JPH09227599A - Ｃｃケモカインレセプタータンパク質、その製造法および用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】CCケモカインレセプタータンパク質、その製造
法および用途の提供。 【解決手段】CCケモカインレセプタータンパク質、該Ｄ
ＮＡ、該レセプタータンパク質を生産する形質転換細
胞、該レセプタータンパク質およびそのＤＮＡの用途、
該形質転換細胞あるいは該レセプタータンパク質を用い
る該レセプター親和性化合物のスクリーニング方法およ
び該スクリーニング用キット、それにより得られるレセ
プター親和性化合物、該レセプター親和性化合物を含有
してなる医薬、該レセプタータンパク質に対する抗体な
どに関する。本発明のCCケモカインレセプタータンパク
質を用い、CCケモカインレセプター親和性化合物のスク
リーニングを行うことにより、該化合物を効率よく選択
することができる。したがって、たとえばウイルス性疾
患、感染性疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、糖尿
病性疾患、中枢性疾患、自己免疫性疾患などの予防・治
療剤を早期に提供することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規CCケモカイン
レセプタータンパク質およびその部分ペプチド、該CCケ
モカインレセプタータンパク質をコードするＤＮＡを含
有するＤＮＡ、該CCケモカインレセプタータンパク質の
製造方法、該CCケモカインレセプタータンパク質および
そのＤＮＡの用途、CCケモカインレセプタータンパク質
を生産する能力を有する形質転換体およびその細胞膜画
分、該形質転換体、その細胞膜画分、CCケモカインレセ
プタータンパク質あるいはその部分ペプチドを用いるCC
ケモカインレセプター親和性化合物もしくはその塩のス
クリーニング方法および該スクリーニング用キットに関
する。さらに、該スクリーニング方法あるいは該スクリ
ーニング用キットを用いて得られるCCケモカインレセプ
ター親和性化合物もしくはその塩、および該化合物を含
有してなる医薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】ケモカイン（chemokine, chemotactic c
ytokineの略）は白血球に対する遊走活性を有する一群
のタンパク質である（Critical Reviews in Immunology
12: 17-46 (1992); Current Opinion in Immunology
6: 865-873 (1994)）。近年ケモカインが炎症の急性期
および慢性期においてその病態の発症、進展、および増
悪に関与していることが明らかにされつつある。ケモカ
インはいずれも４個のシステインをもち、１番目と２番
目のシステインの間に１個のアミノ酸が挿入されたCXC
ケモカインサブファミリー（αケモカインサブファミリ
ー）と１番目と２番目のシステインが隣接したCCケモカ
インサブファミリー（βケモカインサブファミリー）に
分かれる。CCケモカインサブファミリーにはRANTES(reg
ulated on activation, normal T expressed and secre
ted)、MIP-1α(macrophage inflammatory protein 1
α)、MIP-1β、MCP-1 (monocyte chemoattractant prot
ein 1)、MCP-2、MCP-3、I-309などがある。CCケモカイ
ンは単球、リンパ球、好酸球、好塩基球、肥満細胞に作
用してこれらの細胞を遊走させ、また脱顆粒や種々の炎
症性メディエーターの放出などの作用をもつ。MIP-1α
およびRANTESに高親和性のヒトMIP-1α/RANTESレセプタ
ーの構造は1993年に報告され、Gタンパクに共役した７
回膜貫通型のレセプターであることがわかった（Cell 7
2: 415-425 (1993); J. Exp. Med. 177: 1421-1427 (19
93)）。ついでMCP-1に高親和性のヒトMCP-1レセプター
の構造が報告された（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:
2752-2756; Biochem. Biophys. Res. Commun. 202: 11
56- 1162）。両者のアミノ酸の相同性は51%であった。

【０００３】慢性関節リウマチ患者滑膜組織でRANTESお
よびMIP-1α/RANTESレセプターのmRNAの発現量が亢進し
ていることが観察され（Lancet 343: 547-548 (199
4)）、また心臓移植後の心血管の内膜肥厚部位でRANTES
のmRNAの発現量が亢進した（Circulation 82: 111-699
(1990)）ので、該疾患にRANTESが関与することが示唆さ
れる。さらに、腎移植拒絶時に移植部位でRANTES mRNA
の発現およびRANTESタンパク量が増加した（Lancet 34
3: 209-211 (1994)）ので、臓器移植拒絶にRANTESが関
与すると考えられる。また、リウマチ患者滑液中にMIP-
1αタンパクが増加することが報告され（J. Clin. Inve
st. 93: 921-928 (1994)）、マウスコラーゲン関節炎実
験において抗MIP-1α抗体の投与が、関節炎の発症を遅
らせさらに症状を寛和させた（J. Clin. Invest.95: 28
68-2876 (1995)）。抗MIP-1α抗体の投与はマウス実験
的自己免疫性脳脊髄炎（マウス実験的アレルギー性脳脊
髄炎）にも有効であった（J. Immunol. 155: 5003-5010
(1995)）。したがって、MIP-1αも慢性関節リウマチの
発症に関与し、またMIP-1αは多発性硬化症にも関与す
ると推察される。

【０００４】好酸球、好塩基球および肥満細胞は炎症部
位への集積、活性化によってアレルギー性疾患の発症、
進展、および増悪に関わる。RANTESは好酸球の遊走因子
でもあり （J. Immunol. 176: 587 (1992); J. Immuno
l. 176: 1489 (1992)）、ヒトにRANTESを皮内注射する
と単核球と好酸球の浸潤がみられ た（FASEB J. 9: A80
4 (1995)）。以上のことから、これらのCCケモカインの
作用を阻害するアンタゴニストは、慢性関節リウマチ、
動脈硬化、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、多発性硬化
症、腎炎などの予防・治療につながると考えられる。さ
らに、CCケモカインのレセプターに対するアゴニストは
単球などの白血球の機能を亢進させるので、抗腫瘍能な
どを増進させることが予想される。しがしながら、まだ
かかるアンタゴニストやアゴニストの報告はない。

【０００５】レセプターのアンタゴニストやアゴニスト
は、レセプターに特異的に結合する親和性の高い化合物
を探索することによって発見できる。レセプターに対す
るアンタゴニストやアゴニストが発見された後に、これ
らを医薬として開発するためには動物での作用を確認す
ることが必須である。しかしながら、レセプターのアン
タゴニストやアゴニストの活性に動物間で差があること
が予想され、ヒト型のレセプターに強い作用をもつ化合
物が、マウスやラットなどの実験動物では強い作用を示
さないことが十分に起こり得る。したがって、ヒト型レ
セプターを安定に発現する細胞株に加えて、動物由来の
レセプターの安定な発現株がきわめて有用である。ヒト
MIP-1α/RANTESレセプターに類似したマウスのレセプタ
ーが1995年に報告され、ヒトMIP-1α/RANTESレセプター
と80%のアミノ酸が一致することがわかった（J. Biol.
Chem. 270:17494-17501 (1995)）。しかしながら、かか
るレセプターにおけるラット由来のものはまだ報告がな
い。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、MIP-1αやR
ANTESと高い親和性で結合するラット由来のレセプター
（以下CCケモカインレセプターと称する）の構造を明ら
かにし、CCケモカインレセプタータンパク質の製造法お
よびCCケモカインレセプターを用いるCCケモカインレセ
プター高親和性化合物のスクリーニング法を確立するこ
とを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決するために鋭意研究をすすめた結果、ヒトMIP-
1α/RANTESレセプターcDNAの部分塩基配列に相当するジ
ゴキシゲニン標識PCR（polymerase chain reaction）プ
ローブを用いてPCRを行うことにより、ヒトMIP-1α/RAN
TESレセプターに相同性の高いラットマクロファージ由
来のcDNAを単離することに成功した。このcDNAのコード
するタンパク質は、ヒトMIP-1α/RANTESレセプターと81
%のアミノ酸が一致し、またヒトMIP-1α/RANTESレセプ
ターに相同性の高いマウスレセプターとは92%のアミノ
酸が一致した。このcDNAをCHO細胞に発現させ、ヒトMIP
-1αおよびヒトRANTESが高い親和性で結合することを見
出し、このcDNAがラットCCケモカインレセプターである
と結論した。

【０００８】本発明者らは、これらの知見に基づき、さ
らに鋭意研究を進めて本発明を完成するに至った。すな
わち、本発明は、（１）配列番号：１で表されるアミノ
酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含
有することを特徴とするCCケモカインレセプタータンパ
ク質もしくはその塩、（２）第（１）項記載のCCケモカ
インレセプタータンパク質の部分ペプチドもしくはその
塩、（３）第（１）項記載のCCケモカインレセプタータ
ンパク質または第（２）項記載の部分ペプチドをコード
する塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡ、（４）
配列番号：２で表される塩基配列を有する第（３）項記
載のＤＮＡ、（５）第（３）項記載のＤＮＡを含有する
組換えベクター、（６）第（３）項記載のＤＮＡまたは
第（５）項記載の組換えベクターを保持する形質転換
体、（７）第（６）項記載の形質転換体を培養すること
を特徴とする第（１）項記載のCCケモカインレセプター
タンパク質もしくはその塩の製造法、（８）第（１）項
記載のCCケモカインレセプタータンパク質もしくはその
塩または第（２）項記載の部分ペプチドもしくはその塩
に対する抗体、（９）第（１）項記載のCCケモカインレ
セプタータンパク質もしくはその塩または第（２）項記
載の部分ペプチドもしくはその塩と被験化合物とを接触
させることを特徴とするCCケモカインレセプター親和性
化合物もしくはその塩のスクリーニング方法、（１０）
第（１）項記載のCCケモカインレセプタータンパク質も
しくはその塩または第（２）項記載の部分ペプチドもし
くはその塩を含有することを特徴とするCCケモカインレ
セプター親和性化合物もしくはその塩のスクリーニング
用キット、（１１）第（９）項記載のスクリーニング方
法によって得られるCCケモカインレセプター親和性化合
物もしくはその塩、（１２）第（１０）項記載のスクリ
ーニング用キットを用いて得られるCCケモカインレセプ
ター親和性化合物もしくはその塩、（１３）CCケモカイ
ンレセプターアンタゴニストである第（１２）項記載の
CCケモカインレセプター親和性化合物もしくはその塩、
（１４）CCケモカインレセプターアゴニストである第
（１２）項記載のCCケモカインレセプター親和性化合物
もしくはその塩、（１５）第（１３）項記載のアンタゴ
ニストまたは第（１４）項記載のアゴニストを含有して
なる医薬、および（１６）ウイルス性疾患、感染性疾
患、腫瘍、アレルギー性疾患、炎症性疾患、糖尿病性疾
患、中枢性疾患、自己免疫性疾患、高脂血症、高コレス
テロール血症、透析による血小板減少症、脊髄損傷、骨
粗鬆症、潰瘍性大腸炎、消化性潰瘍、敗血症ショック、
肺・心臓における再潅流障害、不安定狭心症、一過性脳
虚血発作、心弁膜症、臓器移植後拒絶反応、血管形成術
後再狭窄、腎不全、子宮内膜症、肺線維症、成人呼吸逼
迫症候群の予防・治療剤である第（１５）項記載の医薬
に関する。

【０００９】また、本発明は、（１７）ラット由来であ
る第（１）項記載のCCケモカインレセプタータンパク質
または第（２）項記載の部分ペプチド、（１８）第
（６）項記載の形質転換体から得られるCCケモカインレ
セプタータンパク質を含有する細胞膜画分、（１９）第
（６）項記載の形質転換体または第（１８）項記載の細
胞膜画分から単離されることを特徴とするCCケモカイン
レセプタータンパク質、その部分ペプチドもしくはそれ
らの塩、（２０）配列番号：１で表されるアミノ酸配
列、配列番号：１で表されるアミノ酸配列中の１または
２個以上のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番
号：１で表されるアミノ酸配列に１または２個以上のア
ミノ酸が付加したアミノ酸配列、または配列番号：１で
表されるアミノ酸配列中の１または２個以上のアミノ酸
が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を有するタン
パク質、それらのタンパク質の分子内のアミノ酸の側鎖
が適当な保護基（例えばホルミル基、アセチル基などの
アシル基など）で保護されているタンパク質、またはそ
れらのタンパク質に糖鎖などが結合しているタンパク質
である第（１）項または第（１９）項記載のCCケモカイ
ンレセプタータンパク質、その部分ペプチドもしくはそ
れらの塩に関する。

【００１０】本発明のスクリーニング方法に関し、より
具体的には、 （２１）（ｉ）CCケモカインレセプターに対するリガン
ドを第（１）項記載のCCケモカインレセプタータンパク
質または第（２）項記載の部分ペプチドを含有する細胞
に接触させた場合と、（ｉｉ）CCケモカインレセプター
に対するリガンドおよび被験化合物を第（１）項記載の
CCケモカインレセプタータンパク質または第（２）項記
載の部分ペプチドを含有する細胞に接触させた場合との
比較を行うことを特徴とする第（９）項記載のCCケモカ
インレセプター親和性化合物もしくはその塩のスクリー
ニング方法、 （２２）（ｉ）CCケモカインレセプターに対するリガン
ドを第（６）項記載の形質転換体または第（１８）項記
載の細胞膜画分に接触させた場合と、（ｉｉ）CCケモカ
インレセプターに対するリガンドおよび被験化合物を第
（６）項記載の形質転換体または第（１８）項記載の細
胞膜画分に接触させた場合との比較を行うことを特徴と
する第（９）項記載のCCケモカインレセプター親和性化
合物もしくはその塩のスクリーニング方法、 （２３）（ｉ）CCケモカインレセプターに対する標識し
たリガンドを第（６）項記載の形質転換体または第（１
８）項記載の細胞膜画分に接触させた場合と、（ｉｉ）
CCケモカインレセプターに対する標識したリガンドおよ
び被験化合物を第（６）項記載の形質転換体または第
（１８）項記載の細胞膜画分に接触させた場合との、該
形質転換体または該細胞膜画分に対する標識したリガン
ドの結合量を測定し、比較することを特徴とする第
（９）項記載のCCケモカインレセプター親和性化合物も
しくはその塩のスクリーニング方法、

