JPH08786B2 - 牛コロナウイルス感染症ワクチン - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は牛コロナウイルス感染
症ワクチンに関する。

【０００２】

【従来の技術】牛コロナウイルス感染症は、Ｃｏｒｏｎ
ａｖｉｒｉｄａｅ科のＣｏｒｏｎａｖｉｒｕｓに属する
牛コロナウイルス（Ｂｏｖｉｎ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕ
ｓ，以下、ＢＣウイルスと略記する）によって引き起こ
される伝染病であり、牛がＢＣウイルスに感染すると、
発熱、白血球の減少を伴って下痢が起こり、重症例では
下痢便中に粘液、血液または偽膜を混じる場合もあり、
特に、乳牛では泌乳量の低下が著しく、ときには泌乳停
止もみられ、子牛では急激な脱水、細菌の二次感染など
により、予後は一般に不良であることが知られている。

【０００３】このような症状を呈するＢＣウイルスは、
日本全国の殆どの牛群に潜在的に分布し、成牛、子牛を
問わず感染と発病を繰り返すので、前記した泌乳量の低
下と共に、成長の遅延を招いて畜産経営の面でも多大な
被害をもたらしている。

【０００４】また、牛コロナウイルス以外のウイルス感
染症ワクチンとしては、弱毒化ワクチン、不活化ワクチ
ンなどが知られている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】ＢＣウイルス感染症ワ
クチンについては、米国などでは既に生ワクチンが開発
され実用化されているが、感染予防および発症予防に対
しての充分な効果については、疑問視されている。

【０００６】また、わが国では、ＢＣウイルス感染症に
ついてのワクチンとしては、特開平２−６７２２７号に
開示されたものが知られている。

【０００７】このワクチンは、不活化したウイルスのみ
を抗原として、従来のワクチンとほぼ同じ製法で得られ
たものであり、培養液からウイルスを遠心法などで分離
し、このウイルスを溶解して抗原液を作り、これにホル
マリンなどを添加して不活化し、次いで抗原液を界面活
性剤で処理したものであった。

【０００８】このようにして得られたワクチンは、その
成分である抗原がウイルスのみからなるので、同ウイル
スに感染した牛の抗体応答を充分に発揮させることがで
きず、よって感染予防効果および発症予防効果が充分に
高いＢＣウイルス感染症ワクチンにならないという問題
点がある。

【０００９】そこで、この発明は、上記した問題点を解
決して、感染予防効果および発症予防効果が充分に高め
られた新規なＢＣウイルス感染症ワクチンを提供するこ
とを課題としている。

【００１０】

【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
め、この発明においては、ＢＣウイルスの感染細胞を界
面活性剤で溶解し不活化した可溶化抗原に、オイルアジ
ュバントを添加したＢＣウイルス感染症ワクチンとした
のである。

【００１１】

【作用】上記したように構成されるこの発明のＢＣウイ
ルス感染症ワクチンは、ＢＣウイルスの感染細胞を抗原
としており、さらにそのような可溶化抗原に対するオイ
ルアジュバントの添加が極めて効果的であるため、抗体
応答が顕著であり、感染防止および発症抑制共に顕著な
効果のあるワクチンとなる。

【００１２】

【実施例】この発明に用いるＢＣウイルスは、特に特定
の株から分離されたものを限定したものではなく、感染
牛から単離された野性株の他、公知のウイルスとして例
えば社団法人動物用生物学的製剤協会の家畜衛生菌株と
して市販されているＢｏｖｉｎ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕ
ｓ６６、菌株番号ＶＢ０８０２などを使用することがで
きる。

【００１３】また、このようなＢＣウイルスを感染し易
い感受性の高い細胞として、ハムスター由来の株化細胞
であるＨＡＬ細胞を用いることが好ましいが、他にたと
えば牛由来のＢＥＫ細胞、またはヒトの直腸癌細胞由来
のＨＲＴ１８細胞などを採用することもできる。

