JPS6330288B2 - - Google Patents
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- JPS6330288B2 JPS6330288B2 JP56501590A JP50159081A JPS6330288B2 JP S6330288 B2 JPS6330288 B2 JP S6330288B2 JP 56501590 A JP56501590 A JP 56501590A JP 50159081 A JP50159081 A JP 50159081A JP S6330288 B2 JPS6330288 B2 JP S6330288B2
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
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- A—HUMAN NECESSITIES
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- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
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- C12N2750/14311—Parvovirus, e.g. minute virus of mice
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- Y10S424/818—Viral vaccine for canidae or mustelidae, e.g. dogs, foxes, minks
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Description
請求の範囲
１ 発病性犬微小ウイルス株を腫膓非形成細胞培
養中で非発病性の免疫ウイルスが得られるまで犬
にとつての正常な温度より低い温度で連続的に継
代接種することによつて得られた、犬の微小ウイ
ルスによる感染症から犬を保護するための変性生
ワクチン。 ２ 連続的継代接種が少なくとも80継代である第
１項に記載の変性生ワクチン。 ３ 連続的継代接種が108継代である第２項に記
載の変性生ワクチン。 ４ 継代接種温度が約33℃である第１項に記載の
変性生ワクチン。 ５ 腫膓非形成細胞培養が、MDCKセルライン
（CCL―34）、犬の腎細胞、ミンクの肺細胞、牛
の胎児のひ臓細胞、牛の睾丸細胞、ネコの肺細胞
およびネコの腎細胞からなる群から選ばれた培地
からなる第１項に記載の変性生ワクチン。 ６ 発病性犬微小ウイルス株がCPV―916である
第１項に記載の変性生ワクチン。 ７ 犬の微小ウイルスから犬を保護するための変
性生ワクチンの製造方法であつて、(a)発病性犬の
微小ウイルスから出発し、(b)腫膓非形成細胞培養
中で犬にとつての正常な温度より低い温度で該ウ
イルスを連続的に継代接種し、(c)非発病性ウイル
スが得られるまで継代ウイルスの発病性を周期的
に試験することを特徴とする方法。 ８ 系列的継代接種が少なくとも80継代である第
７項に記載の方法。 ９ 系列的継代接種が108継代である第８項に記
載の方法。 １０ 継代接種温度が約33℃である第７項に記載
の方法。 １１ 腫膓非形成細胞培養が、MDCKセルライ
ン（CCL―34）、犬の腎細胞、ミンクの肺細胞、
牛の胎児のひ臓細胞、牛の睾丸細胞、ネコの肺細
胞およびネコの腎細胞からなる群から選ばれた培
地からなる第７項に記載の方法。 １２ 発病性犬微小ウイルス株がCPV―916であ
る第７項に記載の方法。
養中で非発病性の免疫ウイルスが得られるまで犬
にとつての正常な温度より低い温度で連続的に継
代接種することによつて得られた、犬の微小ウイ
ルスによる感染症から犬を保護するための変性生
ワクチン。 ２ 連続的継代接種が少なくとも80継代である第
１項に記載の変性生ワクチン。 ３ 連続的継代接種が108継代である第２項に記
載の変性生ワクチン。 ４ 継代接種温度が約33℃である第１項に記載の
変性生ワクチン。 ５ 腫膓非形成細胞培養が、MDCKセルライン
（CCL―34）、犬の腎細胞、ミンクの肺細胞、牛
の胎児のひ臓細胞、牛の睾丸細胞、ネコの肺細胞
およびネコの腎細胞からなる群から選ばれた培地
からなる第１項に記載の変性生ワクチン。 ６ 発病性犬微小ウイルス株がCPV―916である
第１項に記載の変性生ワクチン。 ７ 犬の微小ウイルスから犬を保護するための変
性生ワクチンの製造方法であつて、(a)発病性犬の
微小ウイルスから出発し、(b)腫膓非形成細胞培養
中で犬にとつての正常な温度より低い温度で該ウ
イルスを連続的に継代接種し、(c)非発病性ウイル
スが得られるまで継代ウイルスの発病性を周期的
に試験することを特徴とする方法。 ８ 系列的継代接種が少なくとも80継代である第
７項に記載の方法。 ９ 系列的継代接種が108継代である第８項に記
載の方法。 １０ 継代接種温度が約33℃である第７項に記載
の方法。 １１ 腫膓非形成細胞培養が、MDCKセルライ
ン（CCL―34）、犬の腎細胞、ミンクの肺細胞、
牛の胎児のひ臓細胞、牛の睾丸細胞、ネコの肺細
胞およびネコの腎細胞からなる群から選ばれた培
地からなる第７項に記載の方法。 １２ 発病性犬微小ウイルス株がCPV―916であ
る第７項に記載の方法。
本発明の背景
本発明は、犬の微小ウイルスCanine
parvovirusによる感染から犬を保護するためのウ
イルスワクチン、その製造方法およびその用途に
関する。 微小ウイルスは等長蛋白質カプシドと短い１本
鎖DNA分子からなる小動物DNAウイルスであ
る。微小ウイルスは種々の動物から回収され、単
離されているが、最近になるまで（Siegl、The
Parvoviruses、Springer―Verlag、New York
1976）、病原性犬の微小ウイルスは明確には単離
されたことがなかつた。Bachmannらは、一般的
な微小ウイルスの特性に関する報告の中で、微小
ウイルスの宿主となる可能性のある動物の中に犬
を挙げている（Bachmann et al.、
Intervirology11：248〜254、1979）。1970年、
Binnらは「犬の微小なウイルス」の回収および
特性について報告した（Binn et al.、Infect.
