JPH09501657A

JPH09501657A - テンプレートアセンブル合成タンパク質

Info

Publication number: JPH09501657A
Application number: JP7506615A
Authority: JP
Inventors: イー．ドウソン，フィリップ; ビー．エイチ．ケント，ステファン
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1993-08-11
Filing date: 1994-08-11
Publication date: 1997-02-18
Also published as: EP0804215A1; ATE209658T1; CA2169284A1; AU678524B2; EP0804215B1; AU7564394A; DE69429287D1; WO1995004543A1; EP0804215A4

Abstract

(57)【要約】複雑なペプチド合成への化学選択的連結反応アプローチがテンプレートアセンブル合成タンパク質（ＴＡＳＰ）分子の簡単、便利な製造に採用された。保護されていない形態での、容易に合成される合成プロヘリカルペプチド−αＣＯＳＨ分子と、これも保護されていない形態での合成（ＢｒＡｃ）₄テンプレートペプチド分子との反応は、水溶液中、迅速に進行し、均質な生成物を高収率で与える。得られたＴＡＳＰ分子は、単に精製して均質とすることができる。構造的均質性がイオンスプレ質量分析によって証明される。保護されていないペプチドの化学選択的連結反応は、ＴＡＳＰ分子の合成に対する一般的アプローチとなる。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称テンプレートアセンブル合成タンパク質技術分野本発明は、枝分かれした、またはデンドリティック（樹枝状）ペプチドの合成に関する。さらに詳しくは、本発明は化学選択的連結法を用いるテンプレートアセンブル合成タンパク質（ＴＡＳＰ）分子の合成ならびにψ（ＣＯ−Ｓ−ＣＨ₂ −ＣＯ−ＮＨ）構造を有するデンドリティック結合単位を採用するＴＡＳＰ類に関する。背景技術エミールフィッシャーの時代から、タンパク質を設計および化学的に合成することは有機化学者の目標であった。タンパク質、特にヘリックスバンドル（らせん束形）タンパク質を新規に設計することおよび化学合成または組換えＤＮＡ発現でそれらを製造することに、近年興昧が高まってきた。新規に設計されたヘリックスバンドルタンパク質の例は、次の人々により報告されている。Ｍ．ヘクトら（サイエンス，２４９巻，８８４〜８９１頁，１９９０年）、Ｌ．レーガンら（サイエンス，２４１巻，９７６〜９７８頁，１９８８年）、Ｗ．Ｆ．デグラードら（サイエンス，２４３巻，６２２〜６２８頁，１９８９年）およびＮ．Ｅ．チョーら（バイオケミストリ，３１巻，５７３９〜５７４６頁，１９９２年）。幾つかの場合では、非共有結合分子間会合の制御不可能な性質のために、合成ヘリックスバンドルの実験的に観察された構造が目的とする構造と異なっているという予期されない結果が得られてきた。たとえば、Ｂ．ラブジョイら（サイエンス，２５９巻，１２８８〜１２９３頁，１９９３年）を参照。このような問題を避けるために、ヘリックスバンドルタンパク質は、ポルフィリン分子または金属キレート錯体を介して結合された共有結合アレイを合成することによって作られてきた。予備的な証拠は、期待された構造が達成されたことを示唆している。たとえばＴ．ササキら（ジャーナルオブアメリカンケミカルソサエティ，１１１巻，３８０〜３８１頁，１９８９年）およびＲ．Ｍ．ガジリら（ジャーナルオブアメリカンケミカルソサエティ，１１４巻，４０００〜４００２頁，１９９２年）を参照。予め決定された２次および３次構造の共有結合ペプチドアレイを合成する別途の初期のアプローチは「テンプレートアセンブル（鋳型組立）合成タンパク質」（ＴＡＳＰ）という概念であり、これはＭ．ムッター（ペプチドケミストリーアンドバイオロジー，プロシーディングスオブテンスアメリカンペプチドシンポジウム；Ｇ．Ｒ．マーシャル編；エスコム，ライデン，３４９〜３５３頁，１９８８年）に開示されている。