JPH08510124A - 大腸菌群バクテリアの数を速くカウントする培養媒体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はサンプル中のバクテリアの存在を決定するために用いる製品および方法、特に大腸菌群の早期検出およびカウントを可能にする製品および方法に用いてもよい溶媒に関する。大腸菌群の早期検出およびカウントを促進するバクテリア溶媒媒体はトリプトース、ラクトース、塩化ナトリウム、胆汁酸塩、グアーガム、および増殖したバクテリアの検出およびカウントを１２時間以内に可能にするために、培養バクテリアに近接して高濃度のフェノールレッドを提供するのに十分過剰のフェノールレッドを含有する。

Description

【発明の詳細な説明】 大腸菌群バクテリアの数を速くカウントする培養媒体 本発明はサンプル中のバクテリアの存在を決定するために用いる製品および方 法に関する。本発明は特に、大腸菌群の数を迅速に数える製品および方法に用い てもよい培養媒体に関する。発明の背景 あるサンプル中のバクテリアの存在および数を検出する従来の方法は時間がか かり、退屈でかつ労力が必要である。典型的には、技術者は反応試薬および栄養 源を調製し、栄養源と寒天を混合し、該混合物を加熱し、ペトリ皿に注ぎ、寒天 を凝固させ、テストサンプルを得て、テストサンプルを希釈し、希釈サンプルの アリコートを寒天に加え、２４〜４８時間培養皿で培養し、最後にペトリ皿中の 繁殖したバクテリアのコロニーの数を数える。調製時間を減縮し、バクテリアを より速く、かつ迅速に数える方法および製品が当業者に望まれている。 上記調製時間を簡素化する製品の例は、ハンセンらにより米国特許４,５６５, ７８３に記載の微生物増殖のための乾燥培養装置である。ハンセンらにより報告 されている典型的な装置では、ゲル化剤および微生物成長栄養素を含有する冷水 溶解性乾燥パウダーを防水性基材上に被覆している。指示染料およびゲル化剤粉 体を含有するアクリレート接着剤を表面に被覆した透明リードスルー（read-thr ough）カバーシートを支持体上に添付する。 この装置を用いる際に、所定量の水溶性サンプルを支持体と接触させ、カバー シートをサンプルおよび基材上に置く。水溶性サンプルが溶解性乾燥パウダーを 水和し、微生物の成長を維持しうるゲル媒体を形成する。増殖期間中、カバーシ ートに付着した指示染料は成長しうる微生物の存在下に反応して、検出可能な反 応を与え、これが培養装置上で成長したバクテリアのコロニーを可視化をする。 ハンセンらのレポートに基づいた乾燥培養装置はペトリフィルム（PETRIFILM） プレートとして米国ミネソタ州、セントポールの３Ｍ、カタログナンバー６４０ ０として市販されている。 ハンセンらによる乾燥培養装置は一般に用いられていたゲル化寒天媒体/ペト リ皿システムよりも非常に簡単である。何故ならば、成長媒体、寒天および他の 反応剤を加熱および混合する必要がなく、ペトリ皿または注入プレートに混合物 を加える必要もない。また、ハンセンらの装置はコンパクトで容易に破棄でき、 使用が容易かつ安全である。 ハンセンの装置が従来の培養システムと比べて多くの利点を有するにも拘わら ず、バクテリアを接種した薄いプレートはバクテリアの数を決定する前に２４〜 ４８時間培養されなければならない。バクテリアの存在および数の決定を速い時 間に検出することは多くの場合大変有用である。たとえば、バクテリアの早期検 出および早期カウントは食品工業において重要である。現在、２４〜４８時間の 培養時間後にのみバクテリアの決定をするということは加工業者に対し、食製品 の分配を遅らし、大量の汚染された食品の製造をひき起こすかも知れない。