JPH0915241A - 安定化された酵素標識抗体 - Google Patents
安定化された酵素標識抗体Info
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- JPH0915241A JPH0915241A JP16535595A JP16535595A JPH0915241A JP H0915241 A JPH0915241 A JP H0915241A JP 16535595 A JP16535595 A JP 16535595A JP 16535595 A JP16535595 A JP 16535595A JP H0915241 A JPH0915241 A JP H0915241A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 経時安定性に優れた酵素標識抗体及びその調
製方法、並びにこの経時安定性に優れた酵素標識抗体を
用いた免疫学的測定方法及び該方法に用いるキットを提
供すること。 【構成】 抗体に、Ｎ−サクシンイミジル−（４−ヨー
ドアセチル）−アミノベンゾエート又はスルホサクシン
イミジル−（４−ヨードアセチル）−アミノベンゾエー
トからなる架橋剤を用いてペルオキシダーゼを結合させ
て酵素標識抗体を調製する際に、前記抗体としてメルカ
プト基を有する、あるいは予めメルカプト基を導入して
おいたものを用い、これに前記架橋剤側のメルカプト基
と反応し得る基を反応させてこれらを結合し、また、前
記ペルオキシダーゼのアミノ基に対して前記架橋剤側の
アミノ基に反応し得る基を反応させてこれらを結合させ
ることで酵素標識抗体を得る。
製方法、並びにこの経時安定性に優れた酵素標識抗体を
用いた免疫学的測定方法及び該方法に用いるキットを提
供すること。 【構成】 抗体に、Ｎ−サクシンイミジル−（４−ヨー
ドアセチル）−アミノベンゾエート又はスルホサクシン
イミジル−（４−ヨードアセチル）−アミノベンゾエー
トからなる架橋剤を用いてペルオキシダーゼを結合させ
て酵素標識抗体を調製する際に、前記抗体としてメルカ
プト基を有する、あるいは予めメルカプト基を導入して
おいたものを用い、これに前記架橋剤側のメルカプト基
と反応し得る基を反応させてこれらを結合し、また、前
記ペルオキシダーゼのアミノ基に対して前記架橋剤側の
アミノ基に反応し得る基を反応させてこれらを結合させ
ることで酵素標識抗体を得る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、経時安定性に優れた酵
素標識抗体、その調製方法、該酵素標識抗体を用いた免
疫学的測定方法及び該方法に用いるキットに関する。
素標識抗体、その調製方法、該酵素標識抗体を用いた免
疫学的測定方法及び該方法に用いるキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】免疫学的測定法に使用される酵素標識抗
体を調製するに際しては、抗体の標識方法について重要
なポイントが幾つかある。即ち、標識によって酵素や抗
体の活性が損なわれないこと、酵素と抗体の結合（架
橋）が安定していること、標識抗体としての経時安定性
に優れていること等である。
体を調製するに際しては、抗体の標識方法について重要
なポイントが幾つかある。即ち、標識によって酵素や抗
体の活性が損なわれないこと、酵素と抗体の結合（架
橋）が安定していること、標識抗体としての経時安定性
に優れていること等である。
【０００３】現在、酵素標識抗体を調製するには様々な
方法が知られているが、それらは大別すると三つに分類
することができる。すなわち、酵素と抗体を結合する
ために標識に用いる酵素に対する抗体を使用する方法、
酵素や抗体以外の蛋白分子を介して標識を行う方法、
そして架橋剤を用いて有機化学的結合により酵素と抗
体を結合する方法である。
方法が知られているが、それらは大別すると三つに分類
することができる。すなわち、酵素と抗体を結合する
ために標識に用いる酵素に対する抗体を使用する方法、
酵素や抗体以外の蛋白分子を介して標識を行う方法、
そして架橋剤を用いて有機化学的結合により酵素と抗
体を結合する方法である。
【０００４】有機化学的結合による抗体の酵素標識法の
１つであるＳＩＡＢ法は、架橋剤としてのＮ−スクシン
イミジル−（４−ヨードアセチル）−アミノベンゾエー
ト（以下ＳＩＡＢと略称する）あるいはＳＩＡＢのスル
ホン化された化合物であるスルホスクシンイミジル−
（４−ヨードアセチル）−アミノベンゾエート（以下ス
ルホン化ＳＩＡＢと略称する）側のアミノ基と反応し得
る基（例えばＮ−スクシンイミド基）と抗体側のアミノ
基を反応させた後、β-ガラクトシダーゼの様なＳＨ基
含有酵素或いはその他のＳＨ導入酵素を架橋させること
により酵素標識抗体を得る方法である（例えば、Biotec
hniques 148,(1983)、特開昭５５-３４０８７号公報等
参照）。特開昭５５-３４０８７号公報には、上記方法
は標識効率が高く、得られた酵素標識抗体の非特異吸着
が少ないことが報告されている。
１つであるＳＩＡＢ法は、架橋剤としてのＮ−スクシン
イミジル−（４−ヨードアセチル）−アミノベンゾエー
ト（以下ＳＩＡＢと略称する）あるいはＳＩＡＢのスル
ホン化された化合物であるスルホスクシンイミジル−
（４−ヨードアセチル）−アミノベンゾエート（以下ス
ルホン化ＳＩＡＢと略称する）側のアミノ基と反応し得
る基（例えばＮ−スクシンイミド基）と抗体側のアミノ
基を反応させた後、β-ガラクトシダーゼの様なＳＨ基
含有酵素或いはその他のＳＨ導入酵素を架橋させること
により酵素標識抗体を得る方法である（例えば、Biotec
hniques 148,(1983)、特開昭５５-３４０８７号公報等
参照）。特開昭５５-３４０８７号公報には、上記方法
は標識効率が高く、得られた酵素標識抗体の非特異吸着
が少ないことが報告されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】特開昭５５−３４０８
７号公報に記載のような、抗体と架橋剤との結合を抗体
のアミノ基を利用して行い、また標識用酵素と架橋剤と
の結合を酵素のメルカプト基を利用して行う抗体の酵素
標識方法では、得られた酵素標識抗体の経時安定性が不
十分であるという欠点があり、そのため経時安定性の改
良された酵素標識抗体の出現が望まれていた。
７号公報に記載のような、抗体と架橋剤との結合を抗体
のアミノ基を利用して行い、また標識用酵素と架橋剤と
の結合を酵素のメルカプト基を利用して行う抗体の酵素
標識方法では、得られた酵素標識抗体の経時安定性が不
十分であるという欠点があり、そのため経時安定性の改
良された酵素標識抗体の出現が望まれていた。
【０００６】本発明の目的は、経時安定性に優れた酵素
標識抗体及びその調製方法を提供することにある。本発
明の他の目的は、この経時安定性に優れた酵素標識抗体
を用いた免疫学的測定方法及び該方法に用いるキットを
提供することにある。
標識抗体及びその調製方法を提供することにある。本発
明の他の目的は、この経時安定性に優れた酵素標識抗体
を用いた免疫学的測定方法及び該方法に用いるキットを
提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記問題を
解決すべく鋭意研究を行なった結果、特開昭５５−３４
０８７号公報にＳＩＡＢのスクシンイミド基に標識酵素
のアミノ基を反応させてこれらを結合した場合には収率
