JPH08507222A - 転写因子−ｄｎａ結合アッセイ - Google Patents

転写因子−ｄｎａ結合アッセイ

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JPH08507222A JP7528394A JP52839495A JPH08507222A JP H08507222 A JPH08507222 A JP H08507222A JP 7528394 A JP7528394 A JP 7528394A JP 52839495 A JP52839495 A JP 52839495A JP H08507222 A JPH08507222 A JP H08507222A
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Abstract

(57)【要約】 遺伝子転写のレベルで活性な医薬を高処理量ドラッグスクリーニングアッセイで同定する。本方法はラベル化転写因子、リガンドと結合する核酸、候補医薬及びマイクロタイター・プレート、フィルター又はビーズのような固体基質に固定した受容体を組合わせることを含む。核酸は、転写因子と配列−特異的に相互作用するのに必要な遺伝子の転写の調節に天然に含まれる、少なくともヌクレオチド配列の部分を有する。受容体がリガンドに結合し、かつ候補医薬が存在しない場合に、転写因子が配列−特異的に核酸と結合する条件で、得られた組合せをインキュベートする。その後、結合していない転写因子を固体基質から取り除くか又は洗浄し、ラベル化した、配列−特異的に結合した転写因子を検知する。転写因子結合を変化する候補薬を含むインキュベートは、ラベル信号に関してコントロールインキュベートから離れており、特に結合が破壊され、信号が消される。好ましい態様として、すべての工程を軸方向に回転可能なコンピュータ制御エレクトロメカニカル・ロボットによって行う。

Description

【発明の詳細な説明】 転写因子−ＤＮＡ結合アッセイ 概 説発明の分野 本発明の分野は、配列−特異的タンパク質−ＤＮＡ結合で妨害される薬剤のス クリーニングのためのアッセイに関する。背景 成人の大抵の人口の９０〜９５％に、エプスタイン−バーウィルス（Epstein Barr virus(EBV)）感染の事実が見られる。感染は一般に、幼児期に起こり（年 齢＜６歳）、ほとんど症候が生じない。大学生領域の成人（college bound adul ts）の感染（年に約１％）によって、感染個体の３０〜４０％に感染性単核細胞 症（ＩＭ）が生じる。ＩＭは、通常、熱、倦怠感、及び疲労によって特徴付けら れる自己制御式リンパ増殖性の病気であって、めったに死に至らない。ＥＢＶ病 に対する有効な治療法は、完全には入手されていない。 遺伝子−特異性転写因子は、次の理由から、ＥＢＶ病に関する新規な治療法に 見込みある種類のターゲットを提供する。転写因子は、実質的な特異性を提供す る：各々及びすべての因子は、ターゲットに独特な分子表面を提供する。 新規な医薬の同定及び開発は、米国のみで数百億ドルの工業である。遺伝子転 写レベルで活性な医薬又は薬剤を同定する有効な方法が、早急に必要である。自 動化、高コスト効率、高処理量のドラッグスクリーニングに従うならば、そのよ うな方法は、国内及び国際的な医薬及び生物工学的薬剤の発展プログラムの広範 囲において即時の応用をもたらすであろう。最近の文献 ケンプ（Kemp）ら（1989年）『Amplified DNA Assay』ＰＣＴ国際出願番号466 37/89（出願日1989年12月8日） ケンプ（Kemp）ら（1990年）『Simplified colorimetric analysis of polyme rase chain reactions: detection of HIV sequences in AIDS patients』、Gen e 94巻、223-228頁。 ケンプ（Kemp）ら（1989年）『Colorimetric detection of specific DNA seg ments amplified by polymerase chain reactions』、PNAS USA 86巻、2423-242 7頁。 発明の概要 本発明は、遺伝子転写のレベルで活性な医薬をスクリーニングする方法を提供 する。 一般に、この方法には、ラベル化タンパク質、核酸、候補医薬及びマイクロタ イター・プレートのような固体基質に固定した受容体を組合わせることが含まれ る。ラベル化タンパク質は、遺伝子発現の調節（regulation）に含まれる天然転 写因子の少なくとも一部を含んでいる。核酸は、転写因子と直接又は間接的に、 配列特異的に相互作用するのに必要な、遺伝子の転写の調節に天然に含まれるヌ クレオチド配列の少なくとも一部を有する。核酸は、固定した受容体と特異的に 結合することができるリガンドと接合する。受容体がリガンドと結合し、かつ候 補医薬が存在しない場合、転写因子が配列−特異的に核酸と結合する条件下で、 得られた混合物をインキュベートする。結合していない転写因子は、その後、固 体基質から除去されるか又は洗浄され、ラベル化した配列−特異的結合転写因子 が検知される。転写因子結合を変える候補薬を含む結合反応『インキュベート』 が、基質に保持されるラベルに関してコントロール・インキュベーションから離 れる−代表的には、結合が破壊され、信号が消される。このように、転写因子− 遺伝子相互作用を変調する医薬が同定される。 一般的な方法の他の態様が広範囲にわたって開示されている。これらには、さ まざまなラベル、リガンド、受容体、遺伝子、転写因子、及び補助因子などがあ げられる。好ましい態様として、転写因子がウィルス又は真核生物であり、ラベ ルが放射性元素であり、受容体がアビジンであり、かつリガンドがビオチンであ る。方法の多くは、エレクトロメカニカル・ロボットによる性能に影響をうけや すい。好ましい態様として、軸方向回転可能なアームを有するコンピュータ制御 可能なエレクトロメカニカル・ロボットによって、この方法を行う。また、本発 明は、開示される核酸結合法に基づくドラッグスクリーニングのためのキットを 提供する。 図面の簡単な説明 図１：ロボット・ステーション設計の図。 発明の詳細な説明 本発明は、遺伝子転写のレベルで活性な医薬の有効な同定方法を提供する。本 方法は、自動化、高コスト効率、高処理量のドラッグスクリーニングに従い、国 内及び国際的な医薬及び生物工学的薬剤の発展プログラムの広範囲にわたって即 時の応用をもたらす。 ターゲットの病気は、転写因子と遺伝子又は遺伝子調節領域との特異的な相互 作用の変化によって、阻害を被る病気の進行にのみ限定される。そのようなもの として、ターゲットの病気には、ウィルス性、細菌性、及び真菌性感染、並びに 新形成、炎症、過敏症などのような代謝性の病気、遺伝病、細胞成長及び調節機 能不全があげられる。このターゲットの病気は、植物、特に農作物、又は動物、 特に、家畜及びヒトの病気である。 転写因子は、遺伝子又は遺伝子調節領域の一部と配列−特異的に相互作用する ことができる。