食製 品におけるバクテリアの早期検出は加工業者に食製品を速い時期に分配を可能す る。何故ならば汚染の有無がより速く決定されるからである。また、加工業者は 大量の汚染製品を破棄することなくバクテリアの汚染源を確認しかつ修正するこ とができるだろう。したがって、２４〜４８時間以内のバクテリア汚染の検出は 食品工業において非常に有効である。 食品工業は早期にバクテリアの汚染を決定することにより利益をうることは明 らかであるが、他の工業においてもまたより速くバクテリアを検出することは必 要であろう。大腸菌群の早期検出および速いカウントを可能にする製品および製 法の要求が存在する。発明の要旨 本発明は、大腸菌群の早期検出および速いカウントを可能にする製品および製 法を提供することにより、上記従来の製品および製法の欠点を克服する。本発明 の第１の態様は媒体中で増殖する大腸菌群の早期検出および速いカウントを促進 するバクテリア培養媒体である。この媒体はトリプトース、ラクトース、塩化ナ トリウム、胆汁酸塩、グアーガムおよび１２時間以内に増殖バクテリアの検出お よびカウントを可能にするために増殖バクテリアに近接して高濃度のフェノール レッドを提供するのに十分過剰な量のフェノールレッドの混合物である。 好ましい液状培養媒体はトリプトース約１０〜２０g/l、ラクトース２.５〜７ .５g/l、塩化ナトリウム２.５〜７.５g/l、胆汁酸塩１.３５〜１.６５g/l、グア ーガム２.５〜７.５g/lおよびフェノールレッド０.１６〜５.０g/lを含有する。 特に好ましい液状培養媒体はトリプトース約１５g/l、ラクトース５g/l、塩化ナ トリウム５g/l、胆汁酸塩１.５g/l、グアーガム５g/lおよびフェノールレッド１ .２５g/lを含有する。 本発明の培養媒体はブロス、寒天またはペトリフィルムプレート（PETRIFILM plate）の如き薄いフィルムデバイスに用いてもよい。ペトリフィルムプレート に用いられる場合、培養媒体は装置の表面に塗布され、媒体を乾燥する。培養媒 体が薄いフィルム上で乾燥状態にある場合、媒体はトリプトース約４.８mg/イン チ²、ラクトース１.６mg/インチ²、塩化ナトリウム１.６mg/インチ²、胆汁酸塩 ０.５mg/インチ²、グアーガム１.６mg/インチ²およびフェノールレッド０.４mg/ インチ²含有する。乾燥媒体が再び水和されるとき、培養媒体の上記かげた成分 は好ましい液状培養媒体に用いられた濃度と同じである。 この発明の他の態様は、サンプル中の大腸菌群の存在を検出する方法である。 この方法の実施において、大腸菌群を含有するサンプルのアリコートを、トリプ トース、ラクトース、塩化ナトリウム、胆汁酸塩およびバクテリアに近接して高 濃度のフェノールレッドを提供するのに十分過剰な量のフェノールレッドを含有 する培養媒体に添加する。大腸菌群が培養媒体の存在下に増殖し、バクテリアの 存在が増殖バクテリア代謝物としてフェノールレッドの色の変化を検出すること により決定する。この方法を用いて、大腸菌群の検出およびカウントが約１２時 間以内、好ましくは約８時間以内に可能である。 培養媒体中の大腸菌群の検出は視覚的に行ってもよく、装置を用いて行っても よい。好適な装置は１９９３年５月１４日に出願された関連する米国特許出願番 号０８/０６１,６７８に記載されている。 本発明の他の態様はサンプル中で増殖した大腸菌群を検出するデバイスである 。好ましいデバイスは自己支持性で防水性の支持体および透明カバーシートを含 有する。本発明の培養媒体を自己支持性で防水性の支持体に塗布し、１２時間以 内 に増殖バクテリアの検出およびカウントを可能にするために増殖バクテリアに近 接して高濃度のフェノールレッドを提供するように乾燥する。