JPH09236609A - 走査型プローブ顕微鏡 - Google Patents

走査型プローブ顕微鏡

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JPH09236609A
JPH09236609A JP8042927A JP4292796A JPH09236609A JP H09236609 A JPH09236609 A JP H09236609A JP 8042927 A JP8042927 A JP 8042927A JP 4292796 A JP4292796 A JP 4292796A JP H09236609 A JPH09236609 A JP H09236609A
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JP
Japan
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embedding material
scanning
probe
specimen
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Pending
Application number
JP8042927A
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English (en)
Inventor
Tsutomu Kamiyama
勉 神山
Yoshiaki Hayashi
美明 林
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Olympus Corp
Original Assignee
Olympus Optical Co Ltd
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】 【課題】試料の正確な三次元画像を短時間で取得できる
走査型プローブ顕微鏡を提供する。 【解決手段】包埋材2は凍結され、その中に試料1を含
んでいる。この包埋材2は試料台4に挿入固定される。
試料台4の内部の空間内には液体窒素3が封入される。
回転アーム43は、その一端に包埋材2と試料1を薄く
削り取るためのカッター8を支持し、モーター10によ
り所定の角度範囲で揺動される。探針を自由端に備える
カンチレバー11は、ホルダー12を介して、その自由
端の変位を測定する変位センサーユニット13に取り付
けられる。変位センサーユニット13を支持するスキャ
ナー14は、粗動ステージ17に支持されたフランジ1
5に固定されている。コンピューター29は、装置全体
の制御、信号および画像の処理を行ない、その結果をモ
ニター30に表示する。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、試料、特に常温で
活性のある細胞等の生物試料をナノメートルオーダーの
分解能で観察し、三次元画像を形成する走査型プローブ
顕微鏡に関する。
【0002】
【従来の技術】走査型プローブ顕微鏡は、試料をナノメ
ートルのオーダーの分解能で観察できる装置であり、走
査型トンネル顕微鏡や原子間力顕微鏡などの総称であ
る。走査型トンネル顕微鏡は導電性の試料をナノメート
ルのオーダーで観察でき、原子間力顕微鏡は導電性の試
料に加えて絶縁性の試料もナノメートルのオーダーで観
察できる。
【0003】原子間力顕微鏡は、鋭く尖った探針を自由
端に持つカンチレバーを有している。探針と試料が接近
すると、探針先端と試料表面の原子間に相互作用すなわ
ち原子間力が働き、カンチレバーの自由端が変位する。
その変位量は探針先端と試料表面の間隔に依存する。探
針を試料表面に沿って走査するとともに、カンチレバー
の自由端の変位を測定することで、試料表面上の測定点
における高さ情報が得られ、位置情報と高さ情報とに基
づいて試料表面の凹凸像が得られる。
【0004】これとは別に、凍結させた生体試料をミク
ロトームで切断し、その薄片を電子顕微鏡で観察する技
術が実施されている。この場合、試料はオスミウム染色
などが施される。
【0005】また、同様の薄片試料を原子間力顕微鏡で
観察する技術も確立されている。この場合、試料に染色
等の処理を行なう必要はない。この観察により得られる
画像は試料の内部構造の断面つまり二次元的分布を表し
ている。
【0006】さらに、凍結試料を連続的に切断し、その
各薄片試料を光学顕微鏡または電子顕微鏡を用いて観察
し、その結果得られた多数の画像を重ね合わせて三次元
画像を形成しようとする試みが行なわれている。
【0007】
【発明が解決しようとする課題】この方法により試料の
三次元的構造を画像化するには、多数の薄片試料の二次
元画像に対して、その各々を正しい向きに揃えて重ねる
といった作業が強いられる。この作業は手作業により行
なわれ、多数の二次元画像を常に正しい向きで重ね合わ
せることは難しい。特に、僅かなスパイラルを持つ構造
に対しては、重ね合わせの向きを誤る確率が高い。ま
