JPH08505222A - 遺伝子型および表現型物質を同時に結合することを目的とした基質材料 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 遺伝子型物質および表現型物質の両者を同時結合できる基質材料を記載する。イオン交換能および／またはアフィニティーリガンドのような表面修飾物を有することができる各領域は，例えば、核酸やタンパク質またはペプチドと同時に結合する。上記基質材料は、遺伝子型および表現型を同時に結合できてそれらのさらなる分析に供することができる、生体高分子の進化論的最適化の方法に使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】 遺伝子型および表現型物質を同時に結合することを目的とした基質材料 本発明は生体高分子の進化論的最適化のための基質材料および方法に関する。 進化論的バイオテクノロジーは試験管内で進化を模倣し、複製メカニズムを利 用して変異体および最適化された核酸を得る新しい技術である。核酸の複製はポ リメラーゼのような天然の読み違い率を特定の核酸に由来する擬種分布の創成に 利用しうる適当な酵素で行われる。この技術の詳細はドイツ特許出願No.41 12 4 40 C2に開示されている。 しかし、進化論的バイオテクノロジーに共通する特徴は技術的に可能な時間ス ケールで進化論的最適化を実現するための大量サンプルの同時処理の必要性にあ る。例えば、コード遺伝子の突然変異誘発による酵素などの特定の表現型の系統 的最適化が求められている。所謂不合理的または進化論的設計に基づくこのよう な方法は得られた特定の目的とする表現型によるスクリーニングを必要とする。 望ましい表現型が見つかると、コード遺伝子、即ち対応する核酸を直ちに解析す ることが重要となる。例えば、タンパク質のシーケンシングおよび該配列の対応 する遺伝子配列への転換などによるコード配列を知るための間接的な方法が技術 的には可能であるが、それらは技術的に複雑なために現実的ではない。 さらに、技術的に合理的な進化論的バイオテクノロジーを行うには、大量の各 形質転換細胞に対する分離工程において表現型および遺伝子型が各クローン内に に固定される特異的精製の同時処理、即ち約10⁶-10⁸クローンの同時処理が必要 とされる。 従って、本発明は例えば、タンパク質および対応するコード遺伝子からなる遺 伝子型および表現型の一般的精製が可能であるシステムを提供し、かつ、生体高 分子の進化論的最適化を可能にする方法を提供する技術的課題に関する。増殖培 地と組み合わした本基質システムは細胞コロニーのクローン的増殖、または遺伝 子型がその表現型にクローン的に結合し、他の遺伝子型または表現型に混ざるこ と無く各クローン内に維持される酵素的遺伝子増幅システムを同時に満足するも のである。 本課題は少なくとも遺伝子型物質および表現型物質の各特異的結合に対する２ つの同時結合特性を有する基質材料で解決される。この事は他の遺伝子または遺 伝子型の混入を容易に防げる一方、該遺伝子型に由来する表現型としての酵素シ ステム（情報キャリヤー）が各遺伝子と関係付けられるように維持され、原理的 に単離可能となる効果を有している。この基質システムには本発明の基質材料が 遺伝子型物質とその特定の表面領域で結合し、一方、表現型物質は該基質材料の 別の表面領域に結合するという特徴がある。本発明の基質材料の望ましい態様に おいては、例えば核酸が遺伝子型物質として結合し、同時に例えばタンパク質ま たはペプチドが表現型物質として結合しうる。 本発明の基質材料は遺伝子型および／または表現型の結合が可能であり、かつ 、互いに〈1,000μm好ましくは〈100μmの距離を保つが10nm以下にはならない領 域を含んでいる。遺伝子型および表現型が有する化学的性質の違いにより、これ らの領域は２つの物質、遺伝子型および表現型に対し各々特異的な結合特性を同 時に有することが望ましい。 