JPH09503654A - 組み換えアルタナリアアルタネイタ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａａｌｔｅｒｎａｔａ）アレルゲン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はアレルゲンＡｌｔａ５３、Ａｌｔａ２２及びＡｌｔａ１１の抗原性を有するポリペプチド、またはこれらのアレルゲンのエピトープのうち少なくとも１つを有するペプチドをコードする組み換えＤＮＡ分子に関する。これらの分子は配列１、３−５、７−９、１２、および１３、もしくはこれらの配列の断片と相同的に適合する核酸配列を持つか、又は該核酸と緊縮条件下でハイブリダイズする核酸配列を有することを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】組み換えアルタナリア アルタネイタ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａ ｔａ）アレルゲン 本発明はアレルゲンＡｌｔａ５３、Ａｌｔａ２２及びＡｌｔａ１１の抗原性を 有するポリペプチド、またはこれらのアレルゲンの少なくとも１つのエピトープ を有するペプチドをコードする組み換えＤＮＡ分子に関する。 Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａの前記のアレルゲンは、これらア レルゲンの主要なｃＤＮＡ由来のペプチド配列と同様、免疫反応の１つとして菌 類に対してアレルギーのある人においてＩｇＥ抗体生産を過剰に引き起こす。組 み換えアレルゲン、又は免疫原性活性がある部分ペプチドは、カビアレルギーの 改良された診断だけでなく、インビトロにおいてもインビボにおいてもＴリンパ 球の免疫寛容または免疫低下の誘導に使用できるかもしれない。 ここ数年、疫学の研究でアレルギー発症の頻度が増えてきたことが明らかにな った。アレルギー疾患には多くの原因がある。今日では、花粉、動物の毛、家ダ ニの糞のようなアレルゲンの概念は誰にでも馴染みのあるものとなっているであ ろう（ウットリッチ １９９１、ミヤモト １９９２）。しかし、この分野の専 門的な活動では、カビは未だその生物学的、アレルギー学的意味において多くの 疑問を残している。少なからず、これらの菌類を探すのが難しい異なった生活環 境での偉大な生命力、適応力による。既知の菌類の９８％が郊外に生息する。ほ とんどの菌類にとって、８０％の大気湿度と２０℃の気温の気候条件が理想の生 活、増殖条件である。 カビアレルゲンの機構は正確には知られていず、通常の即効型の吸入 アレルギーより複雑で込み入っているようである。呼吸器系によるだけではなく 、消化器系からの減感作の可能性が議論されていて、集中的な研究の対象になっ ている。即効型アレルギー（Ｉ型アレルギー）はＩｇＥ抗体により引き起こされ るが、ＩｇＥはレセプターを介してＦｃ部分でエフェクター細胞（血液の好塩基 球と同様、粘膜や結合組織型の肥満細胞）と接触し、アレルゲンとの接触で炎症 性の物質（ヒスタミン、ヘパリン、アラキドン酸代謝物等）の放出がおこる（ロ ット １９９１、クレン１９９０）。このようなＩｇＥ抗体の形成は、抗体を分 泌するために活性化したＴリンパ球により分泌される可溶性物質（リンホカイン ）により刺激されるＢリンパ球から起こる（パランチャら １９９１）。 すべての免疫反応は存在する抗原を活発に貪食する細胞によって開始される。 このため、これらの細胞は貪食細胞とも呼ばれる。それらは樹枝状細胞であるが 、後の段階でマクロファージに分化する単球でもある。これら全ての細胞には血 管外遊出（ＤＩＡＰＥＤＥＳＩＳ）の可能性があり、これにより細胞は血液系を 離れて、体腔等にしみ出ることが出来る。抗原撲滅の主要な部分はマクロファー ジによって行われる。