Immun.1：503、1970）。記載された単離物は犬
由来のものであるが、その病原性は不明であり、
また細胞変性効果（CPE）は非常に狭い範囲の
宿主にのみ、即ち単独の連続犬セルラインでのみ
発生し、一次犬または他の種の一次あるいは連続
細胞培養では発生していない。犬に対する病原性
は調べられておらず、またワクチンとしての可能
性について検討されてもいない。Cornell単離物
の既知の性質に照らせば、最近のCPV単離物は
Binnによつて記載された「犬の微小なウイルス」
と同じでないことは明らかである。1977年、
EugsterとNairnは、状況から判断して子犬の下
痢と犬の微小ウイルスとの間に病原的つながりの
あることを報告した（Eugster、Narin、
Southwestern Veterinarian、30：59、1977）。
ここで報告されている単離物は、調べられた唯一
のセルライン、MDCK細胞中で系列的に繁殖さ
せることができなかつた。また、病原性の可能性
については研究されておらず、実験動物への接種
も行なわれていない。1978年、米国およびオース
トラリア（未発表）において犬の新しい病気が流
行した（Appel Cooper、Greisenおよび
Carmichael、JAVMA173（11）、1516〜1518：
Dec.1978）。この自然発生的な病気の特徴は下
痢、発熱および白血球減少症（相対的リンパ球減
少症）であつた。 はつきりとした微小ウイルスの単離、およびミ
ンクの肺細胞および犬の腎臓の如き種々の動物の
セルラインおよび一次細胞中でのインビトロにお
ける微小ウイルスの繁殖は、本発明者らによつて
初めて報告された（105 Veterinary Record 156
および米国特許第4193991号：犬の微小ウイルス
死菌ワクチンに関するもの）。 ウイルスに対する選択的遺伝的影響力にまつわ
るフアクターは、20 Infection and Immunity
108、April 1978、Carmichael＆Medicに記載さ
れているが、この文献は異なつたウイルス（犬の
疱疹）についてのものである。プラクの大きさで
毒力（発病力）を調べる方法は、本発明者である
カーマイケルの米国特許第4213965号（1979年１
月23日出願、発明の名称：Small Plaque
Variant Canine Herpesvirus Vaccine）に記載
されている。 異型ワクチン（カーマイケルらの特許第
4193990号）および死菌ワクチン（カーマイケル
らの特許第4193991号）は既に知られているが、
CPV用の改良生ワクチンの製造は本発明によつ
て始めて成功をみたのである。この改良された
CPV生ワクチンの製造は、この技術分野におけ
る新しいそして明らかな進歩である。この生ワク
チンによる免疫応答の強さは、異型ワクチンや死
菌ワクチンなどの他のワクチンによるものより４
〜５倍改良されており、従つてこの生ウイルスワ
クチンはこれらの他のワクチンより著しく優れた
ものである。免疫の期間は非常に長く、またこの
生ワクチンは工業的により簡単にそしてより安価
に製造される。 本発明の要約および好ましい実施形式 本発明は、犬の微小ウイルスから犬を保護する
方法に関し、更に詳しくは、犬の微小ウイルスに
よる感染症から犬を保護するための安全な、有効
なワクチンとして使用される発病性のない、非毒
化された生CPV変種を、もとの発病性CPV株か
ら生産する方法に関するものである。このウイル
スの非毒化は、非腫瘍性（腫瘍非形成性）の細胞
培養物に長期間系列的に継代接種することにより
達成される。非毒化された株を接種した犬は、も
とのCPV株をチヤレンジしても病気にかからな
い。 本発明の好ましい実施形式によれば、非毒化さ
れたCPV生ワクチンは、もとの発病性ウイルス
（Cornell株CPV―916）を、ミンクの肺および／
または犬の腎臓セルライン中、最適以下の温度
（犬にとつて正常な温度より低い温度）、33℃で少
なくとも108回系列的に継代接種することにより
生産される。 本発明の他の実施型式では、ミンクの肺または
犬の腎臓細胞に加えて、あるいはその代りに、他
の非腫瘍性細胞培養が使用される。非毒化ワクチ
ンは僅か80回の継代接種でも生産され、これも本
発明に包含される。 本発明方法の説明および実施例 初期単離物の起源 系列的継代接種を開始するのに使用した、もと
の発病性ウイルス単離物はCornellタイプ株
780916（以下、CPV―916という）であつた。こ
の株（CPV―916）は、Rockville、Marylandの
The American Type Culture Collection
（ATCC）に寄託されている。このCPV―916株
はATCCまたはThe James A.Baker Institute
for Animal Health、New York State
College of Veterinary Medicine at Cornell
University、Ithaca、New Yorkから入手するこ
とができる。この株は、Argonne National
Laboratoriesにおいて、急性の下痢を患らつてい
るビーグル犬（子犬）の腸内容物および糞便から
回収された（1978年９月９日）。犬の微小ウイル
ス（CPV）の集合体は、当初、電子顕微鏡で検
出された。この物質は、種々の非腫瘍性細胞培養
に接種された。 CPV―916は、判別し得ない性質を持つた付加
的なCPV株と同様、種々のセルタイプ中で発育
することがわかつた。CPVの発育を支持した細
胞培養は、(1)犬の腎細胞（初代、二代、三代）、
(2)ネコの腎細胞（初代、Crandell FKセルライ
ン）、(3)ネコの肺セルライン（CCL150）、(4)ミン
クの肺セルライン（CCL64）、(5)MDCKセルライ
ン（CCL34）、(6)牛の胎児のひ臓細胞および(7)牛
の睾丸細胞である。 以降の継代に選ばれた単離物は、特異的無病原
（SPF）ビーグル犬（子犬）の腎臓から調製され
た二代犬腎細胞中で回収された。この初代培養が
「細胞培養第１継代」となつた。 CPV―916の系列増殖（継代）および毒力試験 １ 操作の概要 最初のCPV―916系列継代用として、SPF犬
の初代または二代犬腎細胞が選ばれた。希釈し
ていないウイルスとして、初めの３〜４日間隔
の継代（全部で４）を36〜37℃で行なつた。各
継代毎に、ウイルスの血球凝集活性（HA価）
および／または免疫蛍光陽性（細胞核内の
CPVに特異的）の増加によつてウイルスの存
在をモニターした。４継代後、犬に接種するこ
とによりウイルスはまだ発病力を有することが
わかつた。臨床的徴候としては、期間変動性
（２〜４日）の発熱、リンパ球減少、食欲減退、
体重減少、抑うつ、血の混入していることもあ
る下痢と粘液便などが観察された。この細胞培
養第４継代（CPV／４という）のウイルスを
−70℃で貯蔵した。この「発病力を有するウイ
ルス」を、後記の病原性比較試験および免疫犬
のチヤレンジに使用した。CPV／４の感染力
の力価測定をした結果、0.2ml当たり106.5〜
107.0TCID50であつた。 それ以降のCPV継代（継代５およびそれ以
降）は希釈したウイルス（１：15〜１：50）を
用いて３〜５日間隔で行なつた。インキユベー
