JPH08505055A

JPH08505055A - 新規好中球抑制剤

Info

Publication number: JPH08505055A
Application number: JP6515483A
Authority: JP
Inventors: モイル、マシュー; フォスター、デイビッド・リー; ブラスク、ジョージ・フィリップ
Original assignee: コルバス・インターナショナル、インコーポレイテッド
Priority date: 1992-12-24
Filing date: 1993-12-23
Publication date: 1996-06-04
Also published as: EP0682714A4; CA2152599A1; NZ261662A; AU6080594A; EP0682714A1; NZ314241A; WO1994014973A1; AU694103B2

Abstract

(57)【要約】血管内皮細胞への接着を含む好中球の活性を抑制する、好中球抑制因子の濃縮組成物を提供する。さらに、好中球活性をやはり抑制する組替え好中球抑制因子を提供する。この組成物には線虫から単離した糖タンパク質を含有していてよい。これらの組成物および組替え好中球抑制因子は、異常で好ましくない炎症応答を含む症状の治療に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】新規好中球抑制剤関連出願の開示本出願は、１９９２年５月１１日に出願された米国特許願第０７／８８１,７２１号の一部継続出願である、１９９２年１２月２４日に出願された米国特許願第０７／９９６,９７２号の一部継続出願である、１９９３年５月１１日に出願された米国特許願第０８／０６０,４３３号の一部継続出願である、１９９３年１１月１０日に出願された米国特許願第０８／１５１,０６４号の一部継続出願である。これらの出願の開示は本明細書に参考として含まれる。発明の分野本発明はＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８インテグリン複合体またはＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８インテグリン複合体のＩ−ドメイン部分と相互作用し、白血球の活性を抑制する因子に関する。この因子は好中球の活性化および血管内皮細胞に対する好中球の接着を含む、好中球の活性化を抑制する。この因子はさらに、血管内皮細胞に対する好酸球の接着の抑制を含む、好酸球活性に対する抑制作用も有する。発明の背景白血球はリンパ球、単球および顆粒球からなる細胞群である。リンパ球の内にはＴ−細胞（ヘルパーＴ−細胞および細胞障害性もしくはサプレッサーＴ細胞として）、Ｂ−細胞（循環性Ｂ−細胞および形質細胞として）、第３種類もしくはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および抗原提示細胞を含む。単球の内には、流血中単核球、クッパー細胞、糸球体内メサンギアル細胞、肺胞マクロファージ、漿膜マクロファージ、ミクログリア、脾洞マクロファージ、リンパ洞マクロファージを含む。顆粒球には好塩基球、肥満細胞（粘膜性肥満細胞および結合組織肥満細胞を含む）を含む。好中球は微生物に対する宿主防御系において、重要な成分である。創傷部位の細胞から放出された可溶性免疫メディエーターに対する応答において、好中球は血管壁を通って血流から組織へと集まる。創傷部位において、活性化された好中球は外来細胞を、貪食作用、または酸化剤、プロテアーゼ類およびサイトカイン類のごとき細胞殺傷性物質を放出して殺す。感染に対する攻撃における重要性の外に、好中球はそれ自身で組織のダメージを促進させ得る。異常な炎症応答の間、好中球は血管壁上または非創傷組織内において毒性物質を放出することによって、組織のダメージの重要な原因となり得る。または、毛細血管壁にこびりついていたり、静脈内に堆積している好中球は、虚血によって組織にダメージを与えることがある。かかる異常な炎症応答は、成人呼吸困難症候群（adult respirat ory distress syndrome：ARDS）、心筋梗塞、ショック、拍動および臓器移植の後の虚血−再循環損傷；急性および慢性同種移植片拒絶；脈管炎；敗血症；リューマチ性関節炎；炎症性皮膚疾患を含むさまざまな臨床疾患の病因となっているハーラン（Harlan）ら、イムノロジー・レビュー（Immunol.Rev.）114,5）。好中球の炎症部位への接着は少なくとも２つの別個の細胞−細胞相互作用を含むと考えられている。最初に炎症組織の近傍の血管内皮が好中球に対して粘着性となる；好中球はこの内皮と低親和性結合機構を介して、「ローリング」として知られている工程において相互作用する。第２の接着ステップにおいて、ローリングしている好中球は血管内皮細胞へより密着し、血管から組織へと移動する。作用を受けた血管セグメント上の好中球のローリングおよび好中球類と内皮との間の他の初期の低親和性接触はセレクチン（selectin）類と称する一群の単量体積分膜糖タンパク質によって媒介される。これまでに確認された三種のセレクチン、即ち好中球表面に存在するＬ−セレクチン（ＬＥＣＡＭ−１、ＬＡＭ−１）、内皮細胞上に存在するＥ−セレクチン（内皮白血球接着分子−１；ＥＬＡＭ −１）および内皮細胞上に発現するＰ−セレクチン（顆粒膜タンパク質−１４０、即ちＧＭＰ−１４０；血小板活性依存性顆粒外部膜タンパク質、即ちＰＡＤＧＥＭ；ＣＤ６２）は、すべて血管内皮細胞への好中球の接着と関連がある〔ジュティラ他（Jutila）、ジャーナル・オブ・イムノロジー（J．Immunol）、第１４３巻、第３３１８頁、１９８９年；ワトソン他（Watson）、ネイチャー、第３４９巻、第１６４頁、１９９１年；ミュリガン他（Mulligan）、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲイション、（J．C1in．Invest.）、第８８巻、第１３９６頁；ガンデル他（Gundel）、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲイション、（J．Clin．Invest.）、第８８巻、第１４０７頁、１９９１年；ジェング他（Ge ng）、ネイチャー、第３４３巻、第７５７頁、１９９０年；ペイテル他（Patel ）、ジャーナル・セル・バイオロジー（J．Cell Biol.）、第１１２巻、第７４９頁、１９９１年〕。Ｅ−セレクチンに対するカウンター−レセプターは細胞表面糖タンパク質上に存在するシアル酸化ルイス（sialylated Lewis）Ｘ抗原（si alyl-Lewis^x）であることが報告されている〔フィリップス他（Phillips）、サイエンス、第２５０巻、第１１３０頁、１９９０年；ウォルツ他（Walz）、サイエンス、第２５０巻、第１１３２頁、１９９０年；ティーマイヤー他（Tiemeyer ）、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.（USA））、第８８巻、第１１３８頁、１９９１年；ロウエ他（Lowe）、セル（Cell）、第６３巻、第４７５頁、１９９０年〕。また他のセレクチン類に対するレセプター類は天然の炭水化物であると考えられているが、まだ解明されていない。好中球と内皮細胞とのより安定な第２の接触は一群のインテグリン（integrin s）類として知られている細胞接着分子類によって媒介される。インテグリン類は広範囲の、進化の過程において保存された（evolutionaly conserved）、事実上すべての型の細胞に存在するヘテロダイメリックな膜間糖タンパク質コンプレックスを含む。ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８（ＬＦＡ−１）およびＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８（Ｍａｃ−１、Ｍｏ−１またはＣＲ３）を含むインテグリン類の白血球に特異的なＣＤ１８（β₂）ファミリーのメンバーは好中球が内皮細胞に接着するのを媒介するということが報告されている〔ラーソンおよびスプリンガー（Larson a nd Springer）、イムノロジー・レビュー（Immunol Rev.）、第１１４巻、第１８１頁、１９９０年参照〕。これらのインテグリンに対する内皮細胞のカウンター−レセプターは、それぞれＣＤ１１ａ／ＣＤ１８に対する細胞間細胞接着分子ＩＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−２、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８に対する細胞間細胞接着分子ＩＣＡＭ−１である〔ロスライン他（Rothlein）、ジャーナル・オブ・イムノロジー（J.Immnol.）、第１３７巻、第１２７０頁、１９８６年；シュタウントン他（Staunton）、セル、第５２巻、第９２５頁、１９８８年；シュタウントン他、ネイチャー、第３３９巻、第６１頁、１９８９年〕。ＩＣＡＭ類は免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである単量体膜間タンパク質である。ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８インテグリンは、単球、マクロファージ、顆粒球、大顆粒リンパ球（ＮＫ細胞）および未成熟ＣＤ５⁺Ｂ細胞を含む様々な白血球上に発現している（キシモト、ラーソン（Larson R.S.）、コルビ（Corbi，A.L.）、ダスティン（Dustin，M.L.）、スタウントン（Staunton，D.E.）およびスプリガー（Spriger，T.A.）（1989）アドバンス・イン・イムノロジー（Adv．in Immunol .）46、149〜182）。ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８は好中球の内皮細胞への接着（プリエト（Prieto，J.）、ベティー（Beatty，P.G.）、クラーク（Clark，E.A.）、パタロジョ（Patarroyo，M.）（1988）イムノロジー63，631-637；ウォリス（Wa llis，W.J.）、ヒクスタイン（Hickstein，D.D.）、シュワルツ（Schwarts，B.R .）、ジューン（June，C.H.）、オークス（Ochs，H.D.）、ベティー（Beatty，P .G.）、クレバノフ（Klebanoff，S.J.）、およびハーラン（Harlan，J.M.）（19 86）ブラッド67，1007-1013；スミス（Smith，C.W.）、マーリン（Marlin，S.D. ）、ロスライン（Rothlein，R.）、トーマンム（Tomanm，C.）およびアンダーソン（Anderson，D.C.）（1989）ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（J.Clin．Invest.）83，2008-2017）、および好中球からの過酸化水素の放出（シャッペル（Shappell，S.B.）、トマン（Toman，C.）、アンダーソン（Anderson，D.C.）、テイラー（Taylor，A.A.）、エントマン（Entman，M.L.）およびスミス（Smith，C.W.）（1990）ジャーナル・オブイムノロジー144，2792 -2711；フォン・アスムス（Von Asmuth，E.J.）、バウールマン（Bauurman，W.A .）（1991）ジャーナル・オブイムノロジー147，3869-3875）を含む様々な白血球の機能に関与すると考えられている。このインテグリンは、オプソニン化された（例えばＣ３ｂに被覆された）標的に対する好中球および単球による貪食において、ある役割を果たし得る（ベラー（Beller，D.I.）、スプリンガー（Spring er，T.A.）、シュライバー（Schreiber，R.D.）（1982）ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン156,1000-1009）。ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８がＣ３ｂｉに被覆された標的細胞に対するナチュラルキラー活性を増強することも報告されている（ラモス（Ramos，O.F.）、カイ（Kai，C.）、イェフェノフ（Yefeno f，E.）およびクライン（Klein，E.）（1988）ジャーナル・オブイムノロジー140，1239-1243）。内皮細胞と好中球の活性化は好中球媒介炎症の重要な成分を表すと考えられている。細胞活性化を誘発する因子はアゴニストと名付けられている。腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）およびインターロイキン−１（ＩＬ−１α）のような小さい調節タンパク質を含む内皮細胞アゴニスト類は障害のある部位の細胞によって放出される。内皮細胞が活性化されることにより、ＩＣＡＭ−１〔シュタウントン他、セル、第５２巻、第９２５頁、１９８８年〕およびＥＬＡＭ−１〔ベビラッカー他（Bevilacqua）、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ、第８４巻、第９２３８頁、１９８７年〕の表面発現が増加する。活性化内皮細胞の表面上にこれら接着分子が高レベルに発現することにより、傷害部位近くに血管内皮細胞に対する好中球類の接着の増加が観測される。好中球の活性化により、形状変化を含む生理的状態、外部侵入物を貪食する能力および細胞内顆粒からの細胞傷害性物質の放出に大きな変化を生じる。更に、活性化により、おそらく好中球表面上のＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８インテグリン複合体内の構造変化を通して、好中球と血管内皮細胞の間の接着接触の親和性が著しく増加する〔ベッダーおよびハーラン（Vedder and Har1an）著、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲイション（J．Clin．Invest.）第８１巻、第６７６頁、１９８８年；ブイヨン他（Buyon）、ジャーナル・オブ・イムノロジー第１４０巻、第３１５６頁、１９８８年〕。好中球活性化を誘発すると報告されている因子には、ＩＬ−１α、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１、ＩＬ −８（ＩＬ−８：インターロイキン−８、ＧＭ−ＣＳＦ：顆粒球／単球−コロニー刺激因子、Ｇ−ＣＳＦ：顆粒球−コロニー刺激因子）、ＴＮＦα、補体Ｃ５α フラグメント、微生物誘導ペプチドであるフォルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅおよび脂質様分子ロイコトリエンＢ₄（ＬＴＢ₄）および血小板活性因子が含まれる〔フォルテスおよびナタン（Fuortes and Nathan）、「モレキュラー・ベイシス・オブ・オキシデイティブ・ダメージ・バイ・ロイコサイツ（Molecular Basi sof Oxidative Damage by Leukocytes）」、ジェサイテス・エイ・ジェーおよびドラッツ・イー・エー（Jesaitis，A.J．and Dratz，E.A.）編集、シ・アール・シー出版（ＣＲＣ Press）、第８１−９０頁，１９９２年〕。加えて、ホルボールエステル類（例えば、ホルボール１２ミリステート１３アセテート；ＰＭＡ）は強力な合成脂質様好中球アゴニストとして提案されている。ＰＭＡを除いて、これらのアゴニストは好中球表面のレセプターに結合することによって好中球を活性化することが報告されている。アゴニスト分子によって占められているレセプター類は好中球の内部で、最終的に好中球の活性化を伴う生理学的変化をもたらすカスケード反応を開始すると考えられている。この工程はシグナル・トランスダクション（signal transduction）として知られている。脂質様ＰＭＡが、細胞表面で形質膜を通って、およびシグナル・トランスダクション機構の細胞内成分（即ち、タンパク質キナーゼ）と直接相互作用して好中球活性に影響を及ぼすと考えられている。好中球の機能を抑制すると報告されている化合物には一般にふたつの群が存在し、これらの化合物は炎症を軽減することが報告されている。抗炎症性化合物のひとつの群は、シグナルトランスダクション機構の成分に作用することにより、好中球活性化、そして恐らく接着のインヒビターとして機能すると言われている。抗炎症性化合物の第２の群は、好中球と血管内皮細胞との接触を媒介する接着レセプターの直接のインヒビターとして作用することによって、好中球が炎症病巣へ侵入するのを抑制すると言われている。治療薬として現在用いられている、プロスタグランジン類、カテコールアミン類、および非ステロイド系抗炎症性医薬（ＮＳＡＩＤｓ）として知られている一群の試薬を含む、抗炎症性化合物の多くは第１のカテゴリーに入ると考えられている〔ショウェルおよびウイリアムス（Showell and Williams）、イムノファーマコロジー（Immunopharmacology）、ギルマン・エス・シーおよびロジャース・ティー・ジェー（Gilman，S.C．and Rogers，T.J.）編集、テルフォード出版（T elford Press）、ニューヨーク、第２３−６３頁、１９８９年〕。例えば、ＴＮＦａによってる活性化された好中球で観察された進んだ接着はシグナルトランスダクションの媒介体サイクリックＡＭＰ〔ｃＡＭＰ；ナタンおよびサンチャズ（ Natan and Sanchez）著、ジェイ・シー・ビー（ＪＣＢ）、第１１１巻、第２１７１頁、１９９０年〕が減少したことと関係がある。プロスタグランジンおよびカテコールアミンへの好中球の暴露により細胞内サイクリックＡＭＰが高レベルとなることが関連づけられている〔ｃＡＭＰ；ショウェルおよびウイリアムス（Showell and Williams）、１９８９年〕。シグナルトランスダクションインヒビター類は広く抗炎症性治療薬として用いられてきたが、それらは急性の炎症状況での効果が薄いこと、特異性がないこと、および胃または腸潰瘍発生、血小板や中枢神経系機能の障害および腎臓機能の変化といった好ましくない副作用を含む幾つかの欠点があった〔インセル（Insel）著、ザ・ファーマコロジカル・ベイシス・オブ・セラピューティクス（The Phermacological Basis of Therapeutics）、ギルマン、エー・ジー（Gilman，A.G.）、レイル、ティー・ダブリュー（Rall，T.W.）、ニーズ、エイ・エス（Nies，A.S.）およびテイラー、ピー（Tay1or，P.）編集、パーガモン出版、ニューヨーク、第８版、第６３８−６８１頁、１９９０年〕。グルココルチコイド類は長い間その抗炎症特性が認められてきた。接着を含むいくつかの好中球作用に対して、好中球に対するするステロイドに誘発される抑制作用が報告されている〔クラーク他（Clark）、ブラッド（Blood）、第５３巻、第６３３−６４１頁、１９７９年；マグレガー（Macgregor）著、アナルズ・オブ・インタナショナル・メディシン（Ann.Intern.Med.）、第８６巻、第３５ −３９頁、１９７７年〕。グルココルチコイド類が好中球機能を調節する機構はよく分かっていないが、一般には炎症プロセスで中心的な役割を演じる好中球を処理して、該好中球での新しいタンパク質の増幅または抑圧を含むものと考えられている〔ニュドセン他（Knudsen）、ジャーナル・オブ・イムノロジー（J.Imm unol.）、第１３９巻、第４１２９頁、１９８７年〕。特にその発現がグルココルチコイドによって好中球中に誘発される、リポコルチンとして知られている一群のタンパク質は抗炎症特性と関係づけられてきた〔フラワー（F1ower）著、ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ファーマコロジー（Br.J.Phermaco1.）、第９４巻、第９８７−１０１５頁、１９８９年〕。