貪食の後、それらは、抗原を非常に免疫原性のあるペプチ ド（平均サイズはおよそ１５アミノ酸）に分解し、マクロファージで発現される ＭＨＣ（主要組織適合抗原）タンパク質と一緒に、それらをＴリンパ球に与える 。この時点でＴリンパ球によって行われる中心的な役割は強調されるべきである 。存在する抗原が“外因性”のものであろうと“内因性”のものであろうと、免 疫反応のこの時点においてのみ、それは見分けることができ、これがＴリンパ球 の中心的役割である。“外因性”のものであると決定したら、抗原に対する更な る攻撃を阻むものはない。内因性のＭＨＣと接触して外来タンパク質 を認識したらＴリンパ球はさらにプラズマ細胞に分化し、直ちにインターロイキ ンを分泌する。このインターロイキンの分泌はＢリンパ球を活性化し、Ｂリンパ 球は、その役目として、可溶性抗原を見分けるが、初めは、自身の分化のために インターロイキンを介してのＴリンパ球からの“伝達”を必要とする。これに続 いて、Ｂリンパ球からプラズマ細胞への分化が起こり、そこでアトピー患者は比 較的大量のＩｇＥクラスの抗体を分泌する。 もし、Ｔ細胞の段階で抗原が内因性のものであると認識されれば、その後は通 常の状態では、免疫反応はこの段階で終了する。しかし、免疫系の複雑な調節の カスケイドは幾つかの欠陥の可能性を抱えている。この条件の証拠は、多くの、 ほとんど致命的な、自己免疫疾患の症例であり、内因性の免疫系は“自己”と“ 非自己”を区別できない。 現在に至っても、このようにアレルギー性疾患の診断と治療は満足の行くもの ではない。ｃＤＮＡクローニング、配列決定、タンパクデータバンクでのアレル ゲンタンパク質の配列比較、および組み換えアレルゲンの生産によるＡｌｔｅｒ ｎａｒｉａの主要アレルゲンの分子的特徴解明は間違った免疫反応を誘発するタ ンパク質のインビボにおける機能のさらなる情報を提供するだろう。この情報は 以下の理由から興味深い； １）高度に精製された組み換えアレルゲンがより細心な診断、現在未精製抽出 物でおこなわれているものより良い診断、に使用しうる。 ２）同時にアレルゲンの配列が寛容原性ペプチドを定義し、また、アレルゲン による免疫感作の間に起こるＩｇＥクラスの切替えを理解するようになるのを助 ける。 数十年のあいだ、ＩｇＥがおこすアレルギーは、ここでは例えば菌類の胞子に 対するアレルギー、減感作によって治療されてきた（バスケットら、１９９１） 。この治療は、数年にわたって達成される投与量を維持するまで、投与量を増や しつつ点滴剤として水溶液の形の経口投与や注射の形態でのアレルゲン抽出物を 投与することからなる。この治療の結果は、投与されたアレルゲンにたいして寛 容性を獲得し、症状の軽減として現れる（バーカーら、１９９０）。このタイプ の治療の問題点は治療が起こすのと逆の反応が幾つも生じることである。減感作 の治療の過程で、治療の途中、過敏性のショックが起こる。ここでの問題は菌類 のタンパク質の単離物を標準化することの難しさにある。過敏性の作用を欠いて いるアレルゲン由来のタンパク質を使用することによって、全く危険なく投与量 を上げることが可能になるかもしれず、これにより減感作の実質的な改良が達成 されうる。 Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａは、実際、自然界において何処で も見つけることが出来る。しかし、この菌類が好む生息地は、様々な土壌型、穀 物のサイロ、腐った木であるが、生きている植物、堆肥場、および鳥の巣もまた 好ましい。もしトマトが黒い斑点で覆われていたら、それはＡｌｔｅｒｎａｒｉ ａのせいである可能性が高い。しかし、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａ ｔａが見つかるのは自然界においてだけではない。非常に頻繁に、その菌類は湿 った室内や、窓枠で見つかる。