この相互作用は、転写因子が直接核酸と接触する直接的な配列− 特異的結合であるか、又は転写因子が、直接核酸結合タンパク質によって核酸と つながれる、他の補助タンパク質により仲介されるか又は助長される間接的な配 列−特異的結合である。また、ある転写因子は、誘導又は協力（synergistic） 結合を示す。広範囲の転写因子−核酸複合体は有用なターゲットを提供する。遺 伝子及び／又は転写因子は、宿主から、又は感染性微生物もしくは寄生微生物か ら誘導することができる。例として、宿主は、免疫細胞活性に含まれる転写因子 のＤＮＡ結合を調節することによって、免疫調節することができる（例えば、炎 症又は過敏症を制御することにより）；又は、ウィルス性、細菌性、又は他の微 生物の病気の進行を、ウィルス性又は微生物性遺伝子転写に含まれる宿主、ウィ ルス性、又は他の微生物の転写因子のＤＮＡ結合を崩壊させる（disrupting）こ とによって阻害することができる。 適用可能な宿主及びウィルス性又は微生物転写因子及び対応するオリゴヌクレ オチド・ターゲットは、定期的に更新される医薬及び国立図書館での生物工学に 関する国立センターの転写因子データベース、Nucleic Acids Research 20巻、 3-26頁（Transcription Factor Database of the National Center for Biotech nology Information at the National Library for Medicine and Faisst and M eyer(1991)）のような情報源に見出される。好ましい対を以下の表１にリストア ップする。 開示される方法及びキットは、ビーカー内での配列−特異的転写因子−核酸相 互作用を再構築し、かつ候補医療で再構築に挑戦することを含む。この方法の好 ましい応用には、少なくとも１つの転写因子及び対応する遺伝子又は遺伝子調節 領域が分子的にクローンされる遺伝子転写調節が挙げられる。この方法は、転写 因子の少なくとも一部を含有するラベル化タンパク質、リガンドと接合する核酸 、候補医薬及び固体基質に固定した受容体の混合物を形成することを含んでいる 。 ラベル化タンパク質は、転写因子の少なくとも一部及びラベルを含有し、その 一部は、核酸接合体に直接又は間接的に、ラベル化タンパク質が配列−特異的に 結合することができるのに十分なものである。この一部は、鎖中に、通常少なく とも約２０個、より通常であれば少なくとも約４０個、最も通常であれば少なく とも約８０個のアミノ酸であり、天然の転写因子と似ている配列−特異性でタン パク質を提供するのに十分な残基を含んでいる。しばしば、ラベル化タンパク質 に、完全な転写因子が含まれることがある。このラベル化タンパク質は典型的に は、少なくとも約１０4Ｍ-1、好ましくは少なくとも約１０6Ｍ-1、より好ましく は少なくとも約１０8Ｍ-1であり、同じ条件での天然の転写因子の結合平衡定数 よりも６桁以上、好ましくは４桁以上の、より好ましくは２桁以上の平衡定数で 核酸接合体と結合することができる。 必要な結合特異性及び親和力を付与することができる、好ましい転写因子部分 は、当業者によって即座に同定される。広範囲の分子的及び生化学的方法が、好 ましい部分を発生するのに有効である。例えば、Molecular Cloning，A Laborat ory Manual（2nd Ed.，Sambrook，Fritsch and Maniatis，Cold Spring Harbor ）、及びCurrent Protocols in Molecular Biology（Eds．Aufubel，Brent，Kin gston，More，Feidman，Smith and Stuhl，Greene Publ．Assoc.，Wiley-Inters cience，NY，NY，1992年）、又は他にも当業界で知られているものを参照のこと 。例えば、ラベルを用いるか又はゲルシフト分析によって、欠失変異株を直接配 列−特異的結合でスクリーニングされる。 ラベル化タンパク質も、ラベル化タンパク質−核酸複合体を検知するのに用い られるラベルを含有する。さまざまなラベルを用いることができる。−核酸接合 体と複合化するとき、ラベル化タンパク質を検知するのに提供される、本質的に はいかなるラベルも用いることができる。ラベルは放射線、蛍光、及び光学的又 は電気的密度などのような直接検知、又はエピトープ・タッグ（epitope tag） 及び酵素などのような間接検知で提供することができる。ラベルは、例えば、リ ンの放射性同位体を含有するリン酸基などのタンパク質に付随させるか、又は例 えば、イオウの放射性同位体を含有するメチオニン残基などのタンパク質の構造 に組み込むことができる。 タンパク質は、アッセイ試薬及び条件に依存する添加成分をも含有する。例え ば、タンパク質が、転写因子部分と他のポリペプチド、例えばアッセイ条件で配 列−特異的な性核酸結合又は安定性をもたらすか又は向上させることができるポ リペプチドとの融合生成物であるのが望ましい。 核酸接合体は、リガンドと結合する核酸を含有する。核酸は通常線形であり、 かつ二重鎖ＤＮＡ又はＲＮＡであり、特にレトロウィルス性転写因子結合部位の 場合に、転写因子配列−特異的結合が保持されている限り、円形プラスミド又は 他の核酸又は構造類似体が置換されてもよい。ある応用において、超コイルＤＮ Ａは最適な配列−特異的結合をもたらし、それが好ましい。核酸はアッセイ条件 及び要件に従い、いかなる長さでもよい。典型的には、核酸は８bp〜５kb、好ま しくは約12bp〜１kb、より好ましくは約18bp〜250bp、最も好ましくは約27bp〜5 0bpである。 核酸は、天然の転写因子が通常結合する遺伝子又は遺伝子調節領域に共通する 一部を少なくとも有する配列を有する。この部分は、連続であるか又は分裂され ていてもよく、ラベル化タンパク質の配列−特異的結合を提供する遺伝子又は遺 伝子調節領域と同じ配列であって十分な配列を共有する。典型的には、核酸の結 合部位部分は、少なくとも約４個、好ましくは少なくとも約６個、より好ましく は少なくとも約８個のヌクレオチドを構成する。さらなるヌクレオチドを、結合 又は安定性などを向上させるか又は減少させる構造を提供するために用いること ができる。例えば、結合性ＤＮＡ結合（combinatorial DNA binding）は、オリ ゴヌクレオチドの異なるか又は同じ転写因子のための２以上のＤＮＡ結合部位を 含めることによって行うことができる。これは、２以上の因子、例えば、タンパ ク質−タンパク質相互作用によってＤＮＡと協同的に結合するHPV E1及びE2など の、協同的又は相乗的ＤＮＡ結合の研究による。また、核酸は、転写因子結合部 位が、問題のアッセイに用いるために簡便にスプライシングされるカセットを含 有することができる。新しいＤＮＡ結合部位が、共通の３０-mer配列内で簡単に 交換することができることを示すカセットの例を以下の表２に示す。 核酸接合体のリガンドは、固定した受容体に特異的に結合することができる。 リガンド−受容体結合は、最大又は測定可能な信号：ノイズ比をもたらすのに十 分に特異的である（受容体仲介と基質上のラベルの非特異的保持との比較）。