【００１１】（２４）（ｉ）CCケモカインレセプターに
対するリガンドを第（６）項記載の形質転換体または第
（１８）項記載の細胞膜画分に接触させた場合と、（ｉ
ｉ）CCケモカインレセプターに対するリガンドおよび被
験化合物を第（６）項記載の形質転換体または第（１
８）項記載の細胞膜画分に接触させた場合との、CCケモ
カインレセプターを介した細胞刺激活性（例えば細胞遊
走、細胞内Ca²⁺濃度の変動、Gタンパク質の活性化、イ
ノシトールリン脂質の産生、アラキドン酸の遊離、ヒス
タミンなどの炎症性メディエーターの遊離、脱顆粒、細
胞膜電位の変動、pHの変動、膜タンパク質あるいは細胞
内タンパク質の活性化、膜タンパク質あるいは細胞内タ
ンパク質のリン酸化などを促進あるいは抑制する活性な
ど）を測定比較することを特徴とするCCケモカインレセ
プターアンタゴニストのスクリーニング方法、 （２５）CCケモカインレセプターに対するリガンドを第
（６）項記載の形質転換体または第（１８）項記載の細
胞膜画分に接触させた場合の、CCケモカインレセプター
を介した細胞刺激活性（例えば細胞遊走、細胞内Ca²⁺濃
度の変動、Gタンパク質の活性化、イノシトールリン脂
質の産生、アラキドン酸の遊離、cAMPの生成、ヒスタミ
ンなどの炎症性メディエーターの遊離、脱顆粒、細胞膜
電位の変動、pHの変動、膜タンパク質あるいは細胞内タ
ンパク質の活性化、膜タンパク質あるいは細胞内タンパ
ク質のリン酸化などを促進あるいは抑制する活性など）
を測定することを特徴とするCCケモカインレセプターア
ゴニストのスクリーニング方法、 （２６）（ｉ）CCケモカインレセプターに対するリガン
ドを第（１９）項記載のCCケモカインレセプタータンパ
ク質、その部分ペプチドもしくはそれらの塩に接触させ
た場合と、（ｉｉ）CCケモカインレセプターに対するリ
ガンドおよび被験化合物を同時に第（９）項記載のCCケ
モカインレセプタータンパク質、その部分ペプチドもし
くはそれらの塩に接触させた場合との比較を行うことを
特徴とする第（１２）項記載のCCケモカインレセプター
親和性化合物またはその塩のスクリーニング方法、およ
び （２７）（ｉ）CCケモカインレセプターに対する標識し
たリガンドを第（９）項記載のCCケモカインレセプター
タンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に接触
させた場合と、（ｉｉ）CCケモカインレセプターに対す
る標識したリガンドおよび被験化合物を同時に第（９）
項記載のCCケモカインレセプタータンパク質、その部分
ペプチドもしくはそれらの塩に接触させた場合との該CC
ケモカインレセプタータンパク質、その部分ペプチドも
しくはそれらの塩に対する標識したリガンドの結合量を
比較することを特徴とする第（１２）項記載のCCケモカ
インレセプター親和性化合物またはその塩のスクリーニ
ング方法に関する。

【００１２】

【発明の実施の形態】本発明のCCケモカインレセプター
タンパク質としては、ラットの白血球などの細胞に由来
するCCケモカインレセプタータンパク質であって、配列
番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的
に同一のアミノ酸配列を含有するものであればいかなる
ものであってもよい。すなわち、本発明のCCケモカイン
レセプタータンパク質としては、配列番号：１で表され
るアミノ酸配列を含有するタンパク質の他に、配列番
号：１で表されるアミノ酸配列と約９５〜９９．９％の
相同性を有するアミノ酸配列を含有し、配列番号：１で
表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に
同質の活性を有するタンパク質などが挙げられる。実質
的に同質の活性としては、例えばリガンドの結合活性や
シグナル伝達活性などが挙げられる。実質的に同質と
は、リガンドの結合活性やシグナル伝達活性などが性質
的に同質であることを示す。したがって、リガンド結合
活性の強さやレセプタータンパク質の分子量などの量的
要素が異なっていてもよい。より具体的には、本発明の
CCケモカインレセプタータンパク質としては、配列番
号：１で表されるアミノ酸配列を含有するCCケモカイン
レセプタータンパク質などの他に、配列番号：１で表さ
れるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは２
個以上２５個以下、より好ましくは２個以上１０個以
下）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号：１
で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましく
は２個以上２５個以下、より好ましくは２個以上１０個
以下）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、あるいは配
列番号：１で表されるアミノ酸配列中の１または２個以
上（好ましくは２個以上２５個以下、より好ましくは２
個以上１０個以下）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換さ
れたアミノ酸配列を有するタンパク質などが挙げられ
る。本発明のCCケモカインレセプタータンパク質には、
Ｎ末端のアミノ酸が保護基（例えばホルミル基、アセチ
ル基などのアシル基など）で保護されているタンパク
質、Ｎ末端のアミノ酸がグルタミンあるいはグルタミン
酸の場合はそれらが環化してピログルタミンに変化した
タンパク質、分子内のアミノ酸の側鎖が適当な保護基
（例えばホルミル基、アセチル基などのアシル基など）
で保護されているタンパク質、あるいはそれらのタンパ
ク質に糖鎖などが結合しているタンパク質なども含まれ
る。本発明のCCケモカインレセプタータンパク質の塩と
しては、生理学的に許容される塩基（例、アルカリ金属
等）や酸（有機酸、無機酸）との塩が用いられるが、と
りわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この
ような塩としては、例えば無機酸（例えば塩酸、リン
酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例え
ば酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、
コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安
息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との
塩などが用いられる。

【００１３】本発明のCCケモカインレセプタータンパク
質の部分ペプチドとしては、例えば、本発明のCCケモカ
インレセプタータンパク質のうち、疎水性プロット解析
により親水性（hydorophilic）であって細胞外領域であ
ると判定された部位を含むペプチドである。さらには、
親水性部位に加えて疎水性（hydrophobic）部位を部分
的に含むペプチドであってもよい。あるいは、親水性部
位の領域や疎水性部位の領域などの複数の領域を含む部
分ペプチドでもよい。本発明のCCケモカインレセプター
タンパク質の部分ペプチドの塩としては、上記したCCケ
モカインレセプタータンパク質の塩と同様のものが用い
られる。本発明のCCケモカインレセプタータンパク質の
部分ペプチドもしくはその塩は、自体公知のペプチド合
成法に従って、あるいは本発明のCCケモカインレセプタ
ータンパク質を適切なペプチダーゼで切断することによ
って製造することができる。ペプチド合成法としては、
たとえば固相合成法、液相合成法のいずれによっても良
い。すなわち、本発明のタンパク質を構成し得る部分ペ
プチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成
物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより
目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方
法や保護基の脱離としては、例えば以下の(a) 〜 (e)に
記載された方法が挙げられる。 (a)M. Bodanszky およびM. A. Ondetti, ペプチドシン
セシス(Peptide Synthesis), Interscience Publisher
s, New York (1966年) (b)Schroederおよび Luebke、ザ ペプチド(The Peptid
e), Academic Press, New York (1965年) (c)泉屋信夫、ペプチド合成の基礎と実験、丸善（1975
年） (d)矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座１、タン
パク質の化学IV, 東京化学同人 (1977年) (e)矢島治明監修、続医薬品の開発第１４巻ペプチド合
成、廣川書店（1991年） また反応後は通常の精製法、例えば溶媒抽出、蒸留、カ
ラムクロマトグラフィー、高速液体クトマトグラフィ
ー、再結晶などを組合わせて本発明の部分ペプチドを単
離精製することができる。上記の方法で得られる部分ペ
プチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当
な塩に変換できるし、逆に塩で得られた場合は、公知の
方法によって遊離体に変換できる。

【００１４】本発明のCCケモカインレセプタータンパク
質をコードするＤＮＡとしては、本発明の配列番号：１
のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸
配列を含有するCCケモカインレセプタータンパク質をコ
ードする塩基配列を含有するものであればいかなるもの
であってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡラ
イブラリー、細胞由来のｃＤＮＡ、細胞由来のｃＤＮＡ
ライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラ
リーに使用するベクターはバクテリオファージ、プラス
ミド、コスミドなどいずれであってもよい。また、細胞
から調製したmRNA画分を用いてreverse transcriptase
polymerase chain reaction （ＲＴ−ＰＣＲ）によって
増幅することもできる。より具体的には、配列番号：１
のアミノ酸配列を含有するCCケモカインレセプタータン
パク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２で表
される塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡなどが
用いられる。また、これとハイブリドするＤＮＡも用い
られるが、該ハイブリドＤＮＡは、配列番号：１のアミ
ノ酸配列を有するCCケモカインレセプタータンパク質と
同質活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡである。

【００１５】本発明のCCケモカインレセプタータンパク
質をコードするＤＮＡのクローニングは、CCケモカイン
レセプタータンパク質をコードするＤＮＡの部分塩基配
列を有する合成プライマーを用いてＰＣＲ法によって増
幅することによって行う。あるいはCCケモカインレセプ
タータンパク質をコードするＤＮＡの一部あるいは全領
域を有するＤＮＡ断片を標識して、適切なベクターに組
み込んだＤＮＡとのハイブリダイゼーションによって行
う。ハイブリダイゼーションの方法は、たとえばモレキ
ュラー クローニング（Molecular Cloning; A Laborat
ory Manual, 2nd ed., J. Sambrook, E. F. Fritsch a
nd T. Maniatis, 1989, Cold Spring Harbor Laborator
y Press)に記載の方法などに従って行う。市販のライブ
ラリーを使用する場合は、添付の使用説明書に記載の方
法に従って行う。

【００１６】クローン化されたCCケモカインレセプター
タンパク質をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、
または所望により制限酵素で消化し、あるいはリンカー
を付加して使用することができる。該ＤＮＡはその５’
末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また
３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＡＴＴ、ＴＧＡ
またはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コ
ドンや翻訳終止コドンは適切な合成アダプターを用いて
付加することもできる。

【００１７】CCケモカインレセプタータンパク質の発現
ベクターは、例えば本発明のCCケモカインレセプタータ
ンパク質をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片
を切出し、該ＤＮＡ断片を適切な発現ベクターのプロモ
ータの下流に連結することにより製造することができ
る。ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例え
ばpBR322、pBR325、pUC12、 pUC13)、枯草菌由来のプラ
スミド（例えばpUB110、pTP5、 pC194)、酵母由来のプ
ラスミド（例えばpSH19， pSH15)、λファージなどのバ
クテリオファージ、あるいはレトロウイルス、ワクシニ
アウイルス、バキュロウイルスなどの動物ウイルスなど
が用いられる。本発明で用いられるプロモーターとして
は、遺伝子の発現に用いる宿主に対応した適切なプロモ
ーターであればいかなるものでもよい。

【００１８】遺伝子の発現に用いる宿主がエシェリヒア
属菌である場合にはtrpプロモーター、lac プロモータ
ー、recA プロモーター、λPLプロモーターなどが、宿
主がバチルス属菌である場合にはSPO1プロモーター、SP
O2プロモーター、penPプロモーターなどが、 宿主が酵
母である場合にはPHO5 プロモーター、PGKプロモータ
ー、 GAPプロモーター、 ADAプロモーターなどが好まし
い。宿主が動物である場合にはSV40由来のプロモータ
ー、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネイン
プロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメ
ガロウイルスプロモーター、SRαプロモーターなどが好
ましい。

【００１９】また、必要に応じてそれぞれの宿主に適し
たシグナル配列をCCケモカインレセプタータンパク質の
Ｎ末端に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合
にはアルカリホスファターゼシグナル配列、OmpAシグナ
ル配列、サブチリシンシグナル配列などが、宿主が酵母
である場合にはメイティングファクターαシグナル配
列、インベルターゼシグナル配列などが、宿主が動物で
ある場合にはインシュリンシグナル配列、α-インター
フェロンシグナル配列、抗体分子シグナル配列などが利
用できる。このようにして構築されたCCケモカインレセ
プタータンパク質をコードするＤＮＡを含有する組換え
ベクターを用いて形質転換体を作製する。

【００２０】宿主としては例えばエシェリヒア属菌、バ
チルス属菌、酵母、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌としては、例えばEscherichia coli K
12（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60: 160 (1968)）、E
scherichia coli DH1（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 6
0: 160 (1968)）、Escherichia coli JM103（Nucleic A
cids Research 9: 309 (1981)）、Escherichia coli JA
221（Journal of Molecular Biology 120: 517 (197
8)）、Escherichia coli HB101（Journal of Molecular
Biology 41:459 (1969)）、Escherichia coli C600（G
enetics 39: 440 (1954)）などが用いられる。バチルス
属菌としては、例えばBacillus subtilis MI 114（Gene
24: 255 (1983)）や Bacillus subtilis 207-21（Jour
nal of Biochemistry 95: 87 (1984)）などが用いられ
る。酵母としては、例えばSaccaromyces cerevisiae AH
22、Saccaromyces cerevisiae AH22R−、Saccaromyces
cerevisiae NA87-11A、Saccaromyces cerevisiae DKD-5
D 、Saccaromyces cerevisiae 20B-12などが用いられ
る。昆虫としては、例えばカイコの幼虫（Nature 315:
592 (1985)）などが用いられる。動物細胞としては、例
えばサル由来の細胞であるCOS-7細胞や Vero細胞、チャ
イニーズハムスター卵巣細胞であるCHO細胞（J. Exp. M
ed. 108: 945（1958））、DHFR遺伝子を欠損したCHO細
胞（以下、CHO(dhfr^-)細胞と略称する場合がある）（Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220 (1980)）、
マウスL細胞、マウスミエローマ細胞、ヒトFL細胞など
が用いられる。

【００２１】形質転換体の作製は公知の方法に従って行
われる。すなわち、エシェリヒア属菌の形質転換体の作
製の場合は例えばProc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 211
0 (1972)や Gene 17: 107 (1982)などに記載の方法に従
って、バチルス属菌の場合は例えばMolecular and Gene
ral Genetics 168: 111 (1979)などに記載の方法に従っ
て、酵母の場合は例えばProc. Natl. Acad. Sci. USA 7
5: 1929 (1978)などに記載の方法に従って、昆虫細胞の
場合は例えばBio/Technology 6: 47 (1988)などに記載
の方法に従って、また動物細胞の場合は例えばVirology
52: 456 (1973)などに記載の方法に従って、それぞれ
行われる。