一般的に、高温多湿がこの菌類の生育には都合が よい。 現時点において、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａはアレルギーを 誘発する菌類のうちで最も重要なものの１つと考えられている。ヤンギンガーら （１９８９）は最初のアレルギー性画分を特定して、アレルゲンとして作用する 最初のタンパク質であるＡｌｔａ１を単離した。Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔ ｅｒｎａｔａの重大な問題は菌類の多様性の幅が広いということである：タンパ ク質のパターンの多様性とアレルギーの引き金としての能力が変化する可能性が 頻繁に論じられてきた。ニョールら（１９８３）はＡｇｌとＡｌｔ−１は同じア レルゲンだが、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａの異なった種が該タ ンパク質の多様性の幅を示すかもしれないことを提示した。ブッド（１９８６） のレビューの記事では、アレルギータンパク質Ａｌｔ−１、現在ではＡｌｔａ１ だが、の単離について記している。それまでＡｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒ ｎａｔａのアレルギータンパク質の完全なｃＤＮＡの配列は発表されていなかっ た。しかし、様々な研究がＡｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａ、ステム フィリウム（Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ）、およびカルブラリア（Ｃｕｒｖｕｌａ ｒｉａ）の間の強い交差反応を示している（アガーワル １９８２）。 本発明において、配列１２および１３と同様に配列１、３−５、７−９もしく はこれらの配列の部分領域に相同的に相当する核酸配列を有するか、または前述 の配列と緊縮条件下でハイブリダイズする核酸配列を有するような、序文で述べ られたタイプの組み換えＤＮＡ分子を新たに作りだした。該ＤＮＡ分子は前述の 配列から変性（縮重）によって誘導される核酸配列も含む。 以下の記載によりさらに発明特定事項の詳細を明らかにする。 ａ）ウエスタンブロッティングによるＡｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａ ｔａのアレルゲンタンパク質の説明 Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａの当該アレルゲンをクローニング するために、１４２人のアトピー患者の血清を使用した。菌類タンパク質抽出物 と患者との反応性を調べるために、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａ （ウィンディシュ教授のコレクション、ベルリン、Ｎｏ．０８−０２０３）を固 体培地（２％グルコース、２％ペプトン、１％イーストエクストラクト）で培養 した。タンパク質を抽出するために、２８℃で３日間培養したのち菌類が繁茂し たものを刈り取り、液体窒素で破壊した。抽出したタンパク質の分離は変性ポリ アクリルアミドゲルで行れ、続いてブロッティングされ、患者の血清とインキュ ベイトされ、¹²⁵ Ｉでラベルされた抗ヒトＩｇＥで検出された。以下に、アレル ゲンタンパク質と反応した患者のパーセンテージを示す： Ａｌｔａ５３ ４４．８％ Ａｌｔａ２２ ３．４％ Ａｌｔａ１１ １０．３％ アレルゴン（Ａｌｌｅｒｇｏｎ）（スウェーデン）から購入した菌類材料から タンパク質を単離し、イムノブロットに使用した場合、ほどんど同じバンドのパ ターンが検出された。これらの数から読み取れるように、Ａｌｔａ５３が主要ア レルゲンでＡｌｔａ２２とＡｌｔａ１１が二次的アレルゲンである。 