の低下や特異性の欠如といった問題が生じることが記載
されているにも拘らず、標識酵素と抗体のＳＩＡＢに結
合させる位置を従来の方法とは逆に入れ換えることで、
その経時安定性が格段に改善されることを見い出し、本
発明を完成した。
解決すべく鋭意研究を行なった結果、特開昭５５−３４
０８７号公報にＳＩＡＢのスクシンイミド基に標識酵素
のアミノ基を反応させてこれらを結合した場合には収率
の低下や特異性の欠如といった問題が生じることが記載
されているにも拘らず、標識酵素と抗体のＳＩＡＢに結
合させる位置を従来の方法とは逆に入れ換えることで、
その経時安定性が格段に改善されることを見い出し、本
発明を完成した。
【０００８】本発明の酵素標識抗体は、抗体に標識酵素
を架橋剤を介して結合させた酵素標識抗体であって、下
記式（１）：
を架橋剤を介して結合させた酵素標識抗体であって、下
記式（１）：
【０００９】
【化３】 ［上記式（１）中、Ａｂは抗体を、ＰＯＤはペルオキシ
ダーゼを表わす。］で表わされる構造を有することを特
徴とする。なお、上記式（１）において、−ＮＨ−はＰ
ＯＤに由来し、−Ｓ−は抗体に由来する。
ダーゼを表わす。］で表わされる構造を有することを特
徴とする。なお、上記式（１）において、−ＮＨ−はＰ
ＯＤに由来し、−Ｓ−は抗体に由来する。
【００１０】本発明において用いられる架橋剤は、ＳＩ
ＡＢ又はスルホン化ＳＩＡＢであり、これを用いてメル
カプト基を有する抗体とペルオキシダーゼを架橋結合さ
せることで本発明の酵素標識抗体を得ることができる。
ＡＢ又はスルホン化ＳＩＡＢであり、これを用いてメル
カプト基を有する抗体とペルオキシダーゼを架橋結合さ
せることで本発明の酵素標識抗体を得ることができる。
【００１１】本発明の酵素標識抗体の調製に用いる抗体
としては、架橋剤としてのＳＩＡＢ又はスルホン化ＳＩ
ＡＢとの結合に利用するメルカプト（−ＳＨ）基を有す
るものが用いられる。抗体が−ＳＨ基を有するものでな
い場合は、これにメルカプト基を常法により導入して用
いれば良い。また、所望の抗原との反応性を有する抗体
のＦab'フラグメントを調製してこれを用いても良い。
としては、架橋剤としてのＳＩＡＢ又はスルホン化ＳＩ
ＡＢとの結合に利用するメルカプト（−ＳＨ）基を有す
るものが用いられる。抗体が−ＳＨ基を有するものでな
い場合は、これにメルカプト基を常法により導入して用
いれば良い。また、所望の抗原との反応性を有する抗体
のＦab'フラグメントを調製してこれを用いても良い。
【００１２】なお、抗体のＦab'フラグメントとは、抗
体をペプシンによって分解した際に得られるＦ(ab')2画
分のヒンジ部のジスルフィド結合を還元し、反応性のメ
ルカプト基を有するようにしたもので、抗体の抗原との
反応性を維持したものである。具体的な調製法として
は、後述の実施例における方法を挙げることができる。
体をペプシンによって分解した際に得られるＦ(ab')2画
分のヒンジ部のジスルフィド結合を還元し、反応性のメ
ルカプト基を有するようにしたもので、抗体の抗原との
反応性を維持したものである。具体的な調製法として
は、後述の実施例における方法を挙げることができる。
【００１３】本発明に用いる抗体としては、ポリクロー
ナル抗体或いはモノクローナル抗体のどちらでもよい。
抗体の具体例としては、抗ＡＦＰ抗体、抗ＣＡ１９-９
抗体、抗ＰＳＡ抗体、抗ＣＡ-５０抗体、抗ＴＳＨ抗
体、抗ＦＳＨ抗体、抗ＰＲＬ抗体、抗ＬＨ抗体、抗ミオ
シン軽鎖抗体、抗ミオグロビン抗体、抗ＣＫ-ＭＢ抗
体、抗ＨＣＧ抗体、抗インスリン抗体に少なくとも−Ｓ
Ｈ基を導入したもの、あるいはこれら抗体のＦ'abフラ
グメント等を挙げることができる。
ナル抗体或いはモノクローナル抗体のどちらでもよい。
抗体の具体例としては、抗ＡＦＰ抗体、抗ＣＡ１９-９
抗体、抗ＰＳＡ抗体、抗ＣＡ-５０抗体、抗ＴＳＨ抗
体、抗ＦＳＨ抗体、抗ＰＲＬ抗体、抗ＬＨ抗体、抗ミオ
シン軽鎖抗体、抗ミオグロビン抗体、抗ＣＫ-ＭＢ抗
体、抗ＨＣＧ抗体、抗インスリン抗体に少なくとも−Ｓ
Ｈ基を導入したもの、あるいはこれら抗体のＦ'abフラ
グメント等を挙げることができる。
【００１４】抗体と架橋剤との反応におけるこれらのモ
ル比は、所望の反応が得られるように設定すれば良く、
例えば、抗体１モルに対して架橋剤を２〜１０モルの範
囲で用いることができる。
ル比は、所望の反応が得られるように設定すれば良く、
例えば、抗体１モルに対して架橋剤を２〜１０モルの範
囲で用いることができる。
【００１５】抗体と架橋剤との反応は、上記式（１）に
おける−Ｓ−ＣＨ2−からなる結合を得ることができる
条件で行われる。この反応は、例えば、適当な緩衝液等
の反応媒体中で、７．５〜８．５の範囲内のｐＨ条件で
行うことができる。反応は、例えば４〜３７℃の範囲温
度で行うことができる。
おける−Ｓ−ＣＨ2−からなる結合を得ることができる
条件で行われる。この反応は、例えば、適当な緩衝液等
の反応媒体中で、７．５〜８．５の範囲内のｐＨ条件で
行うことができる。反応は、例えば４〜３７℃の範囲温
度で行うことができる。
【００１６】本発明において標識酵素として用いられる
ペルオキシダーゼ（以下、ＰＯＤと略記する）は植物由
来のものであればよいが、なかでも西洋わさびＰＯＤが
好ましい。
ペルオキシダーゼ（以下、ＰＯＤと略記する）は植物由
来のものであればよいが、なかでも西洋わさびＰＯＤが
好ましい。
【００１７】本発明においてＰＯＤと架橋剤との反応モ
ル比はＰＯＤの１モルに対して架橋剤が１０モル以上で
あれば良い。ＰＯＤと架橋剤との反応は、以下に示すよ
うに、ＰＯＤの有するアミノ基を利用して、ＰＯＤと架
橋剤側の（スルホ）スクシンイミド基との置換反応によ
って上記式（１）中の−ＮＨ−を介した結合が得られる
ように行われる。
ル比はＰＯＤの１モルに対して架橋剤が１０モル以上で
あれば良い。ＰＯＤと架橋剤との反応は、以下に示すよ
うに、ＰＯＤの有するアミノ基を利用して、ＰＯＤと架
橋剤側の（スルホ）スクシンイミド基との置換反応によ
って上記式（１）中の−ＮＨ−を介した結合が得られる
ように行われる。
【００１８】
【化４】 （Ｒは水素原子または−ＳＯ3Ｎａである。） この反応は、適当な緩衝液等の反応液媒体中で、７〜９
の範囲内のｐＨにおいて行うことができる。なお、ｐＨ
範囲の下限は７．５が、その上限は８．５がより好まし
い。反応は、例えば４〜３７℃の範囲温度で行うことが
できる。
の範囲内のｐＨにおいて行うことができる。なお、ｐＨ
範囲の下限は７．５が、その上限は８．５がより好まし
い。反応は、例えば４〜３７℃の範囲温度で行うことが
できる。
【００１９】本発明における架橋剤としてのＳＩＡＢ及
びスルホン化ＳＩＡＢの中では、スルホン化ＳＩＡＢは
ＳＩＡＢに比して水溶性が良好であるので、酵素標識抗
体の生成効率がより高いという利点がある。
びスルホン化ＳＩＡＢの中では、スルホン化ＳＩＡＢは
ＳＩＡＢに比して水溶性が良好であるので、酵素標識抗
体の生成効率がより高いという利点がある。
【００２０】本発明の酵素標識抗体は、各種酵素免疫測
定法、発光免疫測定法等における抗体と結合し得る物質
の検出段階に好適に利用できる。
定法、発光免疫測定法等における抗体と結合し得る物質
の検出段階に好適に利用できる。
【００２１】例えば、間接法による場合、固相に固定し
た抗原に試料を反応させて、試料中に該抗原に対する標
的抗体が存在するかどうかを検定する場合、固定化した
抗原と試料との反応後に、これに本発明の酵素標識抗体