シヨンは初め（継代１〜31）36℃、それ以降は
33℃で行なつた。種々の継代において、CPV
に特異的な血球凝集阻止（HI）抗体が存在せ
ず、従つて感受性を有することを予め確認した
１頭以上のビーグル犬（通常２〜３頭）に、そ
のCPVを接種した。それぞれの試験では、経
口投与、筋肉内投与または静脈投与により、細
胞培養継代CPVまたはCPV／４（発病性）を、
同じ数の同産犬に、同じ様なウイルス投与量、
接種ルートで接種（チヤレンジ）した。臨床的
および臨床病理学的徴候を毎日詳しくモニター
し、糞便中のウイルス排泄状況を観察した。以
下の条件が満たされた時にウイルスは減弱化さ
れた（病原性が減少しているという証拠により
毒力に変化が生じた）と見做した：(1)継代ウイ
ルスを接種した犬に臨床的徴候がみられず、対
照（発病性）ウイルスを接種した同産の対照犬
には臨床的徴候がみられる；(2)対照ウイルスを
接種した犬の糞便中のウイルス排泄量と比較し
て、細胞培養継代ウイルスを接種した犬の糞便
中のウイルス排泄量が少ないか、あるいはウイ
ルス排泄がないこと。 ２ 種々の継代レベルにおけるCPV発病性（表
１参照） 継代１〜30：CPVは低希釈（１：15〜１：
30）で、３〜５日間隔で継代接種した。継代
時、初代または二次犬腎細胞に顕著な細胞病理
学的影響は現われなかつたが、各継代毎に、核
内免疫蛍光の存在または感受性細胞培養の分析
によりウイルスの発育が確認された。 継代―30（CPV／30）について、２頭の５ヵ
月令のSPFビーグル犬に106.0TCD50のウイルス
を静脈内接種してその発病性を調べた。 接種した二頭の犬は両者とも、接種後の経過
日（PIDと略す）２および３日目に体温が上昇
した（1.5〜２℃）。また両者とも僅かにリンパ
球が減少し（PID4〜５）、食欲が減退し、僅か
にうつ状態となつた。一頭の犬は５日目に下
痢、粘液便をした。両者の血球凝集阻止（HI）
抗体レベルはPID14までに5120となつた。従
つて、CPV／30は、犬にとつてまだ病原性を
有することがわかつた。 継代31〜51：初代または二代犬腎細胞中での
継代接種を更に続けた。ただし温度は33℃に下
げて行なつた。この最適以下の温度は、十分に
CPVが発育する最も低い温度ということで選
んだ。他の犬のウイルスについて、これを最適
以下の温度で継代接種して病原性の減少した変
異株を選択している（Carmichaelおよび
Medic、Infection and Immunity 20 108、
Apr.1978および米国特許第4213965号（1979年
１月23日出願）、Carmichael Small Plaque
Variant Canine Herpesvirus Vaccine）。継
代―51（CPV／51）につき、犬に対するその病
原性および免疫原性を調べた。 この試験では、２頭の犬を使用した。１頭に
は皮下＋経口／経鼻投与ルートでCPV／51を
２ml接種した。ウイルスの感染力価は0.2ml当
たり106.2であり、HA価は１：512であつた。
翌日、歩哨犬（接触対照犬）を接種犬のケージ
に入れ、ウイルスの排泄をモニターした。連
日、８日間に渡つて徴候を観察した。接種犬は
僅かに体温が上昇し（PID4および６）、僅かに
リンパ球が減少し（PID5および６）、僅かに粘
液性の下痢糞を排泄した（PID5）。接触対照犬
はPID4に緩和な有熱性応答を示し、７日およ
び８日目に二次有熱性応答を示したが、リンパ
球減少症は観察されなかつた。接触犬の血清学
的反応から、ウイルスが排泄されていることは
明らかであつた。PID18までに、２頭の犬の抗
体価は１：1280を超えた。 SPFビーグル犬はCPVによりひどい病気に
ならなかつたので、いかなる徴候も（僅かな体
温上昇、リンパ球の減少、食欲不振、抑うつ、
粘液便）、ワクチンとして使用するには、認容
し難い毒力を有するものとみなした。接触犬の
僅かな体温上昇は、その後のこの犬の血清転換
により接種犬からのウイルスの放散がわかつた
ので、CPVに対する病理学的反応とみなすこ
とができた。接触犬にはそれ以外の徴候はみら
れなかつた。 継代52〜79：継続してウイルスの継代接種を
犬の腎細胞中、33℃で行なつた。継代64および
73については力価を測定し、端点希釈で継代接
種した（それぞれ0.2ml当たり106.2および106.5
TCD50）。他の継代接種は３〜４日間隔で、希
釈ウイルス（１：50）を用いて行なつた。それ
ぞれの収獲時において、細胞病理学的影響は明
らかではなかつたが、各継代毎にHA力価を測
定し（上述）、周期的に細胞培養中で感染性を
分析することによりウイルスの発育を確認し
た。 継代80：この時点で、ウイルス個体群にもう
１つの選択圧を導入した。犬の腎細胞（天然の
宿主細胞）中の継代79を、他の宿主、即ちミン
クの肺セルライン（ATCCコード番号CCL―
64）から得た細胞培養に接種した。このセルラ
イン（CCL―64）は、マイコプラズマ、細菌
および真菌が存在しないことが保証されている
ものであつた。これは既知の潜伏ウイルスを含
んでいない。本発明者らは、これはCPVに高
い感受性を有することを知つた（Appel、
ScottおよびCarmichael、Veterinary Record
105 156〜159、1979および米国特許第
4193991号、CarmichaelおよびAppel、Canine
Parvovirus Vaccine）。それ以降の継代はCCL
―64細胞中、33℃で行なつた。CPV／80は、
プラスチツク製フラスコ中（75cm）、CCL―64
細胞中、33〜34℃で増殖させ、発育５日後に収
獲した。感染力価は105.5TCD50／0.2mlであつ
た。犬における発病性試験（実施例１および
２）を行なつた。 実施例 １ ２頭のSPFビーグル犬（855および854）を使用
した。１頭（855）には１mlのCPV／80を筋肉内
接種し、その翌日２頭目（854）を接触させてウ
イルス感染を調べた。次いで１頭（855）には、
保護免疫性を調べるためにCPV／４をチヤレン
ジした。 得られた結果を表２に示す。D855のCPV／80
に対する臨床的反応は極めて軽微なものであつ
た。PID5において僅かなリンパ球減少があつた
ことは弱まつた発病力があることを示唆してい
る。腸の病気にかかつたという証拠はなかつた
が、CPV／80は接触犬（D854）に感染していた。
接触犬はPID12までにHI抗体が生成したが臨床
的には正常のままであつた。初めの接種61日後
に、発病性CPV／４をD855に静脈内投与して免
疫チヤレンジした所、完全な防護を示し、D855
からチヤレンジウイルスの排泄はみられなかつ
た。 80継代で天然の発病力が減退したことは明らか
であるが、SPF犬に僅かな病気がみられたことか
ら、この継代はこれ以降の（80継代以上の）継代
ウイルスよりは不満足なものであつた。従つて、
発病力の減退をさらに探究するためにさらに実験
（実施例２）を行なつた。 実施例 ２ ４頭の同産SPFビーグル犬を障壁ケージ、隔離
ユニツト内に入れ、２つのグループに分けた。１
群（犬862および863）には106.5TCD50／0.2mlの
CPV／80（１ml）を静脈内接種し、第２群（犬
864および865）には、同じ量の発病性CPV／４
を同じ方法で接種した。臨床的徴候を毎日観察