図１は上記アレルゲンのクローニングのために使用した患者の材料をおおまか に表したものである。この図は１２．５％のアクリルアミドゲルを示す。Ｎｏ． ３５と４０の患者（彼らは引き続いてスクリーニングに使用した患者でもある） は５３ｋＤ、２２ｋＤ、および１１ｋＤの順のバンドを示す。 このように図１は、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａのタンパク質 抽出物を分離し；異なった患者の血清とのインキュベーション；¹²⁵ Ｉでラベル した抗ヒトＩｇＥによる検出後の１２．５％ポリアクリルアミドゲルのウェスタ ンブロッティングを示す。 ｂ）ｃＤＮＡ発現バンクの構築 全ＲＮＡは酸グアニジウム−フェノール抽出法で当方で培養した菌類材料 ｅｒ）のオリゴ（ｄＴ）セルロースを使って行われた。ｃＤＮＡ合成（第１及び 第２の鎖）はストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｏ．）の「ラムダＺ ＡＰシステムマニュアル」（Ｍａｎｕａｌ ｄｅｓ Ｌａｎｂｄａ ＺＡＰ−ｓ ｙｓｔｅｍ）に記載のとおりに行った。次いで、ｃＤＮＡにＥｃｏＲＩ（３’側 ）とＸｂａＩのリンカー（５’側）が付けられ、予め短くされたラムダＺＡＰア ームで結合され、まとめられた。最初のバンクの力価は９００、０００クローン であった。 ｃ）患者の血清を使ったｃＤＮＡバンクのスクリーニング、インビボでの取り 出し、配列決定 発現バンクは“拾い上げた”ファージプラークを、検出された抗原のスペクト ルをカバーする患者の血清とインキュベーションすることによって、知られてい るように、ウェスタンブロッティングからスクリーニングされた。ファルマシア 社の抗ヒトＩｇＥ ＲＡＳＴ抗体を使って再度検出が行われた。２次、３次のス クリーニングを行った後、１５０の陽性のクローンが残った。１２のクローンか ら、既に即座に配列決定可能なブルースクリプトベクターが、ヘルパーファージ を使ってインビボで取り出された（ラムダＺＡＰキットのマニュアルの手法）。 取り出したプラスミドの制限酵素による切断（ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩの二重切断 ）により３つの異なった挿入型が示された。これらの３つのクローンはサンガー 法（サンガー、１９７７）によって配列決定された。 ｄ）β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質としてのＡｌｔａ５３、Ａｌｔａ２ ２、およびＡｌｔａ１１のｃＤＮＡの発現 前述したＩｇＥスクリーニングによって、３つの完全なｃＤＮＡが得られた。 大腸菌の株であるＸＬＩ−Ｂｌｕｅがそれぞれの組み換えプラスミドで形質転換 され、ＩＰＴＧ（イソプロピル β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）が導入され た。大腸菌の全タンパク質抽出物は、次いで、電気泳動で分離され、ニトロセル ロースにブロッティングされた。該融合タンパク質は菌類に対してアレルギーの ある患者の血清ＩｇＥと、¹²⁵ Ｉでラベルしたウサギの抗ヒトＩｇＥ抗体（ファ ルマシア、アップサラ、スウェーデン）で検出した。 次の２つの図は患者の血清とインキュベーションし、Ｉ（ヨウ素）でラベルし た抗ヒトＩｇＥで検出したあとの組み換えβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質 を示す。融合タンパク質のβ−ガラクトシダーゼの部分には３６個のアミノ酸が あり、これは分子量３８００Ｄａに相当する。以下の図３と図４はアレルゲンタ ンパク質のこの“増大化”を考慮に入れて見るべきである。