テンプレート分子が２次構造要素のアレイを共有結合的にアンカーするのに用いられる。ＴＡＳＰアプローチの顕著な特徴は、用いられる非線形トポロジーである。すなわち、分子は天然タンパク質の折り畳まれた直線状ポリペプチド鎖よりむしろ分岐されたポリペプチドのアレイから成る。たとえば、Ｍ．ムッターら（アンゲバンデケミーインターナショナルエデイションイングリッシュ，２８巻，５３５〜５５４頁，１９８９年）を参照。このエレガントな概念は、タンパク質の新規設計に強い影響があるであろうと予期される。しかしながら、ＴＡＳＰ分子集合体を合成するための従来の合成アプローチは困難であるか、そして／または低収率を与える。たとえば、段階的固相合成（ＳＰＰＳ）および保護されたセグメント縮合反応アプローチの両方が限られた成功の範囲内で用いられてきた。Ｍ．ムッターら（ジャーナルオブアメリカンケミカルソサエティ，１１４巻，１４６３〜１４７０頁，１９９２年）には、テンプレートアセンブル合成タンパク質の段階的固相合成（ＳＰＰＳ）の一例が開示されている。さらに、Ｂ．ドルナーら（イノベーションアンドパースペクティブズインソリッドフェイズシンセシス；固相合成の技術革新および展望，ロジャーエプトン編，インターセプトリミテッド，アンドーバー，１６３〜１７０頁，１９９２年）およびＩ．アーネストら（テトラヘドロンレターズ，３１巻，４０１５〜４０１８頁、１９９０年）には、テンプレートアセンブル合成タンパク質を合成するための保護されたセグメント縮合反応アプローチの例が開示されている。最小数のＴＡＳＰ分子のみが困難な合成努力によって製造されてきた。たとえば、前記文献およびＭ．ムッターら（プロテインズ，５巻，１３〜２１頁，１９８９年）およびＧ．ツヒシュラーら（プロテインサイエンス，１巻，１３７７〜１３８６頁，１９９２年）を参照。これらの合成の幾つかが実行された際に伴う見事な注意にもかかわらず、定義された共有結合組成物の均質的な分子種としてのＴＡＳＰの製造に関しては、未だ疑問が残る。疑う余地のない具合に、これらの分子を簡便に、直接的に、一般的に合成することは、非常な利用価値があるであろう。最近、Ｍ．シュノルツァーは、未変性（すなわち直線状）のトポロジーを有するタンパク質類似体の全化学合成の１つの方法として、保護されていないペプチドセグメントの化学選択的連結法を導入した（サイエンス，２５６巻，２２１〜２２５頁，１９９２年）。このアプローチは、全く保護されていないペプチドセグメントから長鎖の分子を共有結合的に組み立てるために、１つのタイプが各セグメント上にある、特異な、相互に反応性のある官能基を用いる。このようにして、保護されていないペプチドを合成し、取り扱い、精製し、および同定することができる能力を最大限に利用している。溶解性の問題が軽減され、そして標的分子が最終的に保護されていない状態で直接製造される。発明の開示本発明は、ＴＡＳＰ分子の合成において化学選択的連結アプローチを利用する。用いられたアプローチは図式１に示される。ＴＡＳＰは短い保護されていないペプチドセグメントから組み立てられ、それらは標準的な方法によって回りくどくない様式で合成され、そして、高い均質性の水準まで容易に精製される。標的とする４−ヘリックス（らせん）ＴＡＳＰ分子は、ムッター（テトラヘドロン，４４巻，７７１〜７８５頁，１９８８年）の研究に基づいて設計された。最終的な分子は、総数で４コピーのらせん形成ペプチド１を含み、その１つのコピーがテンプレート分子中の４つのリシン残基の各々の側鎖についている。テンプレート分子２は、逆向き回転構造の形成を容易ならしめるために、およびそうすることによってらせん形成ペプチドの会合を促進するために、中央部にＧｌｙ−Ｐｒｏ配列を含む。図面の簡単な説明図１（Ａ）および（Ｂ）は、ＴＡＳＰ合成に用いられる保護されていない合成ペプチドの例を示す。図１（Ａ）は、チオエステル樹脂上でＳＰＰＳによって合成された１４残基から成るプロヘリックスペプチドチオカルボキシレート１を示す。図１（Ｂ）は側鎖の差別的修飾を許容するようにＮ^αＢｏｃ保護基および塩基そして酸不安定な側鎖保護基を用いるＳＰＰＳ法によって合成された９残基から成るペプチドテンプレート２を示す。工程（ｉ）はＤＭＦ中５０％ピペリジンを用いる。