リポコルチン類は、好中球表面の部位と相互作用することによって抗好中球作用を発揮するかもしれない〔カミュッシ他（Camussi）、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（J .Exp.Med.）、第１７１巻、第９１３−９２７頁、１９９０年〕が、リポコルチンが好中球上で直接接着タンパク質を阻止するように働くということを暗示する証拠はない。これらの有益な抗炎症特性とは別に、グルココルチコイド類は重要な副作用が関係する。これには、下垂体副腎皮質機能の抑圧、流体および電解質変調、高血圧、高血糖症、糖尿、感染し易さ、潰瘍、骨粗鬆症、筋症、成長および行動変調の停止が含まれる〔インセル、１９９０年〕。血管内皮細胞への好中球接着の直接のインヒビターとして報告されている第２の群の抗炎症性化合物はモノクローナル抗体である。これらの接着分子のいくつかの配位子結合機能を認識し阻止するモノクローナル抗体類は好中球媒介炎症の臨床での効果的なインヒビターであることが報告されている。特に、好中球表面上のＣＤ１８インテグリンコンプレックス（即ち、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８およびＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８）のＣＤ１８サブユニットに対するモノクローナル抗体類は動物モデルで、再潅流によって誘発される肺浮腫〔ホーガン他（Horgan）、アメリカン・ジャーナル・オブ・フィジオロジー（Am．J ．Physiol.）、第２５９巻、第Ｌ３１５−Ｌ３１９頁、１９９０年〕、出血性ショックにより誘発される器官傷害〔マイルスキー他（Mileski）、サージェリー（Surgery）、第１０８巻、第２０６−２１２頁、１９９０年〕、虚血／再潅流に伴う心筋傷害〔ウィンキスト他（Winquist）、サーキュレーション、III−７０１、１９９０年〕、耳の虚血／再潅流に伴う浮腫および組織破壊〔ヴェッダー他（Vedder）、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ、第８７巻、第２６４３−２６４６頁、１９９０年〕、細菌性骨膜炎により生じる脳浮腫および脳死〔チュオマーネン他（Tuomanen）、ジャーナル・オブ・エキスペリメンタル・メディシン、第１７０巻、第９５６−９６８頁、１９８９年〕、内毒素ショックによる血管の障害および死〔トーマス他（Thomas ）、エフ・エイ・エス・イー・ビ・ジャーナル（ＦＡＳＥＢＪ．）、第５巻、第Ａ５０９頁、１９９１年〕およびインドメタシン誘発胃障害〔ウォレス他（Wa llace）、ガストロエンタロロジー（Gastroenterology）、第１００巻、第８７８−８８３頁、１９９１年〕を含む種々の好中球媒介組織傷害を抑制することが示されている。ＣＤ１１ｂサブユニットを狙いとしたモノクローナル抗体が記載されている。例えばつぎのものを参照：トッド、アール・エフ他（Todd，R.F.）、米国特許第４,８４０,７９３号明細書（１９８９.６.２０）；トッド、アール・エフ他（To dd，R.F.）、米国特許第４,９３５,２３４号明細書（１９９０.６.１９）；シュロッスマン、エス・エフ他（Schlossman，S.F.）、米国特許第５,０１９,６４８号明細書（１９９１.５.２８）およびルッシェ、ジェイ・アール他（Rusche）、国際出願第ＷＯ９２／１１８７０号（１９９２.７.２３）。ＣＤ１８サブユニットを狙いとしたモノクローナル抗体が記載されている。例えばつぎのものを参照：オーファーズ、ケイ・イー（Aufors，K.E.）、米国特許第４,７９７,２７７号明細書（１９８９.１.１０）；ライト、エス・ディー他（Wright，S.D.）、欧州特許出願第３４６,０７８号（１９８９.１２.１３）；ロー、エム他（Raw，M.）、欧州特許出願第４３８,３１２号（１９９１.７.２４）；ロー、エム他（Raw， M.）、欧州特許出願第４４０,３５１号（１９９１.８.７）；ライト、エス・ディ他（Wright，S.D.）、米国特許第５,１４７,６３７号明細書（１９９２.９.１５）およびウェグナー、シー・ディー他（Wegner，）.、欧州特許出願第５０７, １８７号（１９９２.１０.７）。他の接着分子に対する抗体類も抗炎症特性を有することが報告されている。ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８およびＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８のカウンター−レセプター、I ＣＡＭ−１を認識するモノクローナル抗体は同種心臓移植患者の生存を延長すること〔フラビン他（Flavin）、トランスプランテーション・プロシーディングス（Transplant．Proc.）、第２３巻、第５３３−５３４頁,１９９１年〕および化学的に誘発された肺の炎症を抑制すること［バートン他（Barton）、ジャーナル・オブ・イムノロジー（J．Immunol.）、第１４３巻、第１２７８−１２８２頁、１９８９年〕が報告されている。更に、抗セレクチンモノクローナル抗体類も好中球媒介炎症の動物モデルで有効であったとして報告されている。Ｌ−セレクチンに対するモノクローナル抗体類は炎症を起こしている皮膚〔ルインション他（Lewinshon）、ジャーナル・オブ・イムノロジー（J．Immunol.）、第１３８巻、第４３１３頁、１９８７年〕および炎症を起こしている腹水〔ジュティラ他（ Jutila）、ジャーナル・オブ・イムノロジー（J．Immunol.）、第１４３巻、第３３１８頁、１９８９年；ワトソン他（Watson）、ネイチャー、第３４９巻、第１６４頁、１９９１年〕への好中球の移動を妨げることが報告されている。報告はまた炎症を起こしている肺組織への好中球の浸潤が抗Ｅ−セレクチンモノクローナル抗体によって抑制されることを記載している〔ミュリガン他（Mulligan）、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲイション（J．Clin．Invest.）、第８８巻、第１３９６頁、１９９１年；ギュンデル他（Gundel）、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲイション（J．Clin．Invest.）、第８８巻、第１４０７頁、１９９１年〕。接着タンパク質に対するモノクローナル抗体の活性に関する報告は、抗炎症性薬剤として好中球接着インヒビターを使用する実用可能性を示していると言われているが、このようなこのようなモノクローナル抗体を治療薬として使用するには更に評価が必要である。遺伝子工学によって得られる可溶性接着レセプター類は、抗炎症性化合物として提案されている。可溶性レセプターとは膜間および細胞内領域がＤＮＡ組替え技術によって欠失しているものであるが、これが内皮細胞への好中球接着を抑制することが報告されている。組替え可溶性接着分子の機能的使用を、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８を用いておこなったもの〔ダナ他（Dana）、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ、第８８巻、第３１０６− ３１１０頁、１９９１年〕およびＬ−セレクチンを用いておこなったもの〔ワトソン他（Watson）、ネイチャー1991年〕が報告されている。最近、「ロイメディン（Ieumedins）」と集合的に呼ばれる抗白血球化合物の新しい一群が報告された。これらの化合物は、臨床でＴ−リンパ細胞および好中球が炎症部位へ入るのを阻止することを報告している。ロイメディン類の作用機構は明確でないが、これらが好中球の活性化を抑制して機能するのでないという証拠がある〔バーチ他（Burch）、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ、第８８巻、第３５５頁、１９９１年〕。ロイメディン類が接着分子と直接干渉することにより好中球の侵入を抑制するかどうかはまだ確かめられていない。機構は未だはっきりしないままであるが、宿主の免疫性および炎症応答性を調節することによって、寄生虫がその宿主の中で生存すると言われている〔レイド、ダブリュ・エス（Leid，W.S.）、ヴェタリナリ・パラシトロジー（Veterinary Parasitology）、第２５巻、第１４７頁、１９８７年〕。これに関して、寄生虫−誘発免疫抑制がある種のげっ歯類動物モデルを用いて報告されている〔ソウルスビー他（Soulsby）、イムノロジー・レターズ（Immunol Lett.）、第１６巻、第３１５−３２０頁、１９８７年〕。免疫的攻撃からのがれるための蠕虫による宿主免疫系の調節に関する様々な見解についての総説が近年出された（マイゼルス他（Mizels）、ネイチャー、第３６５巻、第７９７−８０５頁、１９９３年）。様々な寄生虫が宿主の好中球に対して影響を及ぼすことが報告されている。例えば、条虫類から単離したタンパク質、テエニア・タエニエフォルミス（Taenia taeniaeformis ）はウマ好中球類の化学走性および化学動性を抑制し、また好中球凝集を抑制することが報告されている〔シー・スケット他（C.Suquet）、インタナショナル・ジャーナル・オブ・パラシトロジー（Int’lJ．Parasitol.）、第１４巻、第１６５頁、１９８４年；レイド、アール・ダブリュ他（Leid，R.W. ）著、パラサイト・イムノロジー（Parasite Immunology）、第９巻、第１９５頁、１９８７年；およびレイド、アール・ダブリュ他、インタナショナル・ジャーナル・オブ・パラシトロジー、第１７巻、第１３４９頁、１９８９年〕。条虫、エキノコッカス・ムルチオキュラリス（Echinococcus multiocularis）に感染したネズミから単離した腹膜好中球は感染後時間が経つにつれて、寄生虫抗原および非特定の化学誘因物質（chemoattractant）への移動能力を喪失することが報告されている〔アルカルミ、ティー他（Alkarmi，T.）、エクスペリメンタル・パラシトロジー（Exptl．Parasitol.）、第６９巻、第１６頁、１９８９年〕。線虫、トリキネラ・スピラリス（Trichinella spiralis）は、化学走性およびｐ−ニトロブルーテトラゾリウム還元を抑制する因子を排除または分泌する（例えば、酸化性代謝物の放出）が、人の好中球の化学動性を強めることが報告されている〔ブラッシ、エフ他（Bruschi，F.）、ウィアドモッシ・パラツィトロギツン（Wiadomosci Parazytologiczne）、第３５巻、第３９１頁、１９８９年〕。線虫、トリキネラ・スピラリスに感染した人の血清は白血球の化学走性および貪食作用を抑制すると報告されている〔ブラッシ、エフ他著、ジャーナル・オブ・パラシトロジー（J. Parasitol.）、第７６巻、第５７７頁、１９９０年〕。マダニ、イクソデス・ダミニ（Ixodes dammini）の唾液は好中球の機能を抑制することが報告されている〔リベイロ他（Ribeiro）、エクスペリメンタル・パラシトロジー、第７０巻、第３８２頁、１９９０年〕。条虫エキノコッカス・グラニュロサス（Echinococc us granulosus ）によって分泌されるタンパク質は人の好中球化学走性を抑制することが報告されている〔シェパード、シー・ジェー他（Shepard，J．C.）、モレキュラー・アンド・バイオケミカル・パラシトロジー（Mol．Biochem．Parasi tol.）、第４４巻、第８１頁、１９９１年〕。病原の侵入に対する宿主防御機構における他の成分は好酸球である。好酸球と好中球は、貪食能を有し、直接もしくは間接的に病原となる物質に対して毒性となる化合物の放出能を有するという点で両者は機能的には同一である。好酸球はその形態的特徴、成分、産生物および特別な疾患との関与によって好中球から区別される。好酸球はインビトロにおいてバクテリアに対する殺傷能力が認められているにもかかわらず、この種の白血球単独ではインビボにおいてはバクテリアによる感染からの防御には不十分であると考えられている。代わりに、好酸球は寄生回虫のごとき大型の生物に対する初期防御に役立つと考えられている（ブッターワース（Butterworth AE）、1984;アドバンス・イン・パラシトール（Adv． Parasitol.）23:143-235）。さらに、好酸球はある種の炎症性疾患において主要な役割を果たし得ることは広く支持されている。特に好酸球から放出される物質の主なものは塩基性タンパク質、好酸球カチオン性タンパク質および好酸球誘導性ニューロトキシンを含む、全体でカチオン性顆粒タンパク質として知られているものであり、喘息（グレイクとアドルフソン（Gleich GJ and Adolphson，CR ，1986;アドバンス・イン・イムノロジー39:177-253）、炎症性腸疾患（ヘーレン（Hallren，R）1989;アメリカン・ジャーナル・オブ・メディシン86:56-64）およびアトピー性皮膚疾患（ツダら、1992ジャーナル・オブ・ダーマトロジー19 :208-213）。さらに、スーパーオキシドアニオン類、ヒドロキシルラジカル類およびシングレット酸素のごとき他の好酸球産生物もまた、炎症性疾患症状において宿主組織に対するダメージを与えると考えられている（パトリシア（Petreccia，DC）ら、1987、ジャーナル・オブ・ロイコサイト・バイオロジー41:283-288;カノフスキー（Kanofsky ，JR）ら、1988;ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー263:9692-96 96）。好酸球が媒介する炎症疾患における初期段階では好酸球が血管のコンパートメントから組織へ移動すると考えられている。この血管浸出工程においての第１段階は、好酸球の血管内皮口径への接着であると報告されている。好酸球−内皮細胞接着機構は好中球の接着機構ほど詳しくは知られていないが、好酸球の表面上のインテグリンのＣＤ１１／ＣＤ１８ファミリーの一員が好酸球−内皮接着に関与していることが報告されている（ラマス（Lamas，AM）ら、（1988）ジャーナル・オブ・イムノロジー、140、1500;ワルシュ（Walsh，GM）ら、（1990）イムノロジー、71、258）、および内皮細胞のカウンターレセプターはＩＣＡＭ−１様であることが報告されている（ウエグナーＣＤら、1990;サイエンス247:456-4 59）。ＶＬＡ−４（ベリー・レート抗原４、ａ４ｂ１）として知られている、好酸球、リンパ球および単球上には存在するが好中球上には存在しない第２のインテグリンは、内皮細胞表面上に発現しているＶＣＡＭ−１（血管細胞接着分子− １）へ結合することによって好酸球の接着に寄与していると考えられる（ドブリナ（Dobrina，A.）ら、1991、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション88:20）。内皮細胞単層膜のＩＬ−１処理によってヒトの好塩基球、好酸球および好中球に対する接着性が向上することが報告されているが、この内皮細胞をＶＡＣＭ−１に対する抗体で処理すると好塩基球および好酸球の両方の接着は抑制されるが、好中球の接着は抑制されないことが報告されている。ＶＡＣＭ−１に対するモノクローナル抗体は刺激された内皮に対するリンパ球および単球の接着を抑制することもまた報告されている（カルロス（Carlos）ら、（1990 ）ブロッド、76:965-970）;ライス（Rice）ら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（1990）、171:1369-1374）しかし、好中球に対する接着は抑制しない。好酸球の媒介する炎症を治療するためのアプローチは、好中球の媒介する炎症を治療するためのアプローチと同じである。例えば、好酸球の媒介する炎症のための強力な治療薬として研究されているものにはグルココルチコイド（エバンス（Evans，PM）ら、1993、ジャーナル・オブ・アレルギー・クリニカル・イムノロジー91:643-650）。好中球の機能を調節すると報告されている他の剤の場合も、これらの剤は比較的非特異的であり毒性を有することから最適なものではないと認められている。抗好酸球治療のための第２のアプローチは、好酸球の血管内皮への接着を直接的に抑制する化合物を用いるものである。動物の喘息モデルにおいて、ＩＣＡＭ−１に対するモノクローナル抗体が組織内への好酸球の侵入を抑止したことが報告されている。ウエグナーら、（1990）サイエンス、247:456- 459。ＩＣＡＭ−１およびその機能性誘導体が抗炎症剤として提案されている。アンダーソンら、欧州特許願第３１４,８６３号（１９８８年４月２９日）；ウエグナーら、国際出願第ＷＯ９０／１０４５３（１９９０年９月２０日）。しかしながら、好中球および好酸球の機能に対する、特に血管内皮への接着機能に対する高度に特異的で強力な抑制剤の必要性が、異常な顆粒球媒介炎症の治療のために残っている。本発明は好中球および好酸球の活性、特にこれらの顆粒球が血管内皮細胞へ接着する活性に対する強力で特異的な抑制剤で、アンサイロストマ・カニナム（Ancylostoma caninum））のごとき鉤虫および関連種から誘導される剤を提供する。発明の要旨他の因子の中で、本発明は、本発明の好中球抑制因子が抗炎症性治療薬の新世代の発展の先駆段階となるという発見に基づいている。本発明により、炎症性応答を特異的に抑制することにより炎症性疾患の初期治療が可能となるであろう。この新規なアプローチによる治療の利点は、好中球抑制因子の特異性によるものであり、ステロイド類、カテコールアミン類、プロスタグランジン類、および非ステロイド系抗炎症剤のような現行の臨床治療の薬剤使用とは異なる。現行使用されている治療薬類は、炎症過程に加えて多くの生物的過程を非特定的に標的とする全身的効果のために、効率が低く且つ多くの逆反応がある。それにもかかわらず、最適なものではないが、抗炎症薬の広範なリストの存在とこの分野の研究において医薬業界によって費やされた全資金とは、この医学的需要が相当なものであることを教えており、新規で高度に特定的な好中球抑制因子の本発見は重要な適用性があることを暗示している。発明の背景において述べたように炎症性応答によって、弱い関節炎や喘息から生命を脅かすようなショックに至る幅広い臨床的兆候が起こり得る。これらの疾患が強烈であること、非常に多くの人が苦しんでいることおよび適当な治療法がないことから、革新的な治療に対するニーズは、かなえられずに長い間求められていた。本発明の好中球抑制因子はこのような革新的技術を代表し、現在国際医学および医薬研究学会で幅広く探求されている生命を救うことのできる治療の可能性を提供する。さらに、好中球活性が関与していることが明かにされている所望しないおよび／または異常な炎症性症状が関与している無数の症状があるという観点からも、強力で特異性の高い好中球の機能を抑制する、特に血管内皮への接着を抑制する剤が、好中球の媒介する異常な炎症の治療のために望まれている。本発明はこの要求を、鉤虫、（アンサイロストマ・カニナム（Ancylostoma caniumu）のごとき）および関連種から誘導された、好中球活性、特に好中球の血管内皮細胞への接着に対する強力で特異的な抑制剤を開示する。本発明は好中球抑制因子（ＮＩＦ）および好中球抑制因子を豊富に含む組成物を狙いとしたものである。好中球抑制因子は天然のソースから単離しても、組み替え手法によって合成してもよい。好中球抑制因子は抗体、インテグリンまたはセレクチンファミリーの一員ではなく、接着性タンパク質の免疫グロブリンスーパーファミリーの一員でもないタンパク質であり、寄生虫から単離したときには糖タンパク質である。ある発現システムによって作り出される組替えＮＩＦ類はグリコシル化されている場合もいない場合もあり、またはグリコシル化の程度も様々である。しかし、かかるＮＩＦ類がグリコシル化されていてもいなくても本発明の範囲内である。本発明の好中球抑制因子は好中球抑制活性を示す。