JPH08506897A - 発光蛋白質複合体の調製法およびその使用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、未誘導化発光蛋白質の発光活性の全てもしくは相当部分を保持する発光蛋白質の複合体の合成法を含む。本発明に従うと、発光蛋白質を、ストレプトアビジン／アビジン、糖蛋白質、レクチン、ホルモン、抗原、薬物、抗体およびその抗原結合性断片、もしくは他の選択的に結合可能な試薬を含む多様な結合性試薬と、化学的架橋結合法により複合体を形成させることができる。本発明はまた、この方法により生成される複合体、およびこのような複合体の使用法をも含む。

Description

【発明の詳細な説明】 発光蛋白質複合体の調製法およびその使用法技術分野 本発明は、ラベル化特異的結合アッセイ試薬に、そしてより具体的には結合性 分子に結合させてある発光蛋白質を含む特異的結合アッセイ試薬に関する。発明の背景 生物発光は生物学的分子による光の放射を意味する。生物発光蛋白質は、ルシ フェリンの酸化の触媒作用を行って光を放射させかつオキシルシフェリンを放出 させるルシフェラーゼ類、もしくはルシフェリンの酸化の触媒作用を行って光は 放射させるが酸化物質は放出させない発光蛋白質類のような酵素そのものである ことができる。生物発光蛋白質の例には、有櫛動物門の動物であるムネミオプシ ス（Ｍｎｅｍｉｏｐｓｉｓ）（ムネミオプシン（ｍｎｅｍｉｏｐｓｉｎ））およ びベロエ オバタ（Ｂｅｒｏｅ ｏｖａｔａ）（ベロビン（ｂｅｒｏｖｉｎ）） から単離された酵素、腔腸動物門の動物であるアエクオリア（Ａｅｑｕｏｒｉａ ）（アエクオリン（ａｅｑｕｏｒｉｎ））、オベリア（Ｏｂｅｌｉａ）（オベリ ン（ｏｂｅｌｉｎ））、ペラギア（Ｐｅｌａｇｉａ）から単離される酵素、なら びにレニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）（レニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）のルシフェラーゼ） のような動物から単離されるルシフェラーゼ類、ならびに軟体動物門の動物であ るフォラス（Ｐｈｏｌａｓ）（フォラシン（ｐｈｏｌａｓｉｎ））から単離され る酵素が含まれる。生物発光蛋白 質はまた、シプリディナ（Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ）のような貝虫亜網の動物からも 単離することができる。 診断用アッセイにおけるラベル化物として特に有用な生物発光蛋白質は発光蛋 白質アエクオリンである。アエクオリンは腔腸動物門の動物のルシフェリンのオ キシルシフェリンへの酸化の触媒作用を行い、青色光（ラムダー_max＝４６９ｎ ｍ）を付随して発生する。アエクオリンは、強固に結合する腔腸動物門の動物の ルシフェリンおよび酸素を各１モルずつ含むＭ_r２２．０００の一本鎖のポリペ プチド鎖であるアポアエクオリンからできている。この複合体からの光放出はカ ルシウムイオンの結合時に開始する。アエクオリンは単一のターンオーバー現象 すなわち「閃光反応」の触媒作用を行い、これは約１０秒間持続する。 この反応の収量が比較的高いために、アエクオリンを市販品として入手可能な ルミノメーターを用いてアトモルレベル（１０−¹⁸モル）で検出することができ る。カルシウムを必要とすることのため、および非常に低いレベルでの検出が可 能であることのために、アエクオリンは細胞内カルシウムのレベルを記録するの に有用であることが判明している。非放射性同位元素性レポーター分子としてア エクオリンを用いることの有望な効用は最近、組換え蛋白質が利用可能になって 初めて認識されたばかりである（Ｃｏｒｍｉｅｒ ｅｔ ａｌ．により総説がま とめられている。Ｃｏｒｍｉｅｒ、Ｍ．Ｊ．Ｐｒａｓｈｅｒ ＤＣ Ｌｏｎｇｉ ａｔｕ、Ｍ ＆ ＭｃＣａｎｎ、Ｒ．Ｏ．１９８９、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ． Ｐ ｈｏｔｏｂｉｏｌ． ４９：５０９−５１２）。 つい最近になるまで、ホタルであるフォティヌス ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕ ｓ ｐｙｒａｌｉｓ）のルシフェラーゼの特性に基づき、全て の生物発光蛋白質は本質的に不安定かつ複雑であり、このためにそれらはレポー ター分子には不適切なものとなっていると当該分野では一般的に考えられていた （Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ ＆ ＭｃＧｒａｔｈ、１９８９ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ ｅｓｃｅｎｃｅ Ｌｉｇｈｔｓ Ｕｐ．Ｎａｔｕｒｅ ３３８、５９９−６００ ）。しかしながら、アエクオリンのビオチニル化誘導体はそのもともとの活性の ８０パーセントを上回る活性を保持することが最近示され、そしてストレプトア ビジンと組み合わせて用いる場合には、マイクロタイターウエルもしくは膜支持 体に固定化させた蛋白質抗原およびＤＮＡを初めとするビオチニル化標的のナノ グラムからサブナノグラムまでを検出することが証明されている（Ｓｔｕｌｔｓ ｅｔ ａｌ．、１９９２、Ｒｉｖｅｒａ，Ｈ．、ＭｃＣａｎｎ，Ｒ．Ｏ．、Ｏ ’Ｋａｎｅ Ｄ．、Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｒ．Ｄ．、Ｃｏｒｍｉｅｒ Ｍ．Ｊ．、 Ｓｍｉｔｈ Ｄ．Ｆ．Ｕｓｅ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｂｉｏｔｉｎｙ ｌａｔｅｄ−Ａｅｑｕｏｒｉｎ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ ａｎｄ Ｍｅｍ ｂｒａｎｅ−Ｂａｓｅｄ Ａｓｓａｙｓ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒ ｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｐｏａｅｑｕｏｒｉｎ Ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃ ｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１、１４３３−１４４２）。 その上、ビオチニル化アエクオリンはまた、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ）抗原用の捕捉免疫アッセイ（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．、１９９１、Ａ Ｍｉ ｃｒｏｐｌａｔｅ Ａｓｓａｙ Ｆｏｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｏｌｕｔ ｉｏｎ Ｐｈａｓｅ Ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｒｅａｃｔｉ ｏｎｓ：Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｃｏｎｓｔａｎ ｔｓ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９９、２８６−２９２）、ならびにグリコシルトランスフェ ラーゼ類および糖蛋白質類用の固相アッセイ（Ｍｅｎｇｅｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ ．、１９９１、Ａ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ａｓｓａｙ Ｆｏｒ Ａｎａｌｙｓ ｉｓ ｏｆ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｐｈａｓｅ Ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅ ｒａｓｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ：Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｋｉｎｅ ｔｉｃ Ｃｏｎｓｔａｎｔｓ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９、２８６−２ ９２）、（Ｚａｔｔａ ｅｔ ａｌ．、１９９１、Ａ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｆｏｒ β１，４ Ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ Ｔｒａｓｆｅｒａｓ ｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ Ｕｓｉｎｇ Ｒｅｃｏ ｍｂｉｎａｎｔ Ａｅｑｕｏｒｉｎ、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９４、１ ８５−１９１）において成功裏に用いられている。 アエクオリンのビオチニル化誘導体は多様なアッセイ型において良好に作用す るものの、化学的な架橋形成法により、レセプター、ホルモン、レクチン、抗体 およびそれらの結合性断片、抗原、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、なら びに糖蛋白質を初めとする多様な選択的結合可能試薬との組換えアエクオリンの 直接複合体を合成することが有利であろう。このような複合体は、インキュベー ション段階の数を減少するか、あるいはアビジン／ストレプトアビジン−ビオチ ン相互作用を完全に除去することにより生物学的標的のより迅速な検出を可能に するであろう。 ヘテロ二官能性試薬を用いる抗体のＦＡＢ断片に対するアポアエクオリンの直 接的な化学的架橋形成が報告されている（Ｅｒｉｋａｋｕ ｅｔ ａｌ．、１９ ９１、Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｉｍｍｕｎｏ ａｓｓａｙ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｆａｂ’−Ｐｈｏｔｏｐｒ ｏｔｅｉｎ Ａｅｑｕｏｒｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏ ｐｈｙｓ ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７４、１３３１−１３３６）。この抗体複 合体はマレイミド基でのアポアエクオリン上のアミノもしくはチオール基の修飾 に基づく化学的架橋形成技術を用いて調製された。不幸なことに、この架橋形成 法は未誘導化アエクオリンの単に約１０パーセントの活性を保持するアポアエク オリン−抗体複合体をもたらすに過ぎない。（Ａｂｓｔ．、ｐ．１３３１ Ｅｒ ｉｋａｋｕ ｅｔ ａｌ．、１９９１、を参照せよ）。 従って必要とされるのは、実質的に発光蛋白質活性を保存する発光蛋白質複合 体を調製するための直接的な化学的架橋形成法である。発明の要約 本発明は、未誘導化発光蛋白質の発光活性の実質的部分を保持する発光蛋白質 の複合体の合成法を含む。本発明に従うと、発光蛋白質を、ストレプトアビジン ／アビジン、レクチン、酵素、糖蛋白質、ペプチド、ホルモン、レセプター、抗 原、薬剤、抗体およびそれらの抗原結合性断片、ＲＮＡ、ＤＮＡ、オリゴヌクレ オチド、あるいは他の選択的結合可能分子もしくは組成物を含むがそれらには限 定されない多様な結合性試薬と、化学的架橋形成法により架橋形成させることが できる。 本発明はまた、この方法により生成される複合体、ならびにある被検体の試料 中での存在および量を決定するための結合アッセイにおけるこのような複合体の 使用法をも含む。本発明の複合体形成法は、複合体形成予定の発光蛋白質内へ追 加のスルフヒドリル基を導入し、ある結合性試薬を化学的に修飾してその試薬を スルフヒドリル反応性にさせ、そし てそのスフルヒドリル活性化発光蛋白質をそのスルフヒドリル反応性結合性試薬 と反応させて本発明の発光蛋白質−結合性試薬複合体を形成する段階を含む。こ の方法により、発光活性を保持する安定な発光蛋白質−結合性試薬複合体が得ら れる。 従って、生物発光活性を保持する安定な発光蛋白質−結合性試薬複合体を生成 するための方法を提供することは本発明の目的である。 生物発光活性を保持する安定な発光蛋白質−結合性試薬複合体を提供すること は本発明の別の目的である。 生物発光活性を保持するアポアエクオリンもしくはアエクオリンの安定な複合 体の生成のための方法を提供することは本発明の更に別の目的である。 生物発光活性を保持するアポアエクオリンもしくはアエクオリンの安定な複合 体を提供することは本発明の更に別の目的である。 一つもしくは複数のアミノ基を含む結合性試薬を、得られる複合体が生物発光 活性を保持するように少なくとも一つの追加のスルフヒドリル基を含むように修 飾した発光蛋白質に対して複合体形成させることができる方法を提供することは 本発明の更に別の目的である。 結合性試薬が抗体である安定な発光蛋白質複合体を提供することも、やはり本 発明の目的である。 結合性試薬が抗原である安定な発光蛋白質複合体を提供することも、やはり本 発明の目的である。 結合性試薬がレクチンである安定な発光蛋白質複合体を提供することは本発明 の目的である。 結合性試薬がレセプターである安定な発光蛋白質複合体を提供するこ とは本発明の別の目的である。 結合性試薬がリガンドである安定な発光蛋白質複合体を提供することも、やは り本発明の目的である。 結合性試薬がオリゴヌクレオチドである安定な発光蛋白質複合体を提供するこ とも、やはり本発明の目的である。 本発明のこれらの目的および他の目的ならびに利点は、開示される態様および 添付される請求の範囲の以下に記載される詳細な記述の再考査後には明らかにな るであろう。図面の簡単な記述 図１は、発生する光の量により測定した際のスルホ−ＳＭＣＣの増加量での処 理によるアエクオリンの不活化のグラフ的表示である。 図２は、発生する光の量により測定した際のアエクオリンにおける２−イミノ チオランの有害効果の非存在のグラフ的表示である。 図３は、発生する光の量により測定した際の免疫化したヤギの抗−マウス抗体 に特異的なアエクオリン−（マウス抗体）複合体結合のグラフ的表示である。 図４は、発光およびＯ．Ｄ．₂₈₀吸収により測定した際のアエクオリン−抗体 複合体の精製を具体的に説明するゲル−濾過クロマトグラフィー曲線である。 図５は、発光および２８０ｎｍでの光学密度（Ｏ．Ｄ．₂₈₀）により測定した 際のアエクオリン−抗体複合体の精製を具体的に説明するＤＥＡＥイオン交換ク ロマトグラフィー曲線である。 図６は、競合的免疫アッセイにおけるチロキシン（Ｔ４）に対するアエクオリ ン−チロキシン（Ｔ４）複合体の結合性のグラフ表示である。発明の詳細な記述 本明細書に用いられる重要な用語は以下のように定義される。 本明細書に用いられる用語「発光蛋白質」は、いずれかの生物発光蛋白質、す なわち発光可能ないずれかの蛋白質、あるいはルミネセンス反応の（すなわち、 光を発生する生物発光蛋白質介在反応）の一構成成分であるものを意味する。用 語「発光蛋白質」には、ルシフェリン類のような生物発光酵素類およびアエクオ リンのような発光蛋白質類が含まれる。発光蛋白質の例には、アポアエクオリン 、アエクオリン、アポ−オベリン、オベリン、アポ−ムネミオプシン、ムネミオ プシン、アポ−ベロビン、ベロビン、フォラシン、ならびに生物体ペラギア（Ｐ ｅｌａｇｉａ ）、シプリディナ（Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ）のような貝虫亜網の動物 から単離される生物発光蛋白質類、ならびにレニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）のルシフ ェラーゼが含まれるがそれらに限定はされない。