工程（ii）はＤＣＭ中ブロモ無水酢酸を用いる。工程（iii）は０℃ で１時間、フッ化水素／１０％ｐ−クレゾールを用いる。詳細は「原料および製造方法」の欄に記載されている。図２（Ａ）および（Ｂ）は、プロ−ヘリックスペプチド−αチオカルボキシレート１と（ＢｒＡｃ）テンプレートペプチド２とのｐＨ５で、水性溶液中での反応を示す。図２（Ａ）は反応５時間後の反応混合物の分析ＨＰＬＣを示す。反応剤、すなわち枝ペプチド１およびテンプレートペプチド２の位置および出発量は破線のピークで表される。生成物４−ヘリックスＴＡＳＰ３は実線で表される。少量の成分は、イオンスプレー質量分析（ＭＳ）によって同定された。ピークａは、α チオカルボキシレートの加水分解によって形成されたプロヘリックスペプチド αカルボシキレートである。ピークｂは、（プロヘリックス）₃（ＢｒＡｃ）₁テンプレートである。ピークｃは空気酸化によって形成された２量体（プロヘリックス−^αＣＯＳ−）₂である。図２（Ｂ）は、７０分後の反応混合物の分析ＨＰＬＣを示す。生成物はラベルされ、そして上記のように同定された。図３（Ａ）は、ＨＰＬＣで精製したピーク３のイオンスプレー質量分析を示す。データそのものが示されている。多重電荷状態はすべて分子量６６４７ドルトンを有する単一の分子種のプロトン化に由来する。ＨＰＬＣフラクション中、他の目立つ種は検出されなかった。図３（Ｂ）は、すべての生の質量分析データを単一電荷状態に再構築したものを示す。図４は、ＨＰＬＣで精製した４−ヘリックスＴＡＳＰ生成物３（実線）の水溶液中の円２色性スペクトルを示す。２２０ｎｍ、２０８ｎｍでの特徴的な最小値および１９３ｎｍでの最大値は結合ＴＡＳＰの高いらせん成分を示唆する。同一の条件下で、プロ−ヘリックスペプチド１（点線）はらせん構造を示唆しない弱い特徴のないスペクトルを与えた。発明を実施するための最良の実施の形態本発明は、ψ（ＣＯ−Ｓ−ＣＨ₂−ＣＯ−ＮＨ）構造を有するデンドリティック結合を採用するテンプレートアセンブル合成タンパク質（ＴＡＳＰ）に関する。さらに詳しくは、ＴＡＳＰは上に示したデンドリティック結合単位を用いてお互いに結合された少なくとも１つのテンプレートペプチドおよび１つの枝ペプチドを含む。テンプレートペプチドは、アミノ基、好ましくはリシン基を持つテンプレート側鎖を備える少なくとも１つのアミノ酸残基を含む。テンプレートペプチドは、アミノ基を持つリシンまたは他の側鎖を介してデンドリティック結合単位にカップリングされる。枝ペプチドは、そのＣ末端を介してデンドリティック結合単位にカップリングされる。本発明の重要な側面は、テンプレートペプチドおよび枝ペプチド間の化学選択的結合、すなわちテンプレート側鎖のアミノ基を介して枝ペプチドのＣ末端をテンプレートペプチドにカップリングするψ（ＣＯ −Ｓ−ＣＨ₂−ＣＯ−ＮＨ）構造である。デンドリティック結合単位は模式的に以下のように例示される。枝ペプチド−ψ（ＣＯ−Ｓ−ＣＨ₂−ＣＯ−ＮＨ）−テンプレート側鎖−−テンプレートペプチドこのアンサンブル（集合体）がテンプレートアセンブル合成タンパク質（ＴＡＳＰ）を形成する。好適な発明の実施の形態において、枝ペプチドはプロ−ヘリカル（前らせん）ペプチドであり、テンプレートアセンブル合成タンパク質（ＴＡＳＰ）に取り込まれ、そしてらせん促進条件に晒されることによりらせん配置を取ることが可能である。好適な枝ペプチドは下記の配列を有する。すなわち、配列１； ⁺ＮＨ₃−Ｄ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｎ−Ａ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｇ−ＣＯＳ − 上記の枝ペプチドはプロ−ヘリカルペプチドであり、テンプレートアセンブル合成タンパク質（ＴＡＳＰ）に取り込まれ、そしてらせん促進条件にさらされることにより、らせん配置を取ることが可能である。ＴＡＳＰは、ただ１つの枝ペプチドまたは多数の枝ペプチドを含んでもよい。好適なＴＡＳＰは、配列１を有する４つの枝ペプチドを含む。多数の枝ペプチドが用いられるとき、各々の枝ペプチドはそれ自身のデンドリティック結合単位を介してテンプレートペプチドにカップリングされる。