核 酸接合体は典型的には、少なくとも約１０5Ｍ-1、好ましくは少なくとも約１０6 Ｍ-1、より好ましくは少なくとも約１０8Ｍ-1の親和力で受容体と結合すること ができる。好ましい態様として、複数のリガンドが、各々受容体と結合すること ができる。リガンド−受容体のペアの例として、ビオチンとアビジン、抗原と抗 体、砂糖とレクチン、イオンとキレート化剤などが挙げられる。 受容体は、結合していないラベル化タンパク質を簡便に分離することができれ ば、いかなる固体であってもよい固体基質に固定される。固体基質は、あらゆる 材料からなり、あらゆる形状であることができる。例えば、マイクロタイター・ プレート、微小球、計深棒（dipstick）、及び樹脂粒子などである。基質は、信 号：ノイズ比が最大となるように、主にバックグランドの結合を最小にするよう に選ばれ、洗浄が簡易で、低コストのものを選ぶ。例えば、鉄の核を有するビー ズは、磁石を用いて即座に単離することができる。 混合物は、また候補医薬を含有する。候補医薬には多くの化学種類が含まれる か、典型的には、候補医薬は有機化合物、好ましくは小さな有機化合物である。 小さな有機化合物は、分子量が５０を越えるが約２５００未満であり、好ましく は約１０００未満、より好ましくは約５００未満である。候補医薬は、タンパク 質及び／又はＤＮＡと構造的な相互作用するのに必要な機能性化学基を含有し、 典型的には少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシル又はカルボキシル基を 含み、好ましくは該機能性化学基を少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも ３つ含んでいるのがよい。候補医薬は、しばしば１以上の前記機能性基で置換さ れた環状炭素又はヘテロ環構造及び／又は芳香族又はポリ芳香族構造を含有する 。候補医薬はペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン類、ピリミジン類、 誘導体、構造類似体又はこれらの組合せなどを含む生体分子の中にも見出される 。 候補医薬は、合成又は天然化合物のライブラリーを含む広範囲な供給源から得 られる。例えば、多くの手段が、無作為化オリゴヌクレオチド（randomized oli gonucleotide）の発現を含む、広範囲な有機化合物及び生体分子のランダム及び 直接合成に有効である。また、細菌性、真菌性、植物及び動物の抽出物の形態の 天然化合物のライブラリーは、入手可能であるか又は即座に製造される。また、 天然及び合成的に製造したライブラリー及び化合物は、従来からの化学的、物理 的、及び生化学的方法によって即座に改質される。さらに、既知の医薬は、アシ ル化、アルキル化、エステル化、アミド化などのような直接又はランダム化学改 質を受けて、構造類似体を製造することができる。 ラベル化タンパク質、核酸接合体、候補薬及び固定した受容体の他に、混合物 は通常、塩、バッファーなどのさらなる試薬を含み、最適な受容体−リガンド及 びタンパク質−核酸結合を助長する。補助タンパク質又はその一部も含まれ、配 列−特異的タンパク質−核酸結合を仲介するか又は助長するか又はその代わりに 向上させることができる。例えば、１以上の細胞タンパク質、例えばHSVのVP16 の場合のOctl及びHCFなどと複合化すると、多くのウィルス性転写因子の配列− 特異的結合が向上される。補助タンパク質の他の例として、EBNA-2結合のための CBF1、アデノウィルスE1A結合のためのATF-2又はAP-1などが挙げられる。 さまざまな他の試薬も混合物に含めることができる。これらには、非特異的又 はバックグランドのタンパク質−基質、核酸−基質、タンパク質−タンパク質、 及びタンパク質−ＤＮＡ相互作用などを減少させるのに用いることができる洗浄 薬のような試薬が含まれる。また、その他にアッセイの効率を向上させる試薬、 例えばプロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、及び抗菌薬などを用いてもよ い。 受容体がリガンドに結合し、かつ候補医薬が存在しない場合、ラベル化タンパ ク質が核酸と配列−特異的に結合する条件下で、混合物をインキュベートする。 必要な結合をもたらすためには、混合物成分を加えることができる。例えば、ラ ベル化タンパク質を加える前に、核酸接合体をまず加えて、リガンド−受容体結 合を通して基質と先結合させる（prebind）。また、核酸接合体及びラベル化タ ンパク質を先インキュベート（preincubate）し、複合化し、その後に結合する ための基質へ加えることができる。又はさまざまな混合物成分及び試薬を同時に 基質に加えることもできる。タンパク質及び核酸成分を共に加えることは、初期 結合が溶解性で非抑制の核酸分子によって好まれる、ある核酸−タンパク質複合 体において、熱力学的に有利である。 インキュベーションは、最適な結合を助長する、いかなる温度でも行うことが でき、代表的には４〜４０℃、より一般的には１５〜４０℃である。インキュベ ーションの期間は最適結合のために選択されるが、迅速、高処理量のスクリーニ ングを助長するために最小限にされる。代表的には、タンパク質−核酸及び受容 体−リガンド対が、０．１〜１０時間、好ましくは５時間未満、より好ましくは ２時間未満、共にインキュベートされる。もちろん、インキュベーションを同時 に行ってもよく、好ましくはそうである。 受容体−リガンド及びタンパク質−核酸結合が生じた後、配列−特異的に結合 していないラベル化タンパク質を含有する断片を固体基質から分離する。この工 程は、レザーバー（reservoir）からビーズ又は計深棒を取り除き、マイクロタ イター・プレートのウェル（well）のようなレザーバーを空にするか又は希釈し 、ビーズ、粒子、クロマトグラフのカラム又はフィルターを洗浄溶液又は溶媒で 洗浄することを含むさまざまな方法で達成される。代表的に分離工程には、長期 の清浄又は洗浄、もしくは複数回の清浄又は洗浄が含められるであろう。例えば 、固体基質がマイクロタイター・プレートであり、そのウェルが数回洗浄溶液で 洗浄されるとき、それには代表的に塩、バッファー、洗浄薬、非特異性タンパク 質などのような特異的な結合に参加しないインキュベーション混合物の成分が含 まれる。 結合していない断片を固体基質から分離した後、結合した核酸−タンパク質複 合体の存在をラベル化タンパク質を通して検知する。さまざまな方法を用いて、 ラベル及び他のアッセイ成分の性質に依存するラベルを検知することができる。 例えば、ラベルを固体基質に結合させて検知するか、又はラベルを含む結合複合 体の一部を固体基質から分離して、その後にラベルを検知することができる。光 学的又は電気的密度、放射線、非放射エネルギー遷移などによって、ラベルを直 接検知するか、又は、抗体接合体などで間接的に検知することができる。例えば 、放射性ラベルの場合、放射線を、例えば粒子計数器で直接的に、又はシンチレ ーション・カクテル及び計数器で間接的に検知することができる。 転写複合体形成を変調するのに示される候補薬は、細胞、植物、農作物、動物 及びヒト試験のための医薬業、農芸工業に価値ある試薬を提供する。 