（抗体部分は標的抗体を抗原とする抗体からなる）を反
応させて、抗原−標的抗体−酵素標識抗体からなる複合
体を形成させて、この複合体を標識酵素を利用した呈色
反応で検出する。また、競合法や２抗体サンドイッチ法
などの他の手法においても、同様に酵素標識抗体の抗体
部分と結合する物質の検出段階に本発明の酵素標識抗体
が利用できる。
た抗原に試料を反応させて、試料中に該抗原に対する標
的抗体が存在するかどうかを検定する場合、固定化した
抗原と試料との反応後に、これに本発明の酵素標識抗体
（抗体部分は標的抗体を抗原とする抗体からなる）を反
応させて、抗原−標的抗体−酵素標識抗体からなる複合
体を形成させて、この複合体を標識酵素を利用した呈色
反応で検出する。また、競合法や２抗体サンドイッチ法
などの他の手法においても、同様に酵素標識抗体の抗体
部分と結合する物質の検出段階に本発明の酵素標識抗体
が利用できる。
【００２２】本発明の免疫学的測定用キットは、本発明
の酵素標識抗体と、それを用いた免疫学的測定方法に用
いられる試薬及び／または器具を含むセットである。例
えば、上記の構成の酵素標識抗体溶液と、（１）標識酵
素による発色反応を生じさせるために必要な試薬類、
（２）検出対象としての抗原または抗体の標準溶液、
（３）検出対象としての抗原や抗体と、酵素標識抗体と
の反応に必要な試薬類や器具（例えば、反応用プレー
ト、試験管等）、（４）検出対象としての抗原又は抗体
を捕獲するための固相に固定している抗体または抗原試
薬の１種以上を組合せてキットを形成することができ
る。
の酵素標識抗体と、それを用いた免疫学的測定方法に用
いられる試薬及び／または器具を含むセットである。例
えば、上記の構成の酵素標識抗体溶液と、（１）標識酵
素による発色反応を生じさせるために必要な試薬類、
（２）検出対象としての抗原または抗体の標準溶液、
（３）検出対象としての抗原や抗体と、酵素標識抗体と
の反応に必要な試薬類や器具（例えば、反応用プレー
ト、試験管等）、（４）検出対象としての抗原又は抗体
を捕獲するための固相に固定している抗体または抗原試
薬の１種以上を組合せてキットを形成することができ
る。
【００２３】
【実施例】以下、実施例及び比較例により本発明をさら
に具体的に説明する。 実施例１ （スルホン化ＳＩＡＢを用いたＰＯＤ標識Ｆab'化マウ
ス抗ＴＳＨモノクローナル抗体の調製）ＩｇクラスがＩ
ｇＧに属するマウス抗ＴＳＨモノクローナル抗体（以
下、抗ＴＳＨ抗体と略す）３ｍｇを０．１Ｍクエン酸緩
衝液（ｐＨ４．５）１ｍｌに加えて溶解した。これに１
％ペプシン溶液を０．３５ｍｌ添加し、３７℃、３．５
時間反応させた。反応物をゲル濾過カラムクロマトグラ
フィー（ＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷ、東ソー（株）
製）で分離精製し、Ｆ(ab')2画分を回収した。得られた
Ｆ(ab')2画分に最終濃度が０．０１Ｍになるように２−
メルカプトエチルアミンを添加した後、３７℃で１．５
時間反応させた。反応後、反応物を脱塩処理して抗ＴＳ
Ｈ抗体Ｆab'フラグメントの溶液（溶媒：０．０５Ｍリ
ン酸緩衝液：ｐＨ６．５、０．１Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ
ＥＤＴＡ）を得た。
に具体的に説明する。 実施例１ （スルホン化ＳＩＡＢを用いたＰＯＤ標識Ｆab'化マウ
ス抗ＴＳＨモノクローナル抗体の調製）ＩｇクラスがＩ
ｇＧに属するマウス抗ＴＳＨモノクローナル抗体（以
下、抗ＴＳＨ抗体と略す）３ｍｇを０．１Ｍクエン酸緩
衝液（ｐＨ４．５）１ｍｌに加えて溶解した。これに１
％ペプシン溶液を０．３５ｍｌ添加し、３７℃、３．５
時間反応させた。反応物をゲル濾過カラムクロマトグラ
フィー（ＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷ、東ソー（株）
製）で分離精製し、Ｆ(ab')2画分を回収した。得られた
Ｆ(ab')2画分に最終濃度が０．０１Ｍになるように２−
メルカプトエチルアミンを添加した後、３７℃で１．５
時間反応させた。反応後、反応物を脱塩処理して抗ＴＳ
Ｈ抗体Ｆab'フラグメントの溶液（溶媒：０．０５Ｍリ
ン酸緩衝液：ｐＨ６．５、０．１Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ
ＥＤＴＡ）を得た。
【００２４】次に、ＰＯＤ３ｍｇに０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）を０．３ｍｌ加えて溶解した。これに
２ｍｇ／ｍｌの濃度にスルホン化ＳＩＡＢを含有する溶
液０．３ｍｌ添加した後、室温で１時間反応させた。反
応後、反応物の脱塩処理を行って、４−ヨードアセチル
−アミノベンゾエート・ＰＯＤ複合体の溶液（溶媒：
０．０５Ｍリン酸緩衝液：ｐＨ６．５、０．１Ｍ Ｎａ
Ｃｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）を得た。
液（ｐＨ７．０）を０．３ｍｌ加えて溶解した。これに
２ｍｇ／ｍｌの濃度にスルホン化ＳＩＡＢを含有する溶
液０．３ｍｌ添加した後、室温で１時間反応させた。反
応後、反応物の脱塩処理を行って、４−ヨードアセチル
−アミノベンゾエート・ＰＯＤ複合体の溶液（溶媒：
０．０５Ｍリン酸緩衝液：ｐＨ６．５、０．１Ｍ Ｎａ
Ｃｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）を得た。
【００２５】この４−ヨードアセチル−アミノベンゾエ
ート・ＰＯＤ複合体と、先の操作で得られたＴＳＨ抗体
Ｆab'フラグメントを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
５）中で直ちに混合し、４℃で１６時間反応させた。反
応後、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー（ＴＳＫｇｅ
ｌＧ３０００ＳＷ）で分離精製を行い、ＰＯＤ標識Ｆa
b'化抗ＴＳＨ抗体を調製した。
ート・ＰＯＤ複合体と、先の操作で得られたＴＳＨ抗体
Ｆab'フラグメントを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
５）中で直ちに混合し、４℃で１６時間反応させた。反
応後、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー（ＴＳＫｇｅ
ｌＧ３０００ＳＷ）で分離精製を行い、ＰＯＤ標識Ｆa
b'化抗ＴＳＨ抗体を調製した。
【００２６】比較例１ （スルホン化ＳＩＡＢを用いたＰＯＤ標識マウス抗ＴＳ
Ｈモノクローナル抗体の調製）比較のために、ＳＩＡＢ
を用いた酵素標識抗体の調製の従来法の例として、抗体
とスルホン化ＳＩＡＢとを、抗体のアミノ基を利用して
結合し、また、スルホン化ＳＩＡＢとＰＯＤを、ＰＯＤ
のメルカプト基を利用して結合することにより酵素標識
抗体を調製した。
Ｈモノクローナル抗体の調製）比較のために、ＳＩＡＢ
を用いた酵素標識抗体の調製の従来法の例として、抗体
とスルホン化ＳＩＡＢとを、抗体のアミノ基を利用して
結合し、また、スルホン化ＳＩＡＢとＰＯＤを、ＰＯＤ
のメルカプト基を利用して結合することにより酵素標識
抗体を調製した。
【００２７】即ち、抗ＴＳＨ抗体３ｍｇを０．１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．３ｍｌに加え溶解した。こ