【００２２】形質転換体の培養はそれぞれに適した条件
下で行われる。宿主がエシェリヒア属菌やバチルス属菌
である形質転換体の培養には液体培地が適しており、該
形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その
他が含有せしめられる。炭素源としては例えばグルコー
ス、デキストリン、可溶性デンプン、ショ糖など、窒素
源としては例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、ペプト
ン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、馬鈴薯抽出液など、
無機物としては例えば塩化カルシウム、リン酸二水素ナ
トリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。またビ
タミン類、成長促進因子などを添加してもよい。培地の
pHは約５〜８が好ましい。宿主がエシェリヒア属菌であ
る形質転換体の培養に用いる培地としては、例えばグル
コースやカザミノ酸を含むM9培地（Journal of Experim
ents in Molecular Genetics 431-433 (1972)）が好ま
しい。プロモーターを効率よく働かせるために3β-イン
ドールアクリル酸のような薬剤を必要により添加するこ
ともできる。宿主がエシェリヒア属菌の場合、通常約１
５〜４３℃で約３〜２４時間培養し、必要により通気や
撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌の場
合、通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間培養し、必要
により通気や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母で
ある形質転換体の培養に用いる培地としては、例えばバ
ークホールダー（Burkholder）最小培地（Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 77: 4505 (1980)）や０.５％カザミノ
酸を含有するSD培地（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:
5330 (1984)）が挙げられる。培地のpHは約５〜８が好
ましい。通常約２０〜３５℃で約２４〜７２時間培養
し、必要により通気や撹拌を加えることもできる。宿主
が昆虫である形質転換体の培養に用いる培地としては、
例えばGrace's insect medium（Nature 195: 788 (196
2)）に非動化した１０％ウシ血清等を適宜添加したもの
などが用いられる。培地のpHは約６.２〜６.４が好まし
い。通常約２７℃で約３〜５日培養し、必要により通気
や撹拌を加えることもできる。宿主が動物である形質転
換体の培養に用いる培地としては、例えば約５〜２０％
のウシ胎児血清を含むMEM培地（Science 122: 501 (195
2)）、DMEM培地（Virology 8: 396 (1959)）、RPMI 164
0 培地（The Journal of the American Medical Associ
ation 199: 519 (1967)）、199培地（Proceeding of th
e Society forthe Biological Medicine 73: 1 (195
0)）などが用いられる。培地のpHは約６〜８が好まし
い。通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間培養し、必
要により通気や撹拌を加えることもできる。

【００２３】上記の培養物からのCCケモカインレセプタ
ータンパク質の分離精製は、例えば下記の方法により行
うことができる。CCケモカインレセプタータンパク質を
菌体あるいは細胞から抽出するには、培養後、公知の方
法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸
濁し、超音波破砕、ホモジナイザー、凍結融解などによ
って菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離や濾過
によりCCケモカインレセプタータンパク質の抽出液を得
る。緩衝液の中に、塩酸グアニジンや尿素などのタンパ
ク変性剤、PMAS (phenylmethanesulfonyl fluoride)、
ペプスタチン、ロイペプチンなどのタンパク分解酵素阻
害剤やCHAPS (3-［(3-cholamidopropyl)dimethylammoni
o］-1-propanesulonate)、ジギトニン、トリトンX-100
などの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にCC
ケモカインレセプタータンパク質が分泌される場合に
は、培養後それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上
清とを分離し、上清を集める。得られた培養上清あるい
は抽出液中に含まれるCCケモカインレセプタータンパク
質の精製は、自体公知の分離・精製方法を適切に組合わ
せて行うことができる。これらの公知の分離・精製方法
として、塩析や溶媒沈澱などの溶解度を利用する方法、
透析、限外濾過、ゲル濾過、あるいはSDS-ポリアクリル
アミドゲル電気泳動などの主として分子量の差を利用す
る方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差
を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーな
どの特異的親和性を利用する方法、疎水クロマトグラフ
ィーや逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の
差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差
を利用する方法などが用いられる。より具体的には、以
下のようにCCケモカインレセプタータンパク質を分離精
製する。後述する実施例２で得られるCCケモカインレセ
プターの動物細胞発現用プラスミドprCCRを、後述の実
施例３の方法でCHO(dhfr^-)細胞に導入して、CCケモカイ
ンレセプター高発現ＣＨＯ細胞株（CHO(rCCR)細胞）を
得る。得られたCHO(rCCR)細胞を核酸不含の選択培地
（１０％透析FBS/α-MEM without RNA and DNA(GIBCO B
RL)）でCO₂インキュベーターで３７℃、５％CO₂の条件
下で１〜４日培養することによりCCケモカインレセプタ
ータンパク質を産生させる。該ＣＨＯ細胞からCCケモカ
インレセプタータンパク質あるいはその部分ペプチドに
対する抗体を担体に架橋させて作製されたアフィニティ
ーカラムあるいは、CCケモカインレセプターに対するリ
ガンド（例えばMIP-1αやRANTESなど）を担体に架橋さ
せたアフィニティーカラムを用いてCCケモカインレセプ
タータンパク質を分離精製する。精製途上のクロマトグ
ラフィーの画分中の該レセプターの検出には、上記のレ
セプターあるいはその部分ペプチドに対する抗体を用い
る。あるいは後述の実施例３の放射性リガンド結合アッ
セイにおいて、レセプターの共存により放射性リガンド
の結合量が低下することを指標にして検出する。

【００２４】かくして得られるCCケモカインレセプター
タンパク質が遊離体で得られた場合には、自体公知の方
法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換すること
ができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法ある
いはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変
換することができる。なお、CCケモカインレセプタータ
ンパク質を精製前または精製後に適当なタンパク修飾酵
素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり部分
的にペプチドを除去することもできる。タンパク修飾酵
素としては、トリプシン、キモトリプシン、リシルエン
ドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダー
ゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いら
れる。このようにして得られたCCケモカインレセプター
タンパク質の活性あるいは量は、CCケモカインレセプタ
ータンパク質に対する標識したリガンドとの結合実験あ
るいは特異的抗体を用いたエンザイムイムノアッセイな
どにより測定することができる。

【００２５】本発明のCCケモカインレセプタータンパク
質および該タンパク質をコードするＤＮＡは、(a)CCケ
モカインレセプタータンパク質に対する抗体および抗血
清の作製、(b)CCケモカインレセプタータンパク質を発
現する形質転換体の作製、(c)CCケモカインレセプター
結合アッセイ系の開発および医薬品候補化合物のスクリ
ーニング、(d)CCケモカインレセプターに対するリガン
ドの定量アッセイ系の構築、(e)CCケモカインレセプタ
ータンパク質をコードするＤＮＡをもとにしたＰＣＲプ
ライマーの作製、(f)CCケモカインレセプターを発現す
るトランスジェニック動物の作製、(g)CCケモカインレ
セプタータンパク質をコードするＤＮＡを欠失した病態
モデル動物の作製等に用いることができる。本発明のCC
ケモカインレセプタータンパク質、部分ペプチド、CCケ
モカインレセプタータンパク質をコードするＤＮＡおよ
び該レセプタータンパク質に対する抗体の用途につい
て、以下により具体的に説明する。

【００２６】（１）本発明のCCケモカインレセプタータ
ンパク質あるいはその塩または本発明のCCケモカインレ
セプタータンパク質の部分ペプチドまたはその塩に対す
る抗体あるいは抗血清の作製 本発明のCCケモカインレセプタータンパク質あるいはそ
の塩または本発明のCCケモカインレセプタータンパク質
の部分ペプチドまたはその塩に対する抗体（例えばポリ
クローナル抗体やモノクローナル抗体）または抗血清
は、本発明のCCケモカインレセプタータンパク質、その
部分ペプチドまたはそれらの塩を抗原として用いて、自
体公知の抗体または抗血清の方法に従って作製すること
ができる。例えばモノクローナル抗体の作製は、後述の
方法によって行うことができる。

【００２７】［モノクローナル抗体の作製］ （ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製 本発明のCCケモカインレセプタータンパク質、その部分
ペプチドまたはそれらの塩（以下、CCケモカインレセプ
ターと略称する場合がある）は、温血動物に対して、投
与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体
や希釈剤とともに投与される。抗体産生能を高めるため
に完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジ
ュバントを同時に投与してもよい。投与は通常２〜６週
毎に１回ずつ計２〜１０回程度行われる。用いられる温
血動物としては例えばマウス、ラット、ハムスター、モ
ルモット、ウサギ、ニワトリ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、サ
ルなどが挙げられるが、好ましくはマウスおよびハムス
ターが用いられる。モノクローナル抗体産生細胞の作製
には、抗原を免疫した温血動物（例えばマウスやラット
など）から抗体価の認められた個体を選択し、最終免疫
の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取して、それら
に含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させること
により、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作製
することができる。融合操作は既知の方法、例えばケー
ラーとミルスタインの方法（Nature 256: 495 (1975)）
に従って実施できる。融合促進剤としてはポリエチレン
グリコール（PEG）やセンダイウイルスなどが挙げられ
るが、好ましくはPEGが用いられる。骨髄腫細胞として
は、例えばNS-1、P3U1、SP2/0、AP-1などが挙げられる
が、好ましくはP3U1が用いられる。抗体産生細胞（脾臓
細胞あるいはリンパ節細胞）数と骨髄腫細胞数との比率
は好ましくは１：１〜２０：１程度であり、PEG（好ま
しくはPEG1000〜PEG6000）が１０〜８０％程度の濃度で
添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１
〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞
融合を実施できる。

【００２８】抗CCケモカインレセプター抗体産生ハイブ
リドーマの選択は、自体公知あるいはそれに準じる方法
に従って行うことができる。通常HAT（ヒポキサンチ
ン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用
培地で行われる。選択および育種用培地としてはハイブ
リドーマが生育できるものであればどのような培地を用
いてもよい。例えば１〜２０％、好ましくは１０〜２０
％のウシ胎児血清を含むRPMI 1640培地、１〜１０％ウ
シ胎児血清を含むGIT培地（和光純薬工業（株））ある
いはSFM-101ハイブリドーマ培養用無血清培地（日水製
薬（株））などを用いることができる。通常約２０〜４
０℃好ましくは約３７℃で、５日〜３週間好ましくは１
〜２週間、５％CO₂存在下で培養する。

【００２９】抗CCケモカインレセプター抗体を検出する
には種々の方法が用いられる。例えばCCケモカインレセ
プター抗原を直接あるいは担体とともに吸着させたマイ
クロプレートなどの固相に抗血清やハイブリドーマ培養
上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗
免疫グロブリン抗体またはプロテインAあるいはプロテ
インGを添加して固相に結合した抗CCケモカインレセプ
ター抗体を検出する方法、あるいは抗免疫グロブリン抗
体またはプロテインAあるいはプロテインGを吸着させた
固相に抗血清やハイブリドーマ培養上清を添加し、次に
放射性物質や酵素などで標識したCCケモカインレセプタ
ーを添加して固相に結合した抗CCケモカインレセプター
抗体を検出する方法などが挙げられる。

【００３０】（ｂ）モノクローナル抗体の精製 抗CCケモカインレセプター抗体の分離精製は自体公知の
免疫グロブリンの分離精製方法、例えば塩析法、アルコ
ール沈澱法、等電点沈澱法、電気泳動法、超遠心、DEAE
イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、ヒドロキシ
アパタイトクロマトグラフィー、プロテインAあるいは
プロテインGを用いたアフィニティークロマトグラフィ
ーなどにより行われる。

【００３１】以上の（ａ）および（ｂ）の方法に従って
製造される本発明の抗CCケモカインレセプター抗体はCC
ケモカインレセプターを特異的に認識できるので、被験
検体中のCCケモカインレセプターの定量、特にサンドイ
ッチ免疫測定法による定量などに使用できる。すなわち
本発明は、例えば（ｉ）本発明の抗CCケモカインレセプ
ター抗体に対して、被験検体と標識化CCケモカインレセ
プターとを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化
CCケモカインレセプターの割合を測定することを特徴と
する被験検体中のCCケモカインレセプターの定量法、
（ｉｉ）担体上に固相化した抗CCケモカインレセプター
抗体に対して、被験検体および標識化した抗CCケモカイ
ンレセプター抗体とを同時にあるいは連続的に反応させ
たのち、担体に結合した標識剤の活性を測定することを
特徴とする被験検体中のCCケモカインレセプターの定量
法において、担体上に固相化した抗CCケモカインレセプ
ター抗体および標識化した抗CCケモカインレセプター抗
体の一方がCCケモカインレセプターのＮ末端部分を認識
する抗体で、他方の抗体がCCケモカインレセプターのＣ
末端部分を認識する抗体であることを特徴とする被験検
体中のCCケモカインレセプターの定量法を提供する。

【００３２】本発明のCCケモカインレセプターを認識す
るモノクローナル抗体（以下、抗CCケモカインレセプタ
ー抗体と称する場合がある）を用いてCCケモカインレセ
プターを測定できるほか、組織染色等によりCCケモカイ
ンレセプターを検出することもできる。これらの目的に
は抗体分子そのものを用いてもよく、また抗体分子のF
(ab')2、Fab'あるいはFabフラグメントを用いてもよ
い。本発明の抗CCケモカインレセプター抗体を用いるCC
ケモカインレセプターの定量法は、被験検体中の抗原量
もしくは抗原抗体複合体の量を化学的または物理的手段
により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用い
て作成した標準曲線より算出する測定法であれば、いず
れを用いてもよい。例えばサンドイッチ法、競合法、イ
ムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどが挙げら
れるが、感度および特異性の点でサンドイッチ法が特に
好ましい。標識化に用いる標識剤としては、放射性同位
元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが挙げられる。放
射性同位元素としては、例えば［¹²⁵I］［¹³¹I］［³H］
［¹⁴C］［³⁵S］などが、酵素としては安定で比活性の大
きいものが好ましく、例えばアルカリホスファターゼ、
西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、
β−グルコシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが、蛍光
物質としてはフルオレッセインイソチオシアネート、フ
ルオレスカミンなどが、発光物質としてはルミノール、
ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどがそ
れぞれ挙げられる。抗原あるいは抗体の固定化には物理
吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素
の固定化に用いられている化学結合による方法でもよ
い。担体としてはアガロース、デキストラン、セルロー
スなどの不溶性多糖類、またはポリスチレン、ポリアク
リルアミド、シリコンなどの合成樹脂、あるいはガラス
などが挙げられる。

【００３３】サンドイッチ法においてはまず、固定化し
た抗CCケモカインレセプター抗体と被験検体とを反応さ
せ（一次反応）、ついで標識化抗CCケモカインレセプタ
ー抗体を反応させ（二次反応）たのち、固定化担体上の
標識剤の活性を測定することにより被験検体中のCCケモ
カインレセプターを定量できる。一次反応と二次反応と
を逆の順序で行ってもよく、また同時に行ってもよい。
サンドイッチ法による免疫測定法において、固定化抗CC
ケモカインレセプター抗体と標識化抗CCケモカインレセ
プター抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感
度の向上等の目的で２種以上の抗体の混合物であっても
よい。サンドイッチ法によるCCケモカインレセプターの
測定法においては、一次反応と二次反応に用いられる抗
CCケモカインレセプター抗体は、CCケモカインレセプタ
ーに対する認識部位が相異なる抗体であることが好まし
い。すなわち、例えば一次反応に用いられる抗体がCCケ
モカインレセプターのＣ末端部を認識する場合は、二次
反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ末端部以外の例
えばＮ末端部を認識する抗体などが用いられる。