特に、これらの領域はイオン交換性または疎水相互作用等の親和性、または複 合体形成能またはこれらを組み合わせた性質を持ちうる。例えば親和性を有する 領域を使用する場合、遺伝子型は特定の親和性リガンドにより対応する領域内で 認識され、一方、表現型は対応する領域に存在する別の親和性リガンドと相互作 用することが可能である。表現型または遺伝子型を各々提示する分子は基質表面 に直接又は特定の天然または人工の誘導置換基を介して結合しうる。これらの置 換基には、ハプテンまたはビオチンまたはアビジンまたは特定のオリゴペプチド のようなその他の適当な側鎖を使用しうる。しかし、ある領域の一部に親和性を 有し、同じ領域の違う部分にイオン交換性を有する基質材料も有用である。 親和性リガンドで修飾した表面を有する本発明の基質材料は、結合した遺伝子 型または表現型と可逆的な相互作用が可能であり、少なくとも１つの結合した分 子型（遺伝子型または表現型）の溶出が可能である。 遺伝子型および表現型に対する結合性を有する領域を含む基質材料は、メンブ レンまたはメンブレン集合体、シート、ウェハ、キャピラリー、繊維、または織 物または不織布等の繊維状混成構造物、またはこれらの組み合わせ物などのマト リクス上またはマトリクス内にあることが望ましい。 また、少なくとも１つのタンパク質またはペプチドに対する親和性を有する領 域を持ち、同時に核酸にも結合しうる基質材料を提供することは有用である。実 際にこのような材料はイオン交換およびアフィニティー・クロマトグラフィー材 料のハイブリッドと考えることができる。従って、これらの核酸およびタンパク 質に対する分子種特異的結合性は核酸およびタンパク質の同時結合を可能にする 。特定の容積内での特異的タンパク質結合の数は限定しうるので規格化が可能と なる。 本発明の基質材料の領域に用いるイオン交換材料としては、１M濃度の塩化ナ トリウムに相当するイオン強度でDNAなどのポリアニオンを結合しうる大孔また は非孔材料が望ましい。特に、クィアジェン（QUIAGEN）という名称で市販され ておりDE32 11 309に開示されているような大孔シリカゲルが有用である。親和 性リガンドには、例えば、ビオチン誘導体および／またはストレプトアビジン誘 導体および／またはアビジン誘導体および／または核酸および／または抗体断片 および／または金属キレート類および／またはペプチドリガンドがある。もし、 アニオン交換材料および親和性材料が別々の基質材料に結合しているのなら、両 粒子を十分に混合することにより両結合性が本発明の基質領域に現れるようにす ることができる。この領域が繊維状基質上にあるのなら、繊維を相互に織り合わ せること、または同時に圧縮すること、または少なくとも１つのメンブレンが少 なくとも１つの物質種を通過しうるように薄いメンブレンを密着させることで同 様の効果を得ることができる。また、分子型（遺伝子型または表現型）の１つに 対する各結合性をその両側に有する網状基質も使用しうる。 本発明の基質材料の使用は、例えばタンパク質および／またはタンパク質をコ ードする核酸などの２つの異なる分子の空間的に近接した結合を可能にする。本 発明の基質材料の使用は、生体高分子の進化論的最適化、特に種々の遺伝子産物 およびその関連遺伝子の同時分析に利点を有する。 従って、遺伝子型および表現型を同時に１つの基質材料に結合し、かつ、選択 的に、または同時に単離できる生体高分子の進化論的最適化の方法が提供される 。 本発明の方法では、遺伝子型を提示する構造体、例えば核酸に対し突然変異誘 発が行われ、この構造型に対し少なくとも１つの複製ステップ、発現システムに おける発現が行われ、かつ、対応する発現産物（表現型）、例えばタンパク質が 遺伝子型、例えば該タンパク質をコードする核酸と共に基質材料に結合し、最適 化すべき特異的性質に関する検定が行われる。 試験的に、およびさらに加工するためにタンパク質および／または核酸を使用 しうる。一方では、水溶液から連続する６個のヒスチジンを含むタンパク質を抽 出し、それらを複合体として結合しうるニッケル-NTA-結合型固相キャリヤーに 基づく金属キレートと、他方では核酸の抽出および精製を目的としたアニオン交 換クロマトグラフィーの組み合わせは特に有効であることが分かった。特に、こ の組み合わせはメンブレンまたは一次元繊維に配置することが可能であり、これ を使用することにより適当な培養培地の存在下、細胞コロニーを局在化させ、別 々に培養しうる。 しかし、遺伝子を複製するシステムとして細胞の代わりに、酵素的増幅システ ム等の無細胞システムを使用しうる。この場合、本発明の基質の領域は実質的に 他の領域と相互作用すること無しに反応物間に起こりうる各反応の要素としての 役割を果たす。この事は高分子の拡散過程を妨害する表面により保証される。従 って、酵素的増幅は種々のマスター配列に由来する増幅生産物を混合する事無し に行うことができる。この事は各領域の空間的限界内に擬種分布を作成すること を可能にする。 以下に示すメンブレンは特に有効な対応であることが分かった。このメンブレ ン上には、望ましくはDE-A-32 11 309 C 2に対応するアニオン交換材料およびニ トリロトリ酢酸および／または対応するニッケルキレートで修飾した材料を含む 特定の領域が存在する。このメンブレンに所謂エンメッシュ加工（3M社、セント ポール，アメリカ）を施した。本発明の基質材料は、特に以下に示す工程： -１回の実験における約10⁶-10³クローンの比較スクリーニング； -表現型／遺伝子型カップリング、即ち、最適と判断されたタンパク質の対応す る遺伝子への直接的アプローチ； -細胞中または分泌後のタンパク質の酵素活性の定量的比較； -原核または真核細胞の使用； -特定の性質に関する自動的作用および検定； -組み換えタンパク質の規格化； -特異的に結合したタンパク質および核酸の回収；および -タンパク質構造の戦略的に統制された進化論的改良 以上の工程を実現する方法において採用しうる。 本発明の基質材料を採用する利点を以下の実施例でより詳細に説明する。 培養培地を飽和したメンブレンは組み換え体細胞を収容するのに用いる。大腸 菌のコンピテント細胞のトランスホーメーションおよび培地内のコンピテント細 胞濃度の測定後、細胞懸濁液をピエゾ自動ピペッティング装置を用い、１滴およ び１領域単位当たり平均して１つの細胞が含まれるようにメンブレンに配給する 。この領域単位は、0.1-1mmのラスター内に収まるように細胞量に依存して選択 される。従って、m²当たり10⁶-10⁸個の細胞を存在させうる。別のコンピテント 細胞の候補にはバチルス・サチルスまたはバキュロウイルス感染昆虫細胞がある 。 トランスホームしたコンピテント細胞は約20複製サイクルに相当する期間培養 し、結果的に１つの組み換え体細胞から約10⁶個の細胞が誘導されることになる 。さらに、約１-12時間培養を続行し化学的または熱的誘導により組み換え体タ ンパク質の誘導を行う。トランスホームされた核酸は６個のヒスチジン残基を含 むタンパク質のアミノ酸配列をコードしている。これらのタンパク質が分泌され ると、標識されたタンパク質はニトリロトリ酢酸修飾表面を有する領域に結合す る。細胞の分解後放出される対応する核酸も結合するが、それは本発明の基質表 面に存在するイオン交換材料上に結合している。 メンブレンを洗浄して細胞断片およびその他の構成要素を除去し、検定する。 イオン交換材料クィアジェン（QUIAGEN）は劣悪な環境条件下でさえ結合した 核酸を分解することなしに核酸を結合しうるという利点を有する。結合した核酸 、例えばDNAは高塩濃度による溶出によってのみ放出される。 メンブレン検定後、最も高い活性を有する変異体の核酸を対応する領域が溶出 し、進化論的バイオテクノロジーにおける次のサイクルに使用しうる。 