れに２ｍｇ／ｍｌの濃度のスルホン化ＳＩＡＢ溶液を
０．３ｍｌ添加し、室温で１時間反応させた後、反応物
を脱塩処理して４−ヨードアセチル−アミノベンゾエー
ト・抗ＴＳＨ抗体複合体の溶液（溶媒：０．０５Ｍリン
酸緩衝液：ｐＨ６．５、０．１Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ
ＥＤＴＡ）を得た。
酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．３ｍｌに加え溶解した。こ
れに２ｍｇ／ｍｌの濃度のスルホン化ＳＩＡＢ溶液を
０．３ｍｌ添加し、室温で１時間反応させた後、反応物
を脱塩処理して４−ヨードアセチル−アミノベンゾエー
ト・抗ＴＳＨ抗体複合体の溶液（溶媒：０．０５Ｍリン
酸緩衝液：ｐＨ６．５、０．１Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ
ＥＤＴＡ）を得た。
【００２８】ＰＯＤ３ｍｇに０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）を０．３ｍｌ加え溶解した。これにＳ-アセ
チルメルカプトコハク酸無水物２ｍｇをジメチルホルム
アミド５０μｌに溶解した液を加えた。この混合液を２
５℃、３０分間インキュベーションした。次に５００ｍ
Ｍヒドロキシルアミンと１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０
０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液０．２ｍｌを加えてｐＨ
７．０に調整した。この混合液を３０℃、４分間静置し
た後、脱塩処理してメルカプト基を導入したＰＯＤ（Ｓ
Ｈ化ＰＯＤ）の溶液（溶媒：０．０５Ｍリン酸緩衝液：
ｐＨ６．５、０．１Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）
を得た。
Ｈ７．０）を０．３ｍｌ加え溶解した。これにＳ-アセ
チルメルカプトコハク酸無水物２ｍｇをジメチルホルム
アミド５０μｌに溶解した液を加えた。この混合液を２
５℃、３０分間インキュベーションした。次に５００ｍ
Ｍヒドロキシルアミンと１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０
０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液０．２ｍｌを加えてｐＨ
７．０に調整した。この混合液を３０℃、４分間静置し
た後、脱塩処理してメルカプト基を導入したＰＯＤ（Ｓ
Ｈ化ＰＯＤ）の溶液（溶媒：０．０５Ｍリン酸緩衝液：
ｐＨ６．５、０．１Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）
を得た。
【００２９】このＳＨ化ＰＯＤと先の操作で得た４−ヨ
ードアセチル−アミノベンゾエート・抗ＴＳＨ抗体複合
体を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中で直ちに混
合し、４℃で１６時間反応させた後、ゲル濾過カラムク
ロマトグラフィーで分離精製を行い、ＰＯＤ標識抗ＴＳ
Ｈ抗体を調製した。
ードアセチル−アミノベンゾエート・抗ＴＳＨ抗体複合
体を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中で直ちに混
合し、４℃で１６時間反応させた後、ゲル濾過カラムク
ロマトグラフィーで分離精製を行い、ＰＯＤ標識抗ＴＳ
Ｈ抗体を調製した。
【００３０】比較例２ （ＳＭＣＣを用いたＰＯＤ標識抗体の調製）架橋剤をＮ
−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−
シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣと略
記する）とした場合の例として、ＰＯＤ標識Ｆab'化マ
ウス抗ＴＳＨモノクローナル抗体を調製した。
−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−
シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣと略
記する）とした場合の例として、ＰＯＤ標識Ｆab'化マ
ウス抗ＴＳＨモノクローナル抗体を調製した。
【００３１】即ち、まず、実施例１と同様にＦab'化抗
ＴＳＨ抗体の溶液を調製した。
ＴＳＨ抗体の溶液を調製した。
【００３２】次に、ＰＯＤ３ｍｇに０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）を０．３ｍｌ加え溶解した。これに１
００ｍｇ／ｍｌ ＳＭＣＣ・ジメチルホルムアミド溶液
を０．０３ｍｌ添加し、室温で１時間反応させた後、反
応物を脱塩してマレイミド基導入ＰＯＤの溶液（溶媒：
０．０５Ｍリン酸緩衝液：ｐＨ６．５、０．１Ｍ Ｎａ
Ｃｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）を得た。
液（ｐＨ７．０）を０．３ｍｌ加え溶解した。これに１
００ｍｇ／ｍｌ ＳＭＣＣ・ジメチルホルムアミド溶液
を０．０３ｍｌ添加し、室温で１時間反応させた後、反
応物を脱塩してマレイミド基導入ＰＯＤの溶液（溶媒：
０．０５Ｍリン酸緩衝液：ｐＨ６．５、０．１Ｍ Ｎａ
Ｃｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）を得た。
【００３３】これらのＦab'化抗ＴＳＨ抗体とマレイミ
ド基導入ＰＯＤを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）
中で直ちに混合し、４℃で１６時間反応させた後、ゲル
濾過カラムクロマトグラフィーで分離精製を行い、ＰＯ
Ｄ標識Ｆab'化抗ＴＳＨ抗体を調製した。
ド基導入ＰＯＤを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）
中で直ちに混合し、４℃で１６時間反応させた後、ゲル
濾過カラムクロマトグラフィーで分離精製を行い、ＰＯ
Ｄ標識Ｆab'化抗ＴＳＨ抗体を調製した。
【００３４】比較例３ （ＳＰＤＰを用いたＰＯＤ標識抗体の調製）架橋剤をＮ
−スクシンイミジル−３−（２’−ピリジルジチオ）プ
ロピオレート（ＳＰＤＰと略記する）とした場合の例と
して、ＰＯＤ標識Ｆab'化マウス抗ＴＳＨモノクローナ
ル抗体を調製した。
−スクシンイミジル−３−（２’−ピリジルジチオ）プ
ロピオレート（ＳＰＤＰと略記する）とした場合の例と
して、ＰＯＤ標識Ｆab'化マウス抗ＴＳＨモノクローナ
ル抗体を調製した。
【００３５】即ち、まず、実施例１と同様にＦab'化抗
ＴＳＨ抗体溶液を調製した。
ＴＳＨ抗体溶液を調製した。
【００３６】次に、ＰＯＤ３ｍｇに０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）を０．３ｍｌ加え溶解した。これに５
０ｍｇ／ｍｌ ＳＰＤＰ・ジメチルホルムアミド溶液を
０．０３ｍｌ添加し、室温で１時間反応させた後、反応
物を脱塩処理してピリジルジスルフィド基導入ＰＯＤ溶
液（溶媒：０．０５Ｍリン酸緩衝液：ｐＨ６．５、０．
１Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）を得た。