レーン（クローン） １、２、４、５、６、７は組み換え融合タンパク質Ａｌｔａ１１を示し、レーン ３と１２は組み換え融合タンパク質Ａｌｔａ２２を、およびレーン８と１０は組 み換えＡｌｔａ５３を示すが、いずれも融合部分により長くなっている このように図２と図３はＩＰＴＧ導入後のブルースクリプトでの組み換え タンパク質Ａｌｔａ５２、Ａｌｔａ２２およびＡｌｔａ１１の発現を示す。 ｅ）組み換えアレルゲン中のＢ−およびＴ−細胞エピトープの決定 アレルゲンの誘導されたアミノ酸配列は適当なコンピュータープログラムによ るＢ−およびＴ−細胞エピトープの予測のための先行条件を提供する。これらの 研究を通して、例えばＴ−リンパ球を刺激したり、増殖を誘導したりすることが できる特異的なＴ−およびＢ−細胞のエピトープを定めることが出来るが、また （投与量を正確に定めた場合）これらの細胞を寛容や非反応性（アネルギー）の 状態にする事もできる（ロバート、１９９１）。決定されたそれぞれのエピトー プは個々の図での組み換えタンパク質の説明中で記載される。 Ｂ−細胞エピトープの探索はＧＣＧプログラム（ジェネティック コンピュー ター グループ）の“ＰＲＯＴＣＡＬＣ”の助けを借りて行ったが、このプログ ラムはウォドロー教授の研究グループによって重要なパラメーターを加えられて 拡張された。親水性（キテ−ドーリトル）（Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）、 二次構造（チョウ−ファスマン）（Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ）、表面局在性（ロ ブソン−ガーナー）（Ｒｏｂｓｏｎ−Ｇａｒｎｉｅｒ）および自由度の比重に基 づいて決定が行われ、部分ペプチドの抗原性が計算された。 Ｔ−細胞エピトープの予測の主要な部分は基本的にはマルガリータら（１９８ ７）のアルゴリズムに従って行われた。重要な点は決定すべきペプチドの１次配 列にしたがって親水性領域に挟まれた両親媒性のヘリックスを探すところにある 。該当するＴ−細胞エピトープに関して計算されたスコアは1０より大きいに違 いない。ＭＨＣＩＩ結合ペプチドの場合、ＨＬＡ−Ａ２（ヒト白血球抗原）（Ｍ ＨＣＩ）結合ペプチドの場合と同様に、配列やペプチドの長さに基づい ても共通性を定義することはできない。ＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドの場合、ペプ チドの長さは１０アミノ酸で、２番目のアミノ酸がチロシンで、最後のアミノ酸 がロイシンである（ラメンシーら、１９９３）。計算されたエピトープは個々の アレルゲンの配列の記載のところでで別々に議論する。 クローニングされた菌類のアレルゲンの分子的特徴づけ（配列のプロトコール ） 以下では、ｃＤＮＡの配列とそれについて行われた分析が連続して示される。 以下の配列のコンピューターでの評価はＧＣＧソフトウェアーパック（＝ウィス コンシンパック：このパックのアルゴリズムはウィスコンシン大学により開発さ れた）の助けを借りてウルトリックス−ＤＥＣ５０００ワークステーション（Ｕ ｌｔｒｉｘ−ＤＥＣ ５０００ ｗｏｒｋ ｓｔａｔｉｏｎ）により行われた。 Ａ．Ａｌｔａ５３ 以下の配列１は、開始コドンＡＴＧから始まるＡｌｔａ５３の完全なｃＤＮＡ 配列を示す。ｃＤＮＡの長さは１４８８ｂｐで、計算された５３５４３Ｄａの分 子量に相当する。分子量を基にすると、ウェスタンブロッティングで５３ｋＤに 観察されたバンドは、クローニングされ配列が決定されたアレルゲンに相当する 。実行された分析に基づくかぎりでは、成熟タンパク質はおそらくいかなるシグ ナルペプチドにも先行されていないだろう。 Ａｌｔａ５３の相同性をスイスプロト（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ）データバンクで 調べたところＡｌｔａ５３は、Ｃｌａｈ５３と同様にアルデヒドデヒドロゲナー ゼであった。