ある観点から、本発明のＮＩＦはその全アミノ酸配列中の一部として以下に示す群から選択されるアミノ酸配列：（ａ）Ａｒｇ−Ｘ₁−Ｘ₂−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｘ₃−Ｘ₄−Ｈｉｓ−Ａｓｎ− Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｘ₅−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｘ₆−Ｘ₇−Ｉｌｅ（式中、Ｘ₁はＬｅｕまたはＡｒｇである；Ｘ₂はＧｌｎ、ＬｙｓまたはＡｒｇである；Ｘ₃はＡｌａまたはＡｒｇである；Ｘ₄はＬｅｕまたはＭｅｔである；Ｘ₅ はＬｙｓ、Ａｒｇ、ＬｅｕまたはＩｌｅである；Ｘ₆はＶａｌまたはＩｌｅである；Ｘ₇はＳｅｒ、ＧｌｙまたはＡｓｎである）、（ｂ）Ａｌａ−Ｘ₈−Ｘ₉−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｘ₁₀−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｘ₁₁− Ｌｅｕ−Ｘ₁₂−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｘ₁₃−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｘ₁₄−Ｓｅｒ −Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｘ₁₅−Ｓｅｒ−Ａｌａ（式中、Ｘ₈はＨｉｓまたはＰｒｏである；Ｘ₉はＴｈｒ、ＡｒｇまたはＳｅｒである；Ｘ₁₀はＡｒｇまたはＬｙｓである；Ｘ₁₁はＩｌｅまたはＴｙｒである；Ｘ₁₂ はＡｓｐ、ＬｙｓまたはＧｌｕである；Ｘ₁₃はＡｓｐまたはＧｌｕである；Ｘ₁₄ はＧｌｙ、ＬｙｓまたはＡｒｇである；Ｘ₁₅はＧｌｕ、Ｍｅｔ、ＴｈｒまたはＶａｌである）、（ｃ）Ｓｅｒ−Ｘ₁₆−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｘ₁₇−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｘ₁₈−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｘ₁₉−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ −Ｖａｌ−Ｘ₂₀−Ｃｙｓ（式中、Ｘ₁₆はＡｓｎまたはＡｓｐである；Ｘ₁₇はＶａｌまたはＬｅｕである；Ｘ₁₈はＡｌａまたはＴｈｒである；Ｘ₁₉はＬｅｕ、ＶａｌまたはＰｈｅである；Ｘ₂₀はＴｈｒ、ＬｙｓまたはＡｓｎである）、（ｄ）Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｘ₂₁−Ｘ₂₂−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ（式中、Ｘ₂₁はＴｙｒまたはＩｌｅである；Ｘ₂₂はＧｌｙまたは残基のないことを示す）、（ｅ）Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｘ₂₃−Ｘ₂₄−Ｇｌｙ−Ｘ₂₅−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｘ₂₆ −Ｘ₂₇−Ｃｙｓ−Ｘ₂₈−Ｘ₂₉−Ｔｙｒ（式中、Ｘ₂₃はＴｈｒ、Ｓｅｒ、ＬｙｓまたはＧｌｕである；Ｘ₂₄はＴｈｒ、ＶａｌまたはＩｌｅである；Ｘ₂₅はＶａｌ、ＬｙｓまたはＴｈｒである；Ｘ₂₆はＡｒｇ、ＳｅｒまたはＡｓｐである；Ｘ₂₇はＡｓｎ、Ｇｌｙ、ＡｓｐまたはＡｒｇである；Ｘ₂₈はＡｓｎ、ＳｅｒまたはＴｈｒである；Ｘ₂₉はＧｌｙ、ＧｌｕまたはＡｓｐである）、および（ｆ）Ｃｙｓ−Ｘ₃₀−Ｘ₃₁−Ａｓｐ−Ｘ₃₂−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｘ₃₃ −Ｉｌｅ（式中、Ｘ₃₀はＨｉｓ、ＩｌｅまたはＡｓｎである；Ｘ₃₁はＡｌａ、ＰｒｏまたはＡｓｐである；Ｘ₃₂はＧｌｕ、Ｖａｌ、ＡｓｐまたはＩｌｅである；Ｘ₃₃はＩｌｅ、ＶａｌまたはＰｈｅである）を有する。かかるＮＩＦは好中球抑制活性を示す。他の観点から、本発明は特定のアスパラギン残基がグルタミンで置換されているＮＩＦの変異体も含む。この置換によってこのＮＩＦのグリコシレーションが低下すると考えられる。変異ＮＩＦには全アミノ酸配列の一部として上記（ａ）から（ｆ）に示したペプチドからなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する。かかるＮＩＦは好中球抑制活性を有する。他の観点から、本発明は全アミノ酸配列の一部として、特定の核酸プローブに対してハイブリダイズするのに十分な相補性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含有するＮＩＦを提供する。かかるＮＩＦは好中球抑制活性を示す。本発明の範囲内には、かかる核酸プローブも含有する。他の観点から、本発明はＮＩＦをコード化し、本願で記載したごとく単離された核酸分子を提供する。かかる単離された核酸分子にはＮＩＦをコード化する核酸配列を含む発現ベクターを含有している。本発明にはまた、かかる発現ベクターによって形質転換された宿主細胞も含む。他の観点から、本発明は生物活性なＮＩＦを製造する方法、すなわちＮＩＦが発現され、所望により分泌されるような方法を提供する。本発明にはさらにこれらの方法によって製造されるＮＩＦも含まれる。他の観点から、本発明はｃＤＮＡライブラリーをＮＩＦを含有していると予測されるソースから調製し、本発明のあるオリゴヌクレオチドプローブを該ソースからの核酸分子とハイブリダイズさせる工程を含むＮＩＦの製造方法を提供する。かかるＮＩＦは好中球抑制活性を示す。本発明にはまた、これらの方法にて製造されるＮＩＦも含有する。他の観点から、本発明はある試料においてＮＩＦをコード化する核酸分子の存在を検索する方法を提供する。この方法にはかかる核酸分子が含有されていると考えられる試料へ本発明のプローブを適用し、ハイブリダイズしたプローブの存在を検出する工程を含む。他の観点から、本発明はＮＩＦに結合するモノクローナル抗体を提供する。本発明にはまた、かかる抗体を産生するハイブリドーマセルライン、かかるモノクローナル抗体を用いたＮＩＦの精製方法および試料中のＮＩＦの存在をかかる抗体を用いて検出する方法も含む。他の観点から、本発明はＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体への結合において、ＮＩＦと競合するＮＩＦのミミックを試料中から検出する方法を提供する。かかる方法には試料をＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体と接触させる工程を含む。本発明はさらにＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８のＩ−ドメイン部分への結合においてＮＩＦと競合するＮＩＦのミミックを試料中から検出する方法を提供するが、この方法はＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体のＩ−ドメインを有する組替えペプチドを試料に接触させる工程を含む。かかるＮＩＦのミミックは好中球抑制活性を示す。本発明にはまた、これらの方法によって検出されるＮＩＦミミックも含む。他の観点から、本発明はＮＩＦがＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体に結合するのを妨害するＮＩＦアンタゴニストを試料中から検出する方法を提供する。かかる方法には試料をＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体へ接触させる工程を含む。さらに本発明はＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８のＩ−ドメイン部分への結合においてＮＩＦと競合するＮＩＦアンタゴニストを試料中から検出する方法を提供するが、この方法はＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体のＩ−ドメインを有する組替えペプチドを試料に接触させる工程を含む。かかるＮＩＦのアンタゴニストはそれ自身では好中球抑制活性は示さない。本発明にはまた、これらの方法によって検出されるＮＩＦアンタゴニストも含む。他の観点から、本発明はＮＩＦを用いて炎症性疾患を治療する方法、特に炎症応答を抑止もしくは減弱させる方法を提供する。かかる方法には哺乳動物にＮＩＦの治療効果量を投与することを含む。本発明の他の特性および有利さは以下の説明、好ましい態様および請求の範囲の記載からより明らかとなるであろう。定義本発明について、および本明細書で使用するように、以下の用語は他に特に断らない限り、以下に示す意味のものとする。「アミノ酸」という語は天然のＬ−アミノ酸を示す。天然のアミノ酸はその名前もしくは以下に示す略号で示す「アミノ酸残基」という語は-ＮＨ-ＣＨ（Ｒ）-ＣＯ-（式中、Ｒは各アミノ酸基で異なる側鎖基を示す）で示される基である。環状アミノ酸においては、残基は（式中、ｘは１、２または３であり、それぞれアゼチジンカルボン酸、プロリンまたはピペコール酸残基を示す）で示される基である。「アイソフォーム」という語は単一生物から得られた関連タンパク質のファミリーであって、アミノ酸残基の同一配列中に可変性の配列が散在している配列を有しているものをいう。「核酸」という語はデオキシ核酸もしくはリボ核酸いずれかのポリマーであって、一本鎖または２本鎖のものをいう。「単離された核酸」という語は、生物化学的または分子生物学的操作、例えば遠心分離、クロマトグラフ法、電気泳動、ハイブリダイゼーションおよび類似の方法によって単離された核酸をいう。「ＮＩＦのミミック」という語は、小さな分子、ペプチド、ペプチド類縁体またはタンパク質であって、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体またはＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体のＩ−ドメイン部分へＮＩＦが結合するのに競合するものをいう。ＮＩＦのミミックはまた、好中球抑制活性、好酸球抑制活性またはかかる活性を両方有することでも特徴つけられる。「ＮＩＦアンタゴニスト」という語は、小さな分子、ペプチド、ペプチド類縁体またはタンパク質であって、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体またはこのレセプターのＩ−ドメイン部分へＮＩＦが結合するのを阻止するが、それ自身は有意な好中球抑制活性を全く示さないものをいう。ＮＩＦアンタゴニストはＮＩＦのＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体またはＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体のＩ−ドメイン部分への結合を、ＮＩＦのレセプターへ結合するのに必要な部位へ結合して、結合部位を立体的に隠す効果により、またはＮＩＦ上のある部位に結合することにより結合に必要な部位のコンフォメーションが変化して結合が実質的に弱まったりまたは排除されたりするようにして、阻止する。図面の簡単な説明図１は実施例２（Ｂ）のコンカナバリンＡセファロース（Concanavalin A Sep harose）カラム上で実施された実施例２（Ａ）に記載されたごとくして得られた鉤虫溶解物（lysate）のクロマトグラムである。図２は実施例２（Ｃ）のスーパデックス（Superdex）２００カラム上で実施されたコンカナバリンＡで精製された鉤虫溶解物のクロマトグラムである。図３は実施例２（Ｄ）のヒドロキシアパタイトセラミックスカラム上で実施されたコンカナバリンＡ／スーパデックスで精製された鉤虫溶解物のクロマトグラムである。図４は実施例１（Ｅ）に記載されているようにコンカナバリンＡ、スーパデックス２００およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによって単離された鉤虫溶解物の逆相ＨＰＬＣのクロマトグラムである。図５はＨＰＬＣ単離物とある分子量標準物質をＳＤＳ−ゲル電気泳動を用いて実施したゲルパターンである。図６は本発明の精製好中球抑制因子のレーザー−デソープションタイム−オブ −フライトマススペクトロメトリーである。図７はイヌの鉤虫から単離した好中球抑制因子のタンパク質分解したフラグメントのアミノ酸配列である。図８は好中球抑制因子ｃＤＮＡ（クローン１ＦＬ）の遺伝コード指定領域のヌクレオチド配列およびこれより予想されるアミノ酸配列である。図９はいくつかの好中球抑制因子イソ型クローンの予想アミノ酸配列の並びを示す。図１０はイヌの鉤虫から単離された好中球抑制因子を炎症をもった動物モデルに腹腔内投与した場合の、種々の投与量での抗炎症効果を示す。図１１はイヌの鉤虫から単離された好中球抑制因子を炎症をもった動物モデルに腹腔内投与または静脈投与した場合の抗炎症効果を示す。図１２はピキア・パストリス（Pichia pastoris）内で生成した組替え好中球抑制因子を炎症モデル動物にイン・ビボ投与した場合の抗炎症効果を示す。図１３はＴＮＦ−刺激ＨＵＶＥＣ単層への好酸球の接着に対する組替えＮＩＦの抑制効果を示す。データは１実験３回測定したものの平均値である。図１４は発現ベクターＰｍａ５−ＮＩ１／３の遺伝子地図を示す。このベクターは以下の成分を有する：（ｉ）ＣｏｌＥ１型複製起点（ＯＲＩ）；（ｉｉ）複製起点を含む糸状ファージｆ１のインターシストロン領域（ｆ１ＯＲＩ）；（ｉｉｉ）アンピシリン耐性を付与するベータラクタマーゼ遺伝子（ｂｌａ）；（ｉｖ）単一核酸置換の結果のアンバー翻訳停止コドンを有するクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｃａｔ−ａｍ）；（ｖ）ファージラムダＰ_Rプロモーター；（Ｖｉ）小さなリーダーシストロン；（ｖｉｉ）メチオニルＮＩＦコード化領域および（ｖｉｉｉ）２つの縦列に配置されたファージｆｄの中心転写ターミネーター（ｆｄＴ）コピー。Ｍｅｔ−ＮＩＦ発現カセット（拡大された領域）の配列は図１５に示した。ベクターのＰｍａ／ｃファミリーはすでに開示されている。スタンセンズら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ17、 4441-4454、1989参照。図１５はＰｍａ５−ＮＩ１／３の２−シストロンＭｅｔ−ＮＩＦ発現カセットのヌクレオチド塩基配列を示す。コード化されているメチオニン化ＮＩＦおよびリーダーペプチドは１文字標記により示した。以下の性質が認められる：−３５および−１０領域のファージラムダＰ_Rプロモーター領域、転写開始点、リーダーシストロンに先立つシャイン−ダルガルノ配列（ＳＤ_cro）およびＭｅｔ−ＮＩＦ遺伝子（ＳＤ）、およびいくつかの制限部位。ＰＣＲで増幅したＮＩＦ−１ＦＬコード領域を、ＮｃｏＩで開裂させたレシピエントベクターへライゲートしてベクターを調製し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで処理し、その後ＨｉｎｄＩＩＩで消化した（両方のライゲーション点を示した）。構築スキームでは、ＮＩＦコード領域の５’末端をＡＴＧ開始コドンへ結合させる。図１６は鉤虫からのＮＩＦタンパク質のヌクレオチド配列とアミノ酸配列の比較を示す。ＮＩＦ−１ＦＬヌクレオチド配列に番号をつけた；この番号は他の遺伝子の部位を指摘する際にも用いる。ＰＣＲ−ＮＩＦ１７およびＰＣＲ−ＮＩＦ２０はＰＣＲ操作によって回収した：ＰＣＲプライマー（と合致する領域）をイタリック体で示した。ＡｃａＮＩＦ７およびＮＩＦ−１ＦＬ９はただひとつの部位においてのみ異なっている（ＧからＥへの置き換え；ヌクレオチド置換は６４７位に存する）。これらの配列のうちで変わりやすいままであるのは、ＰＣＲ− ＮＩＦ２０の６６０位である。ポリ（Ａ＋）テイルはＮＩＦ−１ＦＬ配列には認められなかった。３’非翻訳領域の下線をひいた配列（ＵＡＵＡＡＡおよびＡＧＵＡＡＡ）はポリアデニレーションシグナルとして働くであろう。ＮＩＦ−１ＦＬ、ＮＩＦ−１ＦＬ９およびＡｃａＮＩＦ２４のｃＤＮＡのみが全分泌シグナルを有している。強力なＮ−グリコシレーション部位（Ｎ−Ｘ−Ｔ／Ｓ）に下線を引いた。図１７は組替えＮＩＦ−１ＦＬの強さを、組替えタンパク質であるＡｃａＮＩＦ６およびＡｃａＮＩＦ２４と比較したものを示す。この３つの精製したタンパク質を、実施例１（Ｅ）の過酸化水素放出アッセイ（パネルＡ）および実施例１（Ｃ）の好中球−プラスチック接着アッセイ（パネルＢ）にて試験した。図１８は組替えＮＩＦ−１ＦＬを組替えＡｃａＮＩＦ４と、実施例１（Ｆ）の競合結合アッセイにて比較した結果を示す。固定量のビオチン化ＮＩＦ−１ＦＬを含有する試料、および様々な量のＡｃａＮＩＦ４またはＮＩＦ−１ＦＬのいずれかを含有する試料を、固定化ＬＭ２／Ｍａｃ−１複合体上でアッセイした。結合したビオチン化ＮＩＦ−１ＦＬを、アルカリ性ホスファターゼと複合体を形成しているエキストロアビジン（ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ）で調べた。図１９はエー・セイラニカム（A.ceylanicum）から誘導したＮＩＦタンパク質（ＡｃｅＮＩＦ３）のアミノ酸配列を示す。下線を付した配列（ＧＡＡＴＴＣＣＧ）は、ｃＤＮＡ上に付加されたＥｃｏＲＩリンカー由来である。ポリアデニル化シグナル（ＡＡＵＡＡＡ）として機能するであろう配列もまた指摘した。コード化されるタンパク質は１０個の強いＮ−グリコシレーション部位（Ｎ−Ｘ−Ｔ／Ｓ）を有する。図２０はエー・セイラニカムからのＮＩＦタンパク質（ＡｃｅＮＩＦ３）を表示するファージのＭａｃ−１への結合を示す。ＬＭ２／Ｍａｃ−１複合体にて被覆したウエルを最初に様々な量のピキア（Pichia）により産生されたＲＮＩＦ１（もしくはコントロール群のバッファー）と共に最初にインキュベートし；３０分後、１０¹⁰個のＮＩＦ−１ＦＬもしくはＡｃｅＮＩＦ３を表示しているウイルスを添加し、インキュベーションをさらに９０分間続けた。保持されたファージをウサギ抗ファージ血清およびヤギ抗ウサギアルカリ性ホスファターゼ複合体によって検出した。様々な成分を１ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭＣａＣｌ₂、および０．１％スキムミルク（ファージ試料は１％スキムミルクに含まれている）を含有するＰＢＳ内でインキュベートした。結合しなかった物質を１ｍＭＭｇＣｌ₂ 、１ｍＭＣａＣｌ₂、０.１％ツイン２０および０.０２％チメロサルを含有するＰＢＳにて洗浄して除いた。結合したファージの相対量をＯＤ_405nmの測定値に基づき、コントロール実験を１００％として計算した。図２１は機能性ＮＩＦ−１ＦＬをＰＡＮ−ＮＩＦ−１ＦＬを用いてファージの結合した形状または「可溶性」の形状で合成する方法を示す。ＰＡＮ−ＮＩＦ− １ＦＬベクターには以下の成分を有する：１）Ｐｌａｃプロモーターの転写調節の下にあるＮＩＦ−１ＦＬ含有融合遺伝子。この融合遺伝子はｐｅｌＢ分泌シグナル、ＮＩＦ−１ＦＬコード領域、糸状ファージＭ１３遺伝子ＩＩＩ（ｇＩＩＩ）からなる。ＮＩＦ−１ＦＬとＧＩＩＩ配列の間に、ＴＡＧアンバー翻訳停止コドンがある。ＮＩＦ−１ＦＬコード領域のクローニングに用いたＮｃｏＩびＮｏｔＩ部位を指摘した。２）１００μ／ｍｌのアンピシリンまたはカルベニシリンに対して耐性を付与するｂｌａ遺伝子（ｂｌａ／Ａｐ^R）。３）糸状ファージＭ１３複製起点を含有する遺伝子内部領域（Ｍ１３−ＩＲ／ＯＲＩ）。４）ＣｏｌＥ１型ラスミドを操作する複製起点（ＣｏｌＥ１−ＯＲＩ）。ＴＧ１のごときｓｕ⁺バクテリア内では、ＰＡＮ−ＮＩＦ−１ＦＬファージミドベクターはＮＩＦ−１ＦＬ−ｐｇＩＩＩ融合タンパク質（ｐｇｉｉｉ；ＧIIIの産生物）をコードしており、ＴＧ１［ＰＡＮ−ＮＩＦ−１ＦＬ］細胞がＭ１３−ＶＣＳ「ヘルパー」−ファージ（スタータジーン）に感染される際に糸状ウイルス内に取り込まれる。