液（ｐＨ７．０）を０．３ｍｌ加え溶解した。これに５
０ｍｇ／ｍｌ ＳＰＤＰ・ジメチルホルムアミド溶液を
０．０３ｍｌ添加し、室温で１時間反応させた後、反応
物を脱塩処理してピリジルジスルフィド基導入ＰＯＤ溶
液（溶媒：０．０５Ｍリン酸緩衝液：ｐＨ６．５、０．
１Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）を得た。
【００３７】これらのＦab'化抗ＴＳＨ抗体とピリジル
ジスルフィド基導入ＰＯＤを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）中で直ちに混合し、４℃で１６時間反応させ
た後、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーで分離精製を
行い、ＰＯＤ標識Ｆab'化抗ＴＳＨ抗体を調製した。
ジスルフィド基導入ＰＯＤを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）中で直ちに混合し、４℃で１６時間反応させ
た後、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーで分離精製を
行い、ＰＯＤ標識Ｆab'化抗ＴＳＨ抗体を調製した。
【００３８】試験例１ （ＰＯＤ標識Ｆab'化抗ＴＳＨ抗体及びＰＯＤ標識抗Ｔ
ＳＨ抗体の酵素活性及び反応性の測定）実施例１、比較
例１〜３で得られた酵素標識抗体の安定性を調べるため
に、抗体溶液を一定期間室温にて保存した後、下記の方
法により酵素活性の変化及び抗体の抗原との反応性の変
化を測定した。 （１）酵素活性の経時変化 酵素活性の測定は以下の測定法で行った。反応容器とし
て用意したプラスチックチューブに、西洋ワサビＰＯＤ
標識抗ＴＳＨ抗体溶液（４０ｎｇ／ｍｌ）を１０μｌ加
え、３７℃で５分間インキュベーションした。その後、
ＴＭＢＺ・過酸化水素水溶液５００μｌを加え、さらに
３７℃で２分間及び５分間インキュベーション後、１Ｎ
硫酸１ｍｌにて反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光
度を測定し、次式Ｉにより本品１μｇ当たりの酵素活性
を測定した。
ＳＨ抗体の酵素活性及び反応性の測定）実施例１、比較
例１〜３で得られた酵素標識抗体の安定性を調べるため
に、抗体溶液を一定期間室温にて保存した後、下記の方
法により酵素活性の変化及び抗体の抗原との反応性の変
化を測定した。 （１）酵素活性の経時変化 酵素活性の測定は以下の測定法で行った。反応容器とし
て用意したプラスチックチューブに、西洋ワサビＰＯＤ
標識抗ＴＳＨ抗体溶液（４０ｎｇ／ｍｌ）を１０μｌ加
え、３７℃で５分間インキュベーションした。その後、
ＴＭＢＺ・過酸化水素水溶液５００μｌを加え、さらに
３７℃で２分間及び５分間インキュベーション後、１Ｎ
硫酸１ｍｌにて反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光
度を測定し、次式Ｉにより本品１μｇ当たりの酵素活性
を測定した。
【００３９】
【数１】 酵素活性の経時変化（経時安定性）は、保存前及び保存
後の酵素標識抗体を用いて上記の方法で測定した吸光度
について、保存後のものの吸光度を、保存前のものの吸
光度を１００とした時の相対値として表すことで評価し
た。得られた結果を表１に示す。
後の酵素標識抗体を用いて上記の方法で測定した吸光度
について、保存後のものの吸光度を、保存前のものの吸
光度を１００とした時の相対値として表すことで評価し
た。得られた結果を表１に示す。
【００４０】
【表１】 表１に示されたとおり、本発明の酵素標識抗体（実施例
１）の標識酵素の活性値の低下率は極めて低く、標識酵
素の活性は安定に保持されることが判明した。また、ス
ルホン化ＳＩＡＢを用いた従来の酵素標識抗体調製法で
得られた酵素標識抗体（比較例１）、或いはＳＩＡＢ以
外の架橋剤を用いた調製法で得られた酵素標識抗体（比
較例２、３）においても実施例１とほぼ同様の結果が得
られた。 （２）抗体の反応性の経時変化 抗体の抗原との反応性については、酵素免疫測定法の原
理を用いて以下の通り行った。反応容器としてのプラス
チックチューブに抗ＴＳＨ抗体固定化磁性微粒子懸濁液
（１．０ｍｇ／ｍｌ）５０μｌと標準溶液（ＴＳＨ濃
度：４０μＩＵ／ｍｌ）８０μｌを加え、３７℃で５分
間インキュベーションした。続いて西洋ワサビＰＯＤ標
識抗ＴＳＨ抗体５０μｌを加え、３７℃で５分間インキ
ュベーションした。その後、磁石により磁性微粒子を集
積させた後、洗浄液にて洗浄操作を３回行い、ＴＭＢＺ
・過酸化水素水溶液３００μｌを加え、さらに３７℃で
５分間インキュベーション後、１Ｎ硫酸１ｍｌにて反応
を停止し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
１）の標識酵素の活性値の低下率は極めて低く、標識酵
素の活性は安定に保持されることが判明した。また、ス
ルホン化ＳＩＡＢを用いた従来の酵素標識抗体調製法で
得られた酵素標識抗体（比較例１）、或いはＳＩＡＢ以
外の架橋剤を用いた調製法で得られた酵素標識抗体（比
較例２、３）においても実施例１とほぼ同様の結果が得
られた。 （２）抗体の反応性の経時変化 抗体の抗原との反応性については、酵素免疫測定法の原
理を用いて以下の通り行った。反応容器としてのプラス
チックチューブに抗ＴＳＨ抗体固定化磁性微粒子懸濁液
（１．０ｍｇ／ｍｌ）５０μｌと標準溶液（ＴＳＨ濃
度：４０μＩＵ／ｍｌ）８０μｌを加え、３７℃で５分
間インキュベーションした。続いて西洋ワサビＰＯＤ標
識抗ＴＳＨ抗体５０μｌを加え、３７℃で５分間インキ
ュベーションした。その後、磁石により磁性微粒子を集
積させた後、洗浄液にて洗浄操作を３回行い、ＴＭＢＺ
・過酸化水素水溶液３００μｌを加え、さらに３７℃で
５分間インキュベーション後、１Ｎ硫酸１ｍｌにて反応
を停止し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００４１】抗体反応性の経時変化（経時安定性）は、
保存前及び保存後の酵素標識抗体を用いて上記の方法で
測定した吸光度について、保存後のものの吸光度を、保
存前のものの吸光度を１００とした時の相対値として表
すことで評価した。得られた結果を表２に示す。
保存前及び保存後の酵素標識抗体を用いて上記の方法で
測定した吸光度について、保存後のものの吸光度を、保
存前のものの吸光度を１００とした時の相対値として表
すことで評価した。得られた結果を表２に示す。
【００４２】
【表２】 その結果、本発明の酵素標識抗体（実施例１）の抗体反
応性の経時的な減少幅は、先の表１に示された標識酵素
の活性値の減少幅とほぼ同じであり、抗体の抗原との反
応性は安定に維持されていることがわかる。すなわち、
本発明の酵素標識抗体は経時安定性に優れるものであっ
た。
応性の経時的な減少幅は、先の表１に示された標識酵素
の活性値の減少幅とほぼ同じであり、抗体の抗原との反
応性は安定に維持されていることがわかる。すなわち、
本発明の酵素標識抗体は経時安定性に優れるものであっ
た。
【００４３】一方、ＳＩＡＢを用いた従来の酵素標識抗
体調製法で得られた抗体（比較例１）、或いはＳＩＡＢ
以外の架橋剤を用いた調製法で得られた抗体（比較例
２、３）においては、先の表１に示すように標識酵素の