た、薄片化や処理による伸縮や剪断変形も起こり易くな
る。このような事情を考慮すると、三次元画像の構築に
は経験と多大な時間が必要な上に、得られた三次元画像
の正確さにも疑問が残る。本発明の目的は、試料の三次
元画像を正確に短い時間で構築できる走査型プローブ顕
微鏡を提供することである。
【0008】
【課題を解決するための手段】本発明による走査型プロ
ーブ顕微鏡は、探針と、探針を自由端に支持するカンチ
レバーと、カンチレバーの自由端の変位を測定する手段
と、試料表面に沿って探針を走査する手段と、測定手段
と走査手段から得られる位置情報と高さ情報とに基づい
て試料表面の画像を形成する手段と、試料を薄く削り取
る手段とを有しており、試料を削り取る毎に、新しく現
れた試料表面の画像を得る。このようにして得られる多
数の試料表面の画像を高さ方向に重ねて処理することに
より試料の三次元像が得られる。
【0009】上記構成において、より好ましくは、試料
は包埋材に包埋されており、削り取り手段は試料を包埋
材と共に削り取り、走査型プローブ顕微鏡は更に包埋材
を昇華させる手段を有している。
【0010】
【発明の実施の形態】以下、図面を参照しながら本発明
の実施の形態について説明する。図1に示されるよう
に、試料1は包埋材2の中に包埋されている。試料1は
単一の細胞やコロニー等であり、包埋材2は例えば水で
ある。試料1の包埋については、低温電子顕微鏡用の試
料調製に関する技術がそのまま適用できる。
【0011】包埋材2は凍結されており、その中に試料
1を含んでいる。この凍結された包埋材2は試料台4に
挿入固定される。試料台4は内部に円筒状の空間を有
し、この空間内には液体窒素3が封入されており、包埋
材2と試料1を冷却する。液体窒素3は、ノズル31を
介して、補充されたり交換されたりする。試料台4は、
スライダ軸受6にガイドされたスラスト軸33に固定さ
れており、モーター7により上下方向に移動される。
【0012】スピンドル9には回転アーム43が固定さ
れており、回転アーム43の一端には、包埋材2と試料
1を薄く削り取るためのカッター8が固定されている。
回転アーム43の他端には、回転のバランスを取るため
の重り32が取り付けられ、回転アーム43はカッター
8の反対側が短く構成されている。スピンドル9はモー
ター10によって所定の角度範囲で回転され、これによ
り回転アーム43は所定の角度範囲で揺動する。このよ
うに、回転アーム43のカッター8の反対側が短いこ
と、回転アーム43が揺動駆動されることによって、チ
ャンバー24の小型化が図られている。
【0013】試料台4の上方には、鋭く尖った探針を自
由端に備えるカンチレバー11が配置される。カンチレ
バー11はホルダー12に固定されており、ホルダー1
2は変位センサーユニット13に取り付けられ、カンチ
レバー11の交換はホルダー12ごと行なわれる。変位
センサーユニット13は、カンチレバー11の自由端の
変位を測定する光てこ法等による変位測定光学系を内部
に有している。
【0014】変位センサーユニット13はスキャナー1
4の下端に固定されており、スキャナー14は上端がフ
ランジ15に固定されている。スキャナー14は例えば
自由端を三次元的に変位できる圧電チューブスキャナー
である。
【0015】フランジ15は、これに固定されたピン2
0と、これに螺合された二本の調整ねじ21(一本のみ
図示される)の三点で粗動ステージ17に支持されてい
る。粗動ステージ17は、チャンバー24の底板にあた
るベース5に固定された支柱18に対して上下方向に移
動可能に設けられている。粗動ステージ17は、ねじ1
9を介して支柱18と連結されており、モーター41と
支柱18に組み込まれた駆動機構とガイドによって上下
に移動される。フランジ15に設けられた一本のピン2
0と二本の調整ねじ21は中心に対して120°の角度
間隔で設けられており、二本の調整ねじ21を回わして
フランジ15の下側の突出量を変化させることにより、
スキャナー14の姿勢すなわちその傾斜方向を変えるこ
とができ、これにより走査位置の調整が行なえる。
【0016】粗動ステージ17には、三つのばね台36
が固定されており、ばね台36の上端には、フランジ1
5を粗動ステージ17に抑え付けるばね37が固定され
ている。これによりフランジ15が粗動ステージ17に
安定に支持されている。
【0017】調整ねじ21の各々に対して、これを装置
の外部から回転させる調整機構が、チャンバー24の天
板にあたるブラケット42に設けられている。この調整
機構は、調整ねじ21の六角形状等の頭に係合する係合
部44、係合部44をその下端で支持するブラケット4
2を貫通する軸22、軸22の上端に固定された摘み2
3、この構造体を上方に押し上げるばね34、軸22と
ブラケット42の間の気密を保つシール35を有してい
る。通常の状態では、係合部44はばね34の力により
上方に押し上げられ、調整ねじ21から離れており、両
者は断熱されている。調整ねじ21の回転調整は、摘み
23を押し下げて係合部44を調整ねじ21の頭に係合