デバイス上で増殖 する大腸菌群の検出は、媒体の赤い色が大腸菌群の酸性バクテリア代謝物の存在 により黄色の色に変化するときに、視覚的または装置を用いてなしうる。 本発明の別の態様では、培養媒体が第２指示薬、即ち、塩化トリフェニルテト ラゾリウムを含有する。この培養媒体を用いると、第２指示薬がバクテリアの早 期検出および速いカウントの確認を提供する。より詳しくは、大腸菌群の存在が フェノールレッドの色の変化により検出された後、増殖バクテリアは酸を生産し 続ける。十分に増殖したとき、酸を生産するコロニーが存在し、媒体はその場合 完全に赤から黄色に変化する。約２４時間後で媒体の色が赤から黄色に変わった ときに、バクテリアの増殖による媒体中の塩化トリフェニルテトラゾリウムの色 の変化の検出が可能になる。大腸菌群の存在において塩化トリフェニルテトラゾ リウムは赤い色に変化する。塩化トリフェニルテトラゾリウムの色の変化はフェ ノールレッドの色の変化に伴ってより速いカウントの確認が行なわれる。この後 の確認は大腸菌群の回りにガスバブル（気泡；bubble）の存在によって補助して もよい。 塩化トリフェニルテトラゾリウムを培養媒体中に用いる場合、培養媒体のこの 指示薬の量は約０.０２５〜０.１２０g/l、より好ましくは約０.０５０g/lであ る。塩化トリフェニルテトラゾリウムを薄いフィルムデバイスに用いた場合、乾 燥媒体は好ましくは塩化トリフェニルテトラゾリウム約０.０２mg/インチ²を含 有する。図面の簡単な説明 図１は本発明の培養媒体を含む装デバイスの模式図である。詳細な説明 本発明は約１２時間以内にサンプル中に大腸菌群の存在を検出するのに用いら れる製品と方法を提供する。大腸菌群はラクトース発酵グラム陰性棒状菌を含む 。数多くの製品および製法が大腸菌群の検出に使用されてきたが、１２時間以内 に検出およびカウントすることは従来の製品および方法の検出時間よりも大きく 時 間を短縮する。 多くのサンプル中の大腸菌群の早期検出および速いカウントは多くの理由で問 題点を有していた。多くの場合、サンプル中に存在する大腸菌群はストレスを有 しており、最適なレベルで増殖をしない。最適な増殖を可能にし、かつ早期検出 を可能にするには、ストレスのかかったバクテリアをそのストレスから回復する 時間が必要であった。本発明では大腸菌群の早期回復を可能にする媒体を提供す る。この媒体は公知の試薬および市販の栄養源を包含する。これらの試薬および 栄養源はトリプトース、ラクトース、塩化ナトリウム、およびメリーランド、バ ルチモアのアキュメディア・インク（Acumedia，Inc.）から市販の胆汁酸塩を含 む。また媒体はスイス国、クロイツジンガー（Kreuz1inger）のローヌープーラ ン・インク（Rhone-Pou1enc,Inc.）から市販のグアーガム、ワイオミング州ミル ウォーキーのシグマーアルドリッチ・コープ（Sigma-A1drich Corp.）から市販 のフェノールレッドおよびオハイオ州ソロンのＡＭＲＥＳＣＯから市販の塩化ト リフェニルテトラゾリウムを含む。好ましい試薬および材料は従来の無菌手続き を用いて重さを計り、混合される。 本発明の培養媒体はｐＨ指示薬、フェノールレッドを含む。フェノールレッド は酸の存在で赤から黄色に変色する公知の指示薬である。バクテリアのコロニー が成長すると、コロニーは代謝性酸を製造し、これが指示薬と反応してコロニー の回りに黄色の領域を形成する。この指示薬は他の培養媒体にも用いられてきた が、一般的に非常に少量、典型的には１０〜３０mg/l（マニュアル・オブ・メソ ッズ・オブ・ジェネラル・バクテリオロジー、第４４０頁（１９８１））で用い られている。