活性自体は安定であるにも拘らず、吸光度の減少率は実
施例１よりも大きく。これらの比較例で得た酵素標識抗
体の経時安定性が不十分であった。
体調製法で得られた抗体（比較例１）、或いはＳＩＡＢ
以外の架橋剤を用いた調製法で得られた抗体（比較例
２、３）においては、先の表１に示すように標識酵素の
活性自体は安定であるにも拘らず、吸光度の減少率は実
施例１よりも大きく。これらの比較例で得た酵素標識抗
体の経時安定性が不十分であった。
【００４４】実施例２ （ＴＳＨ免疫学的測定用キット）ＴＳＨ標準液を調製し
た。その他、測定に必要な試薬を調製し、表３に示すＴ
ＳＨ免疫学的測定用キットを構成した。次に、本キット
を用いたＴＳＨの測定を以下のようにして行った。
た。その他、測定に必要な試薬を調製し、表３に示すＴ
ＳＨ免疫学的測定用キットを構成した。次に、本キット
を用いたＴＳＨの測定を以下のようにして行った。
【００４５】即ち、プラスチックチューブに抗ＴＳＨ抗
体結合磁性微粒子懸濁液５０μｌとＴＳＨ標準溶液或い
は検体８０μｌを加え、３７℃で５分間インキュベーシ
ョンした。西洋ワサビＰＯＤ標識抗ＴＳＨ抗体溶液５０
μｌを加え、３７℃で５分間インキュベーションした。
その後、磁石により磁性微粒子を集積させた後、洗浄液
にて洗浄操作を３回行った。洗浄の終わった試料に発色
液３８ｍｌと酵素基質液２００μｌの混合液３００μｌ
を加え、更に３７℃で５分間インキュベーションした。
その後、反応停止液（１Ｎ硫酸溶液）１ｍｌを添加して
反応を停止し、得られた反応液の４５０ｎｍにおける吸
光度を測定した。図１にＴＳＨ測定用標準溶液の検量線
を示した。
体結合磁性微粒子懸濁液５０μｌとＴＳＨ標準溶液或い
は検体８０μｌを加え、３７℃で５分間インキュベーシ
ョンした。西洋ワサビＰＯＤ標識抗ＴＳＨ抗体溶液５０
μｌを加え、３７℃で５分間インキュベーションした。
その後、磁石により磁性微粒子を集積させた後、洗浄液
にて洗浄操作を３回行った。洗浄の終わった試料に発色
液３８ｍｌと酵素基質液２００μｌの混合液３００μｌ
を加え、更に３７℃で５分間インキュベーションした。
その後、反応停止液（１Ｎ硫酸溶液）１ｍｌを添加して
反応を停止し、得られた反応液の４５０ｎｍにおける吸
光度を測定した。図１にＴＳＨ測定用標準溶液の検量線
を示した。
【００４６】
【表３】 実施例３ （スルホン化ＳＩＡＢを用いたＰＯＤ標識Ｆab'化ウサ
ギ抗β2ミクログロブリンポリクローナル抗体の調製）
ウサギ抗β2ミクログロブリンポリクローナル抗体（以
下抗β2ＭＧ抗体と略す）３ｍｇを０．１Ｍクエン酸緩
衝液（ｐＨ４．５） １ｍｌに加えて溶解した。これに
１％ペプシン溶液を０．３５ｍｌ添加し、３７℃で１６
時間反応させた。反応物をゲル濾過カラムクロマトグラ
フィー（ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ）で分離精製
し、Ｆ(ab')2画分を回収した。得られたＦ(ab')2画分に
最終濃度が０．０１Ｍとなるように２−メルカプトエチ
ルアミンを添加した後、３７℃で１．５時間反応させ
た。反応後、反応物を脱塩処理して抗β2ＭＧ抗体Ｆab'
フラグメントの溶液（溶媒：０．０５Ｍリン酸緩衝液：
ｐＨ６．５、０．１Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）
を得た。
ギ抗β2ミクログロブリンポリクローナル抗体の調製）
ウサギ抗β2ミクログロブリンポリクローナル抗体（以
下抗β2ＭＧ抗体と略す）３ｍｇを０．１Ｍクエン酸緩
衝液（ｐＨ４．５） １ｍｌに加えて溶解した。これに
１％ペプシン溶液を０．３５ｍｌ添加し、３７℃で１６
時間反応させた。反応物をゲル濾過カラムクロマトグラ
フィー（ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ）で分離精製
し、Ｆ(ab')2画分を回収した。得られたＦ(ab')2画分に
最終濃度が０．０１Ｍとなるように２−メルカプトエチ
ルアミンを添加した後、３７℃で１．５時間反応させ
た。反応後、反応物を脱塩処理して抗β2ＭＧ抗体Ｆab'
フラグメントの溶液（溶媒：０．０５Ｍリン酸緩衝液：
ｐＨ６．５、０．１Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）
を得た。
【００４７】次に、ＰＯＤ３ｍｇに０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）を０．３ｍｌ加え溶解した。これに２
ｍｇ／ｍｌの濃度のスルホン化ＳＩＡＢ溶液を０．３ｍ
ｌ添加した後、室温で１時間反応させた。反応後、反応
物を脱塩処理して４−ヨードアセチル−アミノベンゾエ
ート・ＰＯＤ複合体の溶液（溶媒：０．０５Ｍリン酸緩
衝液：ｐＨ６．５、０．１Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤ
ＴＡ）を得た。
液（ｐＨ７．０）を０．３ｍｌ加え溶解した。これに２
ｍｇ／ｍｌの濃度のスルホン化ＳＩＡＢ溶液を０．３ｍ
ｌ添加した後、室温で１時間反応させた。反応後、反応
物を脱塩処理して４−ヨードアセチル−アミノベンゾエ
ート・ＰＯＤ複合体の溶液（溶媒：０．０５Ｍリン酸緩
衝液：ｐＨ６．５、０．１Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤ
ＴＡ）を得た。
【００４８】この４−ヨードアセチル−アミノベンゾエ
ート・ＰＯＤ複合体に、先の操作で得た抗β2ＭＧ抗体
Ｆab'フラグメントを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）中で直ちに混合し、４℃で１６時間反応させた。反
応後、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー（ＴＳＫｇｅ
ｌ Ｇ３０００ＳＷ）で分離精製を行い、ＰＯＤ標識Ｆa
b'化抗β2ＭＧ抗体を調製した。
ート・ＰＯＤ複合体に、先の操作で得た抗β2ＭＧ抗体
Ｆab'フラグメントを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）中で直ちに混合し、４℃で１６時間反応させた。反
応後、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー（ＴＳＫｇｅ
ｌ Ｇ３０００ＳＷ）で分離精製を行い、ＰＯＤ標識Ｆa
b'化抗β2ＭＧ抗体を調製した。
【００４９】比較例４ （スルホン化ＳＩＡＢを用いたＰＯＤ標識ウサギ抗β2
ミクログロブリンポリクローナル抗体の調製）比較のた
めに、ＳＩＡＢを用いた酵素標識抗体の調製の従来法の
例として、抗体とスルホン化ＳＩＡＢとを、抗体のアミ
ノ基を利用して結合し、また、スルホン化ＳＩＡＢとＰ
ＯＤを、ＰＯＤのメルカプト基を利用して結合すること
により酵素標識抗体を調製した。
ミクログロブリンポリクローナル抗体の調製）比較のた
めに、ＳＩＡＢを用いた酵素標識抗体の調製の従来法の
例として、抗体とスルホン化ＳＩＡＢとを、抗体のアミ
ノ基を利用して結合し、また、スルホン化ＳＩＡＢとＰ
ＯＤを、ＰＯＤのメルカプト基を利用して結合すること
により酵素標識抗体を調製した。
【００５０】即ち、抗β2ＭＧ抗体３ｍｇを０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０） ０．３ｍｌに加え溶解し
た。これに２ｍｇ／ｍｌの濃度のスルホン化ＳＩＡＢ溶