好適なテンプレートペプチドは、下記の配列、すなわち配列２を有する： ⁺ＮＨ₃−Ｋ（Ａｃ−）−Ｋ（⁺ＮＨ₃）−Ｋ（Ａｃ−）−Ｐ−Ｇ− Ｋ（Ａｃ−）Ｅ（ＣＯＯ^-）Ｋ（Ａｃ−）−Ｇ−ＣＯＯ^- （前記でＫ（Ａｃ−）はアセチル化されたアミノ基を備えるリシン側鎖を有するリシンアミノ酸残基を表す）。本発明は、またテンプレートアセンブル合成タンパク質（ＴＡＳＰ）の製造方法をも意図する。製造方法は下記の工程から成る。工程Ａ：ハロアセチル官能基に結合されたアミノ基を含む側鎖を有するアミノ酸残基を含む保護されていないテンプレートペプチドを提供すること；工程Ｂ：そのＣ末端に各々^αＣＯＳＨ部分を有する保護されていない枝ペプチドを提供すること、そしてそれから工程Ｃ：化学選択的に枝ペプチドをテンプレートペプチドに結合し、そしてテンプレートアセンブル合成タンパク質（ＴＡＳＰ）を形成するために、枝ペプチドの^αＣＯＳＨ部分とテンプレート分子のハロアセチル官能基との間の置換反応を促進する求核反応条件下において、前記工程Ａからの保護されていないテンプレートペプチドと前記工程Ｂからの保護されていない枝ペプチドを化合（混合）すること。前記製造方法の好適な実施の形態において、工程Ａのテンプレートペプチドのハロアセチル官能基は、リシン側鎖のアミノ基についたブロモアセチル基である。工程Ｃで、枝ペプチドの^αＣＯＳＨ部分およびテンプレート分子のブロモアセチル基が求核置換反応を行ったときにデンドリティック結合が形成されて、次の構造、すなわち： ψ（ＣＯ−Ｓ−ＣＨ₂−ＣＯ−ＮＨ）を有するデンドリティック結合を創生する。ＴＡＳＰの製造方法の好適な実施の形態は、組立てが完了した後、反応生成物をらせん促進条件に晒して、枝ペプチドの配座をらせん配座に変化させるための付加的な工程を含んでもよい。実施例適当ならせん促進条件のもと、１３の残基から成る両親媒性のらせんを形成することを目的とする、合成ペプチド１を付加的なＣ末端−Ｇｌｙ^αＣＯＳＨを有するように合成した（図１Ａ）。このプロヘリックスペプチドを、ブロモアセチル部分を含むように修飾した４つのリシン側鎖を有するテンプレートペプチド２と反応した（図１Ｂ）。ペプチド類は、発表された方法に基づいてマニュアル段階的固相法に従って化学的に合成した。たとえばＳ．Ｂ．ケント（アニュアルレビューバイオケミストリー，５７巻，９５７〜９８９頁，１９８８年）およびＭ．シュノルツァーら（インターナショナルジャーナルペプチドプロテインリサーチ，４０巻，１８０〜１９３頁，１９９２年）を参照。チオエステル樹脂からのプロヘリックスペプチドの酸加水分解はペプチド−^αＣＯＳＨ１を生成する。たとえば、Ｊ．ブレーク（インターナショナルジャーナルペプチドプロテインリサーチ，１７巻，２７３〜２７４頁，１９８１年）およびＤ．ヤマシロ（ジャーナルインターナショナルジャーナルペプチドプロテインリサーチ，３１巻，３２２頁，１９８８年）を参照。塩基不安定および酸不安定な保護基の組合せを用いて、５つのリシン側鎖のうち４つをブロモアセチル基で修飾したテンプレート分子２を生成した（図１Ｂ）。たとえば、Ｒ．Ａ．ロビら（アナリティカルバイオケミストリー，１７７巻，３７３〜３７７頁，１９８９年）を参照。２つのペプチドに存在する反応基の範囲については、図１に示されている。プロヘリックスペプチド１の^αＣＯＳＨ部分およびテンプレート分子２のブロモアセチル官能基間の求核反応によって、所望の様式で保護されていないペプチドを単に結合した。反応は、ｐＨ５．０で、水性緩衝液中、環境温度で数時間かかってきれいに進行し、ほとんど定量的収率の４−ヘリックスＴＡＳＰ分子３（図２Ａ）を与えた。反応は、反応混合物の直接イオンスプレー質量分析、および分析ＨＰＬＣによって追跡した。たとえば、Ｍ．シュノルツァー（アナリティカルバイオケミストリー，２０４巻，３３５〜３４３頁，１９９２年）を参照、塩類は一般的に蒸発イオン化工程を邪魔するが、本実施例で用いた希酢酸アンモニウム緩衝液は合成ペプチドの直接イオンスプレー質量分析と適合性があった。過剰のペプチド−^αＣＯＳＨ成分１を用いた、そして最終反応混合物には、完全に（ＢｒＡｃ）₄テンプレート分子２が欠落していた。連結反応はＨＰＬＣ追跡したところ非常に速やかに進行した。ちょうど７０分後、反応はほとんど完全なまで進行した（図２Ｂ）。