【００１４】またこの発明で用いる界面活性剤は、適度
な可溶化活性を持っているという点で和光純薬社製：ト
ライトン Ｘ−１００、シグマ社製：ノニデットＰ−４
０などの非イオン界面活性剤が好ましい。

【００１５】〔実施例１〕 ＢＣウイルス（（社）動物用生物学的製剤協会 Ｂｏｖ
ｉｎ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ６６、菌株番号ＶＢ０８
０２）を種ウイルスとして、これをローラーボトルで培
養したＨＡＬ細胞に接種し、３７℃で６０分間吸着後、
ウイルス増殖用培養液を５００ミリリットル添加し、３
７℃で回転培養した。そして、２〜４日後、ウイルスの
増殖極期に培養液および感染ＨＡＬ細胞を採取し、３０
００rpm１０分間の条件で遠心分離し、沈渣した細胞に
非イオン界面活性剤としてトライトン Ｘ−１００を
０．５容量％含む０．０１Ｍグリシン−０．００３８Ｍ
トリス緩衝液を１０倍量加え、４℃で一夜攪拌した後、
１０００００Ｇで６０分間遠心分離し、その上清（上澄
み）にホルマリンを０．１％加えて不活化したものを可
溶化抗原とした。そして、この可溶化抗原の３容に７容
のオイルアジュバント（無水マンニトール・オレイン酸
エステル加流動パラフイン）を加えて可溶化抗原ワクチ
ンを得、その適当量をワクチン瓶に分注した。

【００１６】〔比較例１〕 実施例１において、３０００rpm １０分間の条件で遠心
分離した際、沈渣した細胞を用いる代わりに、遠心分離
した際の上清にホルマリンを０．１％加えて不活化した
ものを上清抗原とした以外は、前記実施例１と全く同様
にして上清抗原ワクチンを得、その適当量をワクチン瓶
に分注した。

【００１７】以上の実施例１および比較例１に対して以
下に述べる各種試験を行ない、ワクチンとしての効果お
よび安全性を調べた。

【００１８】(1) 異常毒性否定試験 表１に示すように、４週齢のマウス１０匹の腹腔内に実
施例１（可溶化抗原ワクチン）または比較例１（上清抗
原ワクチン）を０．５ミリリットル接種し、また体重約
３５０ｇのモルモット２匹の筋肉内に実施例１または比
較例１を２ミリリットル接種し、両動物の一般的臨床症
状および体重の推移を１０日間観察し、この結果を表１
中に併記した。

【００１９】

【表１】

【００２０】表１の結果からも明らかなように、実施例
１または比較例１のワクチンを注射されたいずれの動物
も一般的臨床症状に異常は観察されず、体重は順調に増
加した。

【００２１】(2) マウスにおける抗体応答試験 表２に示すように、実施例１または比較例１のワクチン
を４週齢のマウス５匹の筋肉内にそれぞれ０．５ミリリ
ットルずつ３週間間隔で２回注射し、その後、１週間目
の血清について中和抗体価および赤血球凝集抑制（Ｈ
Ｉ）抗体価を測定した。

【００２２】

【表２】

【００２３】表２の結果から明らかなように、実施例１
または比較例１は、中和抗体価が１０２４〜８１９２
倍、ＨＩ抗体価は３２０〜２５６０倍となり、高い抗体
応答が認められた。

【００２４】(3) 牛に対する安全試験 表３に示すように、６〜８箇月齢のホルスタイン種
（Ｈ）の牛９頭を用い、このうち３頭には実施例１を、
３頭には比較例１をそれぞれ筋肉内に２ミリリットルず
つ３週間間隔で２回注射し、残り３頭は未接種の対照群
とし、各注射毎に２週間一般的臨床症状を観察した。

【００２５】

【表３】

【００２６】この結果、実施例１または比較例１を２回
注射したいずれの牛も元気であり、食欲不振および下痢
などの異常はなく、異常発熱の目安となる４０．５℃以
上の発熱および赤・白血球数の異常な増加減少も認めら
れなかった。また、注射局所の腫脹や硬結は認められ
ず、ワクチン注射による副作用は観察されなかった。