特に、フェノールレッドはいくつかの培養媒体中で約１８〜２４mg /lで報告されている（ＢＢＬマニュアル・オブ・プロダクツ・アンド・ラボラト リー・プロセッデュアーズ、第１３１頁（１９７３））。ところが、本発明によ ればフェノールレッドの使用量は従来の培養媒体に一般的に用いられてきたフェ ノールレッドまたは他の指示薬の量より非常に多い。たとえば、従来用いられて きた量の１０倍以上の量のフェノールレッドの使用、１６０mg以上のフェノール レッドの使用が早期検出および速いカウントの利点をうむ。さらに、従来の媒体 に用いられ てきた量の１０００倍以上の量の使用、１ｌ中にフェノールレッド１０００ｍｇ 以上の使用が本発明の媒体における好ましい濃度で、カラーのコントラストを向 上する。 驚くべきことに、大腸菌類は大過剰のフェノールレッドを含有する媒体中で非 常によく回復および増殖を見せ、明らかにこの濃度で大腸菌への毒性はない。１ ｌ中にフェノールレッド約５０００mgほどの大量で、水中へのフェノールレッド の溶解度の上限であっても、大腸菌に対し毒性がないことが判った。おそらく、 大量のフェノールレッドは媒体に対し緩衝剤として作用し、大腸菌群の増殖はｐ Ｈに非常に感受性が強いので、回復および/または増殖を促進するものと考えら れる。媒体で量の使用は、指示薬が一般的にそのような量で用いられる薬剤であ ってまたは溶液に対し緩衝能力を提供するものとして選択されないことから、一 般的に受け入れられないものである。 媒体に対しある種の緩衝能力を提供するために媒体中に過剰量のフェノールレ ッドを用いることの他の利点は、媒体中の代謝性酸の拡散の阻止である。酸の媒 体を通しての拡散をコントロールしないと、成長コロニーの回りの黄色い色の領 域が重なりまたは一つになってしまうかも知れない。黄色い色の領域が重なりま たは一つになってしまうとき、結果的にコロニーのカウントが難しくなるか、不 正確になる。 フェノールレッドの過剰量を用いる他の予想できなかった利点は中性および塩 基性溶液中でのフェノールレッドの赤い色と、酸の存在下でのフェノールレッド の黄色い色とのコントラストが非常に大きくなるということである。媒体の赤い 色と大腸菌群の成長している回りの領域の黄色い色とのコントラストが大きいこ とは、従来の製品や方法の検出時間に比べて非常に速い時間で大腸菌群の視覚的 検出が可能になる。 本明細書において、「１２時間以内に増殖バクテリアの検出およびカウントが 可能になるために増殖バクテリアに近接して高濃度のフェノールレッドを提供す るのに十分過剰なフェノールレッド」とは、大腸菌群の代謝物によって赤から黄 色へ変色する視覚的または装置を用いた検出が可能な約１６０mg/lを越えるフェ ノールレッドの濃度を意味する。 図１は本発明の媒体の使用に好適な薄いフィルムの培養デバイスを示す。明確 には、このデバイスは米国特許４,５６５,７８３に記載されており、この文献を これらの型の培養デバイス製造および使用の方法を記載する目的で、この明細書 中に導入する。 薄いフィルムの培養デバイス１０は自己支持性で防水性の基材１２を有する本 体要素を含む。基材１２は好ましくは水を吸収しない防水材料、たとえばポリエ ステル、ポリプロピレンまたはポリスチレンからなる比較的堅い材料である。他 の好適な防水性材料は防水性ポリエチレン被膜を有する紙のごとき基材を包含す る。基材１２の表面は培養媒体１４の層で被覆され、これは基材１２上で乾燥媒 体を提供するように乾燥されている。また、接着剤層を基材１２上に塗布し、該 接着剤が本体として提供されることもある培養媒体を保持する。接着剤は被覆基 材を通して基材の表面のバクテリアのコロニーの成長の観察を可能にするために 水和された場合に十分透明であるべきである。