ｓｕ⁺株であるＷＫ６には、ＰＡＮ−ＮＩＦ−１ＦＬが遊離の（ファージの結合していない）ＲＮＩＦＩの合成を支配している、これは抗ＮＩＦＭａｂ３Ｄ２およびＭａｃ−１に結合する。ＴＧ１：△（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）、ｈｓｄ△５（ｒ_k ^-ｍ_k ^-）、ｔｈｉ、ｓｕｐＥ／Ｆ’［ｔｒａＤ３６、ｌａｃＩ^q、ｌａｃＺ△Ｍ１５、ｐｒｏＡ⁺Ｂ⁺］。ＷＫ６：△（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）、ｇａｌＥ、ｓｔｒＡ／Ｆ’［ｌａｃＩ^q、ｌａｃＺ△Ｍ１５、ｐｒｏＡ⁺Ｂ⁺］。図２２はＮＩＦ−１ＦＬを表示するファージのＥＬＩＳＡの結果を示す。ＮＩＦを表示するファージ（または非表示コントロールファージ、たとえばＭ１３− ＶＣＳ；それぞれの実験において５×１０⁹個のファージ粒子を添加した）をＭａｃ−１（ＬＭ２−セファロースにて免疫精製したものを用いた）、ＬＭ２／Ｍａｃ−１、ＬＭ２または非中和抗ＮＩＦモノクローナル抗体３Ｄ２で被覆したマイクロタイターウエル内でインキュベートした。いくつかの実験においてはファージの結合していない可溶性ＮＩＦ（ｓＮＩＦ）を上記固定化物質（１μＭ）とファージの添加前３０分間インキュベートした。結合したファージはウサギ抗Ｍ１３血清およびアルカリ性フォスファターゼ複合ヤギ抗ウサギ血清によって調べた。図２３はＡｃａＮＩＦ１とその変異体ＡｃａＮＩＦ１／△ｆ、Ｇｌ１−７およびＡｃａＮＩＦ１／△Ｇｌ１−５の、実施例１（Ｃ）に示した好中球プラスチック接着アッセイにおける強さを比較したものである。図２４は実施例３０に示したごとき、ビオチン化したｒＮＩＦの、リンパ球、単球および顆粒球への結合を示す。図２５はＮＩＦの結合とＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８の発現の直接的な一致を、２蛍光による抹消リンパ球成分のフローサイトメトリー分析により示したものであって実施例３１に記載したものである。発明の詳細な説明好中球抑制因子本発明はあらゆる観点において好中球抑制因子（ＮＩＦ）組成物、すなわち好中球の活性を抑制するタンパク質であって抗体、インテグリン、セレクチンもしくは接着性タンパク質のイムノグロブリンスーパーファミリーではなく、寄生虫より単離した場合には糖タンパク質である物質に関する。あるの発現系によって製造される組替えＮＩＦは糖タンパクではない。かかる非グリコシル化ＮＩＦも本発明の範囲内に入る。ここでいう好中球抑制活性には以下の好中球の活性のうちの１または複数を抑制することを含むが、これらに限定されるものではない：過酸化水素の遊離、スーパーオキサイドアニオンの遊離、ミエロパーオキシダーゼの遊離、エラスターゼの遊離、好中球の同型凝集、プラスチック表面への接着、血管内皮細胞への接着、ケモタキシス、内皮細胞の単層膜を通っての移行および貪食。好中球活性の抑制を評価する好適なアッセイとしては、インビトロで行われるアッセイであって、好中球活性の抑制が、血管内皮細胞への好中球の接着、好中球からの過酸化水素の放出、同型凝集またはプラスチック表面への好中球の接着を評価するアッセイによって証明されるアッセイを含む。好ましいＮＩＦは、上述の好中球活性のアッセイによって測定した場合に、ＩＣ₅₀が５００ｎＭまたはそれ以下、より好ましくは１００ｎＭ以下のものである。ＩＣ₅₀値は、測定された活性の５０％を抑制するＮＩＦの濃度である（実施例１参照）。本発明のＮＩＦはさらに、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体への結合能を有していることでも特徴付けられる（実施例１４参照）。ＮＩＦとＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８との結合を測定する好ましいアッセイ法を実施例１（Ｆ）に記載している。本発明のＮＩＦはさらにＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体のＩ−ドメイン部位への結合能を有する（実施例３２参照）。ＮＩＦのＩドメイン部分に対する結合を測定するための好ましいアッセイを実施例３２に示した。本発明のＮＩＦはさらに好酸球抑制作用を有することによっても特徴付けられる。好酸球抑制活性を調べるための好ましいアッセイは、好中球の血管内皮細胞への付着を測定するインビトロアッセイであって、実施例２９に示したものである。好ましいＮＩＦは、かかる好酸球活性のアッセイをした場合にＩＣ₅₀が５００ｎＭ以下、より好ましくは１００ｎＭ未満のものである。（ａ）濃縮組成物他の観点から、本発明はＮＩＦが濃縮されている組成物、ＮＩＦからなる組成物、およびＮＩＦがクロマトグラフまたは分子生物学的方法もしくは両方の方法の組み合わせによって回虫、好ましくは線虫から単離されたものである組成物を提供する。好ましい寄生虫には偏形動物門（phyla Platyhelminthes）、線虫類（Nematod a）、ネマトモルファ（Nematomorpha）および鉤頭虫類（Acanthocephala）の種から選択される寄生虫が含まれる。特に好ましいソースとしては、例えば感染したイヌに見られるような内部寄生鉤虫種が挙げられる。あるＮＩＦのアイソフォームは、アンサイロストマ・カニナム（Ancy1ostoma caninum）のごときイヌ鉤虫アンサイロストマ（Ancylostoma）種により産生される。他の適当なソースは、内部寄生虫種のトキソカラ・カニス（Toxocara canis）である。実質的に同一の化合物が、他の門の他の内部寄生虫からと同様、他の線虫種からも得られる。ＮＩＦの好ましいソースには寄生体、寄生蠕虫類（parasitic worms）、好ましくは内部寄生線虫類および特に、アンサイロストマ・ブラジリエンス（Ancylost oma braziliense）、アンサイロストマ・カニナム（Ancylostoma caninum）、アンサイロストマ・セイラニカム（Ancylostoma ceylanicum）、アンサイロストマ・デュオデナール（Ancylostoma duodenale）、アンサイロストマ・ジャポニカ（Ancylostoma japonica）、アンサイロストマ・マラヤナム（Ancylostoma mala yanum）、アンサイロストマ・チューバエフオルム（Ancylostoma tubaeforme）、ブノストマム・フィレボトマム（Bunostomum phlebotomum）、サイクロドントストマム・ピュアビシ（Cyclodontostomum purvisi）、ネカトール・アメリカヌス（Necator americanus）、ネカトール・アルゼンチヌス（Necator argentinus ）、ネカトール・シラウス（Necator suillus）およびウンシナリア・ステノセファラ（Uncinaria stenocephala）を含む鉤虫（ hookworm）種が含まれる。濃縮組成物は、コンカナバリンＡセファロース（登録商標）カラム、ヒドロキシアパタイトカラムまたは陰イオン交換カラム上でのクロマトグラフィー、好ましくは登録商標スーパーデックス２００（Superdex 200）カラムを用いたゲル濾過クロマトグラフィー、Ｃ４逆相ＨＰＬＣ、等電点電気泳動法、またはこれらの方法の組み合わせ若しくはタンパク質またはタンパク質様因子を分離するのに用いるこれらと等価な方法によって好中球抑制因子を濃縮して調製する。例えばコンカナバリンＡの代わりに他の固定化レクチンを用いてもよい。スーパーデックス２００（登録商標）の代わりに、適当な分子量の範囲にタンパク質を分離し得る他のアクリルアミドーもしくはアガロース−ベースのゲル濾過材を用いても良い；この例としては登録商標セファクリル（Sephacryl）および登録商標スーパーロース（Superose）（ファルマシア）として販売されているものが含まれる。好ましい態様において、濃縮された組成物はＮＩＦからなるものである。含有されているＮＩＦは、寄生虫、好ましくは線虫、より好ましくは鉤虫種、特にイヌ（canine）鉤虫種より誘導または単離されるかまたは、トキソカラ（Toxocara ）種から誘導または単離された糖タンパク質または、実質的に該糖タンパク質と同じである、好ましくはタンパク質である化合物である。該糖タンパク質のあるアイソフォームは、イヌ鉤虫アンサイロストマ・カニナム（Ancylostoma caninu m ）により製造される。「実質的に同一」という言葉は、その化合物が該当する糖タンパクと同じ選択的な好中球抑制活性を示すことを意味し、該活性は以下に記載した好ましい好中球活性アッセイ法により測定した場合、好ましくはＩＣ₅₀ が約５００ｎＭまたはそれ以下、より好ましくは１００ｎＭ未満の値を示す。（Ｂ）糖タンパク質ＮＩＦおよびアイソフォーム他の観点から、本発明のＮＩＦは精製された糖タンパク質を含有する。ＮＩＦはコンカナバリンＡセファロースへの結合を評価することにより（実施例２（Ｂ）参照）、および炭化水素基の存在を調べる、商標グリコトラック（G1ycoTrack^TM ）による糖タンパク質としてのポジティブテスト（実施例７参照）によって糖タンパク質であると判定される。イヌ鉤虫から単離された好中球抑制活性を有する糖タンパク質は以下の性質を有する：この糖タンパク質は酸性であり、等電点電気泳動で測定すると等電点は約４.５である（実施例３参照）。レーザーデソープション飛行時間型質量分析計によって測定した分子量は４１０００ダルトン（±３０００）である（実施例６参照）。糖タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、還元糖タンパク質がゲル上のかなり高いみかけの分子量の位置に移動したというその挙動により複数のなジスルフィド結合を含むことが判明した（実施例５参照）。該糖タンパク質は好中球活性に対する特異的な抑制を示したが、他の細胞接着アッセイにおける一般的な細胞毒としては働かなかった（実施例１３参照）。この糖タンパク質は好中球の血管内皮細胞への接着および同型好中球凝集を抑制する活性を示した、濃縮組成物の一つ（実施例２（Ｄ）参照）はＩＣ₅₀が約１０ｎＭであった。ＩＣ₅₀は測定した活性の５０％を抑制する抑制剤の濃度である（実施例１参照）。この糖タンパク質は、急性炎症の動物モデルにおいて腹腔内の炎症応答を、腹腔内投与または静脈内投与によって抑制する（実施例１６参照）。この濃縮組成物は好中球からの過酸化水素の遊離およびプラスチック上への好中球の接着／伸展を抑制する（実施例１（Ｃ）参照）。実施例２（Ｄ）で得た組成物はＩＣ₅₀が約１０ｎＭであった。好中球機能に対する抑制因子の濃縮組成物は、血小板凝集に対する抑制作用は示さなかった（実施例１３参照）。好中球抑制活性を有する第２の糖タンパク質をトキソカラ・カニズ（Toxocara Canis）から単離した。この糖タンパク質は分子篩クロマトグラフィーによれば、分子量が約２００００ダルトンである。この糖タンパク質は好中球の血管内皮細胞への接着および好中球のプラスチック上への接着／伸展を抑制した。他の観点から、本発明はＮＩＦを含有する濃縮組成物を製造する方法を提供する。かかる組成物は寄生虫を含む天然のソース（寄生虫に限定されない）から単離されるものである。好ましい態様のひとつには、濃縮した組成物をコンカナバリンＡ−セファロース（登録商標）、ヒドロキシアパタイトもしくは陰イオン交換カラム上でのクロマトグラフを含むクロマトグラフ法、ゲル濾過クロマトグラフィー、好ましくはスーパーデックス（登録商標）２００、Ｃ４逆相ＨＰＬＣ、等電点電気泳動またはこれらの方法の組み合わせ、またはタンパク質もしくはタンパク質と類似の物質を分離するのに用いられる、これらと等価な方法を含むクロマトグラフ法によって単離することを含む。例えば、コンカナバリンＡの代わりに、他の固定化レクチンを用いてもよい。スーパーデックス（登録商標）２００に代えて、タンパク質を適当な分子量の幅に分離する他のアクリルアミド系またはアガロースベースのゲル濾過剤を用いてもよい；これには例えば登録商標セファクリルおよび登録商標スーパーローズ（ファルマシア）として販売されているものを含む。ＮＩＦを含有する濃縮組成物を調製するための好ましい方法として、寄生虫の溶解物を以下の単離操作にかけることからなる方法を提供する；（ａ）コンカナバリンＡセファロース（登録商標）上でのクロマトグラフィー、および（ｂ）スーパーデックス（登録商標）２００上でのゲル濾過、および（ｃ）セラミックヒドロキシアパタイト上でのクロマトグラフィー。濃縮された組成物をさらにＣ４カラムを用いる逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて精製する。本発明の濃縮した組成物の例を実施例２から５に示した。クロマトグラフ法によって単離したＮＩＦ含有濃縮組成物は、少なくとも純度が約５０％、すなわち少なくとも５０％のＮＩＦを含有するものである。好ましくは組成物は少なくとも約２００倍に濃縮する必要がある。他の好ましい態様においては、実質的に純粋な好中球抑制因子が調製される。「実質的に純粋」という語は、純度が少なくとも９０％のものを意味する。より好ましくは、こうして調製された好中球抑制因子はクロマトグラフ的に純粋なものである。特定のソースから単離されたＮＩＦが様々なアイソフォームを含むと考えられている。従って、かかるアイソフォーム類も本発明の範囲に含まれる。従って、他の観点から、本発明は以下の群から選択されるアミノ酸配列を含有するＮＩＦに関する：（ａ）Ａｒｇ−Ｘ₁−Ｘ₂−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｘ₃−Ｘ₄−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｘ₅−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ− Ｈｉｓ−Ｘ₆−Ｘ_7-Ｉｌｅ（式中、Ｘ₁はＬｅｕまたはＡｒｇである；Ｘ₂はＧｌｎ、ＬｙｓまたはＡｒｇである；Ｘ₃はＡｌａまたはＡｒｇである；Ｘ₄はＬｅｕまたはＭｅｔである；Ｘ₅ はＬｙｓ、Ａｒｇ、ＬｅｕまたはＩｌｅである；Ｘ₆はＶａｌまたはＩｌｅである；Ｘ₇はＳｅｒ、ＧｌｙまたはＡｓｎである）、（ｂ）Ａｌａ−Ｘ₈−Ｘ₉−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｘ₁₀−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｘ₁₁− Ｌｅｕ−Ｘ₁₂−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｘ₁₃−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｘ₁₄−Ｓｅｒ −Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｘ₁₅−Ｓｅｒ−Ａｌａ（式中、Ｘ₈はＨｉｓまたはＰｒｏである；Ｘ₉はＴｈｒ、ＡｒｇまたはＳｅｒである；Ｘ₁₀はＡｒｇまたはＬｙｓである；X₁₁はＩｌｅまたはＴｙｒである；Ｘ₁ ₂ はＡｓｐ、ＬｙｓまたはＧｌｕである；Ｘ₁₃はＡｓｐまたはＧｌｕである；Ｘ₁ ₄ はＧｌｙ、ＬｙｓまたはＡｒｇである；Ｘ₁₅はＧｌｕ、Ｍｅｔ、ＴｈｒまたはＶａｌである）、（ｃ）Ｓｅｒ−Ｘ₁₆−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｘ₁₇−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｘ₁₈−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｘ₁₉−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ −Ｖａｌ−Ｘ₂₀−Ｃｙｓ（式中、Ｘ₁₆はＡｓｎまたはＡｓｐである；Ｘ₁₇はＶａｌまたはＬｅｕである；Ｘ₁₈はＡｌａまたはＴｈｒである；Ｘ₁₉はＬｅｕ、ＶａｌまたはＰｈｅである；Ｘ₂₀はＴｈｒ、ＬｙｓまたはＡｓｎである）、（ｄ）Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｘ₂₁−Ｘ₂₂−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ（式中、Ｘ₂₁はＴｙｒまたはＩｌｅである；Ｘ₂₂はＧｌｙまたは残基のないことを示す）、（ｅ）Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｘ₂₃−Ｘ₂₄−Ｇｌｙ−Ｘ25−ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｘ₂₆ −Ｘ₂₇−Ｃｙｓ−Ｘ₂₈−Ｘ₂₉−Ｔｙｒ（式中、Ｘ₂₃はＴｈｒ）Ｓｅｒ、ＬｙｓまたはＧｌｕである；Ｘ₂₄はＴｈｒ、ＶａｌまたはＩｌｅである；Ｘ₂₅はＶａｌ、ＬｙｓまたはＴｈｒである；Ｘ₂₆はＡｒｇ、ＳｅｒまたはＡｓｐである；Ｘ₂₇はＡｓｎ、Ｇｌｙ、ＡｓｐまたはＡｒｇである；Ｘ₂₈はＡｓｎ、ＳｅｒまたはＴｈｒである；Ｘ₂₉はＧｌｙ、ＧｌｕまたはＡｓｐである）、および（ｆ）Ｃｙｓ−Ｘ₃₀−Ｘ₃₁−Ａｓｐ−Ｘ₃₂−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｘ₃₃ −Ｉｌｅ（式中、Ｘ₃₀はＨｉｓ、ＩｌｅまたはＡｓｎである；Ｘ₃₁はＡｌａ、ＰｒｏまたはＡｓｐである；Ｘ₃₂はＧｌｕ、Ｖａｌ、ＡｓｐまたはＩｌｅである；Ｘ₃₃はＩｌｅ、ＶａｌまたはＰｈｅである）。ＮＩＦには上記の（ａ）から（ｆ）に示したアミノ酸配列の１から６個を含有するものであってよい。好ましくはＮＩＦは（ａ）から（ｆ）に示したアミノ酸配列のすべてを含有する。好ましくはＮＩＦは、上に列挙したアミノ酸配列を以下の順番でタンパク質内に有する（アミノ末端からカルボキシ末端へ）：（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）。他のアミノ酸残基またはペプチド配列が上記の配列の間に挟まって散在していても、タンパク質のアミノ末端および／またはカルボキシ末端側の端にあってもよい（例えば図７及び図８参照）。ＮＩＦアイソフォームのいくつかのアミノ酸配列が、１または複数の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）配列を含有していることが、イヌ鉤虫ＮＩＦを示した図９、アンサイロストマ・カニナムのＮＩＦを示した図１６およびアンサイロストマ・セィラニカムのＮＩＦを示した図１９から明らかである。好ましくはＮＩＦは図８に示したアミノ酸配列を有するものである。本発明には、アミノ酸配列（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）の１または複数を有し、少なくともインビトロアッセイのひとつにおいて好中球抑制作用を示すＮＩＦを含む。好適なアッセイには血管内皮細胞に対する好中球の接着、好中球からの過酸化水素の放出、好中球の同種凝集および好中球のプラスチック表面への接着が含まれる。好ましいＮＩＦは、好中球抑制アッセイのうちのひとつで測定した場合にＩＣ₅₀が約５００ｎＭ以下、より好ましくは１００ｎＭ未満であり、かかる好中球抑制濃度においては血小板凝集を実質的に抑制しないものである。ＩＣ₅₀値は、測定された活性を５０％抑制するＮＩＦの濃度である（実施例１参照）。本発明のＮＩＦはさらに、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体への結合能を有するという特徴も有する（実施例１４参照）。ＮＩＦのＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体への結合を測定する好ましいアッセイ法を実施例１（Ｆ）に示した。本発明のＮＩＦはさらに、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体のＩ−ドメイン部分への結合能を有するという特徴も有する（実施例３２参照）。ＮＩＦのＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体のＩ−ドメインに対する結合を測定する好ましいアッセイ法を実施例３２に示した。