液を０．３ｍｌ添加し、室温で１時間反応させた後、反
応物を脱塩処理して４−ヨードアセチル−アミノベンゾ
エート・抗β2ＭＧ抗体複合体の溶液（溶媒：０．０５
Ｍリン酸緩衝液：ｐＨ６．５、０．１Ｍ ＮａＣｌ、２
ｍＭ ＥＤＴＡ）を得た。
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０） ０．３ｍｌに加え溶解し
た。これに２ｍｇ／ｍｌの濃度のスルホン化ＳＩＡＢ溶
液を０．３ｍｌ添加し、室温で１時間反応させた後、反
応物を脱塩処理して４−ヨードアセチル−アミノベンゾ
エート・抗β2ＭＧ抗体複合体の溶液（溶媒：０．０５
Ｍリン酸緩衝液：ｐＨ６．５、０．１Ｍ ＮａＣｌ、２
ｍＭ ＥＤＴＡ）を得た。
【００５１】この溶液と、比較例２と同様にして得たＳ
Ｈ化ＰＯＤとを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中
で直ちに混合し、４℃で１６時間反応させた後、ゲル濾
過カラムクロマトグラフィーで分離精製を行い、ＰＯＤ
標識抗β2ＭＧ抗体を調製した。
Ｈ化ＰＯＤとを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中
で直ちに混合し、４℃で１６時間反応させた後、ゲル濾
過カラムクロマトグラフィーで分離精製を行い、ＰＯＤ
標識抗β2ＭＧ抗体を調製した。
【００５２】比較例５ （ＳＭＣＣを用いたＰＯＤ標識抗体の調製）架橋剤をＳ
ＭＣＣとした場合の例として、ＰＯＤ標識Ｆab'化ウサ
ギ抗β2ミクログロブリンポリクローナル抗体を調製し
た。
ＭＣＣとした場合の例として、ＰＯＤ標識Ｆab'化ウサ
ギ抗β2ミクログロブリンポリクローナル抗体を調製し
た。
【００５３】即ち、まず実施例３と同様にＦab'化抗β2
ＭＧ抗体溶液を調製し、更に比較例２と同様にマレイミ
ド基導入ＰＯＤ溶液を調製した。
ＭＧ抗体溶液を調製し、更に比較例２と同様にマレイミ
ド基導入ＰＯＤ溶液を調製した。
【００５４】これらのＦab'化抗β2ＭＧ抗体とマレイミ
ド基導入ＰＯＤを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）
中で直ちに混合し、４℃で１６時間反応させた後、ゲル
濾過カラムクロマトグラフィーで分離精製を行い、ＰＯ
Ｄ標識Ｆab'化抗β2ＭＧ抗体を調製した。
ド基導入ＰＯＤを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）
中で直ちに混合し、４℃で１６時間反応させた後、ゲル
濾過カラムクロマトグラフィーで分離精製を行い、ＰＯ
Ｄ標識Ｆab'化抗β2ＭＧ抗体を調製した。
【００５５】比較例６ （ＳＰＤＰを用いたＰＯＤ標識抗体の調製）架橋剤をＳ
ＰＤＰとした場合の例として、ＰＯＤ標識Ｆab'化ウサ
ギ抗β2ミクログロブリンポリクローナル抗体を調製し
た。
ＰＤＰとした場合の例として、ＰＯＤ標識Ｆab'化ウサ
ギ抗β2ミクログロブリンポリクローナル抗体を調製し
た。
【００５６】即ち、まず実施例３と同様にＦab'化抗β2
ＭＧ抗体溶液を調製し、更に比較例３と同様にピリジル
ジスルフィド基導入ＰＯＤ溶液を得た。
ＭＧ抗体溶液を調製し、更に比較例３と同様にピリジル
ジスルフィド基導入ＰＯＤ溶液を得た。
【００５７】これらのＦab'化抗β2ＭＧ抗体とピリジル
ジスルフィド基導入ＰＯＤとを０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．５）中で直ちに混合し、４℃で１６時間反応
させた後、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーで分離精
製を行い、ＰＯＤ標識Ｆab'化抗β2ＭＧ抗体を調製し
た。
ジスルフィド基導入ＰＯＤとを０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．５）中で直ちに混合し、４℃で１６時間反応
させた後、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーで分離精
製を行い、ＰＯＤ標識Ｆab'化抗β2ＭＧ抗体を調製し
た。
【００５８】試験例２ （ＰＯＤ標識Ｆab'化抗ＴＳＨ抗体及びＰＯＤ標識抗Ｔ
ＳＨ抗体の酵素活性及び反応性の測定）実施例３、比較
例４〜６で得られたＰＯＤ標識（Ｆab'化）抗β2ＭＧ抗
体の安定性を調べるために、抗体溶液を一定期間室温に
て保存した後、下記の方法により酵素活性の変化及び抗
体の抗原との反応性の変化を測定した。 （１）酵素活性の経時変化 酵素活性の測定は試験例１と同様の操作で行った。但
し、西洋ワサビＰＯＤ標識抗ＴＳＨ抗体溶液の代わりに
西洋ワサビＰＯＤ標識抗β2ＭＧ抗体溶液を用いた。保
存前及び保存後の抗体を用いた場合の吸光度を測定し、
結果を保存前抗体を用いた場合の吸光度を１００とした
時の相対値として表した（表４）。
ＳＨ抗体の酵素活性及び反応性の測定）実施例３、比較
例４〜６で得られたＰＯＤ標識（Ｆab'化）抗β2ＭＧ抗
体の安定性を調べるために、抗体溶液を一定期間室温に
て保存した後、下記の方法により酵素活性の変化及び抗
体の抗原との反応性の変化を測定した。 （１）酵素活性の経時変化 酵素活性の測定は試験例１と同様の操作で行った。但
し、西洋ワサビＰＯＤ標識抗ＴＳＨ抗体溶液の代わりに
西洋ワサビＰＯＤ標識抗β2ＭＧ抗体溶液を用いた。保
存前及び保存後の抗体を用いた場合の吸光度を測定し、
結果を保存前抗体を用いた場合の吸光度を１００とした
時の相対値として表した（表４）。
【００５９】その結果、本発明の酵素標識抗体の酵素活
性値は、ＳＩＡＢを用いた従来の酵素標識抗体調製法で
得られた抗体、或いはＳＩＡＢ以外の架橋剤を用いた調
製法で得られた抗体の活性値とほぼ同様であった。
性値は、ＳＩＡＢを用いた従来の酵素標識抗体調製法で
得られた抗体、或いはＳＩＡＢ以外の架橋剤を用いた調
製法で得られた抗体の活性値とほぼ同様であった。
【００６０】
【表４】 （２）抗体の反応性の経時変化 免疫学的測定は酵素免疫測定法の原理を用いて以下の通
り行った。反応容器としてプラスチックチューブを用い
た。このチューブに抗β2ＭＧ抗体固定化磁性微粒子懸
濁液（１．０ｍｇ／ｍｌ）１００μｌと標準溶液（β2
ミクログロブリン濃度：２０００ｎｇ／ｍｌ）５μｌを
加え、３７℃で５分間インキュベーションした。磁石に
より磁性微粒子を集積させた後、洗浄液にて洗浄を行っ
た。続いて西洋ワサビＰＯＤ標識抗β2ＭＧ抗体１００
μｌを加え、３７℃で５分間インキュベーションした。
その後、上記要領にて洗浄操作を３回行い、ＴＭＢＺ・
過酸化水素水溶液３００μｌを加え、さらに３７℃で５
分間インキュベーション後、１Ｎ硫酸１ｍｌにて反応を
停止し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。保存前
及び保存後の抗体を用いた場合の吸光度を測定し、結果
を保存前抗体を用いた場合の吸光度を１００とした時の
相対値として表した（表５）。
り行った。反応容器としてプラスチックチューブを用い
た。このチューブに抗β2ＭＧ抗体固定化磁性微粒子懸
濁液（１．０ｍｇ／ｍｌ）１００μｌと標準溶液（β2
ミクログロブリン濃度：２０００ｎｇ／ｍｌ）５μｌを
加え、３７℃で５分間インキュベーションした。磁石に
より磁性微粒子を集積させた後、洗浄液にて洗浄を行っ
た。続いて西洋ワサビＰＯＤ標識抗β2ＭＧ抗体１００
μｌを加え、３７℃で５分間インキュベーションした。