高い相同性（同一性は広い範囲にわたって存在する）の証拠として 以下の配列２でＡｌｔａ５３とＣｌａｈ５３を並べたところを示す。２つのタン パク質（アレルゲン）の同一性（同一アミノ酸）は互いに７８％である。相同性 （同一性プラス相同なアミノ酸の交換）の程度は８６％にもなる。 ＮＡＤ依存ＡＬＤＨはヒトにおいてアルコール代謝の最初の産物であるアセト アルデヒドの酸化に関与する主要な酵素である。この関係で、イソ酵素ももちろ ん見つけうる（ハラダら Ｈａｒａｄａ ｅｔ ａｌ．、１９８２）。例えば、 ミトコンドリアでイソ酵素のＡＬＤＨ Ｉが、細胞質でＡＬＤＨ IIがヒトで見 つかっている。興味深いことに、アジアではＡＬＤＨ Ｉが欠損している人は珍 しくない（ハラダら、１９８２）。ＡＬＤＨ Ｉが欠損していると、アセトアル デヒド濃度が高くなり、アルコール消費後、顔がいわゆる潮紅したり、他の血管 拡張の症状が観察できる。イソ酵素の欠損は本来のタンパク質の構造を変えてし まうような変異の結果だと考えられる（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．、１９８７）。現 時点ではＡＬＤＨとアレルギーの引き金との関係とはまだ知られていない。 以下の配列３はコンピューター検索で同定された高い抗原性を持つ領域の一覧 を示す。これらの領域は有力なＢ細胞のエピトープを表す。 以下の配列４はコンピュータープログラムを駆使して決定した両親媒性ヘリッ クスを示し、ここは親水性の領域に挟まれている。このような領域は、１０以上 のスコアで、Ｔ−細胞のエピトープである可能性が高いところを示す。 Ｔ−細胞のエピトープはＮ末端でリジン（Ｋ）に、Ｃ末端でプロリン(Ｐ)(＝ フラッグ)に挟まれている中間点のアミノ酸の位置から計算する。Ｔ−細胞のエ ピトープである可能性が高いところはスコア指数は１０以上のときだけ存在する 。 Ｂ．Ａｌｔａ１１ 以下の配列５は、Ａｌｔａ１１の完全なｃＤＮＡ配列とそこから導き出される アミノ酸配列を示す。読み取り枠は３４２ｂｐ、又は１１４アミノ酸を含む。計 算された分子量は１１１２７Ｄａで、これは患者の１０．３％からウェスタンブ ロッティングで見つかっている１１ｋＤの抗原性タンパク質に相当する。 この場合、スイスプロト（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ）タンパクバンクによる相同性 検索によって、リボソームタンパク質Ｐ２との相同性が見つかった。このリボソ ームタンパク質はリボソームの大きなサブユニットの構成に含まれている。ここ でＣｌａｈ１１の相同性、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｈｅｒｂａｒｕｍにおけ るＡｌｔａ１１の対になるもの、もまた必ず存在する。Ａｌｔａ１１とＣｌａｈ １１の同一性と相同性は以下の配列６から読み取れる。２つのタンパク質の同一 性は７４％で、相同性の程度は８４％に上昇し、これがこの２つのタンパク質が 類似した機能を持つことを疑いなく示す。 異なった生物の酸性リボソームタンパク質（Ｐ０、Ｐ１およびＰ２のような） がさまざまな手法で分析されてきた。Ａタンパク質（酸性の）とＰタンパク質（ リン酸化されたＡタンパク質）は区別されている。Ａタンパク質は１面では疎水 性アミノ酸がたくさんある。そのため、それらはリボソームから容易に分離でき る（５０％エタノールおよび高濃度の塩）。もっともよく特徴がわかっている原 核生物のＡタンパク質はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（大腸菌）のＬ７／ Ｌ１２タンパク質である。真核生物において相同するものはタンパク質 Ｐ１、Ｐ２であり、Ｌ７／Ｌ１２に似ており、伸長因子ＥＦ１およびＥＦ２と相 互作用を起こす。