し、ウイルス分析のために糞便をサンプリングし
た。 得られた結果を表３に示す。顕著な所見は次の
通りであつた。：(1)発病性のおよび高継代
（CPV／80）のウイルス両者に対するSPF犬の臨
床的反応は軽微なものであるか、あるいは不明瞭
なものであつた。CPV／80を投与された１頭に、
PID4において軟便がみられたが、他の全ての犬
については、接種後ずつと正常便であつた。発病
性ウイルスを接種した864および865の両犬は食欲
が減退し、PID3〜４に抑うつ状態となつたが、
それ以降は正常であつた。CPV／80を接種した
犬は観察期間中、ずつと正常であつた。 最も大きな違いは糞便中のウイルスの相対的力
価であつた。CPV／80を接種した犬はPID2〜７
にウイルスを排泄したが、その排泄されたウイル
スの量は発病性ウイルスを接種された犬からの排
泄量の１％以下であつた（排泄期間：PID2〜
６）。６ヵ月後にチヤレンジ接種した所、CPV／
80を接種した両犬は免疫性を有していることがわ
かつた。 このデータは、もとの発病性が明らかに減衰し
ていることを示している。CPV／80がCPV／４
よりも遅れて排泄されたこと、排泄された高継代
ウイルスの量が非常に少なかつたこと（＜１％）
は、特に重要なことである。標準宿主においてウ
イルスの発育が減少したことは、減弱化を示して
いるものと考えられる。 継代81〜108：CCL―64細胞中、３〜４日間隔
で継代を継続した。継代108の感染力価は107.5
TCD50／0.2mlであつた。この継代において、
Ithaco、N.Y.在seronegative（Susceptible）
research Kennelから得た異系（SPFでない）ビ
ーグル犬を用いて発病力試験を行なつた。初期試
験の結果、上記の犬はSPF犬と違つて、CPV／
４を経口または静脈内接種すると、ずつと重い病
気にかかることがわかつた。この犬を実施例３お
よび４で使用した。 実施例 ３ ６頭の同産犬を３頭づつの２群に分けて隔離
し、CPV／108またはCPV／４を接種した。各群
の２頭の犬にはウイルスを筋肉内接種し、１頭に
は経口―経鼻接種した。ウイルス投与量（１ml）
は、CPV／108＝108.2TCD50：CPV／４＝107.7
TCD50であつた。これらの犬につき、毎日臨床
的徴候、糞中のウイルス排泄および血清学的反応
を調べた。 得られた結果を表４に示す。これらの犬の臨床
病理学的反応は、CPV／108および発病性CPV／
４で明らかに異なつていた。CPV／108を投与し
た犬は、臨床的徴候がなく、全て体重が増え、
PID7までに高レベルのHI抗体を生成した。
CPV／108投与群の糞便中にウイルスは排泄され
たが、その量はCPV／４投与群の排泄量（最大
排泄時）の0.5％以下であつた。ウイルス排泄期
間も短かかつた。このワクチン投与犬とは反対
に、発病性CPV／４を接種した犬は全て重い病
気にかかり、１頭（Ｒ―６）はPID10に死亡し
た。重い病気（食欲減退、体重減少、PID6〜９
における重い抑うつ状態、血の混じつたのり状粘
液便）にもかかわらず、Ｒ―４およびＲ―５は急
速に回復し、PID11には正常になつた。これらの
犬は１週間以上やせたままであつた。発熱したも
のはなかつた。最も重篤な犬に、顕著な低体温症
がみられたことは驚くべきことである。 この実験の結果、継代108までにもとの発病力
が減退したことがわかつた。適切なワクチン候補
株の性質としては、この継代レベルで十分である
と考えられる。 実施例 ４ 105.2TCD50を筋肉内投与した犬のCPV／108の
免疫原性を、28日後に免疫チヤレンジすることに
より調べた。血清学的反応および保護免疫反応を
調べた。接触犬（D890）を入れ、糞中のウイル
ス排泄をモニターした。結果を表５に示す。 接種犬は３頭とも健康を維持し、PID7までに
高レベルのHI抗体を生成した。発病性CPV／４
をチヤレンジすると免疫性を有していた。接触犬
は正常のままであり、PID14にはHI抗体を持つ
ていた。接触犬には直接注射しなかつたけれど、
ワクチン接種犬からウイルスが感染し、これに免
疫性を与えた。 実施例 ５ 継代115（CPV／115）：さらに高継代CPVの発
病性に関する試験を、継代115で行なつた（CCL
―64細胞、33℃）。４頭の異系列（SPFでない）
の８週令のビーグル犬（子犬）を隔離ケージに入
れた。２頭の子犬（D870および871）にはCPV／
115（107.0TCD50／0.2ml）５mlを静脈内接種し、
２頭の子犬にはCPV／４（106.5TCD50／0.2ml）５
mlを同じ経路で接種した。 CPV／115を接種した２頭の犬は、２週間の観
察期間中、臨床的には正常であつた。これに対
し、発病性ウイルスを投与された２頭の子犬は
PID―３〜４に、共に粘液性の血便をし、熱性反
応を示した。この２頭はPID3〜６に、極めて抑
うつされた状態にあり、反応性が乏しく、食欲不
振に陥つた。リンパ球減少は僅かであつたが、赤
血球沈降速度が増大し、病気の徴候を示した。犬
870および871（CPV／115接種群）は、感染後最
初の１週間で約1lb体重が増加したが、犬872およ
び873（CPV／４接種群）は当初の体重が10％減
少した。PID6から著しく回復しはじめたが、２
週間後にやつと正常な体重に戻つた。 糞便排泄パターンに顕著な違いがみられた。表
６に、CPV／４またはCPV／115を接種した犬の
糞便中のウイルス排泄パターンを比較して示し
た。犬は全てPID7までに高いHI抗体を獲得し
た。 ワクチン投与３週間後に、免疫性試験として、
経口投与によりチヤレンジ接種を行なつたとこ
ろ、CPV／115を接種した犬は全て免疫性を示し
た。病気にかかつた犬はなく、糞便中にウイルス
は排泄されなかつた。 以上述べた如く、継代115の犬の微小ウイルス
（CPV／115）はいかなる病気も惹起しなかつた
が、発病性ウイルス（CPV／４）に対し、保護
免疫反応を示した。 以上、本発明の実施形式を詳細に記載したが、
本発明の範囲を逸脱することなく、これに各種の
変更を加えることができることは当業者には容易
に理解されるはずである。 80継代後のCPVは、Maryland、Rockvilleの
ATCC（American Type Culture Collection）
にATCC VR2017として、115継代後のCPVは同
じくATCCにVR2016として寄託されている。
parvovirusによる感染から犬を保護するためのウ
イルスワクチン、その製造方法およびその用途に
関する。 微小ウイルスは等長蛋白質カプシドと短い１本
鎖DNA分子からなる小動物DNAウイルスであ
る。微小ウイルスは種々の動物から回収され、単
離されているが、最近になるまで（Siegl、The
Parvoviruses、Springer―Verlag、New York
1976）、病原性犬の微小ウイルスは明確には単離
されたことがなかつた。Bachmannらは、一般的
な微小ウイルスの特性に関する報告の中で、微小
ウイルスの宿主となる可能性のある動物の中に犬
を挙げている（Bachmann et al.、
Intervirology11：248〜254、1979）。1970年、
Binnらは「犬の微小なウイルス」の回収および
特性について報告した（Binn et al.、Infect.