発光蛋白質のアポ−形態は、そ の蛋白質がルシフェリンに結合していることを意味する。それとは対照的に、発 光蛋白質の非アポ−形態は、ルシフェリンがその蛋白質に結合していることを意 味する。 本明細書に用いられる用語「アポアエクオリン」は、引用により本明細書に取 り込まれるＰｒａｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃ ｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡｓ Ｅｎｃ ｏｄｉｎｇ Ａｅｑｕｏｒｉｎ Ｉｓｏｔｙｐｅｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 、ｖｏｌｕｍｅ ２６、ｎｕｍｂｅｒ ５ １３２６−１３３２により例として 示される組換えアポアエクオリンを初めとする、アポアエクオリン配列として当 該技術分野に一般的に知られる関連アミノ酸配列のいずれかを意味する。用語「 アポアエ クオリン」はまた、部位特異的突然変異誘発により変化させた蛋白質のような修 飾化蛋白質を含むことも意図される。アポアエクオリンは、ルシフェリン（これ が強固に会合するとアエクオリン複合体が形成される）を含まない単独の蛋白質 配列を意味する。 本明細書に用いられる用語「アエクリン」は、ルシフェリンおよび酸素が結合 する天然に得られるものかあるいは組換え体のいずれかのアポアエクオリン蛋白 質でできている複合体を意味する。この複合体は、カルシウムのような二価カチ オンによりトリガー反応が起こる（ｔｒｉｇｇｅｒ）際に光を発生することが可 能である。本明細書で用いられる用語「スルフヒドリル−活性化発光蛋白質」は 、未修飾の発光蛋白質中に存在するよりも少なくとも一つ多いスルフヒドリル基 を含むように化学的に修飾された先に定義したような発光蛋白質を意味する。 本明細書で用いられる用語「結合性試薬」は、アッセイ予定の被検体に特異的 に結合可能であって化学修飾に利用可能なアミノ基を有する化合物を意味する。 アッセイ予定の被検体はいずれかの選択的結合可能物質であることができる。結 合性試薬の例には、ストレプトアビジン／アビジン、レクチン、酵素、糖蛋白質 、ペプチド、ホルモン、レセプター、抗原、薬物、抗体およびそれらの抗原結合 性断片、ＲＮＡ、ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、あるいは他の選択的結合可能分 子もしくは組成物が含まれるがそれらには限定されない。 本明細書で用いられる用語「スルフヒドリル−活性化」もしくは「スルフヒド リル−活性化発光蛋白質」は、発光蛋白質中にもともと内在するスルフヒドリル 基に加えて少なくとも一つのスルフヒドリル基を含むように修飾してある発光蛋 白質を意味する。スルフヒドリル−活性化発 光蛋白質をスルフヒドリル−反応性結合性試薬と反応させて本発明の複合体を形 成することができる。 本明細書で用いられる用語「スルフヒドリル−反応性」もしくは「スルフヒド リル−反応性の結合性試薬」は、スルフヒドリル−活性化発光蛋白質上のスルフ ヒドリル基と反応して発光蛋白質−結合性試薬複合体を形成することが可能な結 合性試薬を意味する。ある種のスルフヒドリル−反応性の結合性試薬はマレイミ ド基を含むように予め修飾してあるものを意味し、そしてこれを「マレイミド− 活性化」と称する。別の種類のスルフヒドリル−反応性の結合性試薬はα−ハロ カルボニル基を含むように修飾してあるものである。 本明細書で用いられる用語「発光蛋白質−結合性試薬複合体」もしくは「複合 体」は、スルフヒドリルを基にする架橋形成反応を介して共有結合的に結合する 、発光蛋白質と結合性試薬との先に定義したような複合体を意味する。 本発明は、発光蛋白質と、ストレプトアビジン／アビジン、レクチン、ホルモ ン、抗原、薬物、抗体およびそれらの抗原結合性断片、もしくは他の結合性試薬 を初めとする多様な結合性試薬との化学的架橋形成法による複合体の合成法を含 む。本発明はまた、この方法により生成される発光蛋白質−結合性試薬複合体を も含む。 本発明の複合体形成法には、複合体形成予定の発光蛋白質内へ追加のスルフヒ ドリル基を導入し、ある結合性試薬を化学的に修飾してその試薬をスルフヒドリ ル反応性にさせ、そしてそのスフルヒドリル活性化発光蛋白質をそのスルフヒド リル反応性の結合性試薬と反応させて本発明の発光蛋白質−結合性試薬複合体を 形成する段階が含まれる。この方法 により発光活性を保持する安定な発光蛋白質−結合性試薬複合体が産生される。 この理論に限定されることは望まないものの、発光蛋白質のスルフヒドリル活 性化は、生物発光活性に必須である内在性スルフヒドリル基を保護するのに働く ということが推定される。従って後続の、スルフヒドリル−活性化発光蛋白質中 のスルフヒドリル基を介する結合性試薬への架橋形成は生物発光活性に実質的に 悪影響を及ぼすことがない。これは、非スルフヒドリル−活性化発光蛋白質の従 来の技術の複合体に勝る実質的な改善である。 本発明で用いられる発光蛋白質には、アポアエクオリン、アエクオリン、オベ リン、ムネミオプシン、ベロビン、フォラシン、ルシフェラーゼ類、ならびにペ ラギア（Ｐｅｌａｇｉａ）、シプリディナ（Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ）、および貝虫 亜網の動物から単離される発光蛋白質類が含まれるがこれらには限定されない。 発光蛋白質類を適切な試薬での化学的修飾によりスルフヒドリル活性化させて 、未修飾の発光蛋白質上に存在するよりも少なくとも一つ多いスルフヒドリル基 を付加する。この発光蛋白質に複数のスルフヒドリル基を付加することが好まし い。このようなスルフヒドリル活性化試薬の例には、２−イミノチオラン（トロ ート試薬（Ｔｒａｕｔ’ｓ ｒｅａｇｅｎｔ））、Ｎ−スクシンイミジル Ｓ− アセチルチオ酢酸エステル（これは後にヒドロキシルアミンでの脱保護化をおこ なう）が含まれるがこれらには限定されない。さらに、無水Ｓ−アセチルメルカ プトコハク酸（ＳＡＭＳＡ）、Ｎ−スクシンイミジル−３（２−ピリジルジチオ ）プロピオン酸エステル（ＳＰＤＰ）、およびスルホン化されているかも しくは伸長用スペーサーアームを有するそれらの誘導体類、あるいは４−スクシ ンイミジルオキシカルボニル α−メチル α（２−ピリジルジチオ）−トルエ ン（ＳＭＰＴ）を使用することができ、これら各々を還元試薬での処理により脱 保護化する。好ましいスルフヒドリル活性化試薬は２−イミノチオランである。 本発明で使用することができる結合性試薬には、ストレプトアビジン／アビジ ン、レクチン、酵素、糖蛋白質、ペプチド、ホルモン、レセプター、抗原、薬物 、抗体、ＲＮＡ、ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、あるいは他の選択的結合可能分 子もしくは組成物が含まれるがこれらには限定されない。好ましい結合性試薬は 抗体および抗原である。結合性試薬を化学的に修飾してそれらをスルフヒドリル −反応性にする。スルフヒドリル−反応性ヘテロ二官能性架橋形成試薬およびス ルフヒドリル−反応性モノ二官能性架橋形成試薬がこの目的に用いられる。 マレイミド基を誘導するヘテロ二官能性試薬の例には、スクシンイミジル ４ −（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン（ＳＭＣＣ）、スルホスクシンイミ ジル ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ スルホ−ＳＭＣＣ）、ｍ−マレイミド ベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイ ミドエステル（ＭＢＳ）およびＭＢＳのスルホン化誘導体（スルホ−ＭＢＳ）、 スクシンイミジル ４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）お よびそのスルホン化誘導体（スルホ−ＳＭＰＢ）、ならびにスクシンイミジル− ６−（Ｎ−マレイミド− −ヘキサノエート）（ＭＨＳ）が含まれるがそれらに は限定されない。 