標的とする４−ヘリックスＴＡＳＰ３に加えて、他の検出できる成分は残留する過剰なプロ−ヘリックス−^αＣＯＳＨ１、残留量の（プロ−ヘリックス）₃（ＢｒＡｃ）₁テンプレート、および痕跡量のプロ−ヘリックス−^αＣＯＯＨおよび（プロ−ヘリックス−^αＣＯＳ−）₂２量体のみであった。検知できたただ１つの反応中間体が（プロ−ヘリックス）₃（ＢｒＡｃ）₁テンプレートであったということはかなり興昧がある。所望の生成物は、容易にＨＰＬＣで精製され、そして凍結乾燥されて白色固体を与えた。これはイオンスプレー質量分析（図３）で同定され、そして期待される質量、すなわち観測分子量が６６４７．１±２．８ドルトンを有する高純度の標的とする４−ヘリックスＴＡＳＰ３であることが見いだされた。一方、単一同位体組成（モノアイソトーピック）Ｃ₂₈₈Ｈ₅₀₃Ｎ₈₂Ｏ₈₈Ｓ₄についての計算分子量は６６４５．６であり、平均的な同位体組成を有するＣ₂₈₈Ｈ₅ ₀₃ Ｎ₈₂Ｏ₈₈Ｓ₄についての計算分子量は６６４９．９である。連結された４−ヘリックスＴＡＳＰ３は、ｐＨ５．０、１０ｍＭ酢酸アンモニウム中で環境温度で何日も安定であり、そしてｐＨ６．０、４℃で無期限に安定であった。連結ＴＡＳＰ分子３の水中での２次構造を決定するために円２色性スペクトロスコピーを用いた。分子は高度にらせん状であった（図４）。同一の条件下で、ペプチド１を比較試験したところらせん成分を全然示さなかった。これらの配座的特性は周知の方法（上記参照）で合成された密接に関係のある４−ヘリックスＴＡＳＰで観察された性質に似通っていた。未変性の条件でのイオンスプレー質量分析は、４−ヘリックスＴＡＳＰがモノメリック（単一）種としてあることを示した。たとえば、Ｍ．バッカら（ジャーナルアメリカンケミカルソサエティ，１１４巻，３９９２〜３９９３頁，１９９２年）を参照。この合成アプローチの圧倒的な特徴は、その簡便さである。連結反応は水溶液で迅速に進行し、そして実質的に、他の反応生成物が検出されなかった。生成物は容易に精製されて提案された共有結合的構造と一致する質量数を有する例外的に均質な物質を与えた。観測されたらせん２次構造は、標的４−ヘリックスＴＡＳＰ分子３の生成と一致した。化学選択的連結反応アプローチの主な利点は、最終生成物において微小な不均質性の除去およびアプローチの一般性を含む。段階的固相合成によってテンプレート上で同時に積み上げられたペプチドは大変不均質な粗生成物を与える。ムッターおよび共同研究者は、最終生成物の純度を増加させるために厳密なクロマト手法を用いることを示した（上記参照）。しかしこれらのプロトコールは、モンタールおよび共同研究者（プロシーディングナショナルアカデミーサイエンス，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８８巻，６４１８〜６４２２頁，１９９１年）によって合成されたより大きいそしてより疎水性イオンチャンネル会合体には適用されなかった。保護されたペプチドセグメントのセグメント縮合法が不均質性を減少させるために用いられてきたが、溶解度の問題によって連結反応が極端に遅くなり、その結果として収率が低い。デグラートおよび共同研究者の最近の研究は、保護されていないペプチドセグメントを用いた、しかしながら、これは連結反応がすべての官能基グループ、特にリシンのε−アミノ基と適合性がないことから適用が限られている。（ジャーナルアメリカンケミカルソサエティ，１１４巻，９６５６〜９６５７頁，１９９２年）。これらのアプローチと比較して、化学選択的連結反応アプローチは保護されていないペプチド成分の精製を容易にし、それらは迅速でかつ清浄な反応において高濃度で連結することができる。標的化合物は、最終的に保護されていない形態で直接得られ、そして容易に精製される。本方法は、化学的にペプチドおよびタンパク質で見いだされるすべての官能基グループと適合性があることから、一般的適用性がある（サイエンス，２５６巻，２２１〜２２５頁，１９９２年）。以前の研究で本発明者らは、精製された保護されていないペプチドはたとえば６Ｍグアニジン塩酸塩または有機−水溶性混合液のような溶媒中、正しく連結され得ることを示した。