【００２７】(4) 抗体応答試験 表４に示すように、前記(3) の試験に用いた牛９頭につ
いて、ワクチン１回目注射時から２回目注射後２週まで
１週間毎に採取した血清を用い、ＢＣウイルスの抗体応
答を観察した。

【００２８】

【表４】

【００２９】表４の結果からも明らかなように、実施例
１を注射した牛群においては、１回注射後３週目で中和
抗体価２５６〜１０２４倍、ＨＩ抗体価８０〜１６０倍
の抗体応答がみられ、さらに２回目の注射によって中和
抗体価が８１９２〜１６３８４倍になり、ＨＩ抗体価は
６４０〜２５６０倍に上昇した。

【００３０】また、比較例１を注射した牛群において
は、１回注射後３週目で中和抗体価２５６〜１０２４
倍、ＨＩ抗体価８０〜１６０倍の抗体応答がみられ、さ
らに２回目の注射によって中和抗体価が２０４８〜４０
９６倍になり、ＨＩ抗体価は３２０〜６４０倍に上昇し
た。このように比較例１より実施例１のほうが、抗体産
生能が優れていた。また、試験期間中に未接種対照群の
牛の抗体の上昇はみられなかった。

【００３１】(5) 攻撃試験 表５に示すように、前記(4) の試験に用いた牛９頭につ
いて、ＢＣウイルスの攻撃試験を行なった。すなわち、
ワクチン２回目注射後６週目に、実施例１、比較例１お
よび対照群にＢＣウイルス感染牛の下痢便の２０％乳剤
を１頭当たり、経口２０ミリリットルおよび経鼻１０ミ
リリットル投与した。そして、投与後２週間臨床症状を
観察するとともに、体温および赤・白血球数の測定およ
び糞便、鼻汁および血液からＨＲＴ−１８細胞を用いて
ウイルス分離を行なった。

【００３２】

【表５】

【００３３】表５の結果からも明らかなように、実施例
１または比較例１を注射したいずれの牛群においても下
痢や発熱はみられず、赤・白血球数の異常も認められな
かったのに対して、対照群は３頭中２頭に水様性の下
痢、残り１頭に軟便が認められ、内１頭に４１．０℃前
後の発熱がみられた。

【００３４】また、ウイルス分離については、免疫群は
どの牛の糞便、鼻汁および血液ともＢＣウイルスは分離
されなかったが、対照群は３頭中３頭の鼻汁、２頭の糞
便からＢＣウイルスが分離された。

【００３５】(6) 攻撃試験前後のＢＣウイルスの抗体価
の測定 前記(5) の攻撃試験における攻撃時と、攻撃４週目の血
清について、ＢＣウイルスの抗体価を測定したところ、
表６に示すように、中和抗体価およびＨＩ抗体価とも免
疫群ではほとんど変動がないか、やや低下する傾向を示
したが、対照群では有意な上昇が認められた。

【００３６】また、実施例１は比較例１に比べて顕著に
高い力価が攻撃４週後にも維持されており、実施例１
は、感染予防効果および発症予防効果が極めて高いワク
チンであるといえる。

【００３７】

【表６】

【００３８】

【効果】この発明は、以上説明したように、この発明の
牛コロナウイルス感染症ワクチンは、感染細胞の可溶化
抗原を採用し、それに対するオイルアジュバントの添加
が極めて効果的であるため、抗体応答が優れており、感
染防止効果および発症抑制効果が極めて高く、本病の蔓
延防止に大きく貢献する理想的な牛コロナウイルス感染
症ワクチンであるということができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 牛コロナウイルスに感染した細胞を界面
   活性剤で溶解し不活化した可溶化抗原に、オイルアジュ
   バントを添加してなる牛コロナウイルス感染症ワクチ
   ン。