【００３４】本発明の抗CCケモカインレセプター抗体を
用いたCCケモカインレセプターの定量は、サンドイッチ
法のほかに他の測定方法、例えば競合法、イムノメトリ
ック法あるいはネフロメトリーなどによっても行うこと
ができる。競合法では、標識化抗原と被験検体中の抗原
とを抗体に対して競合的に反応させたのち、抗体に結合
した標識化抗原（B）と未反応の標識化抗原（F）とを分
離し（B/F分離）、BあるいはFのいずれかの標識量を測
定することにより被験検体中の抗原量を定量する。本測
定法には、第一抗体として可溶性抗体を用い、ポリエチ
レングリコールあるいは第一抗体に対する第二抗体を用
いてB/F分離を行う液相法、第一抗体として固定化抗体
を用いる固相法、あるいは第一抗体として可溶性抗体を
用い第一抗体に対する第二抗体として固定化抗体を用い
る固相法などがある。イムノメトリック法では、被験検
体中の抗原と固定化抗原とを一定量の標識化抗体に対し
て競合的に反応させたのち固相と液相とを分離する。あ
るいは、被験検体中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反
応させ、続いて固定化抗原を加えて未反応の標識化抗体
を固定化抗原に結合させたのち固相と液相とを分離す
る。次に、いずれかの相の標識量を測定して被験検体中
の抗原を定量する。ネフロメトリーでは、ゲル内あるい
は溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の
量を測定する。被験検体中の抗原量がわずかであり少量
の沈降物しか得られない場合にも、レーザーの散乱を利
用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられ
る。

【００３５】これらの免疫学的測定法を本発明の測定方
法に適用するにあたって、その一般的な技術手段の詳細
は以下の総説や成書などを参照することができる。例え
ば入江 寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、1974
年）、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談
社、1979年）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学
書院、1978年）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法、第２
版」（医学書院、1982年）、石川栄治ら編「酵素免疫測
定法、第３版」（医学書院、1987年）、Methods in Enz
ymology, vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part
A)、Methods in Enzymology, vol. 73 (Immunochemic
al Techniques (Part B)、Methods in Enzymology, vo
l. 74 (Immunochemical Techniques (Part C)、Methods
in Enzymology, vol. 84 (Immunochemical Techniques
(Part D: Selected Immunoassays)、Methods in Enzym
ology, vol. 92 (Immunochemical Techniques(Part E:
Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Met
hods)、Methodsin Enzymology, vol. 121 (Immunochem
ical Techniques (Part I: HybridomaTechnology and M
onoclonal Antibodies) （以上アカデミックプレス社）
などを参照することができる。以上のように、本発明の
抗CCケモカインレセプター抗体を用いることによりCCケ
モカインレセプターを高感度で定量することができる。

【００３６】（２）CCケモカインの定量法 本発明のCCケモカインレセプタータンパク質、その部分
ペプチドまたはそれらの塩は、リガンドであるMIP-1α
などのCCケモカインに対して特異的な結合性を有してい
るので、被験検体中のMIP-1αなどのCCケモカインを高
感度で定量することができる。これらのMIP-1αなどのC
Cケモカインは、該CCケモカインレセプターと特異的に
結合するものであれば、ヒト由来、ラット由来、マウス
由来あるいはその他の動物由来のCCケモカインであって
もよい。本発明のMIP-1αなどのCCケモカインの定量法
は、例えば競合法と組み合せることによって行うことが
できる。すなわち被験検体を本発明のCCケモカインレセ
プタータンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩
と接触させることにより、被験検体中のMIP-1αなどのC
Cケモカインを定量することができる。具体的には、例
えば入江 寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、19
74年）あるいは入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」
（講談社、1979年）などに記載の方法あるいはそれに準
じる方法に従って行うことができる。

【００３７】（３）CCケモカインレセプター親和性化合
物のスクリーニング方法 本発明のCCケモカインレセプタータンパク質、その部分
ペプチドまたはそれらの塩はCCケモカインレセプター親
和性化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬
として有用である。該CCケモカインレセプター親和性化
合物には、CCケモカインレセプターアンタゴニストおよ
びCCケモカインレセプターアゴニストが含まれる。該親
和性化合物は、ラット由来のCCケモカインレセプターの
みならず該CCケモカインレセプターと相同性が高くMIP-
1αなどに高親和性で結合する他種の動物のレセプター
（例えばヒトMIP-1α/RANTESレセプターなど）にも親和
性を示すことが予想できる。本スクリーニング方法で使
用される被験化合物としては、例えばペプチド、タンパ
ク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、微生物発酵生
産物、海洋生物抽出液、植物抽出液、細胞抽出液、動物
組織抽出液などが挙げられる。これらの被験化合物は新
規な化合物であってもよいし、公知の化合物であっても
よい。スクリーニングに供された被験化合物のうち、本
発明のCCケモカインレセプタータンパク質、その部分ペ
プチドまたはそれらの塩に結合することにより、CCケモ
カインレセプターに対するリガンドとCCケモカインレセ
プタータンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩
との結合を阻害する化合物をCCケモカインレセプター親
和性化合物またはその塩の候補化合物として選択するこ
とができる。CCケモカインレセプター親和性化合物のう
ち、CCケモカインレセプターに対するリガンドと、CCケ
モカインレセプタータンパク質、その部分ペプチドまた
はそれらの塩との結合を阻害するが、CCケモカインレセ
プターを介した細胞刺激活性（例えば細胞遊走、細胞内
Ca²⁺濃度の変動、Gタンパク質の活性化、イノシトール
リン脂質の産生、アラキドン酸の遊離、cAMPの生成、ヒ
スタミンなどの炎症性メディエーターの遊離、脱顆粒、
細胞膜電位の変動、pHの変動、膜タンパク質あるいは細
胞内タンパク質の活性化、膜タンパク質あるいは細胞内
タンパク質のリン酸化などを促進あるいは抑制する活性
など）を有しない化合物をCCケモカインレセプターアン
タゴニストとして選択することができる。また、CCケモ
カインレセプター親和性化合物のうち、CCケモカインレ
セプターに対するリガンドと、CCケモカインレセプター
タンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩との結
合を阻害し、かつCCケモカインレセプターを介した細胞
刺激活性（例えば細胞遊走、細胞内Ca²⁺濃度の変動、G
タンパク質の活性化、イノシトールリン脂質の産生、ア
ラキドン酸の遊離、cAMPの生成、ヒスタミンなどの炎症
性メディエーターの遊離、脱顆粒、細胞膜電位の変動、
pHの変動、膜タンパク質あるいは細胞内タンパク質の活
性化、膜タンパク質あるいは細胞内タンパク質のリン酸
化などを促進あるいは抑制する活性など）を有する化合
物をCCケモカインレセプターアゴニストとして選択する
ことができる。

【００３８】本発明は、（１）CCケモカインレセプター
タンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩と被験
化合物とを接触させることを特徴とするCCケモカインレ
セプター親和性化合物またはその塩のスクリーニング方
法、および（２）CCケモカインレセプタータンパク質を
含有する細胞または該細胞から得られるCCケモカインレ
セプタータンパク質を含有する細胞膜画分と被験化合物
とを接触させることを特徴とするCCケモカインレセプタ
ー親和性化合物またはその塩のスクリーニング方法を提
供する。

【００３９】具体的には本発明は、 （１）（ｉ）CCケモカインレセプターに対するリガンド
をCCケモカインレセプタータンパク質、その部分ペプチ
ドまたはそれらの塩に接触させた場合と、（ｉｉ）CCケ
モカインレセプターに対するリガンドおよび被験化合物
を同時にCCケモカインレセプタータンパク質、その部分
ペプチドまたはそれらの塩に接触させた場合との比較を
行うことを特徴とするCCケモカインレセプター親和性化
合物またはその塩のスクリーニング方法、および （２）（ｉ）CCケモカインレセプターに対するリガンド
を、CCケモカインレセプタータンパク質を含有する細胞
または該細胞から得られるCCケモカインレセプタータン
パク質を含有する細胞膜画分と接触させた場合と、（ｉ
ｉ）CCケモカインレセプターに対するリガンドおよび被
験化合物を同時に、CCケモカインレセプタータンパク質
を含有する細胞または該細胞から得られるCCケモカイン
レセプタータンパク質を含有する細胞膜画分と接触させ
た場合との比較を行うことを特徴とするCCケモカインレ
セプター親和性化合物またはその塩のスクリーニング方
法を提供する。

【００４０】より具体的には、本発明のスクリーニング
方法において（ｉ）と（ｉｉ）の場合に、CCケモカイン
レセプタータンパク質を含有する細胞または該細胞から
得られるCCケモカインレセプタータンパク質を含有する
細胞膜画分、あるいはCCケモカインレセプタータンパク
質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に対するCCケモ
カインレセプターのリガンドの結合量、もしくはリガン
ドによる細胞刺激活性などを測定して、比較することを
特徴とする。すなわち、本発明は、 （１ａ）（ｉ）CCケモカインレセプターに対する標識し
たリガンドを、本発明のCCケモカインレセプタータンパ
ク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に接触させた
場合と、（ｉｉ）CCケモカインレセプターに対するリガ
ンドおよび被験化合物を同時に，本発明のCCケモカイン
レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはそれら
の塩に接触させた場合の、該レセプタータンパク質、そ
の部分ペプチドまたはそれらの塩に対する標識したリガ
ンドの結合量を測定し、比較することを特徴とするCCケ
モカインレセプター親和性化合物またはその塩のスクリ
ーニング方法、 （１ｂ）（ｉ）CCケモカインレセプターに対する標識し
たリガンドを、本発明のCCケモカインレセプタータンパ
ク質を含有する細胞または該細胞から得られるCCケモカ
インレセプタータンパク質を含有する細胞膜画分に接触
させた場合と、（ｉｉ）CCケモカインレセプターに対す
る標識したリガンドおよび被験化合物を同時に、CCケモ
カインレセプタータンパク質を含有する細胞または該細
胞から得られるCCケモカインレセプタータンパク質を含
有する細胞膜画分に接触させた場合の、該細胞または該
細胞膜画分に対する標識したリガンドの結合量を測定
し、比較することを特徴とするCCケモカインレセプター
親和性化合物またはその塩のスクリーニング方法、

【００４１】（２ｂ）（ｉ）CCケモカインレセプターに
対するリガンドを、CCケモカインレセプタータンパク質
を含有する細胞または該細胞から得られるCCケモカイン
レセプタータンパク質を含有する細胞膜画分と接触させ
た場合と、（ｉｉ）CCケモカインレセプターに対するリ
ガンドおよび被験化合物を同時に、CCケモカインレセプ
タータンパク質を含有する細胞または該細胞から得られ
るCCケモカインレセプタータンパク質を含有する細胞膜
画分と接触させた場合の、CCケモカインレセプターを介
した細胞刺激活性（例えば細胞遊走、細胞内Ca²⁺濃度の
変動、Gタンパク質の活性化、イノシトールリン脂質の
産生、アラキドン酸の遊離、cAMPの生成、ヒスタミンな
どの炎症性メディエーターの遊離、脱顆粒、細胞膜電位
の変動、pHの変動、膜タンパク質あるいは細胞内タンパ
ク質の活性化、膜タンパク質あるいは細胞内タンパク質
のリン酸化などを促進あるいは抑制する活性など）を測
定することを特徴とするCCケモカインレセプターアンタ
ゴニストのスクリーニング方法、および、 （３ｂ）CCケモカインレセプターに対するリガンドを、
CCケモカインレセプタータンパク質を含有する細胞また
は該細胞から得られるCCケモカインレセプタータンパク
質を含有する細胞膜画分と接触させた場合の、CCケモカ
インレセプターを介した細胞刺激活性（例えば細胞遊
走、細胞内Ca²⁺濃度の変動、Gタンパク質の活性化、イ
ノシトールリン脂質の産生、アラキドン酸の遊離、cAMP
の生成、ヒスタミンなどの炎症性メディエーターの遊
離、脱顆粒、細胞膜電位の変動、pHの変動、膜タンパク
質あるいは細胞内タンパク質の活性化、膜タンパク質あ
るいは細胞内タンパク質のリン酸化などを促進あるいは
抑制する活性など）を測定することを特徴とするCCケモ
カインレセプターアゴニストのスクリーニング方法を提
供する。

【００４２】上記の（１ａ）または（１ｂ）のスクリー
ニング方法において、CCケモカインレセプタータンパク
質を含有する細胞または該細胞から得られるCCケモカイ
ンレセプタータンパク質を含有する細胞膜画分、もしく
は本発明のCCケモカインレセプタータンパク質、その部
分ペプチドまたはそれらの塩と結合することにより、CC
ケモカインレセプターに対するリガンドとCCケモカイン
レセプタータンパク質を含有する細胞または該細胞膜画
分、もしくは本発明のCCケモカインレセプタータンパク
質、その部分ペプチドまたはそれらの塩との結合を阻害
する化合物をヒトCCケモカインレセプター親和性化合物
またはその塩の候補化合物として選択することができ
る。また、上記の（２ｂ）のスクリーニング方法におい
て、CCケモカインレセプターに対するリガンドと本発明
のCCケモカインレセプタータンパク質を含有する細胞ま
たは該細胞から得られるCCケモカインレセプタータンパ
ク質を含有する細胞膜画分との結合を阻害するが、ラッ
トCCケモカインレセプターを介した細胞刺激活性（例え
ば細胞遊走、細胞内Ca²⁺濃度の変動、Gタンパク質の活
性化、イノシトールリン脂質の産生、アラキドン酸の遊
離、cAMPの生成、ヒスタミンなどの炎症性メディエータ
ーの遊離、脱顆粒、細胞膜電位の変動、pHの変動、膜タ
ンパク質あるいは細胞内タンパク質の活性化、膜タンパ
ク質あるいは細胞内タンパク質のリン酸化などを促進あ
るいは抑制する活性など）を有しない化合物をCCケモカ
インレセプターアンタゴニストとして選択することがで
きる。さらに、上記の（３ｂ）のスクリーニング方法に
おいて、CCケモカインレセプターに結合し、該レセプタ
ーを介した細胞刺激活性（例えば細胞遊走、細胞内Ca²⁺
濃度の変動、Gタンパク質の活性化、イノシトールリン
脂質の産生、アラキドン酸の遊離、cAMPの生成、ヒスタ
ミンなどの炎症性メディエーターの遊離、脱顆粒、細胞
膜電位の変動、pHの変動、膜タンパク質あるいは細胞内
タンパク質の活性化、膜タンパク質あるいは細胞内タン
パク質のリン酸化などを促進あるいは抑制する活性な
ど）を有する化合物をCCケモカインレセプターアゴニス
トとして選択することができる。