α−ハロカルボニル基を導入するのに有用なヘテロ二官能性試薬の例 には、スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＬＡＢ ）およびそのスルホン化誘導体（スルホ−ＳＬＡＢ）、ならびにＮ−ヒドロキシ スクシンイミジルブロモアセテート（ＨＳＢＡ）が挙げられるがそれらには限定 されない。 スルフヒドリル反応性架橋形成に有用なホモ二官能性試薬の例には、ビス（マ レイミド）−メチルエーテル（ＢＭＭＥ）およびビスマレイミドヘキサン（ＢＭ Ｈ）が含まれるがそれらには限定されない。好ましい試薬はスルホスクシンイミ ジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ス ルホ−ＳＭＣＣ）である。 本発明の好ましい態様においては、組換えアエクオリンを２−イミノチオラン で化学的に修飾し、それをスルフヒドリル−活性化させる。これとは別に、アッ セイ予定の被検体に特異的に結合することが可能な抗体のような結合性試薬をヘ テロ二官能性架橋形成剤のスルホ−ＳＭＣＣで化学的に修飾して、その結合性試 薬をスルフヒドリル−反応性にさせる。その後にそのスルフヒドリル−活性化発 光蛋白質とそのスルフヒドリル−反応性の結合性試薬を、発光蛋白質−結合性試 薬複合体を形成するための結合を促進するのに十分な条件下で反応させる。 得られる複合体を、所望される場合には当業者に一般的に知られる方法により 、その反応混合物の未反応構成成分から分離することができる。例えば発光蛋白 質−結合性試薬複合体は一般的に、単独の発光蛋白質もしくは結合性試薬のいず れと比較してもサイズがかなり大きいであろう。そのため、それらは簡単に、サ イズを基にして複合混合物の構成成分を分離するクロマトグラフィーカラムを通 す分離により精製することができる。その上複合体を、イオン交換クロマトグラ フィーのような他の方 法により分離することができる。このような分離技術は当該技術分野において良 く知られている。 本発明の発光蛋白質−結合性試薬複合体を多様な結合アッセイに用いて、ある 結合性試薬に選択的に結合することが可能な被検体の存在もしくは量を測定する ことができる。結合アッセイの例には、遂次捕捉アッセイ（サンドイッチアッセ イとしても知られている）、同時捕捉アッセイ、競合的アッセイ、およびＤＮＡ もしくはＲＮＡへのオリゴヌクレオチド結合のような核酸ハイブリッド形成があ る。このようなアッセイは一般的には結合アッセイと称されるものの、抗体が関 連する場合にはこれらは免疫アッセイと称されることがある。 ある態様においては本発明のアッセイを、被検体と結合可能な発光蛋白質−結 合性試薬複合体を測定予定の被検体を含むことが疑われる試料と接触させ、その 複合体と被検体とを互いに結合させて発光蛋白質−結合性試薬−被検体複合体を 形成させ、その複合体を残りの試料から分離し、そしてその発光蛋白質でルミネ センス反応を開始させ、次いで発生する光を測定することにより被検体の存在お よび量を決定することにより実施する。 別法では被検体の存在および量を、未知の量の被検体を含む試料を既知の量の 被検体−発光蛋白質複合体と合わせ、そしてこの混合物をその被検体用の結合相 手の限定量に結合させる競合的結合アッセイにおいて決定することができる。こ の被検体−発光蛋白質複合体は、被検体の結合相手への結合についてその試料中 の被検体と競合する。被検体の結合相手に結合する複合体の量は、ルミネセンス 反応を開始させかつ放出される光を測定することにより決定する。その後にこの 試料中の被検体の 量を、生じる競合的結合の量の関数として決定する。 多くの診断用アッセイは免疫アッセイ技術を利用しており、そして本発明の発 光蛋白質−結合性試薬複合体は、その結合性試薬が抗体である場合に調製するこ とができる。選択される抗体はモノクローナルもしくはポリクローナルのいずれ かであることができ、かつアッセイ予定の被検体に特異的に結合することが可能 である。体液を例とするアッセイ予定の試料を、マイクロタイターウエルのよう な固体支持体に固定化されていて、抗体であることが良くある捕捉試薬と接触さ せる。この試料中の被検体はその捕捉試薬により選択的に捕捉され、そして非結 合性試料を洗浄して除去する。その後に発光蛋白質−抗体複合体を、特異的に結 合するようにその捕捉化被検体と接触させる。過剰の発光蛋白質−抗体複合体を 洗浄して除去する。別法ではこの捕捉アッセイを、全ての結合性構成成分を同時 に混合することにより実施する。 結合した複合体の量は、その複合体により放射される光の量を測定することに より決定する。アエクオリンの場合には、発光はカルシウムのような二価のカチ オンの添加により引き起こされる。測定された複合体の量は、その試料中に存在 する被検体の量を示す。 既述の複合体は本発明に含まれる複合体の例である。多様な他の結合性試薬を 抗体に代用させることができる。例えば、抗原−複合体は本発明の範囲内に含ま れ、そして試料中の複合体未形成の抗原の量を決定するための競合アッセイに有 用である。同様に、本発明の複合体は結合性試薬としてレクチンを含み、そして 試料中に存在する炭水化物もしくは糖蛋白質の量および種類を決定するのに有用 である。その上、本発明の複合体は結合性試薬としてレセプターおよびリガンド を含み、そしてそ れぞれ試料中のリガンドもしくはレセプターの存在および量を決定するのに有用 である。その他にも、本発明の複合体は結合性試薬としてストレプトアビジン／ アビジンを含み、そしていずれかのビオチニル化被検体の存在および量を決定す るのに有用である。類似の様式で、本発明の複合体は結合性試薬としてＤＮＡ、 ＲＮＡ、およびオリゴヌクレオチドを含み、そして当該技術分野で知られるヌク レオチドハイブリッド形成法により試料中の核酸分子の存在および量を決定する のに有用である。 他のアッセイおよび本発明の複合体の使用法は当業者には明白になるであろう し、かつそれらは添付される請求の範囲内に含まれることが意図される。 本発明は、以下に示す具体例を参照すればより良く理解されるであろう。例１ 有用な複合体を作成するのに失敗した従来の試み 本発明以前には、アエクオリン複合体の合成用の数々の異なる研究方法が試さ れた。このような研究法の一つは、第一級アミン反応性のＮ−ヒドロキシスルホ スクシンイミドおよびチオール反応性のマレイミドを含むヘテロ二官能性試薬ス ルホ−ＳＭＣＣを用いるアエクオリン内へのマレイミド基の導入であった。この 手法はアエクオリンのアミノ基のスルホ−ＳＭＣＣのＮＨＳエステル部分との反 応を必要とし、マレイミド−活性化誘導体を生成し、この誘導体はその後に結合 相手上の利用可能なスルフヒドリル基と共有結合により結合させることができる 。アミノ基それ自体の修飾はアエクオリンに有害ではなく、それはビオチニル化 されたアエクオリン誘導体の作成が成功していることにより説明される （Ｓｔｕｌｔｓ ｅｔ ａｌ．、１９９２）。 しかしながら、同一分子もしくは近隣の分子上の接近可能なスルフヒドリル基 と反応することができるマレイミド基の導入は、同様に発光蛋白質活性の喪失を もたらすであろう。アエクオリン中の３つのシステイン基の内の少なくとも一つ はカルシウム依存的発光に必須であることが示されている（Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．、１９７８；Ｋｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．、１９８４）。部位特 異的突然変異誘発研究により、３つ全てのシステイン基はアエクオリン活性にお いてある役割を担っていることが実証されている（Ｔｓｕｊｉ ｅｔ ａｌ．、 １９８６；Ｋｕｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．、１９８９）。