させ、摘み23を回わして行なう。
【0018】チャンバー24には、試料周辺部分を外部
から観察するの窓16が設けられている。また、チャン
バー24には、ガス置換を行なうための導入管25と排
出管26が設けられており、チャンバー24の中の雰囲
気を任意に変えることができる。
【0019】スキャナー14を駆動するドライバー2
7、粗動ステージ17の上下動用のモーター41を駆動
するドライバー38、カッター8のためのモーター10
を駆動するドライバー39、試料台4の上下動用のモー
ター40を駆動するドライバー40は、コンピューター
29により制御される。また、変位センサーユニット1
3からの変位信号はプリアンプ28を介してコンピュー
ター29に送られる。コンピューター29は、装置全体
の制御、走査信号と変位信号の処理、画像処理を行な
い、その結果をモニター30に表示する。
【0020】試料1の観察は、カッター8で試料1を薄
く削り取る動作と、これにより新しく現れた試料表面の
凹凸を探針を走査して測定する動作とを交互に行なって
なされる。
【0021】モーター10により回転アーム43を揺動
させ、カッター8により埋包材2の上部を薄く削り取
る。現在の技術では、金属製のカッター8を用いて、
0.1μmの厚さで埋包材2の上部を削り取ることがで
きる。埋包材2すなわち試料1を削り取る厚さは薄いほ
ど好ましく、将来、更に薄く削ることのできる技術の提
供が望まれる。
【0022】ミクローム社製のロータリーミクロトーム
HM360によれば、試料や包埋材をカタログ値で0.
25μmの厚さで削り取ることができる。この値は削り
取った薄片を観察対象とする場合のものである。本発明
は、削り取った薄片を観察するのではなく、その後に残
った試料を観察するので、削り取った側は壊れても一向
に構わない。このように削り取った薄片は壊れても構わ
ないという条件下では同装置を用いて実際に埋包材2を
0.1μmの厚さで削ることができる。
【0023】カッター8は、試料1を薄く削り取った
後、カンチレバー11の探針により試料1の観察の邪魔
にならないように退避される。好ましくは、試料1が削
り取られた厚さの分だけモーター6により試料台4が上
昇され、観察対象面の高さが常に一定の位置に維持され
る。一方、試料1の表面には、削り取りの後、その構造
体に応じて凹凸が現れる。つまり、試料1の表面の凹凸
はその構造を現している。
【0024】この試料1の表面に沿って、スキャナー1
4によりカンチレバー11の探針を走査するとともに、
カンチレバー11の自由端の変位を変位センサーユニッ
ト13により所定のタイミングで測定する。コンピュー
ター29は、このとき得られる位置情報(走査信号)と
高さ情報(変位信号)とに基づいて、試料1のその表面
の凹凸像を形成する。
【0025】その後、ここに説明した動作、すなわち、
試料1の削り取りと、新しく現れた表面の観察とを繰り
返し行なう。上述の動作を繰り返し行なうことにより、
削り取りにより得られる試料1の多数の表面の凹凸像、
別の言い方をすれば、試料1の多数の断面の凹凸像が得
られる。走査領域の方向は常に一定しているので、コン
ピューター29を用いて、試料1の多数の表面(断面)
の画像を、方向を誤ることなく、重ねて処理することが
できる。これにより、これまで多大な時間を要してやっ
と得られていた試料1の立体画像すなわち三次元画像が
短時間の内に得られる。
【0026】次に、観察の結果、得られる画像のコント
ラストを高める方法について説明する。前述の測定動作
は、雰囲気を図2において包埋材2である水が固相であ
る環境に維持して行なうが、高いコントラストを得るた
めに雰囲気を以下の様に制御して行なってもよい。
【0027】雰囲気を包埋材2である水が固相となる環
境に維持した状態で、包埋材2をカッター8で薄く削り
取った後、雰囲気の圧力を低下させたり温度を上昇させ
たりして、所定の時間の間、雰囲気を包埋材2である水
が気相となる環境に変える。例えば、図2に示すA点
(温度:およそ−100℃、飽和蒸気圧:およそ1×1
0-3)近傍において、温度を上下させて固相と気相との
間で環境を変えている。その間、包埋材2の表面の一部
が気化するため、試料1の凹凸は顕著となる。その後、
再び、雰囲気を包埋材2である水が固相となる環境に戻
し、試料1の表面の凹凸の観察を行なう。観察終了後、
この動作を繰り返し行なう。この観察方法によれば、コ
ントラストの高い画像が得られる。
【0028】
【発明の効果】本発明によれば、試料の多数の断面の凹
凸像を方向の揃った電子画像として取り込みコンピュー
ターで処理するので、これまで多大な時間を要した試料
の三次元画像の取得を短時間で行なえる。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の実施の形態の走査型プローブ顕微鏡の
構成を示す図である。
【図2】包埋材である水の飽和蒸気圧曲線を示すグラフ
である。
【符号の説明】
8 カッター 11 カンチレバー 13 変位センサーユニット 14 スキャナー 29 コンピューター