【００４３】以下に本発明のスクリーニング方法を具体
的に説明する。CCケモカインレセプタータンパク質を含
有する細胞としては、本発明のCCケモカインレセプター
タンパク質をコードするＤＮＡを導入することにより宿
主細胞を形質転換せしめて得られた、該ＤＮＡを含有し
CCケモカインレセプタータンパク質を発現した形質転換
体や、CCケモカインレセプタータンパク質を含有する天
然の細胞（例えば、ラットマクロファージなど）が挙げ
られる。上記の宿主細胞としては、例えば、大腸菌、枯
草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。CC
ケモカインレセプタータンパク質、その部分ペプチドま
たはそれらの塩を含有するものとしては、それ自体公知
の方法に従って精製したCCケモカインレセプタータンパ
ク質または該CCケモカインレセプタータンパク質の部分
ペプチドであってもよい。

【００４４】CCケモカインレセプタータンパク質を含有
する細胞膜画分とは、CCケモカインレセプタータンパク
質を含有する細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で
破砕して得られる細胞膜を多く含む画分をいう。細胞の
破砕方法としては、例えばPotter-Elvehjem型ホモジナ
イザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーや
ポリトロン（Kinematica社製）による破砕、超音波によ
る破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細い
ノズルから噴出させることによる破砕、凍結融解などが
挙げられる。細胞膜を分画するには、分画遠心分離法や
密度勾配遠心分離法などの方法が主として用いられる。
例えば細胞破砕液を低速（500〜3000 rpm）で短時間
（通常約1〜10分間）遠心し、上清をさらに高速（15000
〜30000 rpm）で通常約0.5〜2時間遠心し、得られる沈
澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したラットCC
ケモカインレセプタータンパク質と細胞由来のリン脂質
や膜タンパク質などの膜成分が多く含まれる。本発明の
CCケモカインレセプタータンパク質を含有する細胞やそ
の細胞膜画分中のCCケモカインレセプタータンパク質の
量は、１細胞あたり10³〜10⁷分子であるのが好ましく、
10⁴〜10⁶分子であるのが好適である。

【００４５】本発明のスクリーニング方法において、CC
ケモカインレセプタータンパク質をコードするＤＮＡを
導入することにより宿主細胞を形質転換せしめて得られ
た、該ＤＮＡを含有しCCケモカインレセプタータンパク
質を発現した形質転換体（例えばラットCCケモカインレ
セプタータンパク質を含有するCHO細胞）を用いる場合
は、該CHO細胞を生細胞のまま用いることができる。あ
るいは、該CHO細胞をそれ自体公知の方法に従ってグル
タルアルデヒドやパラホルムアルデヒドなどで固定化し
た後、用いることもできる。

【００４６】本発明のスクリーニング方法において使用
されるCCケモカインレセプターに対するリガンドとして
は、例えばヒトMIP-1α、ヒトRANTES、ラットMIP-1α、
ラットRANTESなどが挙げられる。CCケモカインレセプタ
ーに対する標識したリガンドとしては、たとえば
［¹²⁵I］［³⁵S］、［³H］、［¹⁴C］などで標識した上記
のリガンドなどを用いることができる。あるいは、フル
オレッセインなどで蛍光標識したリガンド、または西洋
ワサビペルオキシダーゼなどで酵素標識したリガンド、
あるいは遺伝子工学的に作製したリガンドとアルカリフ
ォスファターゼなどのタンパク質との遺伝子工学的に作
製した融合タンパク質を用いることもできる。あるい
は、MIP-1αやRANTESなどのリガンドの部分アミノ酸配
列を有するペプチドを用いることもできる。これらの標
識体は自体公知の方法に従って作製することができる。
例えば［¹²⁵I］で標識されたヒトMIP-1αおよびヒトRAN
TESがデュポンより市販されているので、それらを利用
できる。

【００４７】具体的には、上記の（１ａ）または（１
ｂ）のスクリーニング方法を実施するには、まず、本発
明のCCケモカインレセプタータンパク質を含有するCHO
細胞または該CHO細胞から得られるCCケモカインレセプ
タータンパク質を含有する細胞膜画分、またはCCケモカ
インレセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはそ
れらの塩を、スクリーニングに適した緩衝液に懸濁する
ことによりレセプター標品を調製する。緩衝液として
は、リガンドとレセプターとの結合を阻害しないもので
あれば何でもよく、例えばpH 6〜8のリン酸緩衝液、ト
リス−塩酸緩衝液、PBS、HBSSなどが用いられる。ま
た、非特異的結合を低減させる目的で、ウシ血清アルブ
ミンなどのタンパク質、CHAPSやTween 80 、ジギトニン
などの界面活性剤を加えることもできる。さらに、タン
パク質分解酵素によるCCケモカインレセプタータンパク
質の分解を抑えるために、PMSF、ペプスタチン、ロイペ
プチンなどのタンパク質分解酵素阻害剤を添加すること
もできる。また、CCケモカインレセプタータンパク質を
含有するCHO細胞を培養器に接着させたままスクリーニ
ングに用いることもできる。約0.01〜10 mlの該レセプ
ター発現細胞または該レセプター標品に、一定量（約5,
000 〜 1,000,000 cpm）の標識体と約10^-3 〜 10^-10 M
の濃度の合成化合物などの被験化合物あるいは適宜に希
釈した微生物発酵生産物などの被験化合物とを同時に添
加し、約0〜50℃（望ましくは約4〜37 ℃）で、約0.5
〜24時間（望ましくは約0.5〜3時間）反応させる。反応
後、適量の緩衝液で洗浄したのち該レセプター発現細胞
または該レセプター標品に残存する放射線量をガンマカ
ウンター、液体シンチレーションカウンターなどで測定
する。反応時に大過剰の非標識リガンドを共存させたと
きの残存放射線量を非特異的結合量とする。あるいは、
CCケモカインレセプタータンパク質を含有しないコント
ロールのCHO細胞または該CHO細胞から得られるCCケモカ
インレセプタータンパク質を含有しない細胞膜画分を用
いたときの残存放射線量を非特異的結合量とすることも
できる。共存物のないときの残存放射線量を総結合量と
するとき、総結合量から非特異的結合量を差し引いた値
が特異的結合量である。反応液に添加することにより、
この特異的結合量を低下させる被験化合物をCCケモカイ
ンレセプター親和性化合物またはその塩の候補化合物と
して選択することができる。

【００４８】また、上記（２ｂ）または（３ｂ）のスク
リーニング方法を実施するためには、CCケモカインレセ
プターを介した細胞刺激活性（例えば細胞遊走、細胞内
Ca²⁺濃度の変動、Gタンパク質の活性化、イノシトール
リン脂質の産生、アラキドン酸の遊離、cAMPの生成、ヒ
スタミンなどの炎症性メディエーターの遊離、脱顆粒、
細胞膜電位の変動、pHの変動、膜タンパク質あるいは細
胞内タンパク質の活性化、膜タンパク質あるいは細胞内
タンパク質のリン酸化などを促進あるいは抑制する活性
など）を公知の方法または市販の測定用キットを用いて
測定することができる。具体的には、本発明のCCケモカ
インレセプタータンパク質を含有するCHO細胞を培養
後、細胞懸濁液を調製し、ケモタキシスチャンバーを用
いてリガンドに応答した該CHO細胞の遊走活性を測定で
きる。あるいは、該CHO細胞懸濁液にfura-2やfura-PE3
などの蛍光指示薬を添加することによりCHO細胞にこれ
らの蛍光指示薬を負荷し、蛍光分光光度計などを用いて
リガンドの刺激による細胞内Ca²⁺濃度の変動を測定でき
る。

【００４９】本発明のスクリーニング用キットは、本発
明のCCケモカインレセプタータンパク質を含有するCHO
細胞もしくは該CHO細胞から得られるCCケモカインレセ
プタータンパク質を含有する細胞膜画分、または本発明
のCCケモカインレセプタータンパク質、その部分ペプチ
ドまたはそれらの塩を含有するものである。本発明のス
クリーニング用キットの例としては、次のものが挙げら
れる。 ［スクリーニング用試薬］ (a)測定用緩衝液および洗浄用緩衝液 DMEM (GIBCO BRL) に、0.5%のウシ血清アルブミン（BS
A）を添加したもの。孔径0.2μmのフィルターで濾過滅
菌し、4℃で保存するかあるいは用時調製してもよい。 (b)CCケモカインレセプタータンパク質標品 CCケモカインレセプタータンパク質を含有するCHO細胞
を、96ウェルマイクロプレートに5x10⁴個/ウェルで継代
し、37℃で5%CO₂、95% airの条件下で１日間培養したも
の。 (c)CCケモカインレセプターに対する標識したリガンド ［¹²⁵I］などで標識した市販のヒトMIP-1αやヒトRANTE
Sなどのリガンド。溶液の状態のものを4℃あるいは−20
℃で保存し、用時に測定用緩衝液で0.2〜2.0 nMに希釈
する。 (d)CCケモカインレセプターに対するリガンドの標準
液。 CCケモカインレセプターに対するリガンド（例えば、ヒ
トMIP-1αやヒトRANTESなど）をDMEM/0.5%BSAで10μMに
なるように溶解し、−80℃〜−20℃で保存する。 ［測定法］ (a)96ウェルマイクロプレートでCCケモカインレセプタ
ータンパク質を含有するCHO細胞を培養し、培地を除い
た後、35μl/ウェルのDMEM/0.5%BSAを添加する。 (b)10^-10〜10^-3 Mの被験化合物を5μl/ウェル添加した
後、0.2〜2.0 nMの標識リガンドを10μl/ウェル添加
し、室温で30〜60分間反応させる。非特異的結合量を知
るために被験化合物のかわりに0.2〜2.0 μMの非標識リ
ガンドを10μl/ウェル添加する。 (c)反応液を除去し、200μl/ウェルのPBSで２回洗浄
し、25μl/ウェルのエタノールを添加して撹拌し、さら
に200μl/ウェルのシンチレーター（MicroScint-20, Pa
ckard Instrument Company, Meriden, CT, USA）を添加
して撹拌する。 (d)細胞に結合した放射活性をTopCount（ Packard ）で
測定し、percent of maximum binding（PMB）を次の式
〔数１〕で求める。

【数１】 ＰＭＢ：特異的最大結合量に対する% Ｂ ：被験化合物存在下での結合量 ＮＳＢ：非特異的結合量 Ｂ₀ ：最大結合量

【００５０】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られるCCケモカインレセプ
ター親和性化合物またはその塩は、該スクリーニング方
法または該スクリーニング用キットを用いて被験化合物
の中から選択される化合物またはその塩である。被験化
合物は、例えばペプチド、タンパク質、非ペプチド性化
合物、合成化合物、微生物発酵生産物、海洋生物抽出
液、植物抽出液、細胞抽出液、動物組織抽出液などが挙
げられ、新規な化合物であってもよいし、公知の化合物
であってもよい。これらのCCケモカインレセプター親和
性化合物またはその塩は、CCケモカインレセプターに対
するリガンドとCCケモカインレセプタータンパク質との
結合を阻害する化合物である。該化合物には、CCケモカ
インレセプターを介した細胞刺激活性を有しない化合物
（CCケモカインレセプターアンタゴニスト）と該細胞刺
激活性を有する化合物（CCケモカインレセプターアゴニ
スト）またはそれらの塩が含まれる。本発明のスクリー
ニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得ら
れた該CCケモカインレセプター親和性化合物の構造式の
一部を、付加あるいは置換などにより変換した化合物な
ども本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング
用キットを用いて得られるCCケモカインレセプター親和
性化合物に含まれる。該CCケモカインレセプター親和性
化合物の塩としては、生理学的に許容される塩基（例、
アルカリ金属等）や酸（有機酸、無機酸）との塩が用い
られるが、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好
ましい。このような塩としては、例えば無機酸（例えば
塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有
機酸（例えば酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マ
レイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シ
ュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホ
ン酸）との塩などが用いられる。

【００５１】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られるCCケモカインレセプ
ター親和性化合物またはその塩、すなわち、CCケモカイ
ンレセプターアンタゴニストあるいはCCケモカインレセ
プターアゴニストは、安全で低毒性の化合物であり、種
々のウイルス性疾患あるいは感染性疾患（例えば急性ウ
イルス性脳炎、急性バクテリア性髄膜炎、ヘリコバクタ
ー・ピロリ感染症、肺炎、A型肝炎、B型肝炎、C型肝
炎、単純ヘルペスウイルス感染症、水痘-帯状疱疹ウイ
ルス感染症、エイズ感染症、インフルエンザ感染症、侵
襲性ブドウ状球菌感染症、結核など）、腫瘍（例えば膀
胱ガン、乳ガン、子宮頸ガン、慢性リンパ性白血病、慢
性骨髄性白血病、大腸ガン、多発性骨髄腫、悪性骨髄
腫、前立腺ガン、肺ガン、胃ガン、ホジキン病など）、
アレルギー性疾患（例えば気管支喘息、アトピー性皮膚
炎、アレルギー性鼻炎など）、炎症性疾患（例えば動脈
硬化、心臓移植後に発症する動脈硬化、（慢性）関節リ
ウマチ、腎炎など）、糖尿病性疾患（例えば糖尿病、糖
尿病性腎症、糖尿病性合併症、糖尿病性網膜症、糖尿病
性網膜炎、糖尿病性細小血管症など）、中枢性疾患（例
えばアルツハイマー病、てんかん、発熱、疼痛、痴呆な
ど）、自己免疫性疾患（例えば、多発性硬化症、全身性
エリテマトーデスなど）、高脂血症、高コレステロール
血症、透析による血小板減少症、脊髄損傷、骨粗鬆症、
潰瘍性大腸炎、消化性潰瘍、敗血症（ショック）、肺・
心臓における再灌流障害、不安定狭心症、一過性脳虚血
発作、心弁膜症、臓器移植後拒絶反応、血管形成術後再
狭窄、腎不全、子宮内膜症、肺線維症、成人呼吸逼迫症
候群などの予防・治療剤として有用である。また、本発
明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キット
を用いて得られるCCケモカインレセプター親和性化合物
またはその塩は、CCケモカインレセプターに結合するこ
とができるので、レセプター発現細胞や生体内における
CCケモカインレセプタータンパク質の検出または定量用
の試薬としても有用である。

【００５２】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られるCCケモカインレセプ
ター親和性化合物またはその塩を動物（マウス、ラッ
ト、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、ヒツ
ジ、ブタ、ウシ、サル、マントヒヒ、チンパンジーな
ど）またはヒトなどに医薬として使用する場合、常套手
段に従って実施することができる。例えば必要に応じて
糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイク
ロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくは
それ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、また
は懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。
例えば該化合物またはその塩を生理学的に認められる単
体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合
剤などとともに一般に認められた製薬実施に要求される
単位用量形態で混和することによって製造することがで
きる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲
の適当な容量が得られるようにするものである。錠剤、
カプセル剤などに混和することができる添加剤として
は、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガント、ア
ラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような
賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などの
ような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑
剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペ
パーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤
などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合
には、上記の材料にさらに油脂のような液状単体を含有
することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸
留水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油な
どのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させる
などの通常の製剤実施に従って処方することができる。