Immun.1：503、1970）。記載された単離物は犬
由来のものであるが、その病原性は不明であり、
また細胞変性効果（CPE）は非常に狭い範囲の
宿主にのみ、即ち単独の連続犬セルラインでのみ
発生し、一次犬または他の種の一次あるいは連続
細胞培養では発生していない。犬に対する病原性
は調べられておらず、またワクチンとしての可能
性について検討されてもいない。Cornell単離物
の既知の性質に照らせば、最近のCPV単離物は
Binnによつて記載された「犬の微小なウイルス」
と同じでないことは明らかである。1977年、
EugsterとNairnは、状況から判断して子犬の下
痢と犬の微小ウイルスとの間に病原的つながりの
あることを報告した（Eugster、Narin、
Southwestern Veterinarian、30：59、1977）。
ここで報告されている単離物は、調べられた唯一
のセルライン、MDCK細胞中で系列的に繁殖さ
せることができなかつた。また、病原性の可能性
については研究されておらず、実験動物への接種
も行なわれていない。1978年、米国およびオース
トラリア（未発表）において犬の新しい病気が流
行した（Appel Cooper、Greisenおよび
Carmichael、JAVMA173（11）、1516〜1518：
Dec.1978）。この自然発生的な病気の特徴は下
痢、発熱および白血球減少症（相対的リンパ球減
少症）であつた。 はつきりとした微小ウイルスの単離、およびミ
ンクの肺細胞および犬の腎臓の如き種々の動物の
セルラインおよび一次細胞中でのインビトロにお
ける微小ウイルスの繁殖は、本発明者らによつて
初めて報告された（105 Veterinary Record 156
および米国特許第4193991号：犬の微小ウイルス
死菌ワクチンに関するもの）。 ウイルスに対する選択的遺伝的影響力にまつわ
るフアクターは、20 Infection and Immunity
108、April 1978、Carmichael＆Medicに記載さ
れているが、この文献は異なつたウイルス（犬の
疱疹）についてのものである。プラクの大きさで
毒力（発病力）を調べる方法は、本発明者である
カーマイケルの米国特許第4213965号（1979年１
月23日出願、発明の名称：Small Plaque
Variant Canine Herpesvirus Vaccine）に記載
されている。 異型ワクチン（カーマイケルらの特許第
4193990号）および死菌ワクチン（カーマイケル
らの特許第4193991号）は既に知られているが、
CPV用の改良生ワクチンの製造は本発明によつ
て始めて成功をみたのである。この改良された
CPV生ワクチンの製造は、この技術分野におけ
る新しいそして明らかな進歩である。この生ワク
チンによる免疫応答の強さは、異型ワクチンや死
菌ワクチンなどの他のワクチンによるものより４
〜５倍改良されており、従つてこの生ウイルスワ
クチンはこれらの他のワクチンより著しく優れた
ものである。免疫の期間は非常に長く、またこの
生ワクチンは工業的により簡単にそしてより安価
に製造される。 本発明の要約および好ましい実施形式 本発明は、犬の微小ウイルスから犬を保護する
方法に関し、更に詳しくは、犬の微小ウイルスに
よる感染症から犬を保護するための安全な、有効
なワクチンとして使用される発病性のない、非毒
化された生CPV変種を、もとの発病性CPV株か
ら生産する方法に関するものである。このウイル
スの非毒化は、非腫瘍性（腫瘍非形成性）の細胞
培養物に長期間系列的に継代接種することにより
達成される。非毒化された株を接種した犬は、も
とのCPV株をチヤレンジしても病気にかからな
い。 本発明の好ましい実施形式によれば、非毒化さ
れたCPV生ワクチンは、もとの発病性ウイルス
（Cornell株CPV―916）を、ミンクの肺および／
または犬の腎臓セルライン中、最適以下の温度
（犬にとつて正常な温度より低い温度）、33℃で少
なくとも108回系列的に継代接種することにより
生産される。 本発明の他の実施型式では、ミンクの肺または
犬の腎臓細胞に加えて、あるいはその代りに、他
の非腫瘍性細胞培養が使用される。非毒化ワクチ
ンは僅か80回の継代接種でも生産され、これも本
発明に包含される。 本発明方法の説明および実施例 初期単離物の起源 系列的継代接種を開始するのに使用した、もと
の発病性ウイルス単離物はCornellタイプ株
780916（以下、CPV―916という）であつた。こ
の株（CPV―916）は、Rockville、Marylandの
The American Type Culture Collection
（ATCC）に寄託されている。このCPV―916株
はATCCまたはThe James A.Baker Institute
for Animal Health、New York State
College of Veterinary Medicine at Cornell
University、Ithaca、New Yorkから入手するこ
とができる。この株は、Argonne National
Laboratoriesにおいて、急性の下痢を患らつてい
るビーグル犬（子犬）の腸内容物および糞便から
回収された（1978年９月９日）。犬の微小ウイル
ス（CPV）の集合体は、当初、電子顕微鏡で検
出された。この物質は、種々の非腫瘍性細胞培養
に接種された。 CPV―916は、判別し得ない性質を持つた付加
的なCPV株と同様、種々のセルタイプ中で発育
することがわかつた。CPVの発育を支持した細
胞培養は、(1)犬の腎細胞（初代、二代、三代）、
(2)ネコの腎細胞（初代、Crandell FKセルライ
ン）、(3)ネコの肺セルライン（CCL150）、(4)ミン
クの肺セルライン（CCL64）、(5)MDCKセルライ
ン（CCL34）、(6)牛の胎児のひ臓細胞および(7)牛
の睾丸細胞である。 以降の継代に選ばれた単離物は、特異的無病原
（SPF）ビーグル犬（子犬）の腎臓から調製され
た二代犬腎細胞中で回収された。この初代培養が
「細胞培養第１継代」となつた。 CPV―916の系列増殖（継代）および毒力試験 １ 操作の概要 最初のCPV―916系列継代用として、SPF犬
の初代または二代犬腎細胞が選ばれた。希釈し
ていないウイルスとして、初めの３〜４日間隔
の継代（全部で４）を36〜37℃で行なつた。各
継代毎に、ウイルスの血球凝集活性（HA価）
および／または免疫蛍光陽性（細胞核内の
CPVに特異的）の増加によつてウイルスの存
在をモニターした。４継代後、犬に接種するこ
とによりウイルスはまだ発病力を有することが
わかつた。臨床的徴候としては、期間変動性
（２〜４日）の発熱、リンパ球減少、食欲減退、
体重減少、抑うつ、血の混入していることもあ
る下痢と粘液便などが観察された。この細胞培
養第４継代（CPV／４という）のウイルスを
−70℃で貯蔵した。この「発病力を有するウイ
ルス」を、後記の病原性比較試験および免疫犬
のチヤレンジに使用した。CPV／４の感染力
の力価測定をした結果、0.2ml当たり106.5〜
107.0TCID50であつた。 それ以降のCPV継代（継代５およびそれ以
降）は希釈したウイルス（１：15〜１：50）を
用いて３〜５日間隔で行なつた。インキユベー
シヨンは初め（継代１〜31）36℃、それ以降は
33℃で行なつた。種々の継代において、CPV
に特異的な血球凝集阻止（HI）抗体が存在せ