本発明のＮＩＦはさらに好酸球抑制活性も有するという特徴を有する。好酸球抑制活性を測定する好ましいアッセイ法は、好中球の血管内皮細胞に対する接着を実施例２９に記載したごとく測定するインビトロアッセイによって示された好酸球の活性を抑制するアッセイである。好ましくは、ＮＩＦはこの好酸球活性のアッセイにおいて測定されたＩＣ₅₀が約５００ｎＭ以下、より好ましくは１００ｎＭ以下のものである。（Ｃ）組替えＮＩＦ他の観点から、本発明はＮＩＦを含有すると予測されるソースから取った核酸分子をあるオリゴヌクレオチドプライマーまたはかかるプライマーから作成したｃＤＮＡとハイブリダイズさせる操作を含む方法により製造されるＮＩＦに関する。かかるＮＩＦは好中球抑制活性を示す。その他の観点から、本発明はＮＩＦを製造するためのこのような方法にも関する。ひとつの好ましい観点において、本発明はあるＮＩＦのアミノ酸配列から誘導されたプライマーにハイブリダイズするのに十分に相補的な核酸配列によってコード化されるアミノ酸配列を有するＮＩＦに関する。ＰＣＲクローニング法において好ましいのは、アンサイロストマ・カニウムのＮＩＦの配列から誘導された２０〜１００ヌクレオチド一からなる本鎖ＤＮＡプライマーである。好ましいのは、以下の性質を有するプライマーである：変性を受けにくい；ライブラリーが構築される元となった特定の種のコドン使用の傾向へ忠実である、そして１２のアンサイロスト・マカニナムＮＩＦアイソフォームにおいて保存されている配列を標的配列とするプライマーである。各ＰＣＲ反応においては２つのプライマーを用いる：５−プライマーはＮＩＦコード配列のセンス鎖に対応し、３’−プライマーはＮＩＦコード配列のアンチセンス鎖に対応する。特に好ましいのは５’-CTCGAATTCT(GATC)GC(ATC)AT(ATC)(CT)T(GATC)GG(ATC)TGGGC-3' および５’-CTCGAATTCTT(TC)TCTGG(GA)AA(GA)CG(GA)TC(GA)AA-3' プライマーである。括弧内に記載したヌクレオチドは、括弧にくくられた位置においてはいずれのヌクレオチドを用いてもよい、余分なものを含む。ＤＮＡプライマーの核酸配列は好ましくはアンサイロストマ・カニウムから誘導されたものである。上述のごとく、本発明のＮＩＦの１例には実質的に純粋な形態で単離された糖タンパク質を含有する。業界で知られた方法を用い、通常の当業者はこのタンパク質を用いて該タンパク質のアミノ酸配列を知ることができる。例えば、タンパク質の分析に際して、タンパク質のＮ−末端配列を調べても、または該タンパク質のフラグメントを酵素もしくは他の特異的な消化手段により得、該フラグメントの末端アミノ酸を決定してもよい。かかるアミノ酸配列は、５から６の連続するアミノ酸のみの長さしかない場合ですら、このタンパク質をコード化する遺伝子のＤＮＡ配列の予測のための十分な情報を提供し得る。２または３のかかるアミノ酸フラグメントの配列を決定すれば、多くのオリゴヌクレオチドを報告されている方法を用いて合成することができ、かかるオリゴヌクレオチドをプローブとして用い、鉤虫（または他のソース）のゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーから配列を決定したタンパク質をコード化している遺伝子またはそのフラグメントを単離できる。当業者はこれらのオリゴヌクレオチドがオリゴヌクレオチドが選択されたアミノ酸配列をコード化するように選択されるという標準的なパラメーターを用いてデザインし得ることを認識するであろう。例えば、各オリゴヌクレオチドがいずれのアミノ酸をコードしてもよい余分なコドンを考慮に入れるように変えられている特定の塩基を除けば同じヌクレオチド塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの混合物を特定のアミノ酸配列のプローブとして用いることは通常のことである。できるだけ相違の少ないオリゴヌクレオチドによってコード化されるアミノ酸配列を選択することが望ましいのはいうまでもない。例えば鉤虫核酸において最も好ましいコドンを示すよう、様々の過剰なコドンから特に選択してもよい。加えて、単離された純粋なＮＩＦタンパク質は、既知の方法を用いた抗体の製造に用い得る。かかる抗体はモノクローナルまたはポリクローナル抗体を含んでおり、他のソース（例えば鉤虫）のＤＮＡを含有するバクテリオファージラムダａｇｔ１１発現ライブラリーをスクリーニングするのに用いてもよい。この場合、ＮＩＦをコード化する核酸を含有する個々のいずれのクローンであっても標準的な手法を用いて容易に同定し得る。鉤虫のゲノムＤＮＡライブラリーは、例えば鉤虫のゲノムＤＮＡを単離し、該ＤＮＡを超音波のごときランダムな方法または制限エンドヌクレアーゼ消化のごとき特異的な方法のいずれかでＤＮＡを分け、そしてこれらのフラグメントをバクテリオファージラムダ、プラスミドもしくはコスミドのごとき適当なベクターへライゲートして調製する。かかるライブラリーで、上記オリゴヌクレオチド混合物を用いた核酸ハイブリダイゼーションによって有用なクローンのスクリーニングをし得る。より好ましくは、鉤虫全ＲＮＡを単離し、該ＲＮＡをオリゴ−ｄＴカラムへ通してポリ（Ａ）含有ＲＮＡ（すなわちメッセンジャーＲＮＡ）を精製し、このＲＮＡの逆転写によりＲＮＡに対応するＤＮＡフラグメントを作成する（すなわちｃＤＮＡフラグメント）方法でｃＤＮＡライブラリーを作製する。これらのｃＤＮＡフラグメントはいずれの所望のベクター、例えば、バクテリオファージラムダｇｔ１１（大腸菌内に発現させるためのもの）のごとき市販の大腸菌発現ベクターのごとき発現ベクター等、または哺乳類のＣＯＳ７細胞内へ発現されるプラスミドｐｃＤＮＡ−１内等へ標準的な方法を用いて挿入させ得る。プラスミド発現ライブラリーの個々のクローンによって発現されるタンパク質の生物活性は、本明細書に記載した好中球抑制活性試験または他の適当なアッセイによって容易に調べることができる。この代わりに、上記の抗体を、バクテリオファージ発現ライブラリー（例えばラムダ−ｇｔ１１）内のクローンから発現された免疫活性タンパク質のためのプローブとして用いてもよい。さまざまなライブラリーをサブプールとしてスクリーニングすること、例えば９９９クローンをまとめて、いずれのサブプールが陽性クローンを含有するのかを測定するような方法は特に好ましい。陽性クローンが単離された場合、９９９コロニーの格子を３３×３３のプレート上に作成し、各３３コロニーをプレートの各行および列に並べて同時にアッセイして（すなわち６６プレパレーション）所望のクローンを同定すればよい。所望のクローンを単離した後、その構造を標準的な方法、例えばＤＮＡ配列決定によって所望のタンパク質全体をコード化しているか否かを調べる。そうでなければ、かかるクローンを全長クローンを探してｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングする際のプローブとして、またはかかるＤＮＡを鉤虫または他のソースに存在するＲＮＡからのハイブリッドによって選択するために、およびより選択的なｃＤＮＡライブラリーをかかるＲＮＡから、上記方法を用いて作成するために用いてもよい。他の好ましい観点では、本発明はＮＩＦのアミノ酸から誘導されたｃＤＮＡプローブとハイブリダイズするよう十分相補的な核酸配列によってコード化されるアミノ酸配列を有するＮＩＦに関する。好ましくは、図８に示した配列の部分に対して少なくとも約１２ヌクレオチドが相補的なプローブである。当業者にとっては、オリゴヌクレオチドプライマーがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において相補的ＤＮＡプローブを調製するのに用い得ることは明らかである。これらのプローブはＮＩＦを他のソースまたは同じソースのアイソフォームから単離するのに用いられる。ＰＣＲクローニング法において、２０〜１００ヌクレオチドの一本鎖ＤＮＡプライマーをアンサイロストマ・カニナムからのＮＩＦの配列から誘導する。好ましいプライマーは以下の性質を有する；好ましいのは、以下の性質を有するプライマーである：変性を受けにくい；ライブラリーが構築される元となった特定の種のコドン使用の傾向へ忠実である、そして１２のアンサイロストマ・カニナムＮＩＦアイソフォームにおいて保存されている配列を標的配列とするプライマーである。各ＰＣＲ反応においては２つのプライマーを用いる：５−プライマーはＮＩＦコード配列のセンス鎖に対応し、３’−プライマーはＮＩＦコード配列のアンチセンス鎖に対応する。特に好ましいのは５’-CTCGAATTCT(GATC)GC(ATC)AT(ATC)(CT)T(GATC)GG(ATC)TGGGC-3' および５’-CTCGAATTCTT(TC)TCTGG(GA)AA(GA)CG(GA)TC(GA)AA-3' プライマーである。括弧内に記載したヌクレオチドは、括弧の位置においてはいずれのヌクレオチドを用いてもよい、余分なものを含む。１本鎖ｃＤＮＡ鋳型は、スクリーニングする組織もしくは生体の細胞より得られたポリ（Ａ）⁺または全ＲＮＡを用いて製造される。ＲＮＡはランダムヘキサヌクレオチドまたはオリゴｄ（Ｔ）のいずれかによってプライムし、逆転写酵素によって伸長する。この反応産物を適当なＤＮＡポリメラーゼ（例えばＴａｑポリメラーゼ）をセンスおよびアンチセンスプライマーと共に用いて、適当な熱サイクルにて増幅する。広く様々なポリメラーゼ連鎖反応の条件が用い得るが、最初の試行では好ましくは比較的緩やかな条件下でアニーリングと鎖の延長を行う。好ましい条件は、サイクル１〜３、９４℃にて変性１分間、３７℃にてアニーリング１分間そして７２℃にて鎖の延長２分間。アニーリング工程と延長工程の間の傾斜となっている時間は、これらのサイクルにおいては少なくとも２分間とする；サイクル４〜４０、９４℃にて変性１分間、４５℃にてアニーリング１分間、および７２℃にて鎖の延長２分間。続く試行においては、各プライマー対による増幅により単一の生成物が得られるまで、アニーリング温度を上げた。各増幅反応から得られた増幅した生成物を、ＰＣＲを行った組織から構築されたゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための、ハイブリダイゼーションプローブとして用いる。これらの増幅生成物とハイブリダイズした組替えプラークまたはコロニーからのＤＮＡまたはｃＤＮＡのいずれをもをさらなる分析により選択する。上述の手法を用いて単離したＮＩＦ関連相補的ＤＮＡをジデオキシ配列決定法（サンガーら、1977、プロシーデイングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Proc.Natl.Acad.Sci USA）74:5463〜5467 ）によるヌクレオチド配列分析に供した。オープンリーディングフレーム（すなわち、メチオニンで開始し、TAA、TGAまたはTAGストップコドンで終了する）を有する単離されたＮＩＦのｃＤＮＡを、タンパク質を細菌、酵母、昆虫または動物細胞内のいずれかへ発現させるための適当なベクター内へ挿入する。発現系は組替えタンパク質を培養培地内へ分泌するようにデザインされているベクター（ｃＤＮＡ単離オープンリーディングフレームと細胞の種類に応じた分泌シグナル配列とが融合している）を含有する。分泌シグナル配列を有さないベクターもまた発現に用いられる。使用した発現系により調製した培地または細胞の溶解物のいずれかについて、１または複数の以下の好中球活性化に対する抑制活性を調べる：過酸化水素の遊離、スーパーオキサイドアニオンの遊離、ミエロパーオキシダーゼの遊離、エラスターゼの遊離、好中球の同型凝集、プラスチック表面への接着、血管内皮細胞への付着、ケモタキシス、内皮細胞の単層膜を通過する移行および貪食。上の議論、および実施例１０に記載するごとく、ＮＩＦのペプチド配列から誘導されたオリゴヌクレオチドプローブ（鉤虫アンサイロストマ・カニナムから単離された）を、ＮＩＦのｃＤＮＡ配列を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応に用いた。ＮＩＦ配列は今回は鉤虫ｃＤＮＡライブラリーを探索するために用いた。プロトタイプのＮＩＦ−１ＦＬ全長クローンに加えてＮＩＦの６つの部分的なアイソフォームのクローンを単離した。この実施例はＮＩＦに構造の類似する配列の単離へのこの手法が有用性であることを示す。出願人は、上述の方法および上述の方法と同じまたは等価である手法を用いることにより、他の動物、菌、細菌もしくはウイルスソースからの好中球抑制因子をコード化するＤＮＡ配列を単離することができ、また組替えの好中球抑制因子を発現するのに用いることができることも指摘しておく。免疫応答性物質が発現ライブラリーより発現される場合には、上述の発現ベクターまたはその誘導体を天然のタンパク質のものとと等価な生物活性を有する組替えタンパク質を発現させるのに用いることができる。かかる組替えタンパク質は本発明において有用である。本発明の好中球抑制因子の１例を用い、ペプチドフラグメントを製造し、そのアミノ酸配列を決定した。この例は実施例９に説明している。タンパク質分解フラグメントに対して得られたアミノ酸配列を図７に示した。ＮＩＦの１例としては実施例１０および２１に示したイヌ鉤虫ｃＤＮＡライブラリーからクローン化されたものである。７つのファージ単離物を配列決定のために単離した。単離したクローンのうちのひとつ（クローン１ＦＬ）のｃＤＮＡのヌクレオチド配列を図８に示した。他の単離したＮＩＦアイソフォームクローンから演繹した部分的なアミノ酸配列を図９および図１６に示す。ＤＮＡ単離物には、イントロンのごとき最終的なタンパク質となる部分をコードしない配列および／または上述のペプチド配列に加えて、介在するアミノ酸残基やペプチドをコードする配列をさらに含んでいてもよい。特に好ましいＤＮＡ単離物のコード領域はこのヌクレオチド配列を有し、および／または図８に示した演繹したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。本明細書に記載した手法および当業者に用いられている他の手法を用いて、ＮＩＦはいずれのソースすなわち動物、細菌、真菌、ウイルスまたはＮＩＦを有すると予測される他のソースのいずれからでも、単離することができる。かかるＮＩＦおよびこれをコード化する核酸配列は、ＮＩＦを含有すると予測されるソースから得たゲノムもしくはｃＤＮＡのライブラリーを、図８に示した配列のごときＮＩＦをコード化する核酸配列と十分に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブを用いて探索し、その後本明細書に記載のごとく該プローブとハイブリダイズした核酸配列を単離、発現させることによって単離し得る。かかるプローブは唯一の配列を表示するのに十分な数のヌクレオチドを有する。典型的には、プローブは少なくとも約１２ヌクレオチドからなる。好ましいプローブ群には以下の配列が含まれる：５’-CTCGAATTCT(GATC)GC(ATC)AT(ATC)(CT)T(GATC)GG(ATC)TGGGC-3' および５’-CTCGAATTCTT(TC)TCTGG(GA)AA(GA)CG(GA)TC(GA)AA-3' 括弧内に含有されているヌクレオチドは、括弧の位置においていずれのヌクレオチドを採用してもよいという点で余剰のものである。上記に代えて、ＮＩＦタンパク質およびこのタンパク質をコードする核酸は、ＮＩＦを含有すると予測されるソースから得た核酸のサンプルを、例えば図８に示した配列のごときＮＩＦをコード化することが知られている核酸配列と相補的な、少なくとも約１２ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドプローブを用いて探索し、このオリゴヌクレオチドヘハイブリダイズするのに十分これと相補的な、遺伝子のごとき核酸配列を単離しても得られる。単離された核酸配列をその後クローン化し、常法を用いて発現させてもよい。（Ｄ）単離された核酸分子他の観点から、本発明はＮＩＦのアミノ酸配列をコード化する核酸配列を有する単離された核酸分子を提供する。ＤＮＡ単離物には、イントロンのごとき最終的なタンパク質となる部分をコードしない配列および／または上述のペプチド配列に加えて、介在するアミノ酸残基やペプチドをコードする配列をさらに含んでいてもよい。好ましい単離核酸分子は、以下の群から選択されるアミノ酸配列を少なくとも１つ有するＮＩＦをコード化するものである：（ａ）Ａｒｇ−Ｘ₁−Ｘ₂−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｘ₃−Ｘ₄−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｘ₅−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｘ₆−Ｘ₇−Ｉｌｅ（式中、Ｘ₁はＬｅｕまたはＡｒｇである；Ｘ₂はＧｌｎ、ＬｙｓまたはＡｒｇである；Ｘ₃はＡｌａまたはＡｒｇである；Ｘ₄はＬｅｕまたはＭｅｔである；Ｘ₅ はＬｙｓ、Ａｒｇ、ＬｅｕまたはＩｌｅである；Ｘ₆はＶａｌまたはＩｌｅである；Ｘ₇はＳｅｒ、ＧｌｙまたはＡｓｎである）、（ｂ）Ａｌａ−Ｘ₈−Ｘ₉−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｘ₁₀-Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｘ₁₁− Ｌｅｕ−Ｘ₁₂−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｘ₁₃−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｘ₁₄−Ｓｅｒ −Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｘ₁₅−Ｓｅｒ−Ａｌａ（式中、Ｘ₈はＨｉｓまたはＰｒｏである；Ｘ₉はＴｈｒ、ＡｒｇまたはＳｅｒである；Ｘ₁₀はＡｒｇまたはＬｙｓである；Ｘ₁₁はＩｌｅまたはＴｙｒである；Ｘ₁₂ はＡｓｐ、ＬｙｓまたはＧｌｕである；Ｘ₁₃はＡｓｐまたはＧｌｕである；Ｘ₁₄ はＧｌｙ、ＬｙｓまたはＡｒｇである；Ｘ₁₅はＧｌｕ、Ｍｅｔ、ＴｈｒまたはＶａｌである）、（ｃ）Ｓｅｒ−Ｘ₁₆−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｘ₁₇−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｘ₁₈−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｘ₁₉−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ −Ｖａｌ−Ｘ₂₀−Ｃｙｓ（式中、Ｘ₁₆はＡｓｎまたはＡｓｐである；Ｘ₁₇はＶａｌまたはＬｅｕである；Ｘ₁₈はＡｌａまたはＴｈｒである；Ｘ₁₉はＬｅｕ、ＶａｌまたはＰｈｅである；Ｘ₂₀はＴｈｒ、ＬｙｓまたはＡｓｎである）、（ｄ）Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｘ₂₁−Ｘ₂₂−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ（式中、Ｘ₂₁はＴｙｒまたはＩｌｅである；Ｘ₂₂はＧｌｙまたは残基のないことを示す）、（ｅ）Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｘ₂₃−Ｘ₂₄−Ｇｌｙ−Ｘ₂₅−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｘ₂₆ −Ｘ₂₇−Ｃｙｓ−Ｘ₂₈−Ｘ₂₉−Ｔｙｒ（式中、Ｘ₂₃はＴｈｒ、Ｓｅｒ、ＬｙｓまたはＧｌｕである；Ｘ₂₄はＴｈｒ、ＶａｌまたはＩｌｅである；Ｘ₂₅はＶａｌ、ＬｙｓまたはＴｈｒである；Ｘ₂₆はＡｒｇ、ＳｅｒまたはＡｓｐである；Ｘ₂₇はＡｓｎ、Ｇｌｙ、ＡｓｐまたはＡｒｇである；Ｘ₂₈はＡｓｎ、ＳｅｒまたはＴｈｒである；Ｘ₂₉はＧｌｙ、ＧｌｕまたはＡｓｐである）、および（ｆ）Ｃｙｓ−Ｘ₃₀−Ｘ₃₁−Ａｓｐ−Ｘ₃₂−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｘ₃₃ −Ｉｌｅ（式中、Ｘ₃₀はＨｉｓ、ＩｌｅまたはＡｓｎである；Ｘ₃₁はＡｌａ、ＰｒｏまたはＡｓｐである；Ｘ₃₂はＧｌｕ、Ｖａｌ、ＡｓｐまたはＩｌｅである；Ｘ₃₃はＩｌｅ、ＶａｌまたはＰｈｅである）。