従って当業者は、重要な スルフヒドリル基の化学修飾はアエクオリンの活性を有意に損なうであろうこと を予測するであろう。 アエクオリン中の３つのシステイン残基の内の少なくとも一つが発光に必要で あるため、そしてスルホ−ＳＭＣＣのマレイミド部分は活性化段階中にアエクオ リンの遊離のスルフヒドリル基と反応するであろうために、当業者はアエクオリ ンの発光活性の相当な低減を予測できるであろう。従って、スルホ−ＳＭＣＣで のアエクオリンの処理により発光蛋白質の迅速な不活化がもたらされることが予 測された。 アエクオリンを最高３倍モル過剰のスルホ−ＳＭＣＣで３０分間室温で処理し た。光活性はカルシウムの注入の際にルミノメーターを用いて記録した。スルホ −ＳＭＣＣでの処理によるアエクオリンの激烈かつ有害な不活化が図１に説明さ れる。これらの結果により、スルホ−ＳＭＣＣでの活性化によるアエクオリンの 迅速かつ相当な不活化についてのＥｒｉｋａｋｕ ｅｔ ａｌ．、の所見が証明 される。 これらの考察および先に論議される結果を考慮すると、マレイミド−活性化さ せた結合相手を直接アエクオリンの遊離のスルフヒドリルと反応させるスルホ− ＳＭＣＣを用いる別法の結合手法でもやはりほとんど発光蛋白質活性を持たない 不安定な複合体を生じるとが予期されない訳ではなかった。表１は、未修飾のア エクオリンで作成した複合体とスルホヒドリル−活性化アエクオリンを用いて作 成した複合体との間の劇的な違いを説明する。既知の量の甲状腺刺激化ホルモン （ＴＳＨ）を、ヒトのＴＳＨに対するマウスモノクローナル抗体でコートしたポ リスチレン製の試験管に添加した。結合したホルモンを、スルフヒドリル−活性 化していないアエクオリンに対して２−イミノチオランで活性化させてあるアエ クオリンを用いて調製した抗−ヒトＴＳＨマウスモノクローナル抗体−アエクオ リン複合体を用いて検出した。洗浄後、光活性をカルシウムの注入の際にルミノ メータを用いて検出した。 単位μＩＵはＴＳＨのミクロ国際単位であり、ＲＬＵは相対的光単位を意味し 、ＲＩＵ／ＯＤは２８０ｎｍの光学密度当たりの相対的光単位 を意味し、そして括弧内の数値は％ＣＶ（変動係数）である。 未修飾のＡＥＱで調製した複合体を用いるアッセイにおいては６．５倍多い複 合体を必要としたことに注意することが重要である。このデータにより、未修飾 のアエクオリンで合成された複合体の性能は、追加のスルフヒドリル基を含むよ うに修飾されたアエクオリンを用いて合成された複合体よりも著しく劣ることが 証明される。スルフヒドリル付加を伴わずに調製された複合体の比活性は２−イ ミノチオランを用いて調製された複合体と比較すると１０％を下回っていた。未 修飾化アエクオリンで作成した複合体は免疫アッセイにおいてＴＳＨに結合する 一方で、その性能は、免疫反応性カウント数すなわち添加する必要のあるＩｇＧ の量と、そのアッセイの総体的な性能との両方により制約される。 従って、実質的なルミネセンスを保持する修飾化および架橋結合させたアエク オリン−抗体複合体の発見は驚くべきかつ思いもよらない結果であった。本発明 の光活性の高いアエクオリン−抗体複合体は以下に記載のように合成した。以下 の非制限的実施例は、当業者が添付される請求の範囲により特定される本発明を より良く理解することができることを目的に提供する。 例２ スルフヒドリル−活性化アエクオリンの複合体の合成 材料． ２−イミノチオランおよびスルホ−ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジ ル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキレート）は、Ｐ ｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．社から取得し、ＤＥＡＥ−セファロース （Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）、セファクリル （Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）、および 他の全ての化学物質はＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．社もしくはＦｉｓ ｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のいずれかから取得した。光測定は試験管用ル ミノメーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｃｌｉｎｉｌｕｍａｔ ＬＢ９５０２）もし くはマイクロタイタープレート用ルミノメーター（Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＭＬ１０ ００ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ）のいずれかを用いて行った。Ｄｙｎａｔｅｃｈ社 の装置内ではＤｙｎａｔｅｃｈ社から入手することができる不透明なマイクロタ イターウエル（Ｍｉｃｒｏｌｉｔｅ ２ ウエル）を用いた。 ２−イミノチオランでのアエクオリンの活性化．通常、２ｍＭのＥＤＴＡを含 む１０ｍＭのトリス、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０（ＴＢＳ／Ｅ）中に保 存してあるアエクオリンは２−イミノチオランでの活性化前に、重炭酸塩緩衝液 で平衡化してある脱塩カラムを通すことにより０．１Ｍの重炭酸ナトリウム、０ ．２ＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．５に交換する。各１ｍｌの分画 を回収し、そしてＯ．Ｄ．₂₈₀を記録する。アエクオリンを含む素通り分画を一 緒に合わせ、そしてその合わせた分画の蛋白質の量をＯ．Ｄ．₂₈₀により評価す る。この時点で重炭酸塩緩衝液中にあるアエクオリンをその後に、その合わせた アエクオリンに、重炭酸塩緩衝液中の２−イミノチオランの新しく調製した保存 溶液の適切な容量を添加することにより２〜２００倍モル過剰の２−イミノチオ ランと反応させる。この溶液を緩和に混合させ、そして室温で３０分間放置する 。この反応を、過剰のアミノ試薬（５０〜１００μｌの１．５Ｍ トリス、ｐＨ ７〜９）の添加により停止させる。この反応混合物を、脱気させた０．１Ｍ ト リス、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０（ＴＥ）中で平衡化させた脱塩カラムに通 して余剰な２−イ ミノチオランを除去する。各１ｍｌの分画を回収し、そしてＯ．Ｄ．₂₈₀を記録 する。２−イミノチオラン活性化アエクオリンを含む素通り分画を合わせ、そし てその合わせた分画中の蛋白質の量をＯ．Ｄ．₂₈₀により評価する。この２−イ ミノチオラン活性化アエクオリンは、それをマレイミド−活性化蛋白質と結合さ せるまで氷上に保存する。図２は、１００モル過剰の２−イミノチオランでのア エクオリンのスルフヒドリル活性化でさえアエクオリンの光活性に悪影響を及ぼ さないことを証明している。アエクオリンは図２に示される量の２−イミノチオ ラン（トロート試薬（Ｔｒａｕｔ’ｓ ｒｅａｇｅｎｔ））で、室温で３０分間 処理した。光活性は、カルシウムの注入の際にルミノメーターを用いて測定した 。 抗体の活性化． 抗体のような結合性試薬は、普通は５〜５０倍モル過剰のス ルホ−ＳＭＣＣで活性化させる。該当する抗体が凍結乾燥されている場合には、 それを直接０．１Ｍの重炭酸ナトリウム、０．２ＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＥ ＤＴＡ、ｐＨ７．５中で再構成させるか、あるいはそれが溶液である場合には０ ．１Ｍの重炭酸ナトリウム、０．２ＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ ７．５へとゲル濾過により交換する。活性化予定の抗体の量を蛋白質量測定法に よるか、あるいは適切なモル吸光係数を用いてＯ．Ｄ．