ず、従つて感受性を有することを予め確認した
１頭以上のビーグル犬（通常２〜３頭）に、そ
のCPVを接種した。それぞれの試験では、経
口投与、筋肉内投与または静脈投与により、細
胞培養継代CPVまたはCPV／４（発病性）を、
同じ数の同産犬に、同じ様なウイルス投与量、
接種ルートで接種（チヤレンジ）した。臨床的
および臨床病理学的徴候を毎日詳しくモニター
し、糞便中のウイルス排泄状況を観察した。以
下の条件が満たされた時にウイルスは減弱化さ
れた（病原性が減少しているという証拠により
毒力に変化が生じた）と見做した：(1)継代ウイ
ルスを接種した犬に臨床的徴候がみられず、対
照（発病性）ウイルスを接種した同産の対照犬
には臨床的徴候がみられる；(2)対照ウイルスを
接種した犬の糞便中のウイルス排泄量と比較し
て、細胞培養継代ウイルスを接種した犬の糞便
中のウイルス排泄量が少ないか、あるいはウイ
ルス排泄がないこと。 ２ 種々の継代レベルにおけるCPV発病性（表
１参照） 継代１〜30：CPVは低希釈（１：15〜１：
30）で、３〜５日間隔で継代接種した。継代
時、初代または二次犬腎細胞に顕著な細胞病理
学的影響は現われなかつたが、各継代毎に、核
内免疫蛍光の存在または感受性細胞培養の分析
によりウイルスの発育が確認された。 継代―30（CPV／30）について、２頭の５ヵ
月令のSPFビーグル犬に106.0TCD50のウイルス
を静脈内接種してその発病性を調べた。 接種した二頭の犬は両者とも、接種後の経過
日（PIDと略す）２および３日目に体温が上昇
した（1.5〜２℃）。また両者とも僅かにリンパ
球が減少し（PID4〜５）、食欲が減退し、僅か
にうつ状態となつた。一頭の犬は５日目に下
痢、粘液便をした。両者の血球凝集阻止（HI）
抗体レベルはPID14までに5120となつた。従
つて、CPV／30は、犬にとつてまだ病原性を
有することがわかつた。 継代31〜51：初代または二代犬腎細胞中での
継代接種を更に続けた。ただし温度は33℃に下
げて行なつた。この最適以下の温度は、十分に
CPVが発育する最も低い温度ということで選
んだ。他の犬のウイルスについて、これを最適
以下の温度で継代接種して病原性の減少した変
異株を選択している（Carmichaelおよび
Medic、Infection and Immunity 20 108、
Apr.1978および米国特許第4213965号（1979年
１月23日出願）、Carmichael Small Plaque
Variant Canine Herpesvirus Vaccine）。継
代―51（CPV／51）につき、犬に対するその病
原性および免疫原性を調べた。 この試験では、２頭の犬を使用した。１頭に
は皮下＋経口／経鼻投与ルートでCPV／51を
２ml接種した。ウイルスの感染力価は0.2ml当
たり106.2であり、HA価は１：512であつた。
翌日、歩哨犬（接触対照犬）を接種犬のケージ
に入れ、ウイルスの排泄をモニターした。連
日、８日間に渡つて徴候を観察した。接種犬は
僅かに体温が上昇し（PID4および６）、僅かに
リンパ球が減少し（PID5および６）、僅かに粘
液性の下痢糞を排泄した（PID5）。接触対照犬
はPID4に緩和な有熱性応答を示し、７日およ
び８日目に二次有熱性応答を示したが、リンパ
球減少症は観察されなかつた。接触犬の血清学
的反応から、ウイルスが排泄されていることは
明らかであつた。PID18までに、２頭の犬の抗
体価は１：1280を超えた。 SPFビーグル犬はCPVによりひどい病気に
ならなかつたので、いかなる徴候も（僅かな体
温上昇、リンパ球の減少、食欲不振、抑うつ、
粘液便）、ワクチンとして使用するには、認容
し難い毒力を有するものとみなした。接触犬の
僅かな体温上昇は、その後のこの犬の血清転換
により接種犬からのウイルスの放散がわかつた
ので、CPVに対する病理学的反応とみなすこ
とができた。接触犬にはそれ以外の徴候はみら
れなかつた。 継代52〜79：継続してウイルスの継代接種を
犬の腎細胞中、33℃で行なつた。継代64および
73については力価を測定し、端点希釈で継代接
種した（それぞれ0.2ml当たり106.2および106.5
TCD50）。他の継代接種は３〜４日間隔で、希
釈ウイルス（１：50）を用いて行なつた。それ
ぞれの収獲時において、細胞病理学的影響は明
らかではなかつたが、各継代毎にHA力価を測
定し（上述）、周期的に細胞培養中で感染性を
分析することによりウイルスの発育を確認し
た。 継代80：この時点で、ウイルス個体群にもう
１つの選択圧を導入した。犬の腎細胞（天然の
宿主細胞）中の継代79を、他の宿主、即ちミン
クの肺セルライン（ATCCコード番号CCL―
64）から得た細胞培養に接種した。このセルラ
イン（CCL―64）は、マイコプラズマ、細菌
および真菌が存在しないことが保証されている
ものであつた。これは既知の潜伏ウイルスを含
んでいない。本発明者らは、これはCPVに高
い感受性を有することを知つた（Appel、
ScottおよびCarmichael、Veterinary Record
105 156〜159、1979および米国特許第
4193991号、CarmichaelおよびAppel、Canine
Parvovirus Vaccine）。それ以降の継代はCCL
―64細胞中、33℃で行なつた。CPV／80は、
プラスチツク製フラスコ中（75cm）、CCL―64
細胞中、33〜34℃で増殖させ、発育５日後に収
獲した。感染力価は105.5TCD50／0.2mlであつ
た。犬における発病性試験（実施例１および
２）を行なつた。 実施例 １ ２頭のSPFビーグル犬（855および854）を使用
した。１頭（855）には１mlのCPV／80を筋肉内
接種し、その翌日２頭目（854）を接触させてウ
イルス感染を調べた。次いで１頭（855）には、
保護免疫性を調べるためにCPV／４をチヤレン
ジした。 得られた結果を表２に示す。D855のCPV／80
に対する臨床的反応は極めて軽微なものであつ
た。PID5において僅かなリンパ球減少があつた
ことは弱まつた発病力があることを示唆してい
る。腸の病気にかかつたという証拠はなかつた
が、CPV／80は接触犬（D854）に感染していた。
接触犬はPID12までにHI抗体が生成したが臨床
的には正常のままであつた。初めの接種61日後
に、発病性CPV／４をD855に静脈内投与して免
疫チヤレンジした所、完全な防護を示し、D855
からチヤレンジウイルスの排泄はみられなかつ
た。 80継代で天然の発病力が減退したことは明らか
であるが、SPF犬に僅かな病気がみられたことか
ら、この継代はこれ以降の（80継代以上の）継代
ウイルスよりは不満足なものであつた。従つて、
発病力の減退をさらに探究するためにさらに実験
（実施例２）を行なつた。 実施例 ２ ４頭の同産SPFビーグル犬を障壁ケージ、隔離
ユニツト内に入れ、２つのグループに分けた。１
群（犬862および863）には106.5TCD50／0.2mlの
CPV／80（１ml）を静脈内接種し、第２群（犬
864および865）には、同じ量の発病性CPV／４
を同じ方法で接種した。臨床的徴候を毎日観察
し、ウイルス分析のために糞便をサンプリングし
た。 得られた結果を表３に示す。顕著な所見は次の
通りであつた。：(1)発病性のおよび高継代
（CPV／80）のウイルス両者に対するSPF犬の臨
床的反応は軽微なものであるか、あるいは不明瞭