この方法は、特に自動化高処理量のドラッグスクリーニングに適している。好 ましい態様として、個体サンプル・インキュベーション体積は、約５００μｌ未 満、好ましくは約２５０μｌ未満、より好ましくは約１００μｌ未満であるのが よい。このようにサンプル体積が少ないことにより、稀少な候補薬、高価な転写 複合体成分、及び有害な放射性廃棄物の使用を最小限化する。さらに、この方法 は、自動化、特にコンピュータ自動化を提供する。したがって、この方法の工程 は、コンピュータ制御エレクトロメカニカル・ロボットによって行われるのが好 ましい。各々の工程がそれぞれ自動化することができる一方、好ましい態様とし て、混合物形成、インキュベーション及び分離工程を行う複数のワークステーシ ョンを往来する、軸方向に回転する１つのアームを有する１つのコンピュータ制 御多機能ロボットが挙げられる。このコンピュータは、アーム及びワークステー ションの作業を直接指示し、作業者がインターフェースするために、入力（例え は、キーボード及び／又はマウス）及び表示（例えば、モニター）手段を有する ソフトウェアで稼働する。 特別な態様として、アームはマイクロタイター・プレートを回収し、かつイン キュベーション・バッファー及び１以上の候補薬を含有する各々の測定される少 量の溶液を各々の指定されたウェルに置かれる、液体分配ステーションへ運搬す る。その後アームは回収し、ラベル化転写因子タンパク質を含有する、測定され る少量の溶液を運搬し、指定されたウェルに入れる。第１のインキュベーション 期間の後、液体分配ステーションは、各々指定されたウェルに、測定される少量 のビオチン化核酸溶液を入れる。第１及び／又は次の第２のインキュベーシヨン は、アームがプレートから振盪器に移した後に、任意に行うことができる。第１ のインキュベーション期間後、アームは、マイクロタイター・プレートから、各 々のウェルの結合していない内容物を吸引し、その後ウェルを洗浄バッファーで 満たし、吸引することを繰り返す洗浄ステーションに移る。結合したラベルが放 射性リンの場合、アームは回収し、プレートから測定される少量のシンチレーシ ョン・カクテルを各々指定されたウェルに入れる液体分配ステーションへ移る。 その後、各々指定されたウェルに保持されるラベルの量を計る。 最も好ましい態様として、液体分配ステーション及びアームは、少なくとも８ 個のウェルに少量を入れることができ、洗浄ステーションは９６個ウェルを同時 に満たしかつ吸引することができるものである。好ましいロボットは、２４時間 毎に、少なくとも６４０個、好ましくは１２８０個の候補薬を、例えばマイクロ タイター・プレートで処理できるものである。 次の実施例は、例を示すためのものであり、これによって限定されるものでは ない。実施例 転写因子−ＤＮＡ結合アッセイのための一般的なプロトコール １．試薬 ・中性化アビジン（Neutralite Avidin）：ＰＢＳ中に20μg/ml ・阻止バッファー（Blocking buffer）：ＰＢＳ中に5% BSA、0.5%ツウィーン2 0（Tween 20）：室温１時間 ・アッセイバッファー：ＫＣｌ100mM、ＨＥＰＥＳ20mM pH7.6、ＥＤＴＡ0.25m M、グリセロール1%、ＮＰ−４０ 0.5%、ＢＭＥ50mM、ＢＳＡ１mg/ml、プロテア ーゼ阻害剤のカクテル ・ 33Ｐ全長転写因子10xストック：ラベル化タンパク質（ベックマン・カウン ター(Beckman counter)）100,000-500,000cpmで補足される（supplement）転写 因子部分を含有する非ラベル化タンパク質を含有する『低温("cold")』タンパク 質1-5x10-8。スクリーニングの際、４℃の微小冷蔵庫（microfridge）内に入れ た。 ・プロテアーゼ阻害剤のカクテル（1000X）：ＰＢＳ10ml中に、トリプシン阻 害剤10mg（BMB # 109894）、アプロチニン10mg（BMB # 236624）、ベンズアミジ ン25 mg（Sigma # B-6506）、ロイペプチン25mg（BMB # 1017128）、ＡＰＭＳＦ10mg （BMB # 917575）、及びＮａＶｏ3２mM（Sigma # S-6508）。 ・オリゴヌクレオチドストック（Oligonucleotide stock）：（特定のビオチ ン化）転写因子結合部位を含むビオチン化オリゴ1-100pmole/l。 （ビオチン）−オリゴ：例えば、表１から誘導される。 アンチーセンス：上記のターゲットオリゴから逆補体（reverse complement）と して誘導される。 ２．アッセイプレートの調製： ・ウェル毎にストックN-アビジン100μｌで、一晩４℃でコート。 ・ＰＢＳ200μｌで２回洗浄。 ・阻止バッファー150μｌでブロック。 ・ＰＢＳ200μｌで２回洗浄。 ３．アッセイ： ・アッセィバッファー／ウェル40μｌ添加。 ・化合物又は抽出物10μｌ添加。 ・33Ｐラベル化タンパク質（10,000-50,000cpm/ウェル；１０-10〜１０-8Ｍ最 終濃度） ・室温で１５分間振盪。 ・さらに４５分間２５℃でインキュベート。 ・オリゴ混合物（アッセイバッファー中1.0 pmoles/40 μｌ）40μｌ添加。 ・25℃で１時間インキュベート。 ・ＰＢＳ 200μｌで４回洗浄することにより反応を停止。 ・シンチレーション・カクテル 150μｌ添加。 ・トップカウント（Topcount）計数。 エプスタイン・バーウィルスＥＢＮＡ-1結合アッセイのためのプロトコール １．試薬： ・中性化アビジン：ＰＢＳ中20μｇ／ｍｌ。 ・阻止バッファー：ＰＢＳ中ＢＳＡ5%、0.5%ツウィーン20；１時間、室温。 ・アッセイバッファー：ＫＣｌ100mM、ＨＥＰＥＳ20mM pH7.6、ＥＤＴＡ0.25m M、グリセロール1%、ＮＰ−４０ 0.5%、ＢＭＥ 50mM、ＢＳＡ１mg/ml、プロテア ーゼ阻害剤のカクテル ・ 33ＰＥＢＮＡ 10xストック：ラベル化タンパク質ＥＢＮＡ-1（ベックマン・ カウンター）200,000-250,000cpmで補足される『低温（"cold"）』ＥＢＮＡ（２ 量体の分子量〜40,000）3x10-8。これをスクリーニングの際、４℃の微小冷蔵庫 内に入れた。 ・プロテアーゼ阻害剤のカクテル（1000X）：ＰＢＳ10ml中に、トリプシン阻 害剤10mg（BMB # 109894）、アプロチニン10mg（BMB # 236624）、ベンズアミジ ン25mg（Sigma # B-6506）、ロイペプチン25mg（BMB # 1017128）、ＡＰＭＳＦ1 0mg（BMB # 917575）、及びＮａＶｏ3２mM（Sigma # S-6508）。 ・オリゴヌクレオチドストック：（特定のビオチン化）ビオチン化オリゴ17ｐ mole/l、ＥＢＮＡ部位TO889/832： （ビオチン）−GGA TCT GGT TAG CAT ATG CTA ACC AGG ATC （配列番号６０）； アンチーセンス−GAT CTT GGT TAG CAT ATG CTA ACC AGA TCC （配列番号６５） 。 ２．アッセイプレートの調製： ・ウェル毎にストックN-アビジン 100μｌで、一晩４℃でコート。 ・ＰＢＳ 200μｌで２回洗浄。 ・阻止バッファー 150μｌでブロック。 ・ＰＢＳ 200μｌで２回洗浄。 ３．アッセイ： ・アッセイバッファー／ウェル40μｌ添加。 ・化合物又は抽出物10μｌ添加。 ・33Ｐ- ＥＢＮＡ-1（20,000-25,000 cpm／0.3 pmoles／ウェル＝３×１０-9 Ｍ最終濃度）10μｌ。 ・室温で１５分間振盪。 ・さらに４５分間室温でインキュベート。 ・オリゴ混合物（アッセイバッファー中1.0 pmoles/40μｌ）40μｌ添加。 ・室温で１時間インキュベート。 ・ＰＢＳ 200μｌで４回洗浄することにより反応を停止。 ・シンチレーション・カクテル 150μｌ添加。 ・トップカウント計数。 エプスタイン・バーウィルスＢＺＬＦ-1結合アッセイのためのプロトコール １．試薬： ・中性化アビジン：ＰＢＳ中20μｇ／ｍｌ。 ・阻止バッファー：ＰＢＳ中ＢＳＡ5%、0.5%ツウィーン20；１時間、室温。 ・アッセイバッファー：ＫＣ１100 mM、ＨＥＰＥＳ20mM pH7.6、ＥＤＴＡ0.25 mM、グリセロール1%、ＮＰ−４０ 0.5%、ＢＭＥ 50mM、ＢＳＡ１mg/ml、プロテ アーゼ阻害剤のカクテル ・ 33Ｐ全長ＢＺＬＦ10x ストック：ラベル化ＢＺＬＦ（ベックマン・カウンタ ー）180,000-220,000 cpm で補足される『低温（"cold"）』ＢＺＬＦ 3x10-8で あり、おおよその特異的活性が、180,000-220,000 cpm/l pmole（２量体の分子 量〜54,000）であった。このタンパク質ストック溶液は、ＥｔＯＨ70％、ＢＳＡ を含まないアッセイバッファー30％、及びＢＭＥ50mM（最終濃度）を含んでいた 。このタンパク質をスクリーニングの際、４℃の微小冷蔵庫内に入れた。 ・プロテアーゼ阻害剤のカクテル（1000X）：ＰＢＳ10ml中に、トリプシン阻 害剤10mg（BMB # 109894）、アプロチニン10mg（BMB # 236624）、ベンズアミジ ン25mg（Sigma # B-6506）、ロイペプチン25mg（BMB # 1017128）、ＡＰＭＳＦ1 0mg（BMB # 917575）、及びＮａＶｏ3２mM（Sigma # S-6508）。 ・オリゴヌクレオチドストック：（特定のビオチン化）ビオチン化オリゴ22ｐ mole/l,ＢＺＬＦ部位 TO855/854： センスー（ビオチン） TTAT CTA CAT TAG CAA TGC CTT AGC AAT GTG CAT A（配 列番号６６）；アンチーセンス-TAT GCA CAT TGC TAA GGC ATT GCT AAT GTA GAT A（配列番号６７）。 ２．アッセイプレートの調製： ・ウェル毎にストックN-アビジン 100μｌで、一晩４℃でコート。 ・ＰＢＳ200μｌで２回洗浄。 ・阻止バッファー 150μｌでブロック。 ・ＰＢＳ 200μｌで２回洗浄。 ３．アッセイ： ・アッセイバッファー／ウェル40μｌ添加。 ・化合物又は抽出物10μｌ添加。 ・33Ｐ- ＢＺＬＦ（18,000-22,000 cpm／0.1 pmoles／ウェル＝１×１０-9Ｍ 最終濃度）10μｌ。 ・室温で１５分間振盪。 ・さらに４５分間室温でインキュベート。 ・オリゴ混合物（アッセイバッファー中1.0 pmoles/40 μｌ）40μｌ添加。 ・室温で１時間インキュベート。 ・ＰＢＳ 200μｌで４回洗浄することにより反応を停止。 ・シンチレーション・カクテル 150μｌ添加。 ・トップカウント計数。 ヒト乳頭腫（HUMAN PAPILL0MA）ウィルス６Ｅ２結合アッセイのためのプロトコ ール １．試薬： ・中性化アビジン：ＰＢＳ中20μｇ／ｍｌ。 ・阻止バッファー：ＰＢＳ中ＢＳＡ5%、0.5%ツウィーン20；１時間、25℃。 ・アッセイバッファー：ＫＣｌ100mM、ＨＥＰＥＳ20mM pH7.6、ＥＤＴＡ0.25m M、グリセロール1%、ＮＰ−４０ 0.5%、ＢＭＥ 50mM、ＢＳＡ１mg/ml、プロテア ーゼ阻害剤のカクテル ・ 33Ｐ全長Ｅ２ 10xストック：ラベル化Ｅ2200,000-300,000cpmで補足される 『低温（"cold"）』Ｅ２ 1x10-8であり、おおよその特異的活性が、200,000-30 0,000 cpm/l pmole（２量体の分子量〜100 kD）であった。４℃に設定した微小 冷蔵庫内に入れた。 ・プロテアーゼ阻害剤のカクテル（1000X）：ＰＢＳ10ml中に、トリプシン阻 害剤10mg（BMB # 109894）、アプロチニン10mg（BMB # 236624）、ベンズアミジ ン25mg （Sigma # B-6506）、ロイペプチン25mg（BMB # 1017128）、ＡＰＭＳＦ10mg（B MB # 917575）、及びＮａＶｏ3２mM（Sigma # S-6508）。 ・オリゴヌクレオチドストック：（特定のビオチン化及び共有サケ精子(shear ed salmon sperm)(sss)-DNA）。ビオチン化オリゴ25 pmole/ml、ＨＰＶ−Ｅ２ １位TO922/923： （ビオチン）-CCA GAG TGA CCG AAA ACG GTG TGA GAC C （配列番号６８）；ア ンチーセンス-GGT CTC ACA CCG TTT TCG GTC ACT CTG G （配列番号６９）及び アッセイバッファー中sss-ＤＮＡ25g/ml。 ２．アッセイプレートの調製： ・ウェル毎にストックN-アビジン 100μｌで、一晩４℃でコート。 ・ＰＢＳ 200μｌで２回洗浄。 ・阻止バッファー 150μｌでブロック。 ・ＰＢＳ 200μｌで２回洗浄。 ３．アッセイ： ・アッセイバッファー／ウェル40μｌ添加。 ・化合物又は抽出物10μｌ添加。 ・33Ｐ- Ｅ２（20,000-30,000 cpm／0.1pmoles／ウェル＝１×１０-9Ｍ最終濃 度）10μｌ。 ・室温で１５分間振盪。 ・さらに４５分間２５℃でインキュベート。 ・オリゴ混合物（ビオチン化特定オリゴ１ pmole 及びsss-ＤＮＡ １μｇ）40 μｌ添加。 ・２５℃で１時間インキュベート。 ・ＰＢＳ 200μｌで４回洗浄することにより反応を停止。 ・シンチレーション・カクテル 150μｌ添加。 ・トップカウント計数。 ４．コントロール： ａ．非特異性結合（オリゴ添加せず） ｂ．80％インキュベーションでの特定溶解性オリゴ Ｎｆ−ｋＢ結合アッセイのためのプロトコール（ｐ６５／ｐ５０） １．試薬： ・中性化アビジン：ＰＢＳ中50μｇ／ｍｌ。 ・阻止バッファー：ＰＢＳ中ＢＳＡ5%、0.5%ツウィーン20；１時間、室温。 ・アッセイバッファー：ＫＣｌ100 mM、ＨＥＰＥＳ20 mM pH 7.9、ＥＤＴＡ0. 5 mM、グリセロール1%、ＮＰ−４０ 0.5 %、ＢＳＡ１mg/ml、ＢＭＥ 50mM、プロ テアーゼ阻害剤のカクテル ・ 33Ｐ ｐ６５／ｐ６５／p５０ 10xストック：ラベル化ｐ６５ 200,000-300 ,000 cpm で補足される『低温（"cold"）』ｐ６５／ｐ５０ 1x10-8（ｐ６５ 5x1 0-9Ｍ＋ｐ５０ 5x10-9Ｍ）であり、おおよその特異的活性が、200,000-300,000 cpm/l pmoleであった。