本発明の方法は自動シーケンシング法と組み合わせることにより特定の変異体 の周辺の淘汰値地形の評価に有効である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．遺伝子型物質および表現型物質の各々の特異的結合を目的とした少なくとも ２つの同時結合性有する基質材料。 ２．前記基質材料の特定の表面領域に遺伝子型物質を結合し、かつ、該基質材料 の局所的に分離した表面領域に表現型物質を結合しうるか、または該基質材料の 同じ領域が遺伝子型および表現型物質の両方を結合する事を特徴とする請求項１ 記載の基質材料。 ３．前記核酸が遺伝子型物質として結合し、かつタンパク質またはペプチドが表 現型物質として同時に結合することを特徴とする請求項１および２のいずれか１ 項記載の基質材料。 ４．前記遺伝子型および表現型を結合する各々の領域が互いに10〜1000μm、望 ましくは10nm〜100μm離れていることを特徴とする請求項１〜３の少なくとも１ 項記載の基質材料。 ５．前記領域がイオン交換能または疎水相互作用などの親和性または複合体形成 性、またはこれらの組み合わせた性質を有することを特徴とする請求項１〜４の 少なくとも１項記載の基質材料。 ６．前記領域型の１つが親和性を有し、かつ、他の領域型がイオン交換性を有す ることを特徴とする請求項５記載の基質材料。 ７．前記親和性を有する領域が結合する遺伝子型または表現型と可逆的な相互作 用をすることで、結合する分子型の少なくとも１つの溶出が可能であることを特 徴とする請求項１〜６記載の少なくとも１項記載の基質材料。 ８．前記基質材料がメンブレンまたはメンブレン集合体上に二次元的に存在する か、またはメンブレン中に埋設されているか、または、キャピラリー中または繊 維または不織布のような繊維状混成構造物上に存在するか、またはこれらの組み 合わせ物上に存在することを特徴とする請求項１〜７の少なくとも１項記載の基 質材料。 ９．前記親和性を有する物質およびアニオン交換物質が不織布などのマトリクス 中に存在することを特徴とする請求項１〜８の少なくとも１項記載の基質材料。 10．前記親和性を有する領域が少なくとも１つのタンパク質またはペブチドを特 異的に結合し、かつ、同時に核酸を結合しうることを特徴とする請求項１〜９の 少なくとも１項記載の基質材料。 11．前記領域がイオン交換性を有することを特徴とする請求項１〜10の少なくと も１項記載の基質材料。 12．前記アニオン交換性を有する領域が表面処理された大孔または閉孔粒子によ って提供されることを特徴とする請求項１〜11の少なくとも１項記載の基質材料 。 13．前記アニオン交換性を有する領域が、さらに、１M NaClに相当するイオン強 度条件下でもDNA分子を結合しうることを特徴とする請求項11および12のいずれ か１項記載の基質材料。 14．前記親和性を有する領域がビオチン誘導体、ストレプトアビジン誘導体、ア ビジン誘導体、核酸、抗体断片、金属キレート、タンパク質および/またはペプ チドリガンドで構成されることを特徴とする請求項１〜13の少なくとも１項記載 の基質材料。 15．前記親和性を有する領域がニッケル/ニトリロトリ酢酸キレートに基づく金 属キレートで構成され、かつ、アニオン交換性を有する領域が核酸を結合しうる 材料で構成されていることを特徴とする請求項１〜14の少なくとも1項記載の基 質材料。 16．生体高分子の進化論的最適化の方法であって、遺伝子型および表現型を１つ の基質材料に同時に結合し、ついで選択的または同時にこれらを単離する方法。 17．１つの反応容器中で行われる請求項16記載の方法であって、遺伝子型を提示 する構造型に突然変異を誘発し、少なくとも１回の該構造型の複製ステップを介 し、発現後、該発現産物を遺伝子型と共に基質材料に結合し、発現産物の評価を 行うことを特徴とする請求項16記載の方法。