迅速な反応のために必要な溶解度を維持するようにプロ−ヘリックス配列および溶媒条件を選択するにおいて、これは非常な融通性を許容する。原料および製造方法分析およびセミプレパラティブ勾配ＨＰＬＣは、ＶｙｄａｃＣ−１８分析カラム（５ミクロン、０．４６×１５ｃｍ）およびセミプレパラティブ（１０ｍ、１．０×２５ｃｍ）カラムを用いて、２１４ｎｍＵＶ検出でＲａｉｎｉｎ２０ポンプ高圧混合システムで実施した。分析試験は、０％〜６７％Ｂ勾配液を３０分間にわたって１ｍｌ／分で用い、そこで緩衝液Ａは水中、０．１％ＴＦＡであり、緩衝液Ｂは９０％アセトニトリル＋１０％緩衝液Ａであった。質量分析スペクトルは、ＳｃｉｅｘＡＰＩ−ＩＩＩ４重極イオンスプレー質量分析計で得た。ＣＤ測定はＡｖｉｖ６２ＤＳ機を用いて得られた。ペプチド濃度は、１１０℃で、２４時間、６Ｎ塩酸中加水分解後、アミノ酸分析によって決定した。プロ−ヘリックスペプチド１の合成特記する以外は、公表された手法に従ってマニュアル段階的固相法を用いてペプチドの合成を行った。たとえばＳ．Ｂ．ケント（アニュアルレビューバイオケミストリー，５７巻，９５７〜９８９頁，１９８８年）およびＭ．シュノルツァーら（インターナショナルジャーナルペプチドプロテインリサーチ，４０巻，１８０〜１９３頁，１９９２年）を参照。カップリング収率をニンヒドリン定量で追跡した。プロ−ヘリックスは、標準的なＮ^αＢｏｃ化学ＳＰＰＳを用いて、Ｇｌｙチオエステル樹脂上で合成した。たとえば、Ｊ．ブレーク（インターナショナルジャーナルペプチドプロテインリサーチ，１７巻，２７３〜２７４頁，１９８１年）およびＤ．ヤマシロ（ジャーナルインターナショナルジャーナルペプチドプロテインリサーチ，３１巻，３２２頁，１９８８年）を参照。０℃で、１時間フッ化水素プラス２％アニソールと処理することにより、ペプチドから保護基を取り除き、そして同時に樹脂から開裂させた。粗ペプチドをニートＴＦＡ中に取り、二重蒸留水で０．５％ＴＦＡに希釈し、そして残留するアニソールを除去するために凍結乾燥した。プロ−ヘリックスをセミプレパラティブ逆相ＨＰＬＣ（０％〜６７％緩衝液Ｂ、６０分間，３ｍｌ／分）で精製し、そしてイオンスプレー質量分析で同定した。観測された分子量は、１３７２．２±０．４ドルトンであった。一方、計算分子量は単一同位体組成で、１３７１．８ドルトン、または平均同位体組成で１３７２．６ドルトンである。テンプレートペプチド２の合成テンプレートペプチドは、Ｇｌｙ−ＯＣＨ₂−Ｐａｍ−樹脂上で、Ｎ^αＢｏｃ化学ＳＰＰＳおよびＮ^αＦｍｏｃリシン側鎖保護を組合せ用いて合成した（図１Ｂ）。早過ぎるＦｍｏｃ除去の可能性を最小にするために、カップリング工程での溶液中の中和反応よりむしろ、５％ジイソプロピルエチルアミン／ＤＭＦでの別途の短い中和反応を用いた。たとえば、Ｍ．ジュノルツァーら（インターナショナルジャーナルペプチドプロテインリサーチ，４０巻，１８０〜１９３頁，１９９２年）を参照。９回の合成サイクルに続いて、リシン側鎖上のＳｍｏｃ保護基を５０％ピペリジン／ＤＭＦとの５分間処理を２回行って除去した。遊離ｅアミノ基をブロモー酢酸／ＤＩＣカップリング法を用いてブロモアセチル化した。たとえばＲ．Ａ．ロービーら（アナリティカルバイオケミストリー，１７７巻，３７３〜３７７頁，１９８９年）を参照。ペプチドを脱保護基化し、そして標準プロトコールを用いて０℃で１時間、フッ化水素プラス１０％ｐ−クレゾールで開裂した。たとえばＭ．シュノルツァーら（インターナショナルジャーナルペプチドプロテインリサーチ，４０巻，１８０〜１９３頁，１９９２年）を参照。テンプレートをそれからセミプレパラティブ逆相ＨＰＬＣ（２５％〜４１％緩衝液Ｂ、３０分間，３ｍｌ／分）で均質になるまで精製した。そしてイオンスプレー質量分析で同定した。すなわち、観測分子量は１４８２．７ ±０．４ドルトンであった。一方、計算分子量は１４７８．３ドルトン（単一同位体組成）または１４８３．０ドルトン（平均同位体組成）である。４−ヘリックスＴＡＳＰ３の合成０．５０ｍｇの（ＢｒＡｃ）₄テンプレート（化学式量：１４８４ドルトン、３．３６×１０^-7Ｍ、１．１２ｍＭ）および２．７５ｍｇのプロヘリックス−^α ＣＯＳＨ（化学式量：１３７２ドルトン、２．０×１０^-6Ｍ、６．