₂₈₀により決定する。重 炭酸塩中のスルホ−ＳＭＣＣの新しく調製した保存溶液の適切な量をその抗体に 添加し、そしてその溶液を緩和に混合し、そして室温で３０分間反応させる。こ の反応を既述のようにトリスの添加により停止させ、そしてその後にこの反応混 合物を脱気させた０．１Ｍのトリス、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．０内で平衡化 させてある脱塩カラムに通して余剰なスルホ −ＳＭＣＣを除去する。マレイミド−活性化抗体を含む素通り分画を合わせ、そ してその合わせた分画内の蛋白質の量をＯ．Ｄ．₂₈₀から決定する。マレイミド −活性化抗体は、２−イミノチオラン活性化アエクオリンと合わせるまでは氷上 に保存する。 複合体形成および複合体の活性アッセイ． ２−イミノチオラン活性化アエク オリンおよびスルホ−ＳＭＣＣ活性化抗体を、通常は３と３０との間のモル比で 合わせ、緩和に混合し、そして振盪させずに一晩４℃で反応させる。この反応混 合物内の活性な抗体複合体の存在についてテストするために、幾つかのアリコー トを、アエクオリン−抗体複合体が認識するであろうもしくはその複合体を捕捉 するであろう適切な血清もしくは精製した抗−複合体抗体もしくは抗原で、ある いはストレプトアビジン／アビジンの場合にはビオチニル化した標的で予めコー トしてある不透明なマイクロタイターウエルもしくはポリスチレン製試験管内で インキュベートする。例えばマウスのモノクローナル抗体の場合には、マイクロ タイターウエルを、その複合体を捕捉するであろうヤギ抗−免疫グロブリンでコ ートすることができる。典型的には、ウエルもしくは試験管を１００μｌの５〜 ５０μｇ／ｍｌの抗体で一晩、４℃でコートする。このコートしたウエルもしく は試験管をその後に、１％のゼラチン／５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡのような適切な遮 断試薬で遮断する。平衡に行う一連のブランクウエルもしくは試験管は、同じ遮 断試薬を含む未処理の不透明マイクロタイターウエルをインキュベートすること により調製する。 この複合体反応混合物の数々の１０倍希釈物を、０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを 含むＴＢＳ／Ｅ（ＴＢＳ／Ｅ／ＢＳＡ）中で調製する。幾つか のアリコート（１００μｌ／ウエル）を遮断したブランクウエルもしくは試験管 および遮断したコート化ウエルもしくは試験管内に入れ、そして１０分もしくは それを上回る期間、室温でインキュベートする。このウエルをＴＢＳ／Ｅで４〜 ５回洗浄して結合しなかった複合体を除去する。ＴＢＳ／Ｅ／ＢＳＡ（５０μｌ ）をそのウエルもしくは試験管に添加して乾燥を回避させる。このマイクロタイ ターウエルもしくは試験管を適切なルミノメーターに入れて、カルシウムの注入 （１０〜１００ｍＭのトリス、１０〜１００ｍＭの酢酸カルシウム、ｐＨ７．５ ）により結合した複合体の存在を記録する。ブランクウエルもしくは試験管と比 較して有意な光シグナルが抗体／抗原／ビオチニル化標的でコートしたウエルも しくは試験管内に観察される場合には、この複合体を以下のとおりに精製する。 複合体の精製． アエクオリンと抗体との複合体はゲル濾過およびイオン交換 クロマトグラフィーの組み合わせを用いて精製することができる。この精製段階 を実施する順序は、精製した複合体に関しては問題とはならない。ゲル濾過は、 この反応混合物中に存在するアエクオリン−抗体複合体およびいずれかの未反応 の抗体から遊離のアエクオリン（ＭＷ２２，０００）を分離するのに役立つ適切 な樹脂（例えば、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−１００もしくはＧ− １５０、セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ−１００もしくはＳ−２００） を用いて実施する。適切なイオン交換媒質を用いて、ゲル濾過後に得られるアエ クオリン−抗体複合体から反応しなかった抗体を除去する。酸性の等電点（ｐＨ ４〜５）であるためにアエクオリンと結合するＤＥＡＥ−セファロース（Ｓｅｐ ｈａｒｏｓｅ）を通常は用いる。アエクオリン−抗体複 合体はその樹脂に結合し、そして溶出のためには塩の濃度勾配液を必要とする。 抗体およびストレプトアビジン／アビジンのような結合性試薬はアエクオリンよ りも塩基性よりの等電点を有し、そしてそのためにＤＥＡＥカラムを素通りする か、あるいはより低い親和性で結合し、そしてより低い塩濃度で溶出するかのい ずれかであろう。 この複合体反応混合物を、ＴＥ，ｐＨ７．０中で平衡化させたゲル濾過カラム にかける。例えば、抗体との複合体をセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ− ２００カラム（１．２×８５ｃｍ）に４℃でかけ、そしてそのカラムをＴＥで溶 出させる。各分画（０．５〜１．０ｍｌ）を回収し、そして２８０ｎｍでの吸収 により光活性および蛋白質の存在について記録する。そのカラムのボイド容積付 近に溶出するピークはアエクオリン−抗体複合体ならびに未反応の結合性試薬を 含む。光活性の包括的ピークは遊離のアエクオリンに相当する。図４は、抗体− アエクオリン複合体のセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ−２００カラムク ロマトグラフィーの精製曲線を示す。各１ｍｌの分画を回収し、蛋白質濃度を２ ８０ｎｍでの分光測光により測定し、そして光活性をカルシウムの注入と同時に ルミノメーターを用いて測定した。 アエクオリン−抗体複合体を含む分画を合わせ、そしてＴＥ、ｐＨ７．０で平 衡化させた５ｍｌのＤＥＡＥ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラム（１ ×１２ｃｍ）にかける。このＤＥＡＥカラムを約１５〜２０ｍｌのＴＥ、ｐＨ７ で洗浄した後に、このカラムに結合した蛋白質を、２５ｍｌのＴＥ、ｐＨ７と０ ．６ＭのＮａＣｌを含む２５ｍｌのＴＥ、ｐＨ７とを用いる直線塩濃度勾配液（ 総量５０ｍｌ）を用いて溶出させる。各１ｍｌの分画を回収し、そして２８０ｎ ｍでの吸光度および 光活性について記録する。遊離の抗体が最初の蛋白質ピーク内に存在するであろ う。アエクオリン−抗体複合体は蛋白質および光活性を含むピークとして後から 溶出されるであろう。 図５は、ＤＥＡＥ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）イオン交換クロマト グラフィーによる抗体−アエクオリン複合体の精製の溶出曲線を示す。光活性は カルシウムの注入の際にルミノメーターを用いて測定した。精製されたアエクオ リン−抗体を含む分画を合わせ、そして既述の活性な複合体の存在について再検 査した。精製された複合体のアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して複合体の存 在を更に確認する。この複合体の比活性（ｍｇ当たりの光活性）を決定し、そし てこの複合体を適切な条件下に保存する。 例３： 抗−ヒト抗体−アエクオリン複合体の精製 スルホ−ＳＭＣＣマレイミド−活性化マウス抗−ＴＳＨ抗体の１２倍モル過剰 のスルフヒドリル−活性化アエクオリンを含む抗−ヒトＴＳＨモノクローナル抗 体−アエクオリン反応混合物は、４℃で一晩結合させた後に、そのもともとの光 活性の内の約８４％を保持していた。 遮断試薬のみで予め処理してあるウエルに比較する際のヤギ抗−マウス抗体で 予め処理してあるマイクロタイターウエル内の３〜１０倍多い光活性の結合に基 づき、この反応混合物は所望の複合体を含むことが示された。複合体の希釈液を 、ヤギ抗−マウス抗体でコートした不透明のマイクロタイターウエル内に入れ、 そして遮断試薬で室温で３０分間処理した。未結合の複合体を洗浄して除去した 後に、結合した光活性をカルシウムの注入と同時にマイクロタイタープレート用 のルミノメーター を用いて測定した。