接着剤は基材上に、乾燥培養媒体 で均一に被覆され、接着剤中に媒体が完全に埋まることがないような厚さで塗布 されるべきでもある。 本発明の液状培養媒体が乾燥形態または乾燥粉末として用いられなければなら ない場合、試薬、栄養剤およびフェノールレッドは乾燥される。本発明の培養媒 体は液状媒体を約２２０°Ｆでオーブン中で液体中の水のほぼ全量が蒸発するま で加熱することにより容易に乾燥できる。水が蒸発しても媒体を加熱し続けると 、媒体は劣化し始める。発泡体上に環状の開口部を有する発泡体スペーサ１６が 基材１２の媒体が被覆された表面に付着される。基材１２の周辺をカバーする発 泡体スペーサはサンプルが導入され、基材から漏れるのを防ぐ領域を決定する。 別の態様では、装置はサンプル含有発泡体層を有さなくてもよい。この装置にお いて、サンプルの量は媒体の成分だけによって基材上に含まれる。 カバーシート２０が発泡体スペーサ１６の上面の一端に付着される。カバーシ ート２０は好ましくは基材上に存在するバクテリアのコロニーのカウントを促進 するために透明フィルムまたはシート材料からなる。また、カバーシート２０は 好ましくは成分の汚染および変質の危険を避けるためにバクテリアおよび水蒸気 に対し非透過性である。好ましいカバーシート２０として用いるための材料は二 軸延伸ポリプロピレンである。 使用に際し、カバーシート２０を剥がし、基材１２の真ん中に水性テストサン プルまたは水を加えて、所定量の接種剤、典型的には１mlの接種剤を図１に示す デバイスに、添加した。カバーシート２０が基材１２の上に再び被せられ、基材 上に接種剤が等しく広がる。これを行う有用な器具は重量の有する円形状型板で あり、これが基材１２の特定のエリアに接種剤を限定するのに用いられる。接種 剤が接触し基材１２の上に広がったら、基材１２上の培養媒体に水を加えて増殖 支持栄養ゲルを形成する。接種されたデバイスは所定時間の間増殖し、基材上に 増殖したバクテリアのコロニーの数を透明カバーシート２０を通してカウントし てもよい。 薄いフィルムデバイスの本発明の培養媒体の使用は上述のごときであるが、当 業者はこの培養媒体が公知の他の培養デバイスにおいても使用しうることが判る 。たとえば、培養媒体はブロスとして用いてもよく、懸濁液中でバクテリアを増 殖するのに用いてもよく、また培養媒体は公知の寒天プレート上でバクテリアを 増殖するのに用いてもよい。 以下の実施例に基づいて本発明の実施に関するより詳しいおよび態様を説明す る。これらの実施例は説明のためにのみ用いて、添付の特許請求の範囲の記載の 本発明の範囲を限定するものではない。実施例１−速い大腸菌カウント媒体中での大腸菌類の増殖 この実施例において本発明の好ましい液状媒体（促進大腸菌カウント媒体、Ｒ ＣＣＭ（略語））をブロス、寒天または薄いフィルムプレート中での大腸菌群の 増殖に用いられてもよいことを示す。この実施例において用いられる媒体はトリ プトース１５g/l、ラクトース５g/l、塩化ナトリウム５g/l、胆汁酸塩１.５g/l 、グアーガム５g/l、塩化トリフェニルテトラゾリウム０.０５０g/lおよびフェ ノールレッド１.２５g/lであった。すべての成分は上述した供給者から市販され たものである。但し、ブロス媒体には塩化トリフェニルテトラゾリウムは用い てはいない。 以下の表１に示す種々のバクテリアをまずトリプティケイスソイブロス（ミシ ガン州デトロイトのデフコ・ラボラトリーズ・インク（Difco Laboratories，In c.））中で３５℃で１８〜２４時間増殖した。表１に示すバクテリアはイリノイ 州シカゴのシリエイカー・ラボラトリーズ（Silliaker Laboratories）から購入 したもの（表中においてバクテリアの名前の後に「s」によって示す）またはミ ネソタ州セント・ポールの３Ｍ・マイクロバイオロジー・プロダクツ・ラボラト リーによって用いられた品質を制限した分離体であった。