Ｃ末端の配列は狼瘡患者の自己抗体により認識されるエピトー プを含む（フランコワら、１９８５；リッチら、１９８７；ヒンら、１９９１） 。その相同性から、Ｐ２タンパク質はアレルゲンタンパク質Ａｌｔａ１１に相当 する。 次に、配列７で示すＢ−細胞エピトープは２次構造、表面位置、親水性、自由 度等を考慮にいれて計算された。 以下の配列８では計算されたＴ−細胞エピトープを示し、そのアミノ酸を１文 字表記で表す。 Ｔ−細胞のエピトープはＮ末端でリジン（Ｋ）に、Ｃ末端でプロリン(Ｐ)(＝ フラッグ)に挟まれている中間点のアミノ酸の位置から計算する。Ｔ−細胞のエ ピトープである可能性が高いところはスコア指数は１０以上のときだけ存在する 。 Ｃ．Ａｌｔａ２２ 以下の配列９はＡｌｔａ２２の完全なｃＤＮＡ配列を示す。これから導き出し た１次配列もまた該配列から読み取れる。このアレルゲンタンパク質の読み取り 枠は６１５ｂｐであり、これは２０５アミノ酸の長さに相当する。計算された組 み換えタンパクの分子量は２２０４１Ｄａである。実行された分析に基づくかぎ りでは、成熟タンパク質の前方にはシグナル配列は存在しない。 スイスプロトタンパクデータバンクでの配列が決定されているタンパク質との 相同性の調査では、アレルゲンであるＡｌｔａ２２は酵母のタンパク質ＹＣＰ４ と極めて相同性が高いことが示された。２つのタンパク質の同一性は５６％で、 相同性も７２％である。そのように類似性が高いので、この２つのタンパク質は 共通する機能を持っていると推測してもよいだろう。以下の配列１０はＡｌｔａ ２２とＹＣＰ４との高い相同性を反映している。 さて、ＹＣＰ４の機能は何であろうか。イーストゲノムプロジェクトでは、Ｙ ＣＰ４の配列または読み取り枠はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓ ｉａｅの染色体３にあり、それは公表された（ビトーら、１９９２）。ビトーら （１９９２）によれば、ＹＣＰ４を破壊しても表現型は変わらなかった。しかし 、改善された表現型の分析では、酵母のＹＣＰ４は熱ショックタンパク質（ヒー トショックプロテイン）としての機能を持っている可能性が示された。合わせて 、この研究はアレルゲンの機能分析においてＳａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒ ｅｖｉｓｉａｅがいかに重要かを示すものである。形質転換の容易さが、分子遺 伝学の成熟した手法とあいまって、酵母の遺伝子を破壊して、その結果得られる 表現型を分析することを可能にする。 Ａｌｔａ２２にはＣｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｈｅｒｂａｒｕｍにも相同的な 仲間があることもわかった。以下の配列１１は酵母のＹＣＰ４、アレルゲンＡｌ ｔａ２２とＣｌａｈ２２の配列を示す。 次の配列１２にコンピューターを使用して見つかったＢ−細胞のエピトープも 示す。 以下の配列１３は計算されたＴ−細胞エピトープを示す。１０未満のスコアを もつ両親媒性の領域は関係あるとは思われない。 Ｔ−細胞のエピトープはＮ末端でリジン（Ｋ）に、Ｃ末端でプロリン(Ｐ)(＝ フラッグ)に挟まれている中間点のアミノ酸の位置から計算する。Ｔ−細胞のエ ピトープである可能性が高いところはスコア指数は１０以上のときだけ存在する 。