なものであつた。CPV／80を投与された１頭に、
PID4において軟便がみられたが、他の全ての犬
については、接種後ずつと正常便であつた。発病
性ウイルスを接種した864および865の両犬は食欲
が減退し、PID3〜４に抑うつ状態となつたが、
それ以降は正常であつた。CPV／80を接種した
犬は観察期間中、ずつと正常であつた。 最も大きな違いは糞便中のウイルスの相対的力
価であつた。CPV／80を接種した犬はPID2〜７
にウイルスを排泄したが、その排泄されたウイル
スの量は発病性ウイルスを接種された犬からの排
泄量の１％以下であつた（排泄期間：PID2〜
６）。６ヵ月後にチヤレンジ接種した所、CPV／
80を接種した両犬は免疫性を有していることがわ
かつた。 このデータは、もとの発病性が明らかに減衰し
ていることを示している。CPV／80がCPV／４
よりも遅れて排泄されたこと、排泄された高継代
ウイルスの量が非常に少なかつたこと（＜１％）
は、特に重要なことである。標準宿主においてウ
イルスの発育が減少したことは、減弱化を示して
いるものと考えられる。 継代81〜108：CCL―64細胞中、３〜４日間隔
で継代を継続した。継代108の感染力価は107.5
TCD50／0.2mlであつた。この継代において、
Ithaco、N.Y.在seronegative（Susceptible）
research Kennelから得た異系（SPFでない）ビ
ーグル犬を用いて発病力試験を行なつた。初期試
験の結果、上記の犬はSPF犬と違つて、CPV／
４を経口または静脈内接種すると、ずつと重い病
気にかかることがわかつた。この犬を実施例３お
よび４で使用した。 実施例 ３ ６頭の同産犬を３頭づつの２群に分けて隔離
し、CPV／108またはCPV／４を接種した。各群
の２頭の犬にはウイルスを筋肉内接種し、１頭に
は経口―経鼻接種した。ウイルス投与量（１ml）
は、CPV／108＝108.2TCD50：CPV／４＝107.7
TCD50であつた。これらの犬につき、毎日臨床
的徴候、糞中のウイルス排泄および血清学的反応
を調べた。 得られた結果を表４に示す。これらの犬の臨床
病理学的反応は、CPV／108および発病性CPV／
４で明らかに異なつていた。CPV／108を投与し
た犬は、臨床的徴候がなく、全て体重が増え、
PID7までに高レベルのHI抗体を生成した。
CPV／108投与群の糞便中にウイルスは排泄され
たが、その量はCPV／４投与群の排泄量（最大
排泄時）の0.5％以下であつた。ウイルス排泄期
間も短かかつた。このワクチン投与犬とは反対
に、発病性CPV／４を接種した犬は全て重い病
気にかかり、１頭（Ｒ―６）はPID10に死亡し
た。重い病気（食欲減退、体重減少、PID6〜９
における重い抑うつ状態、血の混じつたのり状粘
液便）にもかかわらず、Ｒ―４およびＲ―５は急
速に回復し、PID11には正常になつた。これらの
犬は１週間以上やせたままであつた。発熱したも
のはなかつた。最も重篤な犬に、顕著な低体温症
がみられたことは驚くべきことである。 この実験の結果、継代108までにもとの発病力
が減退したことがわかつた。適切なワクチン候補
株の性質としては、この継代レベルで十分である
と考えられる。 実施例 ４ 105.2TCD50を筋肉内投与した犬のCPV／108の
免疫原性を、28日後に免疫チヤレンジすることに
より調べた。血清学的反応および保護免疫反応を
調べた。接触犬（D890）を入れ、糞中のウイル
ス排泄をモニターした。結果を表５に示す。 接種犬は３頭とも健康を維持し、PID7までに
高レベルのHI抗体を生成した。発病性CPV／４
をチヤレンジすると免疫性を有していた。接触犬
は正常のままであり、PID14にはHI抗体を持つ
ていた。接触犬には直接注射しなかつたけれど、
ワクチン接種犬からウイルスが感染し、これに免
疫性を与えた。 実施例 ５ 継代115（CPV／115）：さらに高継代CPVの発
病性に関する試験を、継代115で行なつた（CCL
―64細胞、33℃）。４頭の異系列（SPFでない）
の８週令のビーグル犬（子犬）を隔離ケージに入
れた。２頭の子犬（D870および871）にはCPV／
115（107.0TCD50／0.2ml）５mlを静脈内接種し、
２頭の子犬にはCPV／４（106.5TCD50／0.2ml）５
mlを同じ経路で接種した。 CPV／115を接種した２頭の犬は、２週間の観
察期間中、臨床的には正常であつた。これに対
し、発病性ウイルスを投与された２頭の子犬は
PID―３〜４に、共に粘液性の血便をし、熱性反
応を示した。この２頭はPID3〜６に、極めて抑
うつされた状態にあり、反応性が乏しく、食欲不
振に陥つた。リンパ球減少は僅かであつたが、赤
血球沈降速度が増大し、病気の徴候を示した。犬
870および871（CPV／115接種群）は、感染後最
初の１週間で約1lb体重が増加したが、犬872およ
び873（CPV／４接種群）は当初の体重が10％減
少した。PID6から著しく回復しはじめたが、２
週間後にやつと正常な体重に戻つた。 糞便排泄パターンに顕著な違いがみられた。表
６に、CPV／４またはCPV／115を接種した犬の
糞便中のウイルス排泄パターンを比較して示し
た。犬は全てPID7までに高いHI抗体を獲得し
た。 ワクチン投与３週間後に、免疫性試験として、
経口投与によりチヤレンジ接種を行なつたとこ
ろ、CPV／115を接種した犬は全て免疫性を示し
た。病気にかかつた犬はなく、糞便中にウイルス
は排泄されなかつた。 以上述べた如く、継代115の犬の微小ウイルス
（CPV／115）はいかなる病気も惹起しなかつた
が、発病性ウイルス（CPV／４）に対し、保護
免疫反応を示した。 以上、本発明の実施形式を詳細に記載したが、
本発明の範囲を逸脱することなく、これに各種の
変更を加えることができることは当業者には容易
に理解されるはずである。 80継代後のCPVは、Maryland、Rockvilleの
ATCC（American Type Culture Collection）
にATCC VR2017として、115継代後のCPVは同
じくATCCにVR2016として寄託されている。
【表】
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| US5885585A (en) * | 1994-11-08 | 1999-03-23 | Cornell Research Foundation, Inc. | Attenuated canine parvovirus vaccine |
| US5814510A (en) * | 1994-11-08 | 1998-09-29 | Cornell Research Foundation, Inc. | Attenuated canine parvovirus vaccine |
| US6495360B1 (en) * | 1999-05-28 | 2002-12-17 | Photogen, Inc. | Method for enhanced protein stabilization and for production of cell lines useful for production of such stabilized proteins |