特に好ましい単離核酸分子はコード領域にこのヌクレオチド配列を有し、および／または図８に示した演繹したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするものである。（Ｅ）ＮＩＦの発現他の観点から、本発明は生物的に活性なＮＩＦを製造する方法を提供する。該方法において、ＮＩＦは細胞内に発現され、所望により分泌される；ＮＩＦをコード化している発現ベクター；および該発現ベクターによって形質転換されている宿主細胞が、ＮＩＦを発現し、所望により分泌する。ＮＩＦをコード化するｃＤＮＡを、複製可能な発現ベクターへ挿入して生物的に活性な組替え好中球抑制因子を合成させ得る。ヘテロローガスなタンパク質の発現のために多くのベクターを用いることができるが、適当なベクターの選択は主としてホスト細胞にとって望ましい性質に依存する。入手可能な各ベクターは、形質転換させようとするホスト細胞に特異的な様々な成分をそれぞれ有する。ベクターの成分もしくは調節エレメントとしては一般に以下のものを１または複数含有するがこれらに限定されるものではない：シグナル配列、複製オリジン、１または複数のマーカー遺伝子、プロモーター、エンハンサーエレメントおよび転写終止配列。インヒビターを含有する発現ベクターが一旦構築されると、この発現ベクターによって適当なホスト細胞をトランスフェクトもしくは形質転換し、組替えの好中球抑制因子ををホスト細胞そのものまたはホスト細胞の成育培地より単離する。一般に、シグナル配列はベクターの成分であってもよく、ベクターに挿入される好中球抑制因子のＤＮＡによりコード化されていてもよい。天然の抑制因子が分泌された遺伝子生成物（すなわち鉤虫（もしくは他のソース）細胞から）である場合は、鉤虫ＤＮＡより得られた天然のプロー好中球抑制因子は、ポリペプチドをマチュアーな好中球抑制因子へ変える翻訳後のプロセシングにより分離される該ポリペプチドのアミノ末端にあるシグナル配列をコード化する。すべてのベクターは選択された１または複数のホスト細胞内で自己の復製を可能とする核酸配列を有する。一般に、クローニングベクターにおいてこの配列はホストの染色体ＤＮＡから独立して複製し得るものであり、複製オリジンもしくは自律複製配列を含有する。かかる配列は様々な細菌、酵母、昆虫および哺乳類の細胞において良く知られている。プラスミドｐＢＲ３２２から得た複製オリジンはほとんどのグラム陰性細菌に適し、２μプラスミドオリジンは酵母に適し、バキュロウイルスオリジンはいくつかの昆虫細胞（例えばＳｆ９細胞；ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１７１１）に適し、および様々なウイルスのオリジン（例えばＳＶ４０、アデノウイルス）哺乳類細胞内へのクローニングベクターに有用である。発現ベクターには選択遺伝子（選択可能マーカーとも呼ばれる）を含有すべきである。この遺伝子は形質転換されたホスト細胞が、選択培養培地における生存または増殖するのに必要なタンパク質をコード化する。選択遺伝子を含有するベクターにて形質転換されていないホスト細胞はこの培地内で生存することができない。典型的な選択遺伝子は（ａ）抗生物質もしくは他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシンまたはメソトレキサート、に対する抵抗性を付与する、（ｂ）栄養要求欠損を補足するまたは（ｃ）複合培地から得られない重要な養分を補給するタンパク質のいずれかをコード化するものである。発現ベクターはホスト生体に認識されるプロモーターを有する。プロモーターは構造遺伝子（一般に１００から１０００塩基対の間）のスタートコドンの上流（５’）に位置する非翻訳配列であり、鉤虫の好中球抑制因子のごとき当該プロモーターが操縦しやすく連結している特定の核酸配列の転写および翻訳を制御する。様々なホスト細胞に認識され得る数多くのプロモーターが既知である。プロモーターは好中球抑制因子をコード化するＤＮＡと、好中球抑制因子ＤＮＡの５ ’末端がプロモーターと鎖上で極めて接近するように当該ＤＮＡをベクターへ挿入することによって、操作し易いように連結する。高等真核生物による本発明の好中球抑制因子をコード化するＤＮＡの転写はしばしばエンハンサー配列をベクター内へ挿入することにより増強し得る（例えば、クレイグラー（Kriegler，M.）、１９９１、ジーン・トランスファー・アンド・エクスプレッション、第４〜１８頁、フリーマン（W.H．Freeman）、ニューヨーク）。エンハンサーはＤＮＡのシス活性剤であり、通常約１０〜３００塩基対の長さであって、プロモーターへその転写を増加させるように働く。エンハンサーの方向および位置は比較的独立している。典型的なエンハンサーとしては、哺乳類の細胞内への発現のため、真核生物細胞のウイルスより得たエンハンサーがある。例としては、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核生物（すなわち、非細菌）ホスト細胞に用いられる発現ベクターもまた、転写の終止に必要な配列およびｍＲＮＡを安定化させるのに必要な配列を含有する。これらの配列は真核生物もしくはウイルスのＤＮＡの通常５’末端からおよび、場合によっては３’の非翻訳領域から得られる。本発明において好ましい発現ベクターとしては、PHIL7SP-N1c10、PSG5/NIF1FL CR1、Pma5-NI1/3 PAN-NIF-1FL、pYAM7SP-hNIF1/△、G11-5、pYAM7SP-hNIF1/△、 G11-5、pYAMSP-AcaNIF4、pYAMSP-AcaNIF6、pYAMSP-AcaNIF9、pYAMSP-AcaNIF24、 pAN-AceNIF3が挙げられるがこれらに限定されない。発現ベクターの構築については実施例に記載した。本明細書に記載した発現ベクターに適するホスト細胞には細菌、酵母、昆虫もしくは哺乳類の細胞を含む。好ましい細菌としては大腸菌種、好ましい酵母としてはサッカロミセス・セレビジュー（Saccharomyces serevisiae）とピキア・パストリス（Pichia pastoris）、好ましい昆虫のセルラインとしてはＳｆ９（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１７１１）、好ましい哺乳類のセルラインとしてはＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ番号CＲＬ１６５１）、ＣＨＯｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ９０９６）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１）およびＨｅＬａ（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ２）が挙げられる。これらのホスト細胞の例は例示としてのみ示したものであり、これによって本発明を制限するものではない。好ましいホスト細胞は、最小量のタンパク質分解酵素を分泌するものである。グリコシル化された好中球抑制因子を発現するのに特に有用なホスト細胞は、多細胞生体より誘導されたものである。かかるホスト細胞では複雑な翻訳後プロセシングが可能であり、発現したタンパク質のグリコシル化活性が可能である。ホスト細胞をトランスフェクトし、好ましくは上述の本発明の発現ベクターにより形質転換し、そしてプロモーターの誘導および形質転換体の選択に適するように変化させた通常の栄養培地にて培養する。トランスフェクションはホスト細胞が発現ベクターを取り込むことをいう。非常に多くのトランスフェクションの方法が当業者には知られている、例えばリン酸カルシウム共沈降、スフェロプラスト化による形質転換およびエレクトロポレーション等が挙げられる。トランスフェクションが成功したことは一般に、ホストセル内へこのベクターの作用のいずれかが認められる場合に認識される。形質転換とはＤＮＡをある生体内へ導入し、染色体外エレメントとしてかまたは染色体と同化して、ＤＮＡを複製可能とすることをいう。用いるホスト細胞によって、形質転換はその細胞に適した標準的方法（例えば細菌細胞へは塩化カルシウムまたはエレクトロポレーション；酵母細胞へはスフェロプラスト化またはエレクトロポレーション；昆虫および哺乳類細胞へはリン酸カルシウムまたはエレクトロポレーション）を用いてなし得る。組替え鉤虫ＮＩＦは分泌されたポリペプチドとして培養培地から回収するのが好ましいが、シグナルもしくは分泌配列を有さず直接発現している場合にはホスト細胞の溶解物から回収してもよい。発現された鉤虫好中球阻害剤を、培養培地もしくは細胞溶解物より以下の様々な分離方法により精製するが、精製方法としてはこれらに限定されない：ゲル濾過、アフィニティーおよびイオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、Ｃ４逆相ＨＰＬＣおよび等電点クロマトグラフィー等。（Ｆ）ＮＩＦの変異体他の観点から、本発明は図８に記載したアミノ酸配列の、１０、１８、８７、１１０、１３０、１９７または２２３位のアスパラギン残基の１または複数の残基がグルタミン残基で置換されているＮＩＦ変異体を提供する。ＮＩＦのアミノ酸配列変異体は、上述のごとく単離したＮＩＦをコード化するＤＮＡへ、ヌクレオチドの変化を誘導することによって調製される。かかる変異体にはＮＩＦのアミノ酸配列内の残基を置換したものが含まれる。所望の性質を有する最終構築物が得られるならば、どのような組み合わせの置換であってもかかる最終構造に達するために生じさせることができる。変異体の好ましい性質としては、野生型ＮＩＦを越える強さが含まれる（これに制限されない）。一旦変異ＮＩＦのＤＮＡが構築されれば、上記発現系を用いてＮＩＦ変異体の組替え体を合成し得る。ＮＩＦの変異体を調製し得る１つの方法には、塩基−特異的化学変異源を用いた、パイン（Pine）とフアン（Huang）（1987、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods Enzymol）154,415〜430）に詳述されている方法による変異誘発がある。他のアプローチは例えばスタンセンズ（Stanssens）ら、（1989）ヌクレイック・アシッズ・リサーチ17:4441〜4434に記載されている部位特異的変異処理法がある。例えば、実施例２５は１ＦＬと名付けたあるＮＩＦ（図８参照）上の特定のアスパラギン残基の置換に、部位特異的変異処理を用いたものである。ＮＩＦのアイソフォームである１ＦＬのアミノ酸配列の１０、１８、８７、１１０、１３０、１９７および２２３位にあるアスパラギン残基は、このアイソフォームのＮ−結合性グリコシレーションに強くかかわっていると考えられている。スタンセンスらの、段階的部位特異的変異処理および実施例２５に記載した５種類のオリゴヌクレオチドを用いて、１ＦＬの１０、１８、８７、１１０および１３０位にあるアスパラギン残基をグルタミン残基に置換して、ＮＩＦ変異体を得た。その後、この変異体をコード化するｃＤＮＡをさらに、同じ方法によって、記載された他のオリゴヌクレオチドを用いて、１ＦＬのアミノ酸配列の１９７および２２３位のアスパラギン残基をグルタミン残基と置換した。両方の場合において、発現された変異ＮＩＦは好中球抑制活性を有していた。２．ペプチドフラグメント他の観点からすると、本発明はクロマトグラフ的に純粋な本発明の好中球抑制因子から出発してタンパク質分解または化学的な方法によって調製される、好中球阻害活性を有するペプチドフラグメントを提供する。活性なペプチドフラグメントは糖部分を有するか否かにかかわりなく、酵素的もしくは化学的手法によって製造し得る。タンパク質分解による切り出しはインヒビターを１または複数の以下の酵素で消化することによって行い得る：キモトリプシン、トリプシン、ロイシンアミノペプチダーゼ、エンドプロテイナーゼGl u-C、エンドプロテイナーゼLys-C、エンドプロテイナーゼArg-C、エンドプロテイナーゼAsp-N（キャレー（Carrey，E.A.）、1989、「タンパク質の構造、実際のアプローチ（Protein Structure，APractical Approach）」第117〜143頁クレイグトン（T.E.Creighton）編集、アイアールエルプレス、ニューヨーク）。インヒビターの化学的消化は、シアノーゲンブロミド、ヒドロキシルアミンもしくは２−ニトロ−５−チオシアノベンゾエートによる切り出しにより行えばよい（キャレー、１９８９、前出）。糖部分はペプチドフラグメントまたはそのままの好中球抑制因子タンパク質のいずれかから１または複数の以下の酵素：グリコペプチダーゼＦ、エンドグリコシダーゼＨ、エンドグリコシダーゼＦ、またはエンドグリコシダーゼＤ、を用いて、キーセイ（Keesey，J.1987、バイオケミカ・インフォメーション（Biochemica Information）第147〜165頁、キーセイ編集、ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ、インディアナポリス）の方法によって除去し得る。反対に、インタクトなインヒビターのグリコシレーションを、細胞内におけるタンパク質の発現の阻害または真核生物の細胞培養培地内にグリコシレーション阻害剤を含有させることによって阻害してもよい。グリコシレーションの阻害剤およびその適用法は当業者によって開示されている（キーセイ（ Keesey，J.1987、バイオケミカ・インフォメーション（Biochemica Information ）第135〜141頁、キーセイ編集、ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ、インディアナポリス）。活性フラグメントを不活性フラグメントから分離するには、従来の低温、培地、または高圧クロマトグラフィー方法等、従来から公知の方法でなし得る。３．抗体他の観点から、本発明はＮＩＦへの結合能を有するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を提供する。ＮＩＦに対する抗体を調製するには、当業者に知られている方法のうちのいずれを使用してもよい。かかる技術のうちのひとつにおいて、ポリクローナル抗体はある動物（例えばウサギ）に１または複数の本発明のＮＩＦを注射して製造する。注射後、動物はかかるＮＩＦに対する抗体を産生する。抗体濃度（または力価）が十分なレベルに到達した時に、抗体を含有する血液をこの動物から抜き、抗血清をこの血液から調製し、化合物に特異的な抗体を血清中の他の抗体から、いくつもある分離方法のうちのいずれか（例えば、アフィニティークロマトグラフィー）によって単離する。モノクローナル抗体は、ケーラーとミルスタインの、ネイチャー256.495〜497 （1975）の方法および他の当業者によく知られている常套の方法を用いて調製すればよい（例えば、ハーロウとレーン（Harlow and Lane）アンティボディーズ、ア・ラボラトリー・マニュアル（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー１９８８）参照。該記載は参考として本明細書の一部をなす）。好ましいモノクローナル抗体は、ＮＩＦアイソフォームであるＩＦＬ（アミノ酸配列を図８に示した）に対するものを含み、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンである。特に好ましいモノクローナル抗体は、ＮＩＦにモノクローナル抗体３Ｄ２が結合する際と同じエピトープに結合するものである。３Ｄ２と呼ばれるモノクローナル抗体は好ましい態様のひとつである。３Ｄ２の調製は実施例２６に記載した。他の観点から、本発明はかかるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供する。このハイブリドーマをはハーロウとレーン（既出、本記載は参考として本明細書の一部をなす）に記載された常套法にて作成すればよい。好ましいハイブリドーマを実施例２６に記載した。他の観点からは、本発明はさまざまなソースからのＮＩＦおよびかかるソースから得られた不純なＮＩＦを、ＮＩＦに対する抗体を用いて親和性に基づいて精製する方法を提供する。ＮＩＦを単離する好ましい方法には、ＮＩＦを含有すると考えられる試料を、該ＮＩＦと結合し得るモノクローナル抗体と接触させる工程が含まれる。モノクローナル抗体として好ましいのは、モノクローナル抗体３Ｄ２またはこのモノクローナル抗体３Ｄ２がＮＩＦ上で結合する同じエピトープに結合するモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体の親和性に基づく精製の好ましい方法によれば、モノクローナル抗体はクロマトグラフ用樹脂に共有結合させる。特に好ましいクロマトグラフ用樹脂には商標エンファス（Ｅｍｐｈａｚｅ）バイオサポート・メディウム（３Ｍ社）が含まれる。実施例２７および２８にはクロマトグラフ用樹脂をモノクローナル抗体３Ｄ２と結合させ、ＮＩＦを含有する組成物からＮＩＦを精製する方法を記載した。他の観点から、本発明はＮＩＦに対する抗体を用いるイムノアッセイに関する。イムノアッセイのための特定の使用に応じて、イムノアッセイの方法を選択する。適当なイムノアッセイのいくつかを、ハーロウとレーンが記載している（既出）（特に５５３から６１２ページ参照）。この文献の記載は参考として本発明の一部をなす。固相法または液相法を用いるイムノアッセイは、イムノアッセイ分野の当業者によく知られている。例えば、モノクローナル抗体は薬物類、ホルモン類およびタンパク質類をアッセイするのに用いることができ、かかるアッセイは固相または液相法で行われる。本発明の好ましい方法は固相アッセイである。ＮＩＦを試料から検出するための好ましい方法には、ＮＩＦを含有するであろうと考えられる試料を、ＮＩＦに結合し得るモノクローナル抗体と接触させる操作を含む。好ましい態様においては、モノクローナル抗体をポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ナイロンおよび類似物のごときプラスチック表面へ固定化させる。プラスチック表面は試験官、微小球、顕微鏡ビーズ、マイクロタイタープレートおよび類似物の形状のものであってよい。この態様において、モノクローナル抗体は、共有結合または受動吸収によって固定化させればよいが、好ましくは受動吸収によって固定化させる。モノクローナル抗体としては、モノクローナル抗体３Ｄ２がＮＩＦ上に結合するのと、同じＮＩＦ上のエピトープに結合するもの、またはモノクローナル抗体３Ｄ２が好ましい。モノクローナル抗体は、試料と同時に検出可能な標識を共有結合させたＮＩＦに接触させてもよい。またその代わりに、モノクローナル抗体を試料と最初に接触させ、その後に先に検出可能な標識と共有結合させたＮＩＦに接触させてもよい。好ましい検出可能な標識は、酵素、蛍光化合物または放射性同位元素である。特に好ましい検出可能標識はアルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはホースラディッシュ・パーオキシダーゼのごとき酵素またはヨウ素１２５のごとき放射性同位元素である。このような酵素および放射性同位元素をモノクローナル抗体へ共有結合させる方法は、診断の分野における当業者によく知られている。４．ＮＩＦのミミックおよびＮＩＦのアンタゴニストの検索方法他の観点から、本発明は、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体もしくはＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体のＩドメイン部分に対するＮＩＦの結合と競合するＮＩＦのミミックの存在を試料中から検出する方法に関する。