【００５３】注射用の水溶液としては、例えば生理食塩
水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えばD-
ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナ
トリウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助剤、例
えばアルコール（例えばエタノール）、ポリアルコール
（例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコー
ル）、非イオン性界面活性剤（例えばポリソルベート８
０(TM)、HCO-50）などと併用してもよい。油性液として
はゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安
息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用しても
よい。また、緩衝剤（例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナト
リウム緩衝液）、無痛化剤（例えば塩化ベンザルコニウ
ム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えばベンジルア
ルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合し
てもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに
充填させる。このようにして得られる製剤は安全で低毒
性であるので、例えば温血哺乳動物（例えばマウス、ラ
ット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、ヒ
ツジ、ブタ、ウシ、サル、マントヒヒ、チンパンジー、
ヒトなど、特にヒト）に対して投与することができる。
該CCケモカインレセプター親和性化合物またはその塩の
投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場
合、一般的に成人（体重約60 kgとして）においては、
１日あたり約0.1から100 mg、好ましくは1.0から50 m
g、より好ましくは約1.0から20 mgである。非経口的に
投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓
器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注
射剤の形では通常成人（体重約60 kgとして）において
は、１日あたり約0.01から30 mg、好ましくは0.1から20
mg、より好ましくは約0.1から10 mg程度を静脈注射に
より投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体
重60 kg当たりに換算した量を投与することができる。

【００５４】（４）本発明のCCケモカインレセプタータ
ンパク質をコードするＤＮＡを有する動物の作製 本発明のCCケモカインレセプタータンパク質をコードす
るDNAを用いて、本発明のCCケモカインレセプタータン
パク質を発現するトランスジェニック動物を作製するこ
とができる。動物としては、温血動物（例えば、マウ
ス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イ
ヌ、サルなど）が挙げられるが、特に、マウスやラット
などが好ましい。本発明のCCケモカインレセプタータン
パク質をコードするＤＮＡを対象動物に発現させるにあ
たっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させ得るプロモー
ターの下流に結合した遺伝子コンストラクトを作製し、
対象動物受精卵へのマイクロインジェクションを行う。
このようにして、CCケモカインレセプタータンパク質を
高産生するトランスジェニック動物を作製できる。この
プロモーターとしては、例えばウイルス由来プロモータ
ーやメタロチオネイン等の発現プロモーターを使用でき
る。作製されたトランスジェニック動物の胚芽細胞にお
いてCCケモカインレセプタータンパク質が存在すること
は、トランスジェニック動物の子孫が全てその胚芽細胞
および体細胞の全てにCCケモカインレセプタータンパク
質を有することを意味し、遺伝子を受け継いだこの種の
動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てにCCケモ
カインレセプタータンパク質を有する。本発明のCCケモ
カインレセプタータンパク質ＤＮＡを有するトランスジ
ェニック動物は、交配により遺伝子を安定に保持するこ
とを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境
で飼育継代を行うことができる。さらに、該ＤＮＡを保
有する雌雄の動物を交配することにより、該ＤＮＡを相
同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、こ
の雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該Ｄ
ＮＡを有するように繁殖継代することができる。本発明
のCCケモカインレセプタータンパク質を高発現するトラ
ンスジェニック動物は、CCケモカインレセプターに対す
る親和性化合物のスクリーニングに有用である。また、
本発明のトランスジェニック動物を、組織培養のための
細胞源として使用することもできる。すなわち、トラン
スジェニック動物から本発明のCCケモカインレセプター
タンパク質を有する細胞を得て標準組織培養技術により
培養することができる。また、高発現細胞株が樹立する
ことにより、本発明のCCケモカインレセプタータンパク
質を単離精製することも可能である。

【００５５】本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などに対する略号は、IUPAC-IUB Commission on Bi
ochemistry Nomenclatureによる略号あるいは当該分野
における慣用に基づく略号である。それらの例を以下に
示す。またアミノ酸の場合は、光学異性体があり得ると
きは特に明示しない限りＬ体を示す。 ＤＮＡ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ：アデニン Ｔ：チニン Ｇ：グアニン Ｃ：シトシン ＲＮＡ：リボ核酸 ｍＲＮＡ：メッセンジャ−リボ核酸

【００５６】G あるいはGly：グリシン A あるいはAla：アラニン V あるいはVal：バリン L あるいはLeu：ロイシン I あるいはIle：イソロイシン S あるいはSer：セリン T あるいはThr：スレオニン C あるいはCys：システイン M あるいはMet：メチオニン E あるいはGlu：グルタミン酸 D あるいはAsp：アスパラギン酸 K あるいはLys：リシン R あるいはArg：アルギニン H あるいはHis：ヒスチジン F あるいはPhe：フェニルアラニン Y あるいはTyr：チロシン W あるいはTrp：トリプトファン P あるいはPro：プロリン N あるいはAsn：アスパラギン Q あるいはGln：グルタミン BSA：ウシ血清アルブミン CHO：チャイニーズハムスター卵巣細胞 FBS：ウシ胎児血清 PBS：リン酸緩衝生理食塩水 SDS：ドデシル硫酸ナトリウム

【００５７】本願明細書の配列表の配列番号は、以下の
配列を示す。 〔配列番号：１〕ラット由来CCケモカインレセプター蛋
白質のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：２〕ラット由来CCケモカインレセプターｃ
ＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：３〕本発明のCCケモカインレセプター蛋白
質をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合
成ＤＮＡ。 〔配列番号：４〕本発明のCCケモカインレセプター蛋白
質をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合
成ＤＮＡ。 〔配列番号：５〕本発明のCCケモカインレセプター蛋白
質をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合
成ＤＮＡ。 〔配列番号：６〕本発明のCCケモカインレセプター蛋白
質をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合
成ＤＮＡ。

【００５８】後述の参考例１で得られた形質転換体エシ
ェリヒア コリ(Escherichia coli)JM109/pCCRは、平成
７年１２月１９日から通商産業省工業技術院生命工学工
業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−
５３４２として寄託されており、また平成８年１２月２
８日から財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）にＩＦＯ １５
９０９として寄託されている。後述の参考例２で得られ
たCHO/CCRは、平成７年１２月１９日から通商産業省工
業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番
号ＦＥＲＭ ＢＰ−５３４３として寄託されており、ま
た平成８年１２月２８日から財団法人発酵研究所（ＩＦ
Ｏ）にＩＦＯ ５０４５９として寄託されている。後述
の実施例２で得られたプラスミドprCCRをエシェリヒア
コリ(Escherichia coli)JM109に導入することにより
得られた形質転換体エシェリヒア コリ(Escherichia c
oli)JM109/prCCRは、平成８年２月１９日から通商産業
省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄
託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０５として寄託されてお
り、また平成８年２月１４日から財団法人発酵研究所
（ＩＦＯ）にＩＦＯ １５９２５として寄託されてい
る。また、後述の実施例２で得られたCHO(rCCR)は、平
成８年２月１９日から通商産業省工業技術院生命工学工
業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−
５４０４として寄託されており、また平成８年２月１４
日から財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）にＩＦＯ ５０４
６０として寄託されている。

【００５９】

【実施例】以下に実施例を示して、本発明をより詳細に
説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものでは
ない。

【００６０】

【参考例１】ヒトMIP-1α/RANTES受容体発現ベクターの
構築 PCR(polymerase chain reaction) 法によりhuman gland
cDNA library（U-937 cells activated by PMA, Clont
ech Laboratories Inc., Palo Alto, CA, USA）からNeo
teらの報告(Cell 72: 415 - 425 (1993))のKpn I (392)
〜Hinc II(886)に相当する約 500 bpのDNA断片を得た。
これをプローブとしてヒトMIP-1α/RANTES受容体cDNAを
得て、λgt 11のEco RI部位にクローン化した。Neoteら
の報告(Cell 72: 415−425(1993))では未発表であった
5' 側の非翻訳領域の塩基配列を決定し、5'側−30の位
置に TthIII I サイトがあることを見出した。また、翻
訳領域の全塩基配列を決定しNeoteらの報告(Cell 72: 4
15−425 (1993))と完全に一致していることを確認し
た。なお、塩基配列の決定は全て蛍光DNAシークエンサ
ー（Model 373A, Applied Biosystems Inc., Foster Ci
ty, CA, USA）により行った。クローン化されたヒトMIP
-1α/RANTES受容体 cDNA を、以下のようにして動物細
胞発現用ベクターであるpAKKO-111HのSal IおよびNhe I
部位に導入し、プラスミド pCCR を構築した。まず、上
記のλgt 11をEco RIで処理することにより2つの断片を
得た。これらをpUC19（宝酒造、京都）のEco RI部位に
導入し、プラスミドpCR1とプラスミドpCR2を得た。次
に、5'側と3'側の非翻訳領域に切断部位がある制限酵素
TthIII IとBst XIを用いてpCR1とpCR2の一方のEco RI部
位を削除した。非翻訳領域のEco RI部位を削除したこれ
ら2つのプラスミドをSal I -EcoRIおよびXba I - Eco R
Iで消化することにより、2つのDNA断片を得た。これら
をpAKKO-111HのSal IとNhe I部位に導入してpCCRを得
た。

【００６１】

【参考例２】ヒトMIP-1α/RANTES受容体発現CHO細胞株
の樹立 ヒトMIP-1α/RANTES受容体発現プラスミドpCCRをリン酸
カルシウム法によりCHO(dhfr^-)細胞へ導入した。この導
入はCellPhect transfection kit（PharmaciaBiotech,
Uppsala, Sweden）を用いて添付説明書に従って行っ
た。CHO(dhfr^-細胞を直径10 cmのシャーレに1x10⁵ cell
s/10 ml/dishでまき、核酸（+）の非選択培地（10%透析
FBS(GIBCO BRL, Life Technologies Inc., Grand Islan
d, NY, USA)/MEM-α with RNA and DNA (GIBCO BRL)）
で24時間培養した。これらのシャーレに塩化セシウムに
よる精製を２回繰り返して得られたpCCR DNA（10μg/di
sh）とリン酸カルシウムの共沈懸濁物を均一に一滴ずつ
落した。CO₂インキュベーターで37℃、5% CO₂の条件下
で6時間培養した後、非選択培地で２回洗浄し、10 ml/d
ishの非選択培地を加えて2日間さらに培養した。その
後、核酸不含の選択培地（10%透析FBS/MEM-α without
RNA and DNA (GIBCO BRL)）にて4倍に拡大し培養を続け
た。3日ごとにフレッシュな選択培地に交換した。選択
培地での培養10日後に肉眼でコロニーが確認できた。さ
らに4日後にそれらのコロニー（dhfr⁺に形質転換した細
胞）を拾った。dhfr⁺に形質転換した120のクローンに対
する¹²⁵I-RANTES(Du Pont Company, Wilmington, DE, U
SA)の結合量を調べ、結合量の多いクローンを限界希釈
法により再クローン化し、ヒトMIP-1α/RANTES受容体を
高発現している細胞株CHO/CCRを得た。

【００６２】

【参考例３】結合アッセイによるヒトMIP-1α/RANTES受
容体発現の確認¹²⁵ I-RANTESおよび¹²⁵I-MIP-1α（Du Pont Company）を
用いた結合アッセイを以下のように行った。96 ウェル
マイクロプレート（Nunc, Roskilde, Denmark）に 5 x
10⁴ / 100μl / well のCHO/CCR細胞またはベクタープ
ラスミドpAKKO-111HをトランスフェクトしたCHO細胞（m
ock transfectants）をまき24 時間培養した。培地を除
き、DMEM/ 0.5 % BSA で希釈した5 nMの¹²⁵I-RANTESあ
るいは¹²⁵I-MIP-1αを50 μl / well 加え、室温で30分
間インキュベートした。その後200μl / well のPBSで2
回洗浄し、100 μl / wellの0.1 N NaOH / 1 % SDSを
加えて細胞に結合したリガンドを溶出した。結合量の測
定はγ−カウンター（Cobra II, Packard Instrument C
ompany, Meriden, CT, USA ）で行った。その結果、C
HO/CCR細胞に対して¹²⁵I-RANTESおよび¹²⁵I-MIP-1αは
よく結合した。これに対して、mock transfectantsに対
する結合量はいずれも低値であった。これらの結果か
ら、CHO/CCR細胞でのヒトMIP-1α/RANTES受容体の発現
が確認された。

【００６３】

【実施例１】ラットCC ケモカインレセプターｃＤＮＡ
のクローニング （１）ジゴキシゲニン標識ＰＣＲプローブ（DIG標識プ
ローブ）の調製 ラットCC ケモカインレセプターｃＤＮＡのクローニン
グを行うために、ヒトMIP-1α/RANTESレセプターｃＤＮ
Ａ の翻訳領域 282〜620 bp の部分に相当するラットCC
ケモカインレセプターのDIG標識プローブを以下のよう
に調製した。DIG labeling kit （Boehringer Mannhei
m, Mannheim, Germany）を用いて添付のプロトコールに
従って、ヒトMIP-1α/RANTESレセプター ｃＤＮＡ（ Ce
ll 72: 415-425 (1993); J. Exp. Med. 177: 1421-1427
(1993)）の塩基配列の一部分（169 〜798bpに対応する
部分）のDIG標識プローブを作製した。これを用いてプ
ラークハイブリダイゼーション法によりマウスマクロフ
ァージｃＤＮＡライブラリー（code # ML1005b, Clonte
ch Laboratories Inc., Palo Alto, CA, USA）より、ヒ
トMIP-1α/RANTESレセプター に相同性の高いマウスの
レセプターと推測される塩基配列をインサートに持つλ
gt 11ファージをクローン化した。得られたマウスのレ
セプターと推測される塩基配列の中で、ヒトMIP-1α/RA
NTESレセプターと相同性が高く、かつヒトMIP-1α/RANT
ESレセプターとヒトMCP-1レセプター（Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 91: 2752-2756; Biochem. Biophys.Res.
Commun. 202: 1156-1162）の間で相同性が高くない30塩
基からなる配列を２ヶ所選択した。これら２ヶ所の塩基
配列をもとに２本の合成ＤＮＡをプライマーとして作製
した（F01 および R01）。プライマー F01 はヒトMIP-1
α/RANTESレセプター ｃＤＮＡ の 282〜311bp の30塩
基対に相当する塩基配列の相補鎖で、 ５’−ＧＴＴＧＡＡＡＧＡＣＧＡＣＴＧＧＡＴＴＴＴＴ
ＧＧＴＧＡＴＧＣ−３’（配列番号：３） の配列を有する。プライマー R01 はヒトMIP-1α/RANTE
Sレセプター ｃＤＮＡの591〜620bpの30塩基対に相当す
る塩基配列の逆行相補鎖 で、 ５’−ＣＣＡＡＧＡＡＧＧＴＴＴＡＧＣＴＴＴＡＧＡＧ
ＣＴＴＧＡＡＡＣ−３’（配列番号：４） の配列を有する。なお、ＰＣＲ用プライマーとして用い
た合成ＤＮＡはすべて日本バイオサービス（埼玉）より
購入した。ラットマクロファージｃＤＮＡライブラリー
（code # RL1028b, Clontech Laboratories Inc.）を鋳
型としてプライマーF01とR01 によりサーマルサイクラ
ー（DNA Thermal Cycler 480, Perkin Elmer, Norwal
k, CT, USA ）でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物
をpCR2ベクター（Original TA cloninng kit, Invitrog
en, San Diego, CA, USA）にサブクローン化し、ラット
CCケモカインレセプター ｃＤＮＡの一部分と推測され
る塩基配列をインサートにもつプラスミド（pCR2-ratFR
1）を取得した。ＤＮＡ（pCR2-ratFR1）、プライマーF0
1 および R01 、Taq DNA polymerase（宝酒造、京都）
および DIG-DNA labeling mixture（Boehringer Mannhe
im ）を用いてＰＣＲを行った。ジゴキシゲニン標識の
有無を、ＰＣＲ産物を1.5%アガロースゲルで電気泳動し
てエチジウムブロマイドで染色し、非標識ＤＮＡに比べ
て分子量が増加したことを見ることにより確認した。こ
のようにして調製したDIG標識プローブはラットCCケモ
カインレセプターｃＤＮＡの翻訳領域 282〜620bpに相
当した。