その後、上記要領にて洗浄操作を３回行い、ＴＭＢＺ・
過酸化水素水溶液３００μｌを加え、さらに３７℃で５
分間インキュベーション後、１Ｎ硫酸１ｍｌにて反応を
停止し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。保存前
及び保存後の抗体を用いた場合の吸光度を測定し、結果
を保存前抗体を用いた場合の吸光度を１００とした時の
相対値として表した（表５）。
【００６１】その結果、本発明の酵素標識抗体の反応性
は、ＳＩＡＢを用いた従来の酵素標識抗体調製法で得ら
れた抗体、或いはＳＩＡＢ以外の架橋剤を用いた調製法
で得られた抗体の反応性と比べて経時的減少が少なく、
本発明の酵素標識抗体は、経時安定性に優れていること
がわかった。
は、ＳＩＡＢを用いた従来の酵素標識抗体調製法で得ら
れた抗体、或いはＳＩＡＢ以外の架橋剤を用いた調製法
で得られた抗体の反応性と比べて経時的減少が少なく、
本発明の酵素標識抗体は、経時安定性に優れていること
がわかった。
【００６２】
【表５】 実施例４ （β2ＭＧ免疫学的測定用キット）β2ＭＧ標準液を調製
した。その他測定に必要な試薬を調製し、表６に示すβ
2ＭＧ免疫学的測定用キットを構成した。本キットを用
いたβ2ＭＧの測定は以下のようにして行う。
した。その他測定に必要な試薬を調製し、表６に示すβ
2ＭＧ免疫学的測定用キットを構成した。本キットを用
いたβ2ＭＧの測定は以下のようにして行う。
【００６３】即ち、プラスチックチューブに抗β2ＭＧ
抗体結合磁性微粒子懸濁液１００μｌとβ2ＭＧ標準溶
液或いは検体５μｌを加え、３７℃で５分間インキュベ
ーションする。磁石により磁性微粒子を集積させた後、
洗浄液により洗浄を行う。西洋ワサビＰＯＤ標識抗β2
ＭＧ抗体溶液１００μｌを加え、３７℃で５分間インキ
ュベーションする。その後上記要領で３回洗浄を行う。
洗浄の終わった試料に発色液３８ｍｌと酵素基質液２０
０μｌの混合液３００μｌを加え、更に３７℃で５分間
インキュベーションする。その後、反応停止液（１Ｎ硫
酸溶液）１ｍｌを添加して反応を停止し、得られた反応
液の４５０ｎｍにおける吸光度を測定する。図２にβ2
ＭＧ測定用標準溶液の検量線を示した。
抗体結合磁性微粒子懸濁液１００μｌとβ2ＭＧ標準溶
液或いは検体５μｌを加え、３７℃で５分間インキュベ
ーションする。磁石により磁性微粒子を集積させた後、
洗浄液により洗浄を行う。西洋ワサビＰＯＤ標識抗β2
ＭＧ抗体溶液１００μｌを加え、３７℃で５分間インキ
ュベーションする。その後上記要領で３回洗浄を行う。
洗浄の終わった試料に発色液３８ｍｌと酵素基質液２０
０μｌの混合液３００μｌを加え、更に３７℃で５分間
インキュベーションする。その後、反応停止液（１Ｎ硫
酸溶液）１ｍｌを添加して反応を停止し、得られた反応
液の４５０ｎｍにおける吸光度を測定する。図２にβ2
ＭＧ測定用標準溶液の検量線を示した。
【００６４】
【表６】
【００６５】
【発明の効果】本発明の酵素標識抗体は優れた経時安定
性を有するため、該酵素標識抗体を用いると免疫学的測
定の結果について優れた再現性が得られる。
性を有するため、該酵素標識抗体を用いると免疫学的測
定の結果について優れた再現性が得られる。
【００６６】また、本発明の酵素標識抗体を用いた免疫
学的測定用キットは長期間保存可能であるため大変経済
的である。
学的測定用キットは長期間保存可能であるため大変経済
的である。
【図１】ＴＳＨ測定用標準溶液の検量線を示す図であ
る。
る。
【図２】β2ＭＧ測定用標準溶液の検量線を示す図であ
る。
る。
Claims (8)
- 【請求項１】 抗体に標識酵素を架橋剤を介して結合さ
せた酵素標識抗体において、下記式（１）： 【化１】 ［上記式（１）中、Ａｂは抗体を、ＰＯＤはペルオキシ
ダーゼを表わす。］で表わされる構造を有することを特
徴とする酵素標識抗体。 - 【請求項２】 前記抗体がＦab'フラグメントである請
求項１に記載の酵素標識抗体。 - 【請求項３】 前記抗体が、予めメルカプト基が導入さ
れたものである請求項１または２に記載の酵素標識抗
体。 - 【請求項４】 抗体に、Ｎ−スクシンイミジル−（４−
ヨードアセチル）−アミノベンゾエート又はスルホスク
シンイミジル−（４−ヨードアセチル）−アミノベンゾ
エートからなる架橋剤を用いて標識酵素を結合させるこ
とにより下記式（１）： 【化２】 ［上記式（１）中、Ａｂは抗体を、ＰＯＤはペルオキシ
ダーゼを表わす。］で表わされる構造を有する酵素標識
抗体を調製する方法において、（ａ）前記抗体としてメ
ルカプト基を有するものを用い、該メルカプト基と、前
記架橋剤のヨードアセチル基とを反応させることでこれ
らを結合する過程と、（ｂ）前記標識酵素をそのアミノ
基を利用して、前記架橋剤のスクシンイミド基またはホ
スホスクシンイミド基と置換することでこれらを結合す
る過程とを有することを特徴とする酵素標識抗体の調製
方法。 - 【請求項５】 前記抗体がＦab'フラグメントである請
求項４に記載の酵素標識抗体の調製方法。 - 【請求項６】 前記抗体が、予めメルカプト基が導入さ
れたものである請求項４または５に記載の酵素標識抗体
の調製方法。 - 【請求項７】 試料と、請求項１〜３のいずれかに記載
の酵素標識抗体を反応させる過程と、該試料中に抗原が
含まれる場合に形成される抗原−酵素標識抗体コンプレ
ックスを、該抗体に結合させた標識酵素を利用して検出
する過程とを有することを特徴とする免疫学的測定方
法。 - 【請求項８】 請求項４に記載の酵素標識抗体と、該酵
素標識抗体を用いた免疫学測定法に必要な試薬を有する
ことを特徴とする免疫学測定用キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16535595A JP3516526B2 (ja) | 1995-06-30 | 1995-06-30 | 安定化された酵素標識抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16535595A JP3516526B2 (ja) | 1995-06-30 | 1995-06-30 | 安定化された酵素標識抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0915241A true JPH0915241A (ja) | 1997-01-17 |
| JP3516526B2 JP3516526B2 (ja) | 2004-04-05 |
Family
ID=15810798
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16535595A Expired - Lifetime JP3516526B2 (ja) | 1995-06-30 | 1995-06-30 | 安定化された酵素標識抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3516526B2 (ja) |
-
1995
- 1995-06-30 JP JP16535595A patent/JP3516526B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3516526B2 (ja) | 2004-04-05 |
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