当業者は、バクテリア の均等な株および種類が市販もしくは公知の方法を用いて単離されてもよいこと がわかる。 トリプティケイス中で約２４時間増殖後、約１０⁸〜１０⁹/mlを含有する増殖 培養物をバッタフィールズ・スタンダード・メソッズ・バッファ（ＳＭＢ、ミネ ソタ州ミネアポリスのフィッシャ・サイアンティフィック（Fisher Scientific ））中で連続的に約１０⁶〜１０⁷に希釈した。希釈培養物のアリコート（約１ml ）をペトリ皿、スクリュキャップガラス管またはＲＣＣＭ含有ペトリフィルム（ PETLIFILM）プレートに接種した。 寒天中での増殖に対し、増殖物アリコートをペトリ皿に加え、ＲＣＣＭおよび 寒天（約１vol/重量％寒天を含有する媒体の約１２ml）で被覆し、３５℃で２４ 時間培養した。ブロスにおける増殖において、培養物アリコートをＲＣＣＭ（約 １０ml）を含有するスクリュキャップチューブおよびダーラムチューブに加えた 。これらチューブに蓋をし、３５℃で２４時間培養した。 薄いフィルム上での増殖に対し、ＲＣＣＭの層を室温で７.５ミルポリエステ ル基材フィルム（ＤＥ、ウィルミントンのインペリアル・ケミカル・インダスト リーズ）をカバーするために小さなオリフィスを通した。カバーされたポリエス テルフィルムをついで、２００〜２５０°Ｆで約１〜２０分間乾燥した。ポリエ ステルフィルムを被せるために、１８ミルのスチロフォームスペーサシートを切 断して、円形状の開口部をスチロフォームスペーサ中にあけた。切断されたスチ ロフォームスペーサの１つの表面をイソオクチルアクリレート/アクリルアミド 感圧接着剤（アクリレート/アクリルアミドの９６/４重量％比）で被覆し、スチ ロ フォームシートをポリエステルフィルムの被覆表面に接着した。 透明なポリプロピレンフィルムを切断して、ポリエステル/スチロフォームラ ミネートフィルムをカバーした。ポリプロピレンフィルムの１つの表面（ミネソ タ州セントポールの３Ｍ、１.６ミル）をイソオクチルアクリレート/アクリルア ミド感圧接着剤（アクリレート/アクリルアミド９６/４重量％比）で被覆し、グ アーガム（スイス国クロイツリンガーのローヌープーラン社）の層で被覆した。 両面接着被覆テープ（ミネソタ州セントポールの３Ｍ）の層をスチロフォームの 露出端に置き、ポリプロピレンフィルムのガムを含有する表面を１つの端部に沿 ってスチロフォームスペーサに接着した。 培養物アリコート（１ml）をスチロフォームスペーサの開口部に置き、ポリプ ロピレンフィルムを用いて接種剤を被覆し、薄いフィルムを３５℃で２４時間培 養した。 ２４時間の培養後、ペトリ皿、ガラス管および薄いフィルムプレートを酸性ゾ ーンの存在で評価した。酸性ゾーンの存在はプレートまたはペトリ皿の赤い背景 中の黄色の領域またはガスバブルの存在として確認した。ブロス培養体は赤から 黄色への色の変化およびダーラムチューブ中でのガスバブルの存在で評価した。 以下の表１に示すデータはＲＣＣＭが大腸菌群の増殖に有効であることを示す 。 実施例２−フェノールレッドの濃度の影響 この実施例は過剰量のフェノールレッド、すなわち約１６０ml/lより大きい量 のフェノールレッドが大腸菌群の早期検出およびカウントを提供することを示す 。この実施例において種々のバクテリアはミネソタ州セントポールの３Ｍ・マイ クロバイオロジー・プロダクツ・ラボラトリーによって用いられた品質制限の単 離物であった。