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| AU2010306752B2 (en) | 2009-10-14 | 2015-05-28 | The Board Of Regents For Oklahoma State University | Isolation of a virus related to canine parvovirus-2 from a raccoon |
Family Cites Families (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2136131A (en) * | 1937-03-09 | 1938-11-08 | Robert G Green | Distemper vaccine and method of preparing the same |
| US2271818A (en) * | 1939-02-06 | 1942-02-03 | Fromm Lab Inc | Distemper vaccine and method of preparing the same |
| US2271819A (en) * | 1939-02-06 | 1942-02-03 | Fromm Lab Inc | Distemper vaccine and method of preparing the same |
| US3133861A (en) * | 1961-11-08 | 1964-05-19 | Dow Chemical Co | Attenuated live measles virus vaccine and method of production |
| DE1174016B (de) | 1962-05-18 | 1964-07-16 | Behringwerke Ag | Verfahren zur Herstellung einer Lebend-Vaccine gegen Maul- und Klauenseuche |
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| US3465077A (en) * | 1964-07-01 | 1969-09-02 | Cornell Res Foundation Inc | Protecting horses against infectious equine rhinopneumonitis with live bovine rhinotracheitis virus inoculation |
| US3577525A (en) * | 1964-07-01 | 1971-05-04 | Cornell Res Foundation Inc | Adenovirus vaccine against canine hepatitis |
| US3346456A (en) * | 1964-07-01 | 1967-10-10 | Cornell Res Foundation Inc | Immunizing pigs against hog cholera with selected strains of live virus diarrhea virus and preparation of virus diarrhea virus hyper-immune hog cholera serum |
| FR1426195A (fr) | 1964-10-23 | 1966-01-28 | Agronomique Inst Nat Rech | Procédé d'obtention de virus-vaccins et son application à l'obtention des viandesde consommation |
| US3285817A (en) * | 1965-08-17 | 1966-11-15 | Philips Roxane | Method of protecting dogs at birth against canine distemper |
| GB1177635A (en) * | 1966-02-18 | 1970-01-14 | Wellcome Found | Cell Stains. |
| US3562387A (en) * | 1967-12-01 | 1971-02-09 | Mogul Corp | Mink virus enteritis vaccine and method for the production thereof |
| GB1286250A (en) | 1968-10-08 | 1972-08-23 | Wellcome Found | Heteroploid cell lines |
| US3733401A (en) * | 1970-11-30 | 1973-05-15 | Takeda Chemical Industries Ltd | Highly attenuated newcastle disease virus vaccine and production thereof |
| US3869547A (en) * | 1971-11-10 | 1975-03-04 | Univ Nebraska | Calf diarrhea virus vaccine and processes |
| US3892627A (en) * | 1973-06-04 | 1975-07-01 | Rohm & Haas | Feline panleukopenia vaccine |
| US3944469A (en) * | 1974-11-21 | 1976-03-16 | Pitman-Moore, Inc. | Feline calicivirus vaccine and production thereof |
| US4004974A (en) * | 1975-05-07 | 1977-01-25 | Mikhail Petrovich Chumakov | Live virus culture vaccine against carnivore distemper and method of producing same |
| US4211843A (en) * | 1977-11-30 | 1980-07-08 | L'institut Armand-Frappier | Strain of measles virus and process of producing the same |
| US4193991A (en) * | 1978-12-20 | 1980-03-18 | Cornell Research Foundation, Inc. | Canine parvovirus vaccine |
| US4213965A (en) * | 1979-01-23 | 1980-07-22 | Cornell Research Foundation, Inc. | Small-plaque variant canine herpesvirus vaccine |
| US4193990A (en) * | 1979-02-16 | 1980-03-18 | Cornell Research Foundation, Inc. | Heterotypic canine parvovirus vaccine |
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