他の観点から、本発明はＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体もしくはＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体のＩドメインに対するＮＩＦの結合を抑制するＮＩＦアンタゴニストに関する。該方法には該試料をＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体またはＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体のＩドメインと接触させる操作を含む。ＮＩＦミミックおよびＮＩＦアンタゴニストには小さな分子、ペプチド、ペプチド類縁体またはタンパク質を含有するが、これらに制限されない。好ましい態様において、試験するＮＩＦミミックまたはアンタゴニストは好中球または固定化ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体もしくはＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体のＩドメイン部分を有する組替えペプチドを含有する溶液内でプレインキュベートし、このプレインキュベートした溶液を標識したＮＩＦと接触させる。ＮＩＦの好中球、固定化ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体またはＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体のＩドメイン部分を含有する組替えペプチドへの結合に対する試験化合物の効果を測定する。好ましい態様において、アッセイ方法は溶液内で遊離の好中球を用いる。ここで、検出可能な標識と結合しているＮＩＦ、好中球および、ＮＩＦミミックもしくはＮＩＦアンタゴニストが含有されていると考えられる試料を溶液内で結合が生じるのに十分な時間、共にインキュベートする。遠心分離、濾過または適当な方法にて結合していない標識ＮＩＦを結合しているＮＩＦから除き、結合ＮＩＦを検出可能標識によって測定する。他の好ましい態様では、好中球をプラスチック表面上へ受動吸収またはグルタルアルデヒドまたは同様の物質を用いた化学的固定化によって固定化する。標識したＮＩＦをこの固定化ＮＩＦおよび、ＮＩＦミミックもしくはＮＩＦアンタゴニストを含有していると思われる試料と共にインキュベートする。非結合標識ＮＩＦを洗浄して除き、結合している標識ＮＩＦを検出可能標識によって測定する。特に好ましい態様においては、ヒト白血球の洗剤抽出物からのＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体を、プラスチック表面へ固定化している抗ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８モノクローナル抗体へ補足させる。検出可能な標識を結合したＮＩＦまたは後から検出可能標識へ結合させ得るＮＩＦ、およびＮＩＦミミックもしくはＮＩＦアンタゴニストを含有すると思われる試料を、固定化ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体と共にインキュベートする。結合が生じた後、結合していないＮＩＦを洗浄して除く。ＮＩＦに結合する検出可能標識をその後、ＮＩＦの検出ができるよう添加する（最初にＮＩＦにかかる標識を結合していない場合）。結合したＮＩＦを、検出可能標識にて測定する。抗ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８抗体を共有結合または受動吸収によってプラスチック表面へ結合させてもよく、この場合には受動吸収によるのが好ましい。好ましいプラスチック表面は、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ナイロンおよび類似物であるが、ポリスチレンが好ましい。プラスチック表面は試験官、微小球、顕微鏡ビーズ、マイクロタイタープレートおよび類似物の形状であってよい。好ましい抗ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８抗体はＬＭ２と名付けられているモノクローナル抗体である。ＮＩＦには検出可能標を結合させるか、または本発明のアッセイ方法の工程中においてかかる標識を結合させてもよい。ＮＩＦにかかる標識を、グルタルアルデヒド、ジスクシンイミジルスベレート（disuccinimidyl suberate）、ジメチルスベリミデート（dimethyl suberimidate）および類似物のごとき、同−２官能性（homobifunctional）架橋剤を用いた共有結合によって結合させる。ＮＩＦは、本発明のアッセイ法の工程中において、最初にビオチンをＮＩＦへ結合し、そしてアビジンを検出可能標識へ結合させることによって、検出可能標識へ結合することができる。好ましい検出可能標識には、酵素、蛍光物質または放射線同位元素を含む。特に好ましい検出可能標識はアルカリ性ホスファターゼ、β−ガラストシダーゼ、ホースラディッシュ・パーオキシダーゼまたはヨウ素１２５である。他の特に好ましい態様において、検出可能標識に結合しているかまたはその後に検出可能標識に結合させ得るペプチドＮＩＦのある部分を認識するモノクローナル抗体複合体と複合体を形成しているＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体のＩドメインを含有する組替えペプチドと、ＮＩＦミミックもしくはＮＩＦアンタゴニストを含有すると考えられる試料を共にインキュベートする。結合が生じた後、タンパク質Ａセファロースを、未結合ＮＩＦと結合したものを分離するために添加する。その後、ＮＩＦに結合する検出可能標識を、ＮＩＦの検出のために添加する（ＮＩＦが最初に標識されていない場合）。結合したＮＩＦをこの検出可能標識によって測定した。ＮＩＦミミックもしくはＮＩＦアンタゴニストについて、好中球抑制活性のアッセイを行ってもよい。好中球抑制活性は好中球の血管内皮細胞に対する接着の測定、好中球からの過酸化水素の放出の測定、好中球の同種凝集およびプラスチック表面への好中球の接着のごときアッセイによって測定し得る。ＮＩＦミミックは好中球活性の抑制のＩＣ₅₀が５００ｎＭまたはそれ以下のものであり、約１００ｎＭまたはそれ以下が好ましい。ＮＩＦアンタゴニストはこのＩＣ₅₀が約１０００ｎＭから約１ｍＭと特徴付けられるが、好ましくは約５０００ｎＭから約１０ｍＭである。ＩＣ₅₀は測定された活性を５０％抑制するＮＩＦミミックまたはＮＩＦアンタゴニストの濃度である（実施例１参照）。所望によりＮＩＦミミックもしくはＮＩＦアンタゴニストを好酸球抑制活性のアッセイに供してもよい。好酸球抑制活性は好酸球の血管内皮細胞への接着を測定するアッセイによって調べる。ＮＩＦミミックをアッセイした場合、好酸球活性の抑制のＩＣ₅₀が約５００ｎＭまたはそれ以下であると特徴付けられるが、ＩＣ₅₀が１００ｎＭまたはそれ以下のものが好ましい。ＮＩＦアンタゴニストをアッセイした場合、好中球活性抑制のＩＣ₅₀が約１０００ｎＭから約１ｍＭであると特徴付けられるが、ＩＣ₅₀が５０００ｎＭから約１０ｍＭのものが好ましい。ＩＣ₅₀は測定した活性を５０％抑制する際のＮＩＦミミックもしくはＮＩＦアンタゴニストの濃度である。他の観点から、本発明はこの章の上記検出方法によって発見されるＮＩＦミミックおよびＮＩＦアンタゴニストも提供する。５．医薬処方および投与方法他の観点から、本発明はＮＩＦを含有する医薬組成物を提供する。医薬組成物は、経口投与のためのタブレット、カプセルまたはエリキシル；直腸投与のための座薬、注射用の滅菌溶液、懸濁液などとして調製し、使用する。投与量および方法は最適効果が得られるように設定すればよいが、これは体重、食餌、同時に投与している薬などの因子、および医薬に関する当業者が認識しているであろう他の因子に依存する。使用される組成物の効力にもよるが一般に０ .０１mg／kgから１００mg／kg体重／日の量で投与される。好ましい態様には貯蔵およびその後の投与のために調製された、医薬的に有効な量の本明細書に記載したＮＩＦもしくはＮＩＦの濃縮組成物を、医薬的に許容し得るキャリアーまたは希釈剤中に含む医薬組成物を包含する。治療に許容し得るキャリアーまたは希釈剤は医薬分野ではよく知られ、かつ、例えばレミントンズ・ファーマシウチカル・サイエンス、（マック・パブリッシング・コ；Ａ．Ｒ．ジェナロ著１９８５）などに記載されている。保存剤、安定剤、染料、および香料を医薬組成物中に加えてもよい。例えば安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸を保存剤として加えてもよい。加えて抗酸化剤および分散剤を使用してもよい。他の観点において、本発明は異常な好中球の活性化もしくは異常な好酸球の活性化に特徴づけられる哺乳類の炎症症状を排除するために、当該哺乳類に治療効果量のＮＩＦもしくはその医薬組成物を投与する工程を含む方法を提供する。好ましい方法を実施する際に、ＮＩＦまたはその医薬組成物を単独でまたは相互に組み合わせて、もしくは他の治療もしくは診断薬と組み合わせて使用してもよい。これらの組み合わせはイン・ビボで通常ほ乳類に、好ましくは人に、あるいはイン・ビトロで利用してもよい。ＮＩＦまたはその医薬組成物をイン・ビボに採用する際には、種々の方法、例えば非経口、静脈、皮下、筋肉内、結腸、直腸、鼻または腹膜内に、種々の投与形態でほ乳動物に投与し得る。当業者に明らかなように、有用なインビボ投与の剤形および投与方法は治療すべき哺乳動物種、使用する組成物およびこれらの組成物を使用するための用途によって変わる。有効な容量レベルの決定、即ち、所望の結果を達成するに必要な容量レベルは当業者の通常業務の範囲内である。典型的には組成物の適用は低容量レベルで始め、所望の効果が達成されるまで容量を増加させて行う。ＮＩＦまたはその医薬組成物の用量は所望の効果および治療上の徴候により広範囲であってよい。典型的には用量は約０.０１mgから１００mg／kg、好ましくは約０.０１から１０mg／kg体重である。投与は好ましくは非経口投与、たとえば毎日のあるいは必要に応じての静脈注射である。注射薬は通常の形状、即ち、溶液状または懸濁液、注射前に溶液または懸濁液にするために適した形状の固体またはエマルジョンとして調製してもよい。適当な賦形剤は例えば水、生理食塩水、デキストローズ、マンニトール、ラクトース、レシチン、アルブミン、グルタミン酸ナトリウム、システイン塩酸塩などである。加えて、所望ならば注射可能な医薬組成物は少量の非毒性助剤、例えば湿潤剤、pＨ緩衝剤などを含んでいてもよい。所望ならば吸収増強剤（例えばリポソーム）を利用してもよい。６．利用および応用出願人が上記に述べたように、本発明は白血球の抑制剤を提供するものであり、好ましい観点からはＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体を有するかまたは発現している白血球を抑制するものである。ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８インテグリンレセプターを有するかまたは発現している白血球はよく知られており単球、マクロファージ顆粒球、大顆粒リンパ球（ＮＫ細胞）および未熟ＣＤ５⁺Ｂ細胞（キシモト、ラーソン（Larson，R.S.）、コルビ（Corbi，A.L.）、ダスティン（Dustin，M.L.）、スタウトン（Staunton，D.E.）およびスプリンガー（Springer，T.A.）（1989 ）アドバンス・イン・イムノロジー46、149〜182）を含む。ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８は好中球の内皮細胞への接着（プリエット（Prieto，J.）、ベティー（Beatty ，P.G.）、クラーク（Clark，E.A.）、パタローヨ（Patarroyo，M.（1988）イムノロジー、63、631〜637;ワリス（Wallis，W.J.）、ヒクスタイン（Hickstein， D.D.）、シュワルツ（Schwartz，B.R.）、ジューン（June，C.H.）、オクス（Oc hs，H.D.）、ベティー（Beatty，P.G.）、クレバノフ（Klebanoff，S.J.）、およびハーラン（Harlan，J.M.）（1986）ブラッド67、1007-1013；スミス（Smith ，C.W.）、マーリン（Marlin，S.D.）、ロスライン（Rothlein，R.）、トーマン（Ｔoman，C.）およびアンダーソン（Anderson，D.C.）（1989）ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション83、2008〜2017）および好中球からの過酸化水素の放出（シャペル（Shappell，S.B.）、トーマン、アンダーソン（An derson，D.C.）、テイラー（Taylor，A.A,）、エントマン（Entman，M.L.）および、スミス（Smith，C.W.）(1990）ジャーナル・オブ・イムノロジー144、2702 〜2711;フォン・アスムス（VonAsmuth，E.J.U.）、ファン・デル・リンデン（Va n Der Linden，C.J.）、レレーウェベルグ（Leeuwenberg，J.F.M.）、およびブールマン（Buurman，W.A.（1991）ジャーナル・オブ・イムノロジー147、3869〜 3875）のごときさまざまな白血球の機能に関与している。このインテグリンは好中球および単球のオプソニン化された（すなわちＣ３ｂｉ被覆された）標的の貪食において主要な働きをしている（ベラー（Beler，D.I.）、スプリンガー（Spr inger，T.A.）およびシュライバー（Schreiber，R.D.）（1982）ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン、156、1000〜1009）。ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８はＣ３ｂｉ被覆標的細胞に対するナチュラルキラー活性にも寄与していることが報告されている（ラモス（Ramos，O.F.）、カイ（Kai，C.）、イェフェノフ（Yefenof，E.）、およびクライン（Klein，E.）（1988）ジャーナル・オブ・イムノロジー140、1239〜1243）。先に述べたごとく、本発明のＮＩＦは強い好中球抑制活性を有する。したがって、好中球のインビトロにおける活性化を含む、好中球活性の抑制剤として用いるのと同様、好中球の異常な活性化に特徴付けられる哺乳類の炎症疾患の予防または治療のために用いることができる。すなわちＮＩＦは好中球の異常な活性化が重要な役割を果たす炎症の治療に有用である。出願人は、活性の理論もしくは機構をむすびつけることを意図するものではないが、本発明の化合物が好中球−内皮細胞相互作用によって活性化される炎症応答を妨害するものであると考えられる。すなわち、好中球の内皮細胞への結合が阻止されれば、好中球が組織へ移動できず、組織のダメージを導く前炎症応答を生じさせることができなくなる。ＮＩＦによる好中球−好中球結合および／または凝集の抑制もまた毛細血管閉塞を阻止する。すなわち、ＮＩＦは、ショック、拍動、急性および慢性同種移植拒絶、脈管炎、自己免疫性糖尿病、慢性間接リューマチ、炎症性皮膚疾患、炎症性腸疾患、成人呼吸減少症候群（ＡＲＤＳ）、心筋梗塞の後の虚血−再灌流損傷等の、様々な臨床症状で好中球の浸潤および活性化が関与する様々な症状、敗血症または細菌性脳膜炎のごとき細菌の感染によって生じる急性炎症の治療に有用である。ＮＩＦの好中球活性抑制能のため、ＮＩＦは炎症、虚血、および他の好中球の媒介する組織のダメージの生理的プロセスを抑制するのに有用である。これらの関連機能におけるＮＩＦの特異的活性のため、ＮＩＦは治療および／または診断薬として特に有用である。ＮＩＦに対するモノクローナルおよびポリクローナル両方の抗体は、診断目的に有用であり、さまざまな生物流体内の目的とするペプチドの濃度を特定するのに有用である。これらの抗体を使用するイムノアッセイを哺乳類のホストへの寄生虫の感染の検査または哺乳類ホストの組織内における寄生虫からのＮＩＦの検出のための診断試験に有用である。さらにかかるイムノアッセイは組織ホモジネイト、クローン化細胞などからのＮＩＦの検出および単離にも有用である。本発明の他の観点では、適当なアジュバントと共にＮＩＦを哺乳類の寄生虫感染に対するワクチンとして用いることができる。ＮＩＦワクチンによる免疫化は、寄生虫の感染に対する予防および治療の両方に有用である。ＮＩＦのフラグメントおよびＮＩＦのアミノ酸配列を有する合成ポリペプチドもまた、ワクチンとして用い得る。寄生虫による疾患症状は、これらの感染動物に、ＮＩＦに対してアンタゴナイズする寄生虫物質（ＮＩＦアンタゴニストのごとき）を投与して治療し得る。化合物の抗ＮＩＦ効果は上述のスクリーニング法によってスクリーニングし得る。かかる抗蠕虫剤の例としては、ＮＩＦに対する抗体、血清から単離される天然由来の抗体および上述のポリクローナルおよびモノクローナル抗体が含まれる。化学合成された化合物であってＮＩＦの抑制剤として働く化合物もまた抗蠕虫剤として適する。本発明の理解を助けるため、以下の実施例は、一連の実験の結果を含む。以下の実施例は本発明に関するものであるが、当然、本発明を特に限定するものと考えられるべきではなく、現在知られており、および将来開発される本発明の変形であって、当業者が明細書に記載し、特許請求の範囲としている本発明の範囲に入るとするものは、本発明の範囲である。実施例実施例１好中球抑制活性試験本発明の好中球抑制因子は、好中球‐HUVECおよび好中球プラスチック接着試験、好中球の同型凝集試験および過酸化水素放出試験で測定された好中球機能抑制で活性を示した。この抑制因子は鉤虫組織溶解物から、ゲル濾過クロマトグラフィー、ハイドロキアパタイトおよびコンカナバリンＡセファロースクロマトグラフィー、C4逆相HPLC、モノ‐Ｑイオン交換クロマトグラフィーおよび分取用等電点電気泳動を含む様々な方法による濃縮成分として単離された。この単離された因子は好中球活性化を抑制することにより、内皮細胞単層への好中球接着を抑制すると考えられる。（A）細胞および試薬クロネティックス（Clonetics、サンディエゴ（San Diego、CA））より入手した一次ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を５％Co₂環境下15％ウシ胎児血清（FBS ）を含むEGM‐UV培地（クロネティックス）中に保存した。HUVECを二回継代し、接着試験のためにフィブロネクチン塗布96ウエルマイクロタイタープレート（コラボレーティブリサーチ（Collaborative Research）、ベッドフォード（Bedfor d）、MA）に接種するために使用した。プロテアーゼ抑制剤E64、ペプスタチンA、キモスタチンおよびAPMSFはカルバイオケム（Calbiochem、ラ・ジョラ（La Jolla、CA））より入手した。好中球はヘパリン化またはクエン酸化ヒト血液から、製造者の指針に従ってモノポリ（Mono-Poly）分離培地（ICN バイオメディカルズ（Biomedicals）、コスタ・メサ（Costa Mesa、CA））を用いて単離した。好中球をHSA緩衝液（pH 7 .4の10mMHEPES、1.2mM CaCl₂、1.0 mM MgCl₂、1％ヒト血清アルブミンを含むRPM I1640）中に6.6×10⁶細胞／mlの濃度で再懸濁し、単離後１時間以内に使用した。好中球を以下の手順で蛍光標識した。細胞をハンクス（Hank's）の平衡塩溶液（HBSS）で一回洗浄し、20μg／mlのカルセイン（モレキュラー・プローブス（M olecular Probes；ユーゲン（Eugene）OR）））を含むHBSS中に1×10⁷細胞／ml で再懸濁した。HBSSに添加する前にカルセインをまず50μlの乾燥ジメチルスルホキサイドに溶解した。ときどき転置撹拌して細胞を37℃でインキュベートした。 45分間のインキュベーション後、細胞を氷上で５分間冷却し、次いで氷冷HSA緩衝液で二回洗浄した。