【００６４】（２）DIG標識プローブを用いたハイブリ
ダイゼーション 上記の DIG 標識プローブと、λgt 11のEcoR Iサイトに
構築されたラットマクロファージ ｃＤＮＡライブラリ
ー（code # RL1028b, Clontech Laboratories Inc.）の
約10⁶個のプラークとのハイブリダイゼーションを行っ
た。直径約 10 cmのシャーレ上にプラークを形成したλ
ファージ ＤＮＡをフィルター（Colony /Plaque Screen
hybrydization transfer membrane, Du Pont Company
）にトランスファーし、アルカリ変性させて１本鎖Ｄ
ＮＡをフィルターに固定した。フィルターを洗浄溶液
（1% SDS / 40 mM sodium phosphate buffer (pH7.2)）
で65℃で３回洗浄し、アルカリフォスファターゼ標識抗
ジゴキシゲニン抗体（Boehringer Mannheim ）とインキ
ュベートした。その後 0.2 % Tween-20/150 mM NaCl/1
00 mM maleic acid (pH 7.5 )で２回洗浄して非特異的
結合を抑えた。ついで、100 mM NaCl/50 mM MgCl₂ /100
mM Tris-HCl (pH9.5)で100倍に希釈した発光基質 CSPD
（Boehringer Mannheim ）と室温で5〜10 分間反応さ
せ、X線フィルム（X-OMAT AR, Kodak, Rochester, NY）
へ室温で30〜40分間露光してシグナルを検出した。その
結果、ポジティブな 2クローンを得た。それらのインサ
ートＤＮＡをＰＣＲで増幅し、アガロースゲル電気泳動
で大きさを調べたところ、約 1.5 kbpと約1.1 kbpのＤ
ＮＡをインサートとして持つことがわかった。EcoR Iの
切断パターンからこの2つのｃＤＮＡは同一の配列を有
することが示唆されたので、大きい方（約 1.5 kbp ）
のインサートＤＮＡの塩基配列のみを決定した。得られ
たラット細胞由来のｃＤＮＡの塩基配列は、ヒトMIP-1
α/RANTESレセプターのＮ末端のアミノ酸を10残基に相
当する部分を欠いていたが、それ以降の ３’側の塩基
配列の翻訳領域で 80 %以上のアミノ酸が一致した。

【００６５】（３）Rapid amplification of 5'-cDNA e
nds PCR (5'-RACE PCR) ラットCCケモカインレセプターの翻訳領域の全長を得る
ために５’−ＲＡＣＥＰＣＲを行った。 Lewis ラット
の腹腔に0.3 % チオグリコール酸を投与し腹腔浸出細胞
を得て、QuickPrep micro mRNA purification kit（Pha
rmacia Biotech, Uppsala, Sweden）を用いてラット細
胞由来ｍＲＮＡを調製した。次いで、そのｍＲＮＡを用
いて、Marathon cDNA amplification kit（Clontech La
boratories Inc.）により５’−ＲＡＣＥ ＰＣＲを行
った。５’−ＲＡＣＥ ＰＣＲは添付のプロトコールに
従った。まずラット腹腔浸出細胞由来ｍＲＮＡを鋳型と
してMMLV逆転写酵素（ClontechLaboratories Inc.）に
より１本鎖ｃＤＮＡを合成した。ついでT4 DNA polymer
ase（Clontech Laboratories Inc.）で２本鎖ＤＮＡと
し、さらにその２本鎖ｃＤＮＡの両端にライゲーション
により特別なアダプターを付加して５’−ＲＡＣＥ Ｐ
ＣＲ用の鋳型ＤＮＡを調製した。プライマーとして R01
およびアダプター特異的なキットに添付のAP-1プライマ
ー を用いてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をpCR
2 ベクター（Original TA cloninng kit, Invitrogen）
に直接サブクローン化した。同ベクター内にサブクロー
ン化したＤＮＡフラグメントの塩基配列を決定し、ラッ
ト CCケモカインレセプター の５’側の翻訳領域全部の
配列をインサートとしてもつプラスミド（pCR2-rat CCR
h ( 5')）を得た。なお、ＤＮＡ塩基配列はすべてdyede
oxy terminator 法（PRISM ready reaction, Applied B
iosystems Inc., Foster City, CA, USA ）によってサ
ンプルを調製し、蛍光 DNAシークエンサー （ Model 37
3A, Applied Biosystems Inc.）により決定した。アダ
プター特異的なプライマー AP-1 とラットCCケモカイン
レセプター特異的なプライマーR02でＰＣＲを行うこと
により R02 プライマーよりも５’側の配列をもつＤＮ
Ａフラグメントが増幅される。増幅されたＤＮＡフラグ
メントを pCR2ベクターにサブクロン化し、最も大きな
インサートＤＮＡを持つプラスミドの塩基配列を決定
し、〔図１〕に示したように、５’側の翻訳領域を全て
含むＤＮＡフラグメントをインサートにもつことを確認
した。〔図１〕の傍点部分の配列が５’−ＲＡＣＥ Ｐ
ＣＲによって新たに決定された塩基配列である。なお、
このＤＮＡフラグメントの塩基配列は傍点部分以降の
３’側の配列とプライマーR02の位置まで一致してい
た。〔図１〕の塩基配列より予想されるアミノ酸配列を
〔図２〕に示した。クローン化したラットCCケモカイン
レセプターｃＤＮＡの塩基配列から予想されるアミノ酸
の残基数は355であった。このアミノ酸残基数は ヒトMI
P-1α/RANTESレセプター およびヒトMIP-1α/RANTESレ
セプターと80%のアミノ酸が一致すると報告されたマウ
スのレセプター（マウスMIP-1αレセプター）（J. Bio
l. Chem. 270:17494-17501 (1995)）と同一であった。
ラットCCケモカインレセプターはヒトMIP-1α/RANTESレ
セプターと81 %のアミノ酸が一致し、マウスMIP-1αレ
セプターとは92 %のアミノ酸が 一致した〔図２〕。

【００６６】

【実施例２】ラットCC ケモカインレセプター発現CHO細
胞の樹立 （１）動物細胞発現用プラスミドの構築 ５’−ＲＡＣＥ ＰＣＲ法で決定した ラットCCケモカ
インレセプター ｃＤＮＡの５’側の非翻訳領域 -20〜-
1bpの部分の塩基配列を含むプライマ−F02 と３’側の
非翻訳領域 1311〜1333bpの部分の塩基配列の逆行相補
鎖の配列を含むプライマーR02を作製した。プライマーF
02は、 ５’−ＣＴＴＧＴＣＧＡＣＣＡＧＴＴＣＣＴＣＡＧＣＡ
ＡＡＧＧ−３’（配列番号：５） の配列を有し、５’側に制限酵素 Sal Iサイトを導入し
た。プライマーR02は、 ５’−ＣＴＣＡＡＧＡＴＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＴＴＧＧ
−３’（配列番号：６） の配列を有する。Lewisラット腹腔浸出細胞由来ｍＲＮ
Ａを鋳型としてMMLV逆転酵素（宝酒造）によって一本鎖
ｃＤＮＡを調製し、そのｃＤＮＡを鋳型として上記のプ
ライマー（F02 および R02）を用いＰＣＲを行い、ラッ
トCCケモカインレセプターｃＤＮＡの翻訳領域全長を含
むＤＮＡフラグメントを増幅した。増幅したＤＮＡフラ
グメントを pCR2 ベクター（Original TA cloninng ki
t, Invitrogen）にサブクローン化しインサートＤＮＡ
の塩基配列を決定することにより、ラットCCケモカイン
レセプターｃＤＮＡの全翻訳領域をもつプラスミド ( p
CR2-rCCR ）を得た。そのプラスミド ＤＮＡ pCR2-rCCR
内には、プライマー F02 にSalIサイトおよびプライマ
ーR02よりもさらに３’側にSpe Iサイトがあるので、pC
R2-rCCRをSal IとSpe Iで消化することにより、ラット
CCケモカインレセプターの翻訳領域全長を持つＤＮＡフ
ラグメントを得た。そのＤＮＡフラグメントをプラスミ
ドベクター pAKKO-111HのSal IサイトとSpe Iサイトに
導入しラットCCケモカインレセプターを動物細胞で発現
させるプラスミド prCCRを取得した。

【００６７】（２）ラットCC ケモカインレセプター発
現CHO細胞の樹立 ラットCC ケモカインレセプター発現用プラスミド prCC
RのCHO(dhfr^-)細胞への導入は、CellPhect transfectio
n kit（ Pharmacia Biotech）を用いて添付マニュアル
に従ってリン酸カルシウム法で行った。直径 10 cm の
シャーレに１x10⁵ cells / 10 ml / dishの CHO(dhfr^-)
細胞をまき、核酸を含有する非選択培地（10 %透析 FBS
( GIBCO BRL, Life Technologies Inc., Grand Island,
NY, USA) / α-MEM with RNA and DNA ( GIBCO BRL)）
で24 時間培養した。塩化セシウムによる精製を２回繰
り返して得られた prCCR DNA（10μg / dish）とリン酸
カルシウムの共沈懸濁物をそれらのシャーレに均一に一
滴ずつ落した。CO₂インキュベーターで37 ℃、5 % CO₂
の条件下で6 時間培養し、非選択培地で２回洗浄した
後、10 ml/dish の非選択培地を加えて2 日間さらに培
養した。つづいて核酸不含の選択培地（10 % 透析 FBS
/ α-MEM without RNA and DNA (GIBCO BRL)）にて 4
倍に拡大し培養を続けた。3 日ごとにフレッシュな選択
培地に交換した。選択培地での培養10 日後に肉眼でコ
ロニーが確認できた。さらに4 日後にそれらのコロニー
（dhfr⁺に形質転換した細胞）を拾った。dhfr⁺ に形質
転換したクローンに対する¹²⁵I-ヒトMIP-1αの結合量を
調べ、結合量の多いクローンを限界希釈法により再クロ
ーン化し、ラットCC ケモカインレセプターを高発現し
ている細胞株（CHO(rCCR) 細胞）を得た。

【００６８】

【実施例３】ラットCC ケモカインレセプターの性状解
析―放射性リガンド結合アッセイ 放射性リガンド（¹²⁵I-ヒトRANTESおよび¹²⁵I-ヒトMIP-
1α）はDu Pont Company（Wilmington, DE, USA）より
購入した。組換え型ヒトRANTES、ヒトMIP-1α、ヒトMIP
-1β、ヒトMCP-1 および ヒトIL-8はPepro Tech Inc.
（Rocky Hill, NJ,USA）から購入した。96 ウェルプレ
ート（Nunc, Roskilde, Denmark）にCHO(rCCR)細胞また
はmock transfectants（ベクタープラスミドpAKKO-111H
をトランスフェクトしたCHO細胞）を5x10⁴ / 100μl /
ウェル でまき24 時間培養した。培地を除き0.5 % BSA/
20mM HEPES (pH7.4) / DMEM で希釈した¹²⁵I-リガンド
（5 nM）を50 μl /ウェル 加え、室温で30〜40 分間イ
ンキュベートした。その後200μl /ウェル のPBSで2 回
洗浄し、100 μl / ウェルの 0.1 N NaOH / 1 % SDSを
加えて細胞に結合したリガンドを溶出させ 、γ−カウ
ンター（Cobra II, Packard Instrument Company ）で
測定した。その結果、¹²⁵I-MIP-1α 〔図３Ａ〕および
¹²⁵I-RANTES〔図３Ｂ〕はCHO(rCCR)細胞によく結合する
ことがわかった。mock transfectantsへの結合量はいず
れも低値であった。

【００６９】〔図４ＡおよびＢ〕はそれぞれ¹²⁵I-MIP-1
αおよび¹²⁵I-RANTESの飽和結合曲線を示す。〔図４Ｃ
およびＤ〕はそれぞれ¹²⁵I-MIP-1αおよび¹²⁵I-RANTES
の飽和結合曲線から得られたスキャッチャードプロット
を示す。スキャッチャードプロットから求められたラッ
トCC ケモカインレセプター のヒトMIP-1αおよびヒトR
ANTESに対する Kd値はそれぞれ 6 nMおよび 17 nMであ
った。さらに一定量の¹²⁵I-MIP-1αおよび¹²⁵I-RANTES
に種々の濃度の非標識リガンドを共存させることにより
ラットCC ケモカインレセプターのリガンド特異性を調
べた〔図５ＡおよびＢ〕。¹²⁵I-MIP-1αの結合は非標識
MIP-1αおよび非標識MIP-1βでほぼ置換できたが、非標
識RANTESおよび非標識MCP-1によっては部分的に置換で
きた。またCXCケモカインであるIL-8は高濃度でも全く
置換できなかった〔図４Ａ〕。また、¹²⁵I-RANTES の結
合は、非標識RANTES 、非標識MIP-1αおよび非標識 Ｍ
ＩＰ−１β でほぼ置換できたが、非標識MCP-1 および
非標識IL-8は高濃度の添加によってもほとんど置換でき
なかった〔図５Ｂ〕。また〔図５ＣおよびＤ〕は、ヒト
MIP-1α/RANTESレセプターを発現したCHO細胞（参考例
３）に対するこれらのリガンドの結合の特異性を調べた
結果を示す。CHO(rCCR)細胞での結果とほぼ同様の結果
でが得られた。