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】探針と、 探針を自由端に支持するカンチレバーと、 カンチレバーの自由端の変位を測定する手段と、 試料表面に沿って探針を走査する手段と、 測定手段と走査手段から得られる位置情報と高さ情報と
    に基づいて試料表面の画像を形成する手段と、 試料を薄く削り取る手段とを有しており、試料を削り取
    る毎に、新しく現れた試料表面の画像を得る走査型プロ
    ーブ顕微鏡。
  2. 【請求項2】請求項1において、 試料は包埋材に包埋されており、 削り取り手段は試料を包埋材と共に削り取り、 走査型プローブ顕微鏡は更に包埋材を昇華させる手段を
    有している走査型プローブ顕微鏡。
JP8042927A 1996-02-29 1996-02-29 走査型プローブ顕微鏡 Pending JPH09236609A (ja)

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JP8042927A JPH09236609A (ja) 1996-02-29 1996-02-29 走査型プローブ顕微鏡

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JPH09236609A true JPH09236609A (ja) 1997-09-09

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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006349419A (ja) * 2005-06-14 2006-12-28 Research Institute Of Biomolecule Metrology Co Ltd 立体試料観察システム及び立体試料観察方法
EP3404416A4 (en) * 2016-01-12 2019-08-28 Hanbat National University Industry Academic Cooperation Foundation APPARATUS AND METHOD FOR GENERATING A THREE-DIMENSIONAL IMAGE OF SOLUT POLYMER SUBSTANCE THAT EXISTS IN A LIQUID SOLVENT

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Legal Events

Date Code Title Description
A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20050104