周りで新規分子を直接的に形成することによって 新規分子を製造するための使用。 ８．請求項４〜７の何れか１項に従って製造された抗-イディオタイプ様イン プリントの使用であって、新規阻害剤、新規薬剤、新規親和性リガンド、新規な 抗-抗体および新規触媒としての使用。 ９．抗-イディオタイプインプリントを製造するための分子的インプリンティ ングの使用であって、非キラルな基本要素に由来するキラルキャビティー内で、 またはキラルモノマー類を用いてキラル性を生じさせるための使用。 １０．請求項３に従って製造された模倣物の使用であって、新規阻害剤、新規 薬剤、新規親和性リガンド、細胞親和性材料および抗-抗体を含む新規な抗親和 性材料、および新規触媒としての使用。 １１．或る分子の存在下でモノマー類および架橋剤を重合させることにより、 前記分子のインプリントを有するマトリックスを形成し、次いで該マトリックス から前記分子を分離することによって製造された分子的インプリントの使用であ って、新規阻害剤、新規薬剤、新規親和性リガンド、細胞親和性材料および抗- 抗体を含む新規な抗親和性材料、および新規触媒としての使用。 １２．成る分子に対して相補的な目的物を製造するための方法であって：活性 部位または結合部位を含む前記分子に対して、前記分子の部位に相補的な活性基 を有する架橋性の小成分を添加し、この小成分を前記部位に結合させることと； その後、前記分子に対して相補的な活性基を有する目的物の形成下で、これら活 性部位に結合した前記小成分を架橋させることと；次いで前記目的物を前記分子 から分離することとを特徴とする方法。