【００７０】

【発明の効果】本発明のCCケモカインレセプタータンパ
ク質および該タンパク質をコードするＤＮＡは、（１）
CCケモカインレセプタータンパク質に対する抗体および
抗血清の作製、（２）CCケモカインレセプタータンパク
質を発現する形質転換体の作製、（３）CCケモカインレ
セプター結合アッセイ系の開発および医薬品候補化合物
のスクリーニング、（４）CCケモカインレセプターに対
するリガンドの定量アッセイ系の構築、（５）CCケモカ
インレセプタータンパク質をコードするＤＮＡをもとに
したＰＣＲプライマーの作製、（６）CCケモカインレセ
プターを発現するトランスジェニック動物の作製、
（７）CCケモカインレセプタータンパク質をコードする
ＤＮＡを欠失した病態モデル動物の作製等に用いること
ができる。

【００７１】

【配列表】

【配列番号：１】 配列の長さ：３５５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Glu Ile Ser Asn Ile Thr Glu Thr Tyr Pro Thr Thr Thr Glu Tyr 1 5 10 15 Asp Tyr Gly Asp Ser Thr Pro Cys Gln Lys Thr Asp Val Arg Ala Phe 20 25 30 Gly Ala Gly Leu Leu Pro Pro Leu Tyr Ser Phe Val Phe Ile Ile Gly 35 40 45 Val Val Gly Asn Ile Leu Val Ile Leu Val Leu Met Gln His Arg Arg 50 55 60 Leu Gln Ser Met Thr Ser Ile Tyr Leu Phe Asn Leu Ala Val Ser Asp 65 70 75 80 Leu Val Phe Leu Phe Thr Leu Pro Phe Trp Ile Asp Tyr Lys Leu Lys 85 90 95 Asp Asn Trp Val Phe Gly Asp Ala Met Cys Lys Leu Leu Ser Gly Phe 100 105 110 Tyr Tyr Leu Gly Leu Tyr Ser Glu Ile Phe Phe Ile Ile Leu Leu Thr 115 120 125 Ile Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Val Phe Ser Leu Arg Ala 130 135 140 Arg Thr Val Thr Phe Gly Ile Ile Thr Ser Ile Ile Ile Trp Ala Leu 145 150 155 160 Ala Ile Leu Ala Ser Ile Pro Ala Leu Cys Phe Phe Lys Ala Gln Trp 165 170 175 Glu Phe Thr His His Thr Cys Ser Pro His Phe Pro Asp Glu Ser Leu 180 185 190 Lys Thr Trp Lys Arg Phe Gln Ala Leu Lys Leu Asn Leu Leu Gly Leu 195 200 205 Ile Leu Pro Leu Leu Val Met Ile Ile Cys Tyr Ala Gly Ile Ile Arg 210 215 220 Ile Leu Leu Arg Arg Pro Asn Glu Lys Lys Ala Lys Ala Val Arg Leu 225 230 235 240 Ile Phe Ala Ile Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Trp Thr Pro Tyr Asn 245 250 255 Leu Thr Val Phe Val Ser Ala Phe Gln Asp Val Leu Phe Thr Asn Gln 260 265 270 Cys Glu Gln Ser Lys Gln Leu Asp Leu Ala Ile Gln Val Thr Glu Val 275 280 285 Ile Ala Tyr Thr His Cys Cys Val Asn Pro Ile Ile Tyr Val Phe Val 290 295 300 Gly Glu Arg Phe Arg Lys Tyr Leu Arg Gln Leu Phe Gln Arg His Val 305 310 315 320 Ala Ile Pro Leu Ala Lys Trp Leu Pro Phe Phe Ser Val Asp Gln Leu 325 330 335 Glu Arg Thr Ser Ser Leu Thr Pro Ser Thr Gly Glu His Glu Leu Ser 340 345 350 Gly Gly Phe 355

【００７２】

【配列番号：２】 配列の長さ：１５４４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GCTATTGTTC CTGACCAGTT CCTCATCAAA GGATGGAGAT TTCAAATATC ACAGAAACCT 60 ACCCCACAAC CACAGAATAT GACTATGGGG ACTCTACTCC ATGCCAAAAA ACTGATGTAA 120 GAGCCTTCGG GGCTGGACTC CTGCCCCCCC TGTACTCTTT CGTGTTTATC ATTGGAGTGG 180 TAGGCAATAT CCTGGTGATT CTGGTGCTCA TGCAGCATAG GAGGCTTCAA AGCATGACCA 240 GCATATACCT GTTCAACCTG GCTGTCTCTG ATCTGGTCTT CCTTTTCACT TTACCTTTCT 300 GGATTGACTA CAAGCTGAAA GACAACTGGG TTTTTGGTGA TGCCATGTGT AAGCTTCTCT 360 CTGGGTTTTA TTACCTGGGC TTATACAGTG AGATCTTCTT TATCATCCTG CTGACAATTG 420 ACAGGTACCT GGCCATTGTC CATGCAGTGT TTTCCCTGAG GGCCCGAACT GTCACTTTTG 480 GCATCATCAC CAGTATTATT ATTTGGGCCC TAGCCATCTT AGCTTCTATT CCTGCCTTAT 540 GCTTTTTCAA GGCCCAGTGG GAGTTCACTC ACCATACCTG TAGCCCTCAT TTCCCCGATG 600 AGAGCCTGAA GACGTGGAAG AGGTTTCAGG CTCTAAAGCT AAACCTCCTT GGACTAATTT 660 TACCTCTGTT AGTCATGATA ATTTGCTACG CAGGGATCAT CAGAATTCTG CTCAGACGAC 720 CCAATGAGAA GAAGGCGAAA GCCGTGCGTC TGATATTTGC TATTACGCTT CTATTCTTCC 780 TCCTCTGGAC CCCCTACAAT CTGACTGTAT TTGTTTCTGC TTTCCAAGAT GTTCTATTCA 840 CCAATCAGTG TGAGCAGAGC AAGCAGCTGG ACCTGGCCAT ACAGGTGACT GAAGTGATTG 900 CCTACACCCA CTGTTGTGTC AATCCAATCA TTTATGTCTT TGTGGGTGAG CGGTTCCGGA 960 AGTACCTTCG GCAGCTGTTT CAAAGGCATG TGGCTATACC GCTGGCAAAA TGGCTGCCCT 1020 TCTTCTCTGT GGACCAACTA GAAAGGACCA GTTCCTTAAC TCCATCCACA GGAGAACATG 1080 AACTTTCTGG GGGCTTCTGA TTCAGACCCT AGGTGTCAAC CAAGGTCTAG AGGAGAATGA 1140 GGGGGATAGT ATATAGCTCT CCAAGGCAGA TACTGACAGC TATTACAGCG GGGATTCCCA 1200 GTCTTGTTGG GTCAAAGGGA ACTTTGAGGT CGCTTAGGTA CAAGTCACCT ATTCAATGGT 1260 TTCCTTGAAC TCTCTCTGTT AAAAATGAGA TGAATACAAA AAGTGGGACA TTATTGAAAT 1320 GGGGATAATC AGTGGCTTGG GCCCAACAAG TGATGGATCT TGTAGATAGT AACCTAAAAA 1380 CTGAACCACA ACTTTTACTG AAAACGACAC CTAATGATGT AATATTCTGA GAAAAATTTA 1440 AAGCATTGTA AAAGAGGATT TTGTGTATTT TCATATTGAC ATATATATAA AGTAGATATT 1500 ATGTCCAAAT TAAAACTGTA GCAAACTAAA AAAAAAAAAA ACCG 1544

【００７３】

【配列番号：３】 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＴＴＧＡＡＡＧＡＣ ＧＡＣＴＧＧＡＴＴＴ ＴＴＧ
ＧＴＧＡＴＧＣ ３０

【００７４】

【配列番号：４】 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＣＡＡＧＡＡＧＧＴ ＴＴＡＧＣＴＴＴＡＧ ＡＧＣ
ＴＴＧＡＡＡＣ ３０

【００７５】

【配列番号：５】 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTTGTCGACC AGTTCCTCAG CAAAGG 26

【００７６】

【配列番号：６】 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＴＣＡＡＧＡＴＣＣ ＡＴＣＡＣＴＴＧＴＴ ＧＧ
２２

【００７７】

【図面の簡単な説明】

【図１】ラットＣＣケモカインレセプターのコード領域
を含む塩基配列。開始コドンＡＴＧおよび終止コドンＴ
ＧＡをそれぞれ下線で示した。

【図２】ラットCCケモカインレセプターのアミノ酸配列
とヒトMIP-1α/RANTESレセプターおよびマウスMIP-1α
レセプターのアミノ酸配列との比較。影を付けた部分は
ヒトMIP-1α/RANTESレセプターと一致しているアミノ酸
を示す。ヒトMIP-1α/RANTESレセプターのアミノ酸配列
はCell 72: 415-425 (1993)およびJ. Exp. Med. 177: 1
421-1427 (1993)に、マウスMIP-1αレセプターのアミノ
酸配列はJ. Biol. Chem. 270: 17494-17501 (1995)によ
った。膜貫通領域と推測される部分を１〜７の番号で示
した。

【図３】ラットCCケモカインレセプター発現CHO細胞に
対する¹²⁵I-ヒトMIP-1αおよび¹²⁵I-ヒトRANTESの結
合。96 ウェルプレートでコンフルエントとなったラッ
トCCケモカインレセプター発現CHO細胞および mock tra
nsfectantsに5 nMの¹²⁵I-ヒトMIP-1αあるいは¹²⁵I-RAN
TESを加え、細胞への結合を調べた。

【図４】ラットCCケモカインレセプター発現CHO細胞に
対する¹²⁵I-ヒトMIP-1α（Ａ，Ｃ）および¹²⁵I-ヒトRAN
TES（Ｂ，Ｄ）の結合の飽和曲線（Ａ，Ｂ）およびスキ
ャッチャードプロット（Ｃ，Ｄ）。Ａの白抜きの丸、お
よびＢの白抜きの三角はそれぞれmock transfectantsに
対する¹²⁵I-ヒトMIP-1αおよび¹²⁵I-ヒトRANTESの結合
を示す。

【図５】ラットCCケモカインレセプター発現CHO細胞
（Ａ，Ｂ）およびヒトMIP-1α/RANTESレセプター発現CH
O細胞（Ｃ，Ｄ）に対する¹²⁵I-ヒトMIP-1α（Ａ，Ｃ）
および¹²⁵I-ヒトRANTES（Ｂ，Ｄ）の結合の種々の非標
識リガンドによる置換反応。¹²⁵I-ヒトMIP-1αおよび
¹²⁵I-ヒトRANTESは5 nM。白抜きの丸はヒトMIP-1α；黒
塗りの丸はヒトRANTES；黒塗りの三角はヒトMIP-1β；
白抜きの三角はヒトMCP-1；黒塗りの四角はヒトIL-8。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＰ Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ ＡＤＸ 37/02 ＡＡＢ ＡＤＹ ＡＢＣ Ｃ０７Ｈ 21/04 ＡＢＥ Ｃ０７Ｋ 16/28 ＡＢＦ Ｃ１２Ｎ 5/10 ＡＤＰ 15/09 ＺＮＡ ＡＤＸ Ｃ１２Ｐ 21/02 ＡＤＹ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ａ６１Ｋ 39/395 9282−4Ｂ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同
   一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有すること
   を特徴とするCCケモカインレセプタータンパク質もしく
   はその塩。
2. 【請求項２】請求項１記載のCCケモカインレセプタータ
   ンパク質の部分ペプチドもしくはその塩。
3. 【請求項３】請求項１記載のCCケモカインレセプタータ
   ンパク質または請求項２記載の部分ペプチドをコードす
   る塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡ。
4. 【請求項４】配列番号：２で表される塩基配列を有する
   請求項３記載のＤＮＡ。
5. 【請求項５】請求項３記載のＤＮＡを含有する組換えベ
   クター。
6. 【請求項６】請求項３記載のＤＮＡまたは請求項５記載
   の組換えベクターを保持する形質転換体。
7. 【請求項７】請求項６記載の形質転換体を培養すること
   を特徴とする請求項１記載のCCケモカインレセプタータ
   ンパク質もしくはその塩の製造法。
8. 【請求項８】請求項１記載のCCケモカインレセプタータ
   ンパク質もしくはその塩または請求項２記載の部分ペプ
   チドもしくはその塩に対する抗体。
9. 【請求項９】請求項１記載のCCケモカインレセプタータ
   ンパク質もしくはその塩または請求項２記載の部分ペプ
   チドもしくはその塩と被験化合物とを接触させることを
   特徴とするCCケモカインレセプター親和性化合物もしく
   はその塩のスクリーニング方法。
10. 【請求項１０】請求項１記載のCCケモカインレセプター
    タンパク質もしくはその塩または請求項２記載の部分ペ
    プチドもしくはその塩を含有してなるCCケモカインレセ
    プター親和性化合物もしくはその塩のスクリーニング用
    キット。
11. 【請求項１１】請求項９記載のスクリーニング方法によ
    って得られるCCケモカインレセプター親和性化合物もし
    くはその塩。
12. 【請求項１２】請求項１０記載のスクリーニング用キッ
    トを用いて得られるCCケモカインレセプター親和性化合
    物もしくはその塩。
13. 【請求項１３】CCケモカインレセプターアンタゴニスト
    である請求項１２記載のCCケモカインレセプター親和性
    化合物もしくはその塩。
14. 【請求項１４】CCケモカインレセプターアゴニストであ
    る請求項１２記載のCCケモカインレセプター親和性化合
    物もしくはその塩。
15. 【請求項１５】請求項１３記載のアンタゴニストまたは
    請求項１４記載のアゴニストを含有してなる医薬。
16. 【請求項１６】ウイルス性疾患、感染性疾患、腫瘍、ア
    レルギー性疾患、炎症性疾患、糖尿病性疾患、中枢性疾
    患、自己免疫性疾患、高脂血症、高コレステロール血
    症、透析による血小板減少症、脊髄損傷、骨粗鬆症、潰
    瘍性大腸炎、消化性潰瘍、敗血症ショック、肺・心臓に
    おける再潅流障害、不安定狭心症、一過性脳虚血発作、
    心弁膜症、臓器移植後拒絶反応、血管形成術後再狭窄、
    腎不全、子宮内膜症、肺線維症、成人呼吸逼迫症候群の
    予防・治療剤である請求項１５記載の医薬。