これらのバクテリアはセラティア・リクエファーシエムス（Serr atia liqefaciens（Ｃ１、異なる濃度、即ち約２５バクテリア/ml、５０バクテ リア/mlおよび７５バクテリア/mlで用いた）、ハフニア・アルビー（Hafnia alv ei）（Ｃ２）、エンテロバクター・サカザキ（Enterobactr sakazaki）（Ｃ３） 、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella Oxytoca）（Ｃ４）、エンテロバクタ ー・クロアセ（Enterobacter cloacae）（Ｃ５）および大腸菌（Escherichia co li）（１４９、３つの異なる濃度、約２５バクテリア/ml、５０バクテリア/mlお よび７５バクテリア/mlで使用）を包含する。当業者はバクテリアの等価的な株 および種類を容易に認識するだろう。バクテリアを実施例１と同様に増殖および 希釈し、増殖アリコートをポリエステルフィルム上に被覆した媒体中のフェノー ルレッドの濃度を０.０４〜２.５g/lで変化させる以外は、実施例１と同様に薄 いフィルムプレートに加えた。 以下の表２に示すデータは２４時間でカウントされたコロニーの数と比較して １２時間でカウントしたコロニーの％を示す。２４時間のカウントはガスの生産 および塩化トリフェニルテトラゾリウムの色の変化したコロニーを確認すること により行った。１６２mg/lを越えるフェノールレッドの量は安定的な早期検出と 速いカウント、並びに酸産出バクテリアのより速い確認を可能にすることが判っ た。 実施例３−比較例 １つの実験において、本発明の培養媒体（ＲＣＣＭ）を含有する薄いフィルム プレートを市販のペトリフィルム大腸菌カウントプレート（ミネソタ州セントポ ールの３Ｍ）およびバイオレット・レッド・アガーを含有する市販のポアープレ ートと比較した。 薄いフィルムプレート（ＲＣＣＭ）を含む薄いフィルムプレートは実施例１と 同様に調製した。 薄いフィルムプレートを培養するために用いるアリコートはミネソタ州ミネア ポリスのデイリー・クォリティ・コントロール・インスティテュートに注文して 得たミルクサンプルから取り、これを実施例１と同様に希釈した。異なるサンプ ルに、アリコート（１ml）を各々３つのプレートに加え、その３つのプレートは 異なる型の媒体を有し、その接種プレートを３５℃で培養した。接種プレートの 各々を各１時間毎に視覚で評価した。 また、ＲＣＣＭおよびペトリフィルム（PETLIFILM）薄いフィルムプレートを ２つの異なる波長でカメラでプレートを画像化することにより各３０分毎に評価 した。両方の波長での画像をレジタル化して電子的に保存した。保存イメージは さらに２つの波長のイメージを分割し、ついで３０分速くなされたイメージから 計算された分割したイメージから上記の分割イメージを差し引くことにより処理 した。 このイメージ分析方法は同時係属の米国特許出願０８/０６１,６７８（１９９ ３年５月１４日出願）に記載されている。 ３つの媒体からコロニー形成ユニットの検出およびカウントを相互に行った。 上記比較例により検出されたデータは下記表３に示す。このデータによれば本 発明の媒体が他の媒体に比べて、より速い検出とカウントを可能にすることを示 す。 別の実験として本発明の培養媒体を含む薄いフィルムプレートをミネソタ州セ ントポールの３Ｍから市販のペトリフィルム大腸菌カウントプレート、フェノー ルレッドまたはニュートラルレット（ワイオミング州ミルウォーキーのシグマ・ アルドリッチ社から市販の指示薬）を有する変性ペトリフィルム大腸菌カウント プレートおよびＲＣＣＭと同じであるが、フェノールレッドをニュートラルレッ ド、別の一般に使用されている指示薬、に変更した媒体で被覆した薄いフィルム プレートと比較した。 