６８ｍＭ）を２３℃で、３００μｌの１０ｍＭ酢酸アンモニウム水性緩衝液（ｐＨ５．０）中、混合することにより連結反応を実施した。反応を分析逆相ＨＰＬＣ（４μｌアリコート）で追跡した。紫外線吸収に基づいてピークを集め、そしてイオンスプレー質量分析で調べた。たとえば、Ｍ．シュノルツァー（アナリティカルバイオケミストリー，２０４巻，３３５〜３４３頁，１９９２年）を参照。２３℃で６．５時間の後、反応混合物を４．０℃で貯蔵した。生成物（１７０μｌの反応混合物）を逆相ＨＰＬＣ（３８％〜５４％、緩衝液Ｂ．３０分間，３ｍｌ／分）で精製し、そして凍結乾燥すると、０．２６ｍｇの純生成物が得られた。理論収率は、１．２７ｍｇで、２０．５％であった。質量をイオンスプレー質量分析で決定した。すなわち観測分子量は６６４７．１±２．８ドルトンであった。一方、計算分子量は６６４５．６ドルトン（単一同位体組成）または６６４９．９ドルトン（平均同位体組成）である。安定性安定性は集めたピークを分析逆相ＨＰＬＣおよび質量分析計で追跡して調べた。連結反応から得られた１ｍＭ４−ヘリックスＴＡＳＰは数日間分解することなしに２３℃で貯蔵された。５ｍＭ４−ヘリックスＴＡＳＰを１００ｍＭ燐酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）中に貯蔵したところ、４℃で７日間の後、分解を全く示さなかった。円２色性プロヘリックス（７．５μＭ）および４−ヘリックスＴＡＳＰ（１．７８μモル）の両方を２回蒸留した水中に溶解した。測定は、２０．０℃で光路長１ｃｍの２ｍｌセルで、２６０ｎｍ〜１９０ｎｍにかけて０．５０ｎｍ毎にスキャンすることにより行った。結論上記の結果は、ＴＡＳＰ類似巨大分子の合成の一般的方法としての化学選択的連結反応アプローチの重要性を示唆している。既知の化学的戦略を組合せることによって、各種のＴＡＳＰ関連化合物の設計および合成に用いることができる保護されていないペプチド構築ブロックへ反応性部分を選択的に導入することに対して非常な融通性を提供する。特に、ここで記載されたチオエステル求核連結化学方法は、タンパク質の断片を結合するために元来開発された他の連結化学反応と組合せて非常に多様性のある非直線状共有結合分子トポコロジーを生み出すのに用いることができる。たとえばＫ．ローズら（バイオコンジュゲートケミストリー，２巻，１５４〜１５９頁，１９９１年）およびＨ．ゲートナーら（バイオコンジュゲートケミストリー，３巻，２６２〜２６８頁，１９９２年）を参照。現代タンパク質分析化学と一緒に用いると、化学選択的合成アプローチは、タンパク質関連巨大分子の設計、配座の研究および活性に対して強力な補助手段となる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ケント，ステファンビー．エイチ. アメリカ合衆国カリフォルニア州 92037 ラホヤファモーサアベニュー 6046

Claims

【特許請求の範囲】１．ψ（ＣＯ−Ｓ−ＣＨ₂−ＣＯ−ＮＨ）構造のデンドリティック結合単位を有することを特徴とするテンプレートアセンブル合成タンパク質（ＴＡＳＰ）。２．さらにψ（ＣＯ−Ｓ−ＣＨ₂−ＣＯ−ＮＨ）構造を有する４つのデンドリティク結合単位と、各々が⁺ＮＨ₃−Ｄ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｎ−Ａ−Ｌ− Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｇ−ＣＯＳ−配列を有する４つの枝ペプチドと、⁺ＮＨ₃−Ｋ（Ａｃ −）−Ｋ（⁺ＮＨ₃）−Ｋ（Ａｃ）−Ｐ−Ｇ−Ｋ（Ａｃ−）−Ｅ（ＣＯＯ^-）−Ｋ（Ａｃ−）−Ｇ−ＣＯＯ^-配列を有するテンプレートペプチドとを含んで成り、かつ前記４つの結合単位が前記枝ペプチドを前記テンプレートペプチドの４つのＫ（Ａｃ）残基にカップリングすることを特徴とする請求項１記載のテンプレートアセンブル合成タンパク質（ＴＡＳＰ）。３．