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/569 0276−2Ｊ 33/569 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ジーモン ビルジット オーストリア国 Ａ―8700 レオベン デ ィルンボクベグ 17 (72)発明者 ウンゲル アンドレア オーストリア国 Ａ―5201 ジーキルヘン ツァイスベルグ 14 (72)発明者 レヒナエル エーリッヒ オーストリア国 Ａ―5400 ハレイン ド ットルストラッセ 16 (72)発明者 ヒルシュベール ラインホルト オーストリア国 Ａ―1160 ヴィーン ナ ウジーガッセ 18／10 (72)発明者 エブネール クリストフ オーストリア国 Ａ―1040 ヴィーン セ ント エリザベートプラッツ ４／13 (72)発明者 クラフト ディートリッヒ オーストリア国 Ａ―1170 ヴィーン モ ンティガッセ １ (72)発明者 プリリンゲル ハンス−ヨルグ オーストリア国 Ａ―3711 エベルスブル ン エベルスブルン 70 (72)発明者 ブライテンバッハ ミヒャエル オーストリア国 Ａ―5020 ザルツブルグ アルフレッド クビンストラッセ 11 ／11

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．配列１、３−５、７−９、１２、および１３もしくはこれらの配列の部 分領域と相同的に適合する核酸配列を有する、または緊縮条件で該核酸とハイブ リダイズする核酸配列を持っていることを特徴とする、アレルゲンＡｌｔａ５３ 、Ａｌｔａ２２およびＡｌｔａ１１の抗原性を有するポリペプチド、又はこれら のアレルゲンの少なくとも１つのエピトープを有するペプチドをコードする組み 換えＤＮＡ分子。 ２．前記配列１、３−５、７−９、１２、および１３から変性（縮重）によ って誘導することができる核酸配列を有することを特徴とするクレーム１に記載 の組み換えＤＮＡ分子。 ３．抗原としてアレルゲンＡｌｔａ５３、Ａｌｔａ２２およびＡｌｔａ１１ と交差反応性があり、これらと高い相同性を示すポリペプチドをコードする核酸 配列を有することを特徴とするクレーム１または２に記載の組み換えＤＮＡ分子 。 ４．発現構成を付与する発現調節配列と機能的に結合されていることを特徴 とするクレーム１〜３に記載の組み換えＤＮＡ分子。 ５．クレーム４に記載の組み換え発現構成で形質転換されることを特徴とす るポリペプチドの発現のための宿主系。 ６．Ａｌｔａ５３、Ａｌｔａ２２若しくはＡｌｔａ１１又はこれらのタンパ ク質のエピトープの少なくとも１つの抗原性を有することを特徴とするクレーム １〜３のいずれかに記載のＤＮＡ由来の組み換え又は合成によるタンパク質又は ポリペプチド。 ７．前記配列１、３−５、７−９、１２、および１３と完全にまたは部分的 に対応するアミノ酸配列を有することを特徴とするクレーム６に記載の組み換え 又は合成によるタンパク質又はポリペプチド。 ８．アレルゲンＡｌｔａ５３、Ａｌｔａ２２若しくはＡｌｔａ１１又はこれ らの少なくとも１つのエピトープの抗原性と、付加的ポリペプチド部分とを有す る融合産物、 クレーム４に記載の発現構成のＤＮＡによりコードされている融合産物全体、 から構成されることを特徴とするクレーム６または７のいずれかに記載の組み換 え又は合成によるタンパク質又はポリペプチド。 ９．上記付加ポリペプチド部分がβ−ガラクトシダーゼ又は他の融合に適し たポリペプチドであることを特徴とするクレーム８に記載の組み換え又は合成に よるタンパク質又はポリペプチド。 １０．クレーム６〜９のいずれかに記載の合成によるタンパク質又はポリペ プチドを含有することを特徴とする診断または治療用試薬。 １１．患者の血清中のＩｇＥ抗体とクレーム６〜９のいずれかに記載の組み 換え又は合成によるタンパク質又はポリペプチドとの反応を測定することを特徴 とするアレルゲンＡｌｔａ５３、Ａｌｔａ２２又はＡｌｔａ１１に対する患者の アレルギーをインビトロで検出する方法。 １２．クレーム６〜９のいずれかに記載の組み換え又は合成によるタンパク 質又はポリペプチドが細胞反応の刺激又は阻害に使用されることを特徴とするア レルゲンＡｌｔａ５３、Ａｌｔａ２２又はＡｌｔａ１１に対する細胞反応 をインビトロで検出する方法。