異なる媒体および指示薬を含有する薄いフィルムプレートを実施例１と同様に 調製し、以下の表４に示すバクテリアを含む希釈サンプルをアリコートを培養し た。この実施例に使用したバクテリアは上記実施例２に用いたものであった。こ のデータによれば、塩化トリフェニルテトラゾリウムの色の変化およびガス気泡 の形成によって検出された２４時間後に見られるコロニーの１００％をカウント するのに必要な時間を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｑ 1/06 6807−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/06 (72)発明者 ヘッセルロス、カレン・イー アメリカ合衆国 55133―3427、ミネソタ 州、セント・ポール、ポスト・オフィス・ ボックス33427番（番地の表示なし) (72)発明者 アダムス、カール・エイ アメリカ合衆国 55133―3427、ミネソタ 州、セント・ポール、ポスト・オフィス・ ボックス33427番（番地の表示なし) (72)発明者 シュワッブ、デブラ・エイ アメリカ合衆国 55133―3427、ミネソタ 州、セント・ポール、ポスト・オフィス・ ボックス33427番（番地の表示なし)

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．トリプトース、ラクトース、塩化ナトリウム、胆汁酸塩、グアーガム、お よび増殖したバクテリアの検出およびカウントを１２時間以内に可能にするため に、培養バクテリアに近接して高濃度のフェノールレッドを提供するのに十分過 剰のフェノールレッドを含有する媒体中で増殖する大腸菌群の検出およびカウン トを促進するバクテリア培養媒体。 ２．フェノールレッドの濃度が約１６０mg/lより大きい請求項１記載の培養媒 体。 ３．フェノールレッドの濃度が約１０００mg/lより大きい請求項１記載の培養 媒体。 ４．トリプトース約１０〜２０g/l、ラクトース２.５〜７.５g/l、塩化ナトリ ウム２.５〜７.５g/l、胆汁酸塩１.３５〜１.６５g/l、グアーガム２.５〜７.５ g/l、塩化トリフエニルテトラゾリウム０.０２５〜０.１２０g/lおよびフェノー ルレッド０.１６〜５.０g/lを含有する請求項４記載の培養媒体。 ５．トリプトース、ラクトース、塩化ナトリウム、胆汁酸塩、グアーガムおよ び培養バクテリアに近接して高濃度のフェノールレッドを提供するのに十分過剰 なフェノールレッドを含有する培養媒体に大腸菌群を含むサンプルのアリコート を加える工程、培養媒体の存在下にバクテリアを培養する工程、ついで、１２時 間以内に培養したバクテリアの代謝物としてフェノールレッドの色の変化を検出 する工程からなるサンプル中の大腸菌群の存在を検出する方法。 ６．バクテリアが培養媒体を含有する寒天中で増殖する請求項５記載の方法。 ７．バクテリアが媒体を含有する懸濁液中で増殖する請求項５記載の方法。 ８．自己支持性で防水性の支持体、発泡体スペーサーおよび透明カバーシート から本質的になるサンプル中の大腸菌群の増殖を検出する装置において、トリプ トース、ラクトース、塩化ナトリウム、胆汁酸塩、グアーガムおよび１２時間以 内にバクテリアの増殖の検出およびカウントを行うために増殖バクテリアに近接 して高濃度のフェノールレッドを提供するのに十分過剰のフェノールレッドを含 有する培養媒体を前記自己支持性で防水性の支持体上に塗布する、大腸菌群の増 殖を検出するデバイス。 ９．フェノールレッドが色を赤から黄色に変化させ、その変化がある特定の装 置で検出される請求項８記載のデバイス。 １０．塩化トリフェニルテトラゾリウムが大腸菌群の存在下に約２４時間後に 色が変化する請求項８記載のデバイス。