Ｃ末端を持つ枝ペプチドと、アミノ基を含むテンプレート側鎖を備えるアミノ酸残基を含むテンプレートペプチドとを有する改良型テンプレートアセンブル合成タンパク質において、 ψ（ＣＯ−Ｓ−ＣＨ₂−ＣＯ−ＮＨ）構造を有する連結単位が、前記枝ペプチドのＣ末端を下記のテンプレート側鎖のアミノ基を介して、前記テンプレートペプチドにカップリングし：枝ペプチド−ψ（ＣＯ−Ｓ−ＣＨ₂−ＣＯ−ＮＨ）−テンプレート側鎖−− テンプレートペプチド、かつ枝ペプチドがテンプレートペプチド上の枝としての役割を果たし、テンプレートアセンブル合成タンパク質を形成することを特徴とする改良型テンプレートアセンブル合成タンパク質（ＴＡＳＰ）。４．前記テンプレートペプチドのテンプレート側鎖がリシンアミノ酸残基に対応するリシン側鎖である請求項３記載の改良型テンプレートアセンブル合成タンパク質（ＴＡＳＰ）。５．前記枝ペプチドがプロヘリカルペプチドであり、テンプレートアセンブル合成タンパク質（ＴＡＳＰ）に組込まれ、そしてらせん促進条件に晒らされると、らせん配置を取ることが可能である請求項３記載の改良型テンプレートアセンブル合成タンパク質（ＴＡＳＰ）。６．枝ペプチドが、各々Ｃ末端を持つ第１の枝ペプチドおよび第２の枝ペプチドを含み、そしてテンプレートペプチドがアミノ基を含む第１のテンプレート側鎖を有する第１アミノ酸残基と、アミノ基を含む第２のテンプレート側鎖を有する第２アミノ酸残基とを含み、さらに前記結合単位が各々ψ（ＣＯ−Ｓ−ＣＨ₂ −ＣＯ−ＮＨ）構造を持つ第１結合単位および第２結合単位を含み、第１結合単位が前記第１枝ペプチドのＣ端末を、第１テンプレート側鎖を介して、前記テンプレートペプチドにカップリングする役割を果たし、第２結合単位が第２枝ペプチドのＣ末端を、第２テンプレート側鎖を介して、前記テンプレートペプチドにカップリングする役割を果たし、それによって第１および第２枝ペプチドがテンプレートペプチド上で第１および第２の枝部として働き、２つの枝部を有するテンプレートアセンブル合成タンパク質を形成することを特徴とする請求項３記載の改良型テンプレートアセンブル合成タンパク質（ＴＡＳＰ）。７．前記第１および第２枝ペプチドがともにプロヘリカルペプチドであり、テンプレートアセンブル合成タンパク質（ＴＡＳＰ）に組込まれ、そしてらせん促進条件に晒らされると、らせん配置を取ることが可能である請求項６記載の改良型テンプレートアセンブル合成タンパク質（ＴＡＳＰ）。８．工程Ａ：ハロアセチル官能基に結合されたアミノ基を持つテンプレート側鎖を有するアミノ酸残基を含むテンプレートペプチドを提供すること；工程Ｂ：各ペプチドが^αＣＯＳＨ部分を持つＣ末端を含む１つまたはそれ以上の枝ペプチドを提供すること；そして工程Ｃ：化学選択的に枝ペプチドをテンプレートペプチドに結合し、そしてテンプレートアセンブル合成タンパク質（ＴＡＳＰ）を形成するために、枝ペプチドの^αＣＯＳＨ部分と、テンプレート分子のハロアセチル官能基との間の置換反応を促進する求核反応条件下において、前記工程Ａからのテンプレートペプチドと前記工程Ｂの１つまたはそれ以上の枝ペプチドを化合すること；以上の工程を含んでなることを特徴とするテンプレートアセンブル合成タンパク質（ＴＡＳＰ）を製造する方法。９．前記工程Ａにおいて、ハロアセチル官能基がブロモアセチル官能基である請求項８記載のテンプレートアセンブル合成タンパク質（ＴＡＳＰ）を製造する方法。 10．前記工程Ａにおいて、ハロアセチル官能基に結合されたアミノ基を持つテンプレート側鎖が、リシンアミノ酸残基に対応するリシン側鎖である請求項９記載のテンプレートアセンブル合成タンパク質（ＴＡＳＰ）を製造する方法。 11．前記工程Ｃにおいて、枝ペプチドのＣ末端がψ（ＣＯ−Ｓ−ＣＨ₂−ＣＯ −ＮＨ）構造を有する結合単位によってテンプレートペプチドのアミノ酸残基に結合され、テンプレートアセンブル合成タンパク質（ＴＡＳＰ）を形成する請求項８記載のテンプレートアセンブル合成タンパク質（ＴＡＳＰ）を製造する方法。 12．前記工程Ｂにおいて、枝ペプチドがプロヘリカルペプチドであり、テンプレートアセンブル合成タンパク質（ＴＡＳＰ）に組込まれ、そしてらせん促進条件に晒らされると、らせん配置を取ることが可能であり、そして、工程Ｃと同時かその後で、工程Ｄ：枝ペプチドによるらせん形成を促進するために、前記工程Ｃで形成されたテンプレートアセンブル合成タンパク質（ＴＡＳＰ）をらせん促進条件に晒すこと、をさらに含む請求項８記載のテンプレートアセンブル合成タンパク質（ＴＡＳＰ）を製造する方法。