特異的結合の結果を図３に示す。 この反応混合物をセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ−２００カラムに、 次いでＤＥＡＥ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）イオン交換クロマトグラ フィーに通した。このクロマトグラフィー曲線を図４に示す。図４に示されるよ うに、このＳ２００カラムにかけた約６％の光活性および３６％の蛋白質がボイ ド容積付近に溶出される一方で、残りの光活性は遊離のアエクオリンに相当する 位置に溶出された。このＤＥＡＥ段階は、図５に示されるように、複合体形成を 行わなかった微量の抗体の除去に役立った。 結合は、抗体の重鎖（５０ｋＤ）が観察されるよりも大きい分子量の幾つかの バンドが観察される精製複合体の還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により立証された （データー非公開）。その上この同一の複合体は、発光蛋白質および免疫学的活 性の両方に関して、溶液の状態でも、そして凍結乾燥に対しても安定であった。 この複合体は、適切な緩衝液内に一カ月間４℃で保存した後にその光活性の約７ ０％を、そして室温で凍結乾燥粉末として保存した際にはその光活性の８５％を 上回る光活性を保持していた。 例４ 甲状腺刺激化ホルモン結合アッセイ 甲状腺剌激化ホルモン（ＴＳＨ）アッセイを実施した。簡潔に記載すると、既 知の量の甲状腺刺激化ホルモン（ＴＳＨ）を、ヒトのＴＳＨに対するマウスのモ ノクローナル抗体でコートしたポリスチレン製の試験管に添加した。結合したホ ルモンを抗−ヒトＴＳＨマウスモノクローナル抗体−アエクオリン複合体で検出 した。洗浄後、光活性をＢｅｒｔｈ ｏｌｄ Ｃｌｉｎｉｌｕｍａｔルミノメーターを用いて記録した。表２に示すよ うに抗−ＴＳＨ抗体−アエクオリン複合体は機能状態であり、それは、捕捉免疫 アッセイにおける低いレベルのＴＳＨを検出する能力により証明されている。 例５ 競合的免疫アッセイ チロキシン−（Ｔ４）アエクオリン複合体を用いるチロキシン用の競合的免疫 アッセイを実施した。既知の量のチロキシン（Ｔ４）を、チロキシン（Ｔ４）に 対するマウス抗体とチロキシン−（Ｔ４）アエクオリン複合体の両方と共に、緩 衝液を含む、マウスＩｇＧに対するロバ抗体でコートしたポリスチレン製の試験 管に添加した。洗浄後に、結合した複合体をルミノメーターを用いてカルシウム の検出時に測定した。得られた競合的結合曲線を図６に示す。 例６ 核酸−発光蛋白質複合体の調製 一般的にはＤＮＡ／ＲＮＡプローブを，蛋白質に類似する様式で誘導化するこ とができる。ＲＮＡおよびＤＮＡの特異的配列に対する相補的プローブを作成し 、そしてアミノ末端もしくは側鎖のアミノ、カルボニル、もしくは他の官能基を 介して直接的に誘導化させるか、あるいは誘導化用試薬と反応させるかのいずれ かで、より活性の高い「ラベル化可能」な基を提供することができる。その上Ｄ ＮＡは、連結用の遊離のアミノ基を提供することができるプソラレン類のような 物質と架橋結合させることができる。これらの方法を説明する例は以下のとうり である。 プローブを１，１’−カルボニルジイミダゾールおよびビス−アミンのような 活性化剤と反応させてＤＮＡの二重ヘリックス形成を妨害しないプローブ用の脂 肪族性第一級アミン連結部分を提供することができる。その後にこの第一級アミ ンをオリゴヌクレオチドとしてスルホ−ＳＭＣＣのようなＮＨＳエステルと反応 させて、マレイミド官能基を付加した。この例は、引用により本明細書に取り込 まれるＳ．Ｂｅｃｋ、Ｔ．Ｏ’ 文（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．、１９８９、１７、５１１５−５１２３）に示 されている。修飾化オリゴヌクレオチドをＮＨＳ−ビオチンと反応させる際には 、実質的にはＳＭＣＣを用いることができそうである。 アルキルアミンリンカーを，そのプローブの合成中もしくは合成後のいずれか に付加することができる。この修飾法の例はアリルアミンの使用である。これを 例えばピリミジンのＣ−５位と反応させてアリルアミン基を作成し、これを標準 的なＮＨＳもしくは他の化学作用を用いて修 飾させて、ＳＭＣＣもしくはそれに等価な基に結合させることができる。Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９８３、３８−４１中のＬ．Ｇａｒｄｎｅｒ、および ＰＮＡＳ、１９８３、８０、４０４５−４０４９におけるそれらの利用法を参照 せよ（この両方共は、引用により本明細書に取り込まれる）。 ＮＨＳの化学作用を用いてアクリジニウムエステルをアミン修飾化ＤＮＡおよ びＲＮＡ分子に連結させてＤＮＡおよびＲＮＡプローブが作成された。引用によ り本明細書に取り込まれるＣｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｍｉｓｔｒｙ、１９８９、３ ５ 、１５８８−９４のＬ．Ｊ．Ａｒｎｏｌｄ Ｊｒ．を参照せよ。 このようなプローブを、ＤＮＡもしくはＲＮＡに対してハイブリッド形成する オリゴヌクレオチドのような当業者に知られる核酸ハイブリッド形成アッセイに 用いることができる。 先の説明文および実施例に本発明を十分に記載したので、他の変法および使用 が当業者に明らかになるであろう。このような変法の全ては添付される請求の範 囲の範囲内に含まれることが意図される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ， ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 光を発生するためのルミネセンス反応に関与することが可能であり、あ る被検体に特異的に結合することが可能なスルフヒドリル−反応性の結合性試薬 に結合したスルフヒドリル−活性化発光蛋白質を含んでなる発光蛋白質−結合性 試薬複合体組成物。 ２． 前記スルフヒドリル−活性化発光蛋白質が、未修飾の発光蛋白質内に存 在するよりも少なくとも一つ多いスルフヒドリル基を含むように修飾されており 、そして前記スルフヒドリル−反応性の結合性試薬が前記発光蛋白質上のスルフ ヒドリル基と架橋結合するように修飾され、得られる発光蛋白質−結合性試薬複 合体が前記リガンドに特異的に結合することが可能でありかつルミネセンス反応 に関与して光を発生することができる、請求の範囲１の発光蛋白質−結合性試薬 。 ３． 前記発光蛋白質が、アポアエクオリン、アエクオリン、アポ−オベリン 、オベリン、アポ−ムネミオプシン、ムネミオプシン、アポ−ベロビン、ベロビ ン、ホラシン、ルシフェラーゼ類、ペラギア（Ｐｅｌａｇｉａ）もしくは貝虫亜 網の動物から単離される生物発光蛋白質類からなる群より選択される、請求の範 囲１の組成物。 ４． 前記結合性試薬が、ストレプトアビジン／アビジン、レクチン、酵素、 糖蛋白質、ペプチド、ホルモン、レセプター、抗原、薬物、抗体、ＲＮＡ、ＤＮ Ａ、およびオリゴヌクレオチドからなる群より選択される、請求の範囲１の組成 物。 ５． 前記発光蛋白質がアポアエクリンもしくはアエクリンであり、かつ前記 結合性試薬が抗体である、請求の範囲１の組成物。 ６． 前記発光蛋白質がアポアエクリンもしくはアエクリンであり、 かつ前記結合性試薬が抗原である、請求の範囲１の組成物。 ７． 前記発光蛋白質がアポアエクリンもしくはアエクリンであり、かつ前記 結合性試薬が核酸分子である、請求の範囲１の組成物。 ８． 前記発光蛋白質が、２−イミノチオラン（トロート試薬（Ｔｒａｕｔ’ ｓ ｒｅａｇｅｎｔ））；Ｎ−スクシンイミジル Ｓ−アセチルチオアセテート （これは後にヒドロキシルアミンで脱保護化する）；Ｓ−アセチルメルカプトコ ハク酸無水物（ＳＡＭＳＡ）（これは後に還元剤での処理により脱保護化する） ；Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤ Ｐ）およびその誘導体類（これらは後に還元剤での処理により脱保護化する）； ならびに４−スクシンイミジルオキシカルボニル α−メチル α−（２−ピリ ジルジチオ）−トルエン（ＳＭＰＴ）（これは後に還元剤での処理により脱保護 化する）からなる群より選択されるスルフヒドリル活性化剤でスルフヒドリル活 性化された、請求の範囲１の組成物。 ９． 前記発光蛋白質が、２−イミノチオランでスルフヒドリル活性化された 、請求の範囲８の組成物。 １０． 前記結合性試薬が、マレイミド基もしくはα−ハロカルボニル基を含む ように前記結合性試薬を修飾することによりスルフヒドリル反応性にされた、請 求の範囲１の組成物。 １１． 前記結合性試薬が、スクシンイミジル ４−（Ｎ−マレイミドメチル） シクロヘキサン（ＳＭＣＣ）、ＳＭＣＣのスルホン化誘導体、ｍ−マレイミドベ ンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、ＭＢＳのスルホ ン化誘導体（スルホ−ＭＢＳ）、スクシンイミジル ４−（ｐ−マレイドフェニ ル）ブチレート（ＳＭＰＢ）、ＳＭＰ Ｂのスルホン化誘導体（スルホ−ＳＭＰＢ）、スクシンイミジル−６−（Ｎ−マ レイミド−ｎ−ヘキサノエート）、スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）ア ミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、ＳＩＡＢのスルホン化誘導体（スルホ−ＳＩＡ Ｂ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルブロモアセテート、ビス−（マレイミド ）メチルエステル、およびビス−マレイミドヘキサン（ＢＭＨ）からなる群より 選択される化合物で前記結合性試薬を処理することによりスルフヒドリル反応性 にされた、請求の範囲１の組成物。 １２． 前記結合性試薬が、スルホスクシンイミジル ４−（Ｎ−マレイミドメ チル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）で前記結合 性試薬を処理することによりスルフヒドリル反応性にされた、請求の範囲１１の 組成物。 １３． 光を発生するためのルミネセンス反応に関与することが可能なスルフヒ ドリル−活性化発光蛋白質の、ある被検体に特異的に結合することが可能なスル フヒドリル−反応性の結合性試薬への結合の段階を含む、発光蛋白質−結合性複 合体組成物の作成法。 １４． 前記スルフヒドリル−活性化発光蛋白質が、未修飾の発光蛋白質内に存 在するよりも少なくとも一つ多いスルフヒドリル基を含むように修飾されており 、そして前記スルフヒドリル−反応性の結合性試薬を前記発光蛋白質上のスルフ ヒドリル基と架橋結合するように修飾され、得られる発光蛋白質−結合性試薬複 合体が前記リガンドに特異的に結合することが可能でありかつルミネセンス反応 に関与して光を発生することができる、請求の範囲１３の方法。 １５． 前記発光蛋白質が、アポアエクオリン、アエクオリン、アポ− オベリン、オベリン、アポ−ムネミオプシン、ムネミオプシン、アポ−ベロビン 、ベロビン、ホラシン、ルシフェラーゼ類、ペラギア（Ｐｅｌａｇｉａ）もしく は貝虫亜網の動物から単離される生物発光蛋白質類からなる群より選択される、 請求の範囲１３の方法。 １６． 前記結合性試薬が、ストレプトアビジン／アビジン、レクチン、酵素、 糖蛋白質、ペプチド、ホルモン、レセプター、抗原、薬物、抗体およびその抗原 結合性断片、ＲＮＡ、ＤＮＡ、およびオリゴヌクレオチドからなる群より選択さ れる、請求の範囲１３の方法。 １７． 前記発光蛋白質がアポアエクリンもしくはアエクリンであり、かつ前記 結合性試薬が抗体である、請求の範囲１３の方法。 １８． 前記発光蛋白質がアポアエクリンもしくはアエクリンであり、かつ前記 結合性試薬が抗原である、請求の範囲１３の方法。 １９． 前記発光蛋白質がアポアエクリンもしくはアエクリンであり、かつ前記 結合性試薬が核酸分子である、請求の範囲１３の方法。 ２０． 前記発光蛋白質が、２−イミノチオラン（トロート試薬（Ｔｒａｕｔ’ ｓ ｒｅａｇｅｎｔ））；Ｎ−スクシンイミジル Ｓ−アセチルチオアセテート （これは後にヒドロキシルアミンで脱保護化する）；Ｓ−アセチルメルカプトコ ハク無水物（ＳＡＭＳＡ）（これは後に還元剤での処理により脱保護化する）； Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸エステル（Ｓ ＰＤＰ）およびその誘導体類（これらは後に還元剤での処理により脱保護化する ）；ならびに４−スクシンイミジルオキシカルボニル α−メチル α−（２− ピリジルジチオ）−トルエン（ＳＭＰＴ）（これは後に還元剤での処理により脱 保護化する）からなる群より選択されるスルフヒドリル活性化剤でスル フヒドリル活性化された、請求の範囲１３の方法。 ２１． 前記発光蛋白質が２−イミノチオランでスルフヒドリル活性化された、 請求の範囲２０の方法。 ２２． 前記結合性試薬が、マレイミド基もしくはα−ハロカルボニル基を含む ように前記結合性試薬を修飾することによりスルフヒドリル反応性にされた、請 求の範囲１３の方法。 ２３． 前記結合性試薬が、スクシンイミジル ４−（Ｎ−マレイミドメチル） シクロヘキサン（ＳＭＣＣ）、ＳＭＣＣのスルホン化誘導体、ｍ−マレイミドベ ンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、ＭＢＳのスルホ ン化誘導体（スルホ−ＭＢＳ）、スクシンイミジル ４（ｐ−マレイミドフェニ ル）ブチレート（ＳＭＰＢ）、ＳＭＰＢのスルホン化誘導体（スルホ−ＳＭＰＢ ）、スクシンイミジル−６−（Ｎ−マレイミド−ｎ−ヘキサノエート）、スクシ ンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、ＳＩＡＢ のスルホン化誘導体（スルホ−ＳＩＡＢ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルブ ロモアセテート、ビス−（マレイミド）メチルエステル、およびビス−マレイミ ドヘキサン（ＢＭＨ）からなる群より選択される化合物で前記結合性試薬を処理 することによりスルフヒドリル反応性にされた、請求の範囲１３の方法。 ２４． 前記結合性試薬が、スルホスクシンイミジル ４−（Ｎ−マレイミドメ チル）シクロヘキサン−１−カルボン酸エステル（スルホ−ＳＭＣＣ）で前記結 合性試薬を処理することによりスルフヒドリル反応性にされた、請求の範囲２３ の方法。 ２５． 結合アッセイにおいて請求の範囲１の発光蛋白質−結合性試薬 複合体を用いることにより、ある試料中の被検体の存在もしくは量を測定するこ とを含むアッセイ法。 ２６． 結合アッセイが、同時捕捉結合アッセイ、遂次捕捉結合アッセイ、競合 的結合アッセイ、および核酸ハイブリッド形成を含む群より選択される、請求の 範囲２５のアッセイ法。 ２７． 測定されるべき被検体に特異的に結合可能な発光蛋白質−結合性試薬複 合体が、測定されるべき被検体を含むことが疑われる試料と、その発光蛋白質− 結合性試薬複合体と被検体とが互いに結合して発光蛋白質−結合性試薬−被検体 複合体を形成するのに十分な条件下で接触され、同時もしくはその後にその複合 体が残りの試料から分離され、そして発光蛋白質でルミネセンス反応を開始させ ることにより被検体の存在もしくは量が測定され、かつ発生される光が測定され 、請求の範囲２５のアッセイ法。 ２８． 測定されるべき被検体の結合相手に選択的に結合可能な発光蛋白質−結 合性試薬複合体が、測定されるべき被検体を含むことが疑われる試料と、その発 光蛋白質−結合性試薬複合体とその被検体の結合相手とが互いに結合して発光蛋 白質−結合性試薬−被検体の結合相手複合体を形成するのに十分な条件下で接触 され、その後にその複合体を残りの試料から分離され、そして発光蛋白質でルミ ネセンス反応を開始させることにより被検体の存在もしくは量が測定され、かつ 発生される光が測定される、請求の範囲２５のアッセイ法。