使用する前に３７℃で１時間その混合物をインキュベー トすることによりヘテロ２量体形成を助長する。 ・プロテアーゼ阻害剤のカクテル（1000X）：ＰＢＳ10ml中に、トリプシン阻 害剤10mg（BMB # 109894）、アプロチニン10mg（BMB # 236624）、ベンズアミジ ン25mg（Sigma # B-6506）、ロイペプチン25mg（BMB # 1017128）、ＡＰＭＳＦ1 0mg（BMB # 917575）、及びＮａＶｏ3２mM（Sigma # S-6508）。 ・ビオチン化オリゴ：40x stock アッセイバッファー中1pmoles/lμｌ。ＥＬ ＡＭ ２部位END-126/127：（ビオチン）-CAA CAG ATT GGG GAT TTC CTC GGT TC C ATT GGG GAT TTC CTC CAG C（配列番号７０）；アンチーセンス-GC TGA GAG G AA ATC CCC AAT GGA ACC GAG GAA ATC CCC AAT CTG TTG（配列番号７１）。 ２．アッセイプレートの調製： ・ウェル毎にストックN-アビジン 100μｌで、一晩４℃でコート。 ・ＰＢＳ 200μｌで２回洗浄。 ・阻止バッファー 150μｌでブロック。 ・ＰＢＳ 200μｌで２回洗浄。 ３．アッセイ： ・アッセイバッファー／ウェル40μｌ添加。 ・化合物又は抽出物10μｌ添加。 ・33Ｐ- ｐ６５／ｐ５０（20,000-30,000cpm／0.1pmoles／ウェル＝１×１０- 9 Ｍ最終濃度）10μｌ。 ・室温で１５分間振盪。 ・さらに４５分間室温でインキュベート。 ・アッセイバッファー中のオリゴ混合物（1.0pmole／40μｌ／ウェル）40μｌ 添加。 ・室温で１時間インキュベート。 ・ＰＢＳ 200μｌで４回洗浄することにより反応を停止。 ・シンチレーション・カクテル 150μｌ添加。 ・トップカウント計数。 Ｎｆ−ｋＢ結合アッセイのためのプロトコール（ｐ６５／ｐ６５） １．試薬： ・中性化アビジン：ＰＢＳ中20μｇ／ｍｌ。 ・阻止バッファー：ＰＢＳ中ＢＳＡ5%、0.5%ツウィーン20；１時間、室温。 ・アッセイバッファー：ＫＣｌ100mM、ＨＥＰＥＳ20mM pH7.9、ＥＤＴＡ0.5mM 、グリセロール1%、ＮＰ−４０ 0.5%、ＢＳＡ１mg/ml、ＢＭＥ 50mM、プロテア ーゼ阻害剤のカクテル ・ 33Ｐ ｐ６５／ｐ６５ 10xストック：ラベル化ｐ６５ 200,000-300,000cpm で補足される『低温（"cold"）』ｐ６５ 1x10-8であり、おおよその特異的活性 が、200,000-300,000 cpm/l pmoleであった。 ・プロテアーゼ阻害剤のカクテル（1000X）：ＰＢＳ10ml中に、トリプシン阻 害剤10mg（BMB # 109894）、アプロチニン10mg（BMB # 236624）、ベンズアミジ ン25mg（Sigma # B-6506）、ロイペプチン25mg（BMB # 1017128）、ＡＰＭＳＦ1 0mg（BMB # 917575）、及びＮａＶｏ3２mM（Sigma # S-6508）。 ・ビオチン化オリゴ：40x stock アッセイバッファー中1pmoles/lμｌ。 ＥＬＡＭ ２部位END-126/127：（ビオチン）-CAA CAG ATT GGG GAT TTC CTC G GT TCC ATT GGG GAT TTC CTC CAG C （配列番号７０）；アンチ−センス-GC TG A GAG GAA ATC CCC AAT GGA ACC GAG GAA ATC CCC AAT CTG TTG（配列番号７２ ）。 ２．アッセイプレート調製： ・ウェル毎にストックN-アビジン 100μｌで、一晩４℃でコート。 ・ＰＢＳ 200μｌで２回洗浄。 ・阻止バッファー 150μｌでブロック。 ・ＰＢＳ 200μｌで２回洗浄。 ３．アッセイ： ・アッセイバッファー／ウェル40μｌ添加。 ・化合物又は抽出物10μｌ添加。 ・33Ｐ-ｐ６５（20,000-30,000cpm／0.1pmoles／ウェル＝１×１０-9Ｍ最終濃 度）10μｌ。 ・室温で１５分間振盪。 ・さらに４５分間室温でインキュベート。 ・アッセイバッファー中のオリゴ混合物（1.0pmole／50μｌ／ウェル）40μｌ 添加。 ・室温で１時間インキュベート。 ・ＰＢＳ 200μｌで４回洗浄することにより反応を停止。 ・シンチレーション・カクテル 150μｌ添加。 ・トップカウント計数。 単純性庖疹ウィルス（HERPES SIMPLEX VIRUS）ＶＰ-16結合アッセイのためのプ ロトコール １．試薬： ・中性化アビジン：ＰＢＳ中20μｇ／ｍｌ。 ・阻止バッファー：ＰＢＳ中ＢＳＡ5%、0.5％ツウィーン20；１時間、25℃。 ・アッセイバッファー：ＫＣｌ100mM、ＨＥＰＥＳ20mM pH7.6、ＥＤＴＡ0.25m M、グリセロール1%、ＮＰ−４０ 0.5%、ＢＭＥ 50mM、ＢＳＡ１mg/ml、プロテア ーゼ阻害剤のカクテル ・ 33Ｐ先端（Truncated）ＶＰ−１６／ＨＣＦ／ＯＣＴ−１ 10xストック混合 物：ラベル化ＶＰ−１６ 250,000-300,000cpmで補足される『低温（"cold"）』 ＶＰ−１６ 1x10-8であり、おおよその特異的活性が、250,000-300,000cpm/lpm ole（分子量〜18kD）、ストック混合物中のｍｌ当りＨＣF50μｌ及びＯＴＣ−１ 500ngであった。４℃に設定した微小冷蔵庫に入れた。 ・プロテアーゼ阻害剤のカクテル（1000X）：ＰＢＳ10ml中に、トリプシン阻 害剤10mg（BMB # 109894）、アプロチニン10mg（BMB # 236624）、ベンズアミジ ン25mg（Sigma # B-6506）、ロイペプチン25mg（BMB # 1017128）、ＡＰＭＳＦ1 0mg（BMB # 917575）、及びＮａＶＯ3２mM（Sigma # S-6508）。 ・オリゴヌクレオチドストック：（特定のビオチン化及びsss−ＤＮＡ）。ビ オチン化オリゴ25pmole/ml、ＨＳＶ−ＶＰ−１６ TO876/877：センス−ビオチン Ｔ-GAT AGT CAG GAC TGA ATG CCG TGC ATG CTA ATG ATA TTC TTT GCT TGA TC （配列番号７３）；アンチーセンス-GAT CAA GCA AAG AAT ATC ATT AGC ATG CAC GGC ATT CAG TCC TGA CTA TC （配列番号７４）及びアッセイバッファー中sss- ＤＮＡ 2.5g/ml。 ２．アッセイプレートの調製： ・ウェル毎にストックN-アビジン 100μｌで、一晩４℃でコート。 ・ＰＢＳ 200μｌで２回洗浄。 ・阻止バッファー 150μｌでブロック。 ・ＰＢＳ 200μｌで２回洗浄。 ３．アッセイ： ・アッセイバッファー／ウェル40μｌ添加。 ・化合物又は抽出物10μｌ添加。 ・33Ｐ- ＶＰ-１６、ＨＣＦ、ＯＣＴ−１ストック（25,000-30,000 cpm／0.1p moles／ウェル＝１×１０-9Ｍ最終濃度、ＨＣＦ0.5μｌ、及びＯＣＴ−１５ng） 10μｌ。 ・２５℃で１５分間振盪。 ・さらに４５分間２５℃でインキュベート。 ・オリゴ混合物（ビオチン化特定オリゴ1pmole及びsss-ＤＮＡ１μg）40μｌ 添加。 ・２５℃で１時間インキュベート。 ・ＰＢＳ 200μｌで４回洗浄することにより反応を停止。 ・シンチレーシヨン・カクテル 150μｌ添加。 ・トップカウント計数。 ４．すべてのアッセイのコントロール（各々のプレートに局在）： ａ．非特異的結合（オリゴ添加せず） ｂ．80％インキュベーションでの特定溶解性オリゴ ＨＩＶ ＴＡＴ結合アッセイのためのプロトコール １．試薬： ・中性化アビジン：ＰＢＳ中20μｇ／ｍｌ。 ・阻止バッファー：ＰＢＳ中ＢＳＡ5%、0.5%ツウィーン20；１時間、室温。 ・アッセイバッファー：ＫＣｌ100mM、ＨＥＰＥＳ20mM pH7.9、ＥＤＴＡ0.5mM 、グリセロール1%、ＮＰ−４０ 0.5%、ＢＳＡ１mg/ml、ＢＭＥ 50mM、プロテア ーゼ阻害剤のカクテル ・ 33ＰＴＡＴ10xストック：ラベル化ＴＡＴ200,000-300,000cpmで補足される 『低温（"cold"）』ｐ６５ 1x10-8（ｐ６５ 5x10-9Ｍ＋ｐ５０ 5x10-9Ｍ）で あり、おおよその特異的活性が、200,000-300,000cpm/1 pmoleであった。 ・プロテアーゼ阻害剤のカクテル（1000X）：ＰＢＳ10ml中に、トリプシン阻 害剤10mg（BMB # 109894）、アプロチニン10mg（BMB # 236624）、ベンズアミジ ン25mg（Sigma # B-6506）、ロイペプチン25mg（BMB # 1017128）、ＡＰＭＳＦ1 0mg（BMB # 917575）、及びＮａＶｏ3２mM（Sigma # S-6508）。 ・ビオチン化オリゴ：40x stock アッセイバッファー中1 pmoles/1μｌ。 ＴＡＲ ＲＮＡ部位：（ビオチン）-GGG TCT CTC TGG TTA GAC CAG ATC TGA GCC TGG GAG CTC TCT GGC TAA CTA GGG AAC CCA（配列番号５９） ２．アッセイプレートの調製： ・ウェル毎にストックN-アビジン 100μｌで、一晩４℃でコート。 ・ＰＢＳ 200μｌで２回洗浄。 ・阻止バッファー 150μｌでブロック。 ・ＰＢＳ 200μｌで２回洗浄。 ３．アッセイ： ・アッセイバッファー／ウェル40μｌ添加。 ・化合物又は抽出物10μｌ添加。 ・33Ｐ-ｐＴＡＴ（20,000-30,000 cpm／0.1pmoles／ウェル＝１×１０-9Ｍ最 終濃度）10μｌ。 ・室温で１５分間振盪。 ・さらに４５分間室温でインキュベート。 ・アッセイバッファー中のビオチン化オリゴ（1.0pmole／50μｌ／ウェル）40 μｌ添加。 ・室温で１時間インキュベート。 ・ＰＢＳ 200μｌで４回洗浄することにより反応を停止。 ・シンチレーション・カクテル 150μｌ添加。 ・トップカウント計数。 各々個々の文献又は特許出願が特に各々、参考として含まれるべきであると示 されていたとしても、本明細書中で引用した全ての文献及び特許出願は参考とし て本明細書内に含まれる。先述の発明は、鮮明な理解のために、いくらか詳細に 説明したが、当業者であれば、本発明の説明から、添付の請求の範囲の精神又は 範囲を離れないで、そこからある変形及び修正を加えることができるであろう。 配列表 （1）一般的な情報： （i）出願人：チュラリック社（TULARIK，INC．） （ii）発明の名称：転写因子−ＤＮＡ結合アッセイ （iii）配列の数：７４ （iv）通信住所： （A）住所：フレアー、ホッフバッハ、テスト、アルブリットン・ア ンド・ヘルベルト （FLEHR，HOHBACH，TEST，ALBRITTON & HERBERT） （B）街：４エンバルカデロ・センター、スイテ3400 （4Embarcadero Center，Suite 3400） （C）市：サンフランシスコ（San Francisco） （D）州：カリフォルニア（California） （E）国：USA （F）郵便番号（ZIP）：94111-4187 （v）コンピュータ読取りフォーム： （A）媒体タイプ：フロッピーディスク （B）コンピュータ：IBM PC コンパチブル （C） オペレーティング・システム：PC-DOS/MS-DOS （D） ソフトウェア：パテントイン・リリース#1.0、 バージョン#1.25 （PatentIn Release #1.0，Version #1.25） （vi）出願データ： （A）出願番号： （B）出願日： （C）クラス： （vii）優先権出願データ： （A）出願番号：US 08/235,503 （B）出願日：1994年4月29日 （viii）代理人（ATTORNEY/AGENT）情報： （A）名前：オスマーン・リチャード（Osman，Richard A） （B）登録番号（REGISTRATION NUMBER）：36,627 （C）参照／事件番号 （REFERENCE/DOCKET NUMBER）：FP-59232-PC/RAO （ix）テレコミュニケーション情報： （A）電話：（415）781-1989 （B）テレファックス：（415）398-3249 （C）テレックス：910 277299 （2）配列番号１の情報： （i）配列の性質： （A）配列の長さ：１４塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ｃＤＮＡ （xi）配列：配列番号１： （2）配列番号２の情報： （i）配列の性質： （A）配列の長さ：１２塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ｃＤＮＡ （xi）配列：配列番号２： （2）配列番号３の情報： （i）配列の性質： （A）配列の長さ：１０塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ｃＤＮＡ （xi）配列：配列番号３： （2）配列番号４の情報： （i）配列の性質 （A）配列の長さ：１５塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ｃＤＮＡ （xi）配列：配列番号４： （2）配列番号５の情報： （i）配列の性質： （A）配列の長さ：１６塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ｃＤＮＡ （xi）配列：配列番号５： （2）配列番号６の情報： （i）配列の性質： （A）配列の長さ：１６塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ｃＤＮＡ （xi）配列：配列番号６： （2）配列番号７の情報： （i）配列の性質： （A）配列の長さ：１６塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ｃＤＮＡ （xi）配列：配列番号７： （2）配列番号８の情報： （i）配列の性質： （A）配列の長さ：１８塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ｃＤＮＡ （xi）配列：配列番号８： （2）配列番号９の情報： （i）配列の性質： （A）配列の長さ：１３塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ｃＤＮＡ （xi）配列：配列番号９： （2）配列番号１０の情報： （i）配列の性質： （A）配列の長さ：１９塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ｃＤＮＡ （xi）配列：配列番号１０： （2）配列番号１１の情報： （i）配列の性質： （A）配列の長さ：１９塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ｃＤＮＡ （xi）配列：配列番号１１： （2）配列番号１２の情報： （i）配列の性質： （A）配列の長さ：１０塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ｃＤＮＡ （xi）配列：配列番号１２： （2）配列番号１３の情報： （i）配列の性質： （A）配列の長さ：１５塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ｃＤＮＡ （xi）配列：配列番号１３： （2）配列番号１４の情報： （i）配列の性質： （A）配列の長さ：１３塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ｃＤＮＡ （xi）配列：配列番号１４： （2）配列番号１５の情報： （i）配列の性質： （A）配列の長さ：１５塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ｃＤＮＡ （xi）配列：配列番号１５： （2）配列番号１６の情報： （i）配列の性質： （A）配列の長さ：１５塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ｃＤＮＡ （xi）配列：配列番号１６： （2）配列番号１７の情報： （i）配列の性質： （A）配列の長さ：１８塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ｃＤＮＡ （xi）配列：配列番号１７： （2）配列番号１８の情報： （i）配列の性質： （A）配列の長さ：１９塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ｃＤＮＡ （xi）配列：配列番号１８： （2）配列番号１９の情報： （i）配列の性質： （A）配列の長さ：１３塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ｃＤＮＡ （xi）配列：配列番号１９： （2）配列番号２０の情報： （i）配列の性質： （A）配列の長さ：１３塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ｃＤＮＡ （xi）配列：配列番号２０： （2）配列番号２１の情報： （i）配列の性質： （A）配列の長さ：１１塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ｃＤＮＡ （xi）配列：配列番号２１： （2）配列番号２２の情報： （i）配列の性質： （A）配列の長さ：１２塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ｃＤＮＡ （xi）配列：配列番号２２： （2）配列番号２３の情報： （i）配列の性質： （A）配列の長さ：１５塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ｃＤＮＡ （xi）配列：配列番号２３： （2）配列番号２４の情報： （i）配列の性質： （A）配列の長さ：１０塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ｃＤＮＡ （xi）配列：配列番号２４： （2）配列番号２５の情報： （i）配列の性質： （A）配列の長さ：１６塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ｃＤＮＡ （xi）配列：配列番号２５： 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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ストルロヴィッチ バータ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94080 サウス サン フランシスコ イ ースト グランド アベニュー 270

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．遺伝子転写のレベルで活性な医薬のための化学ライブラリーのスクリーニン グ方法であって、転写因子の一部及びラベルを有するラベル化したタンパク質、 核酸接合体、候補医薬、及び固体基質に固定した受容体を組合わせることにより 混合物を形成し、前記核酸接合体が前記受容体と特異的に結合することができる ヌクレオチド配列及びリガンドを有し、前記受容体が前記リガンドに結合し、か つ前記候補医薬が存在しない場合に、前記ラベル化タンパク質が前記核酸接合体 に配列特異的に結合する条件下で該混合物をインキュベートし、前記ラベル化タ ンパク質が前記核酸接合体と配列特異的に結合しないとき、前記ラベル化タンパ ク質を有する前記混合物の断片を前記固体基質から分離し、前記固体基質上の前 記ラベルの有無を検知し、前記固体基質上の前記ラベルが存在しないことにより 、前記候補医薬が遺伝子転写のレベルで医薬的に活性であることを示すスクリー ニング方法。 ２．前記ラベル化タンパク質が、少なくとも結合親和力１０6Ｍ-1で、前記核酸 接合体と直接配列特異的に結合できる請求項１記載の方法。 ３．前記混合物が、前記ラベル化タンパク質、前記核酸接合体、前記候補医薬、 固体基質上に固定した前記受容体及び補助タンパク質部分を組合わせることによ って形成される請求項１記載の方法。 ４．前記転写因子部分がウィルス性転写因子部分である請求項１記載の方法。 ５．前記転写因子部分が細菌性転写因子部分である請求項１記載の方法。 ６．前記転写因子部分が、単子葉植物又は双子葉植物転写因子部分である請求項 １記載の方法。 ７．前記転写因子部分が、真菌性転写因子部分である請求項１記載の方法。 ８．前記受容体がアビジンであり、前記リガンドがビオチンである請求項１記載 の方法。 ９．前記形成工程及び前記分離工程が、少なくとも一部分、軸回転可能アームを 有するコンピュータ制御エレクトロメカニカル・ロボットにより行われ、前記固 体基質がマイクロタイター・プレートのウェルの一部である請求項１記載の 方法。 10．固体基質、転写因子の一部及びラベルを含有するラベル化タンパク質、候補 医薬、前記固体基質に固定した受容体、ヌクレオチド配列を有する核酸接合体及 び前記受容体と特異的に結合することができるリガンドを含む、遺伝子転写のレ ベルで活性な医薬のための化学ライブラリーをスクリーニングするためのキット 。
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