標識好中球を接着試験に使用するために1.3×10⁷細胞／ml でHSA緩衝液に再懸濁した。（１）タンパク質濃度精製したNIFアイソフォームおよびその変異体のモルタンパク質濃度を、278nm にて分光分析して計算した吸光係数を用いて測定した。計算はトリプトファン残基に対しては5600cm^-1・mol^-1、チロシン残基に対して1420cm^-1・mol^-1であるという標準吸光値に基づいて行った。（２）３Ｄ２−ＨＲＰ複合体の調製 250μlのグルタルアルデヒド（25％溶液）を８ｍｇ／ｍｌのホースラディッシュパーオキシダーゼ溶液（シグマP8375；リン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ））１ｍｌへ添加した。室温で２時間置いた後、混合物を透析用の袋（分子量分断、１２ＫＤ）へ移し、１リットルのＰＢＳに対して５時間透析した。緩衝液は３回新しいものに変えた。溶液を試験管に移した後、等体積の３Ｄ２精製モノクローナル抗体（実施例２６参照；２ｍｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳに溶解した）を添加し、さらに室温で一晩インキュベートした。グリシンを最終濃度が５０ｍＭとなるように添加して反応を止めた。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；カルバイオケム社）を最終濃度が０.２５％（ｗ／ｖ）となるように添加し、溶液を分注して−２０℃で保存した。（３）ビオチン化ピキアＮＩＦ−ＩＦＬの調製ピキアから精製した組替えＮＩＦ（ＮＩＦ−ＩＦＬ）を、１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５.５）に対して透析して、１ｍｇ／ｍｌの濃度の精製物を得た。等体積の冷２０ｍＭメタペリオデート・ナトリウム（１００ｍＭの酢酸緩衝液ｐＨ５．５中）を添加した。暗所、氷上にて２０分間酸化反応が進むよう、放置した。反応はグリセロールを最終濃度が15mMとなるように添加して停止させた。試料はセントリコン30（Centricon30）による限外濾過によって脱塩した。ジメチルスルホキシドに溶解したビオチン-LCヒドラジド（ピアース（Pierce））を最終濃度が5 mMになるように添加し、その後さらに2時間室温にてインキュベートした。ビオチン化試料を続いて、12000の分子量分画スペクトラポアー（Spectrapor）膜にてPBSに対して透析した。（B）好中球‐HUVEC接着アッセイカルセイン標識好中球（1.32×10⁷細胞／mlで175μl）を、160nMのホルボール ‐12‐ミリステート‐13‐アセテート（PMA；シグマ、セントルイス、MO））の存在下に175μlの試験分画（HSA緩衝液中で希釈）と室温で10分間プレインキュベーションした。PMAは1.6mMの貯蔵濃度でジメチルスルホキサイド中に可溶化されている。本アッセイのために96ウエルプレートを使用した。次ぎにそれぞれの懸濁液の100μlを、HUVEC単層を含むウエル３個に100μlずつそれぞれ分注した。好中球をHUVEC単層と共に37℃で30分間インキュベートした。非接着細胞を除くためウエルをまず250μlのHSA緩衝液で満たし、パラフィルムでシールし、次いで75×gで３分間遠心回転した。次に回転させたプレートをロッキングプラットホームシェーカー上に５分間置き、その後内容物を傾斜流出して除き、ウエルを100μlのHSA緩衝液で二回洗浄した。接着した好中球を100μlの0.1％（v／v）トリトンX‐100（Triton X-100）（50mMトリス（Tris）HCl、pH 7.4中）中で溶解し、プレートシェーカー上で10分間撹拌した。25μlの好中球／内皮細胞溶解物を100μlの50mMトリス（pH 7.4）を含む96ウエルマイクロタイタープレートに移し、ウエルをサイトフルオル（Cytofluor）蛍光プレートリーダー（ミリポア（Millipore）；ベッドフォード（Bedford、MA））上で530nm（485nm励起）で読みとった。鉤虫好中球抑制因子のヒドロキシアパタイト貯蔵調製液（実施例１（D）参照）は約10nMのIC₅₀でHUVEC単層への好中球接着を抑制した。（C）好中球‐プラスチック接着アッセイ（１）プロトコル＃１このアッセイは実施例1から19までにおいて用いたものであり、該実施例においてはこのアッセイが適当であった。 0.5mlのポリエチレン試験管中で好中球（6.6×10⁶細胞／mlで20μl）を5μLの PMA（0.8μM）と室温で５分間インキュベートした。HSA緩衝液中で希釈した20μ lの試験分画を添加し、懸濁液を緩やかに混合した。この懸濁液の10μl分を３連で、60ウエルHCA（テラサキ）プレート（ヌンク（Nunc）、ネーぺルビル（Naper ville、IL））のマイクロタイターウエルに添加した。好中球を37℃で５分間インキュベートし、プレートをHBSS中に６回浸けてして非接着細胞を除いた。倒立光学顕微鏡下で計数して接着好中球を定量した。結合は目視で判定した。 PMA活性化好中球はポリスチレンプラスチック上に伸展して固く接着した。非活性化好中球（例えばPMAなし）は円く半透明のままであり、プラスチックに固く接着しない。接着好中球はより、より大きく、形状はひし形で、顆粒の存在から、より不透明であった。好中球抑制因子がない場合、80％以上のPMA活性化好中球は急速かつ不可逆的にプラスチックに結合、形状変化し穏やかな洗浄工程では除去されなかった。さらにアンサイロストマ（Ancylostoma）好中球抑制因子を含む分画は、活性化好中球によるプラスチック結合にかなりの抑制効果を示した。鉤虫好中球抑制因子のハイドロキシルアパタイト貯蔵調製液（実施例１（D）参照）は、約10nMのIC₅₀でこの試験におけるプラスチックへの好中球接着を抑制した。（２）プロトコル＃２このアッセイは実施例20から29にて用いたものであり、該実施例においてはこのプロトコルが適していた。好中球（60μl、HSA緩衝液内に8×10⁶細胞/ml）を、15μlのPMA（2.4mM）および５μlのCaCl₂（0.05M）と共にインキュベートした。穏やかに混合した後、80 μlの剌激した細胞懸濁液を、HSA緩衝液にて希釈した試験試料20μlを入れた96 ウエル高結合性ポリスチレンマイクロタイタープレート（コスター（Costar））へ添加した。37℃で45分間インキュベートした後、プレートをPBS内へ４回沈めて非結合細胞を除いた。接着した細胞を、100μlの0.5%（w/v）クリスタルバイオレット指示薬（CAS 548-62-9）溶液を添加して染色した。10分間室温で放置した後、プレートをPBS 内へ４回浸してゆすいだ。染色された接着細胞の溶解は、100μlの１%（v/v）トリトンX-100溶液を添加して行った。605nmにおける吸収を、サーモマックス・プレート・リーダー（Thermomax plate reader）を用いて測定し、結合した好中球を定量した。（D）好中球の同型凝集サイエンコ（Scienco）デュアルチャネル凝集計（モリソン（Morrison、CO））中、37℃で好中球凝集を行った。好中球（6.6×10⁶細胞で190μl）をガラスキュベット（サイエンコ)中で２分間、室温で200μlの試験分画（HSA緩衝液で希釈）とプレインキュベートした。10μlのPMAを凝集を開始するために添加した（最終80nM）。好中球凝集の抑制は、PMA添加後５分間の最大凝集応答で測定した。好中球抑制因子のヒドロキシアパタイト貯蔵調製液（実施例１（D）参照）は約10nMのIC₅₀で好中球接着を抑制した。（E）過酸化水素放出試験好中球（6.6×10⁶細胞／ml）を放出試験緩衝液（25mMグルコースを含むHBSS緩衝液、10％FBS）200μg／mlフェノールレッド、32μg／mlセイヨウワサビペルオキシダーゼ）中で５分間、37℃で試験分画とインキュベートした。インキュベーション容器は、50％FBSを含むHBSSで37℃で60分間プレコートされた1.5mlのプラスチック試験管製であり、被覆された試験管を使用前に0.15M NaClで２回洗浄した。最終濃度250μMのFMLP（シグマ；セントルイス、MC）を添加し、好中球／試験化合物懸濁液を37℃で60分間インキュベートした。細胞を8000×gで３分間遠心してペレットとし、200μlの上澄液を96ウエルマイクロタイタープレートに移した。1N Na0H 10μlをそれぞれのウエルに添加し、モレキュラー・デバイス・サーモマックス（Molecular Device ThermoMax）プレートリーダーにより610nm で吸光度を読みとった。過酸化水素濃度は標準曲線を用いて測定した。データーポイントは二連で行った。鉤虫好中球抑制因子のハイドロキシルアパタイト貯蔵調製液は、約10nMのIC⁵⁰ で好中球からの過酸化水素放出を抑制した。（F）CD11b/CD18結合アッセイマイクロタイターポリスチレンプレート（コスター-高結合性;96ウエル）に、 CD11b/CD18結合性、非中和マウスモノクローナル抗体LM2（精製LM2モノクローナル抗体、濃度10μg/ml（0.1M NaHCO₃、pH9.5中）;LM2 ATCCハイブリドーマ＃HB2 04）を、４℃で一晩のインキュベーションして被覆した。抗体を除いた後、ウエルを１%（w/v）スキムミルク（ディフコ・ラボラトリーズ）を含有するPBS200μ lにて室温でブロックした。２時間後、ブロック溶液を除き、ウエルを200μlのP BSで３回洗浄した。固定化したLM2モノクローナル抗体を以下のごとく、洗浄剤に可溶化させたCD1 1b/CD18レセプターの免疫-捕獲に用いた。好中球をポリモルフプレップ^TM（Poly morphprep^TM）（ニコムド（Nycomed））を用いて、クエン酸化した全血または軟層（buffy coat）から、説明書に従って単離した。50mlの軟層から得た好中球のペレットを40mlのRPMIに再懸濁し、ホールボルミリステートアセテート（PMA）を最終濃度が0.8μMになるように添加した。懸濁液を室温で20分間、穏やかに回転させた。回転により集まった細胞を、5mlの0.02Mトリス-HCl、0.15M NaCl，0. 001MMgCl₂、0.001M CaCl₂溶液に再懸濁させた。５ｍlの２％トリトンX-100（バイオーラッドラボラトリーズ））、0.02MトリスpH7.5、0.15M NaCl、0.001M MgC l₂、0.001M CaCl₂および0.02％チメロサル(シグマT-5125)を含有する緩衝液を添加して細胞を溶解させた。PMSF（シグマ）およびヨードアセトアミド（メルク- シュカルド）を最終的な濃度が1mMとなるように添加した。混合した後、懸濁液を氷上へ１時間保持し、定期的にボルテックスをかけた。30,000gにて遠心分離した後、上澄を0.02Mのトリス-HCl、0.15MのNaCl、0.01MのMgCl₂にて２倍に希釈し、2mlのIgGセファロース（シグマ）を加えた。２時間冷却中でインキュベートした後、回転させて樹脂を沈殿させた。上澄を分取し、0.02Mトリス-HCl、0.15M NaCl、0.01M MgCl₂、0.001M CaCl₂を含む溶液にて５倍に希釈した。50μｌのこの好中球溶解物をLM2で被覆したウエル内へ添加し、２時間室温でインキュベートしてCD11b/CD18インテグリンを捕獲させた。PBSにて洗浄の後、プレートを-20 ℃にて保存した。ある種類のアッセイにおいては、NIFの結合（NIF-1NFL、およびそのアイソフォームもしくは操作して得た変異体）のLM2/CD11b/CD18被覆プレートに対する結合を3D2-HRP複合体にて測定した。NIFを含有する試料を0.1%（w/v）スキムミルク、0.001M MgCl₂、0.001M CaCl₂を含有するPBSにて希釈した。室温で２時間インキュベーションした後、0.001M MgCl₂、0.001M CaCl₂、0.02%ツイン20および0.0 2%チメロサルを含有するPBS200μｌにてウエルを２回洗浄した。その後適当に希釈した3D2-HRP複合体（典型的には2000倍に、0.1%（w/v）スキムミルク、0.001M MgCl₂、0.001M CaCl₂を含有するPBSにて希釈したもの）を100μl添加した。１時間後、0.001M MgCl₂、0.001M CaCl₂、0.02%チメロサルおよび0.02%ツイン20を含有するPBS200μｌにてウエルを３回洗浄した。HRPに対する基質（100μl;2.3m gのオルソーフェニレンジアミンを11.6mlの50mMクエン酸、100mMリン酸２ナトリウム緩衝液、pH5に溶解させ、２μｌの35%H₂O₂を添加して調製）をウエルへ添加した。反応を（典型的には20分後に）10μlの4M硫酸溶液を添加して止めた;605n mにおける吸収をサーモマックス・プレートリーダー（モレキュラー・デバイシズ）によって測定した。または、NIF（NIF-1FL）他のNIFタンパク質およびNIF変異体）のLM2/CD11b/CD 18複合体への結合は、ピキアが産生する組替えNIF-1FLをビオチン化したものとの競合によって測定した（実施例12参照）。一定量のビオチン化組替えNIF-1FL とさまざまな量の非標識組替えNIF-1FLを含有する試料を0.001M MgCl₂、0.001M CaCl₂および0.1%（w/v）カゼイン（ディフコ・ラボラトリーズ）を含有するPBS 内に調製した。各試料100μlをそれぞれLM2/CD11b/CD18で被覆したウエルへ添加し、室温で２時間インキュベートした。結合していない物質を0.001M MgCl₂、0. 001M CaCl₂、0.02%ツイン20および0.02%チメロサルを含有するPBS200μlにてウエルを３回洗浄して除いた。保持されたビオチン化組替えNIF-1FLを測定すべく、最初に100μlのエキストラアビジン（ExtrAvidin）-フォスファターゼ（シグマ）複合体を0.1%カゼインを含有するPBSにて希釈したものと共にインキュベートした。１時間の室温におけるインキュベーションの後、非結合複合体を0.001M MgCl₂、0.001M CaCl₂、0.02%ツイン20および0.02%チメロサルを含有するPBS200 μlにてウエルを３回洗浄して除いた。アルカリ性フォスファターゼの基質（1.8 mlの0.01Mジエタノールアミン、0.5mMのMgCl₂、pH9.5中に5mgのオルソ-ニトロフェニルホスフェートを含有する溶液を100μl）を添加した。30分の後、ウエルをサーモマックス・プレートリーダーにて405nmの吸収を調べて、結合しているビオチン化組替えNIF -1FLを定量した。実施例２鉤虫溶解物からの天然好中球抑制因子の単離（A）鉤虫溶解物の調製凍結イヌ鉤虫をアンタィボディー・システムズ（Antibody Systems、ベッドフォード（Bedford、TX））から入手した。鉤虫はホモジェネートに使用するまでは-70℃にて保存した。鉤虫をホモジェネーション緩衝液（0.02M トリス‐HCl（pH 7.4）、0.05M NaC l、0.001M MgCl₂、0.001M CaCl₂、1.0×10^-5M ジチオトレイトール、1.0×10^-5 E-64プロテアーゼインヒビター（CAS 66701-25-5）、1.0×10^ー6ペプスタチンA（イソバレリル‐Val‐Val‐4‐アミノ‐3‐ヒドロキシ‐6‐メチル‐ヘプタノイル‐Ala‐4‐アミノ‐3‐ヒドロキシ‐6‐メチルヘプタン酸、CAS26305-03-3）、1.0×10^-5Mキモスタチン（CAS 9076-44-2）、2.0×10^-5M APMSF（アミジノフェニルメチルスルホニルフルオライド‐HCl）、５％（v／v）グリセロール）中で、テクマール・ティッシュマイザー（Tekmar Tissuemizer）ホモジェナイザーを用いて氷上でホモジェネートした。プロテアーゼインヒビターE64、ペプスタチンA、キモスタチン、およびAPMSFはカルバイオケム（Calbiochem、ラ・ジョラ（La Jolla、CA））から得た。約３〜６mlのホモジェネーション緩衝液をグラム毎（約500匹の虫）の凍結虫をホモジェナイズするために使用した。不溶物を二回連続遠心分離工程、すなわち４℃、40,000×g_maxで20分間、次いで４℃、105, 000×g_maxで40分間にてペレット化した。上澄液を0.2μmセルローズアセテートフィルター（コスタール（CoStar））を通して透明化した。（B）鉤虫溶解物のコンカナバリンAセファローズクロマトグラフィー鉤虫溶解物（79ml）を、Con A緩衝液（0.02M トリス‐HCl、pH 7.4、1M NaCｌ、0.001M CaCl₂、0.001M MnSO₄、1×10^-5ジチオトレイトール)を３ml／分（90cm ／時間)の流速で２時間、前以て平衡化した1.6×8cmのカラム上を循環させて、1 6mlのコンカナバリンＡセファローズ（ファルマシア（Farmacia））に吸着させた。カラムは室温（24℃）であったが、溶解物の容器は工程中氷の上に置いた。続いてカラムを80mlのCon A緩衝液で洗浄した。カラム中のCon A緩衝液を0.5Mメチル ‐アルファ‐マンノピラノシドで置換し、30分間流れを止めた。次いで0.5ml／分（15cm/時間）の流速で流れを再開した。好中球機能試験で抑制活性を有する物質を、0.5Mメチル‐アルファ‐マンノピラノシド（CAS 617-04-09）を含有するカラム体積の約３倍容量のCon A緩衝液で溶離した。この工程における好中球接着抑制活性の収率は約38％であった。図１は、上記の様に行われた鉤虫溶解物のコンカナバリンＡセファローズクロマトグラフィーを示す。280nmの吸光度を時間の関数としてプロットした。（C）スーパーデックス200を用いる分子ふるいクロマトグラフィー活性分画を固定化コンカナバリンＡから溶離し（上記工程（B）参照）、10,00 0ダルトン分画膜（YM10）を装着したアミコン（Amicon）撹拌セルを用いて４℃ で限外濾過により濃縮し、次いで５〜20mlの濃縮液を分取用スーパーデックス（ Superdex）200（ファルマシア）の、同種のカラムと直列につないだ2.6cm×60cm カラム（合わせた寸法2.6×120cm）に負荷した。双方のカラムを24℃で0.01Mリン酸カリウム、pH 7.35、0.150M NaCｌ、1×10^-5Mジチオトレイトールであらかじめ平衡化した。クロマトグラフィーは流速1.5ml／分で行い、抗接着活性は典型的には実験中に395〜410mlに溶出した（K_av 0.46、図２参照）。この溶離体積は分子量50.000を有する球状タンパク質で予想されるものである。この工程での好中球機能抑制活性の収率は典型的には70〜80％であった。使用するクロマトグラフィー緩衝液のイオン強度を0.01Mリン酸ナトリウム、pH 7.00、および10％（ v／v）グリセロール添加に減少させた場合、溶出する活性は実質的により早くなる（K_av=0.34）が、これはこの様な条件下ではタンパク質が凝集するか、またはそのコンフォーメーションを変える（より大きいストークス半径を想定）ことを示唆している。図２はコンカナバリンＡ精製鉤虫溶解物のスーパーデックス200クロマトグラフィーを示す。280nmにおける吸光度を溶離体積に対してプロットした。活性分画を固定化コンカナバリンＡから溶離し（上記工程（B）参照）、10,000ダルトン分画膜（YM10）を装着したアミコン（Amicon）撹拌セルを用いて４℃で限外濾過により濃縮し、次いで５〜20mｌの濃縮液を調製用スーパーデックス（Superdex）200の、同種のカラムと直列につないだ2.6cm×60cmカラム（合わせた寸法2.6×120cm）に負荷した。双方のカラムは24℃で0.01Mリン酸カリウム、pH 7.35、0.150M NaC ｌ、1×10^-5Mジチオトレイトールであらかじめ平衡化しておいた。クロマトグラフィーを流速1.5ml／分で行い、活性が典型的には実験中に395〜410mlに溶出した（K_av 0.46、図２参照）。（D）セラミック‐ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー分子ふるいクロマトグラフィーで精製した材料を、10キロダルトン分画膜を装着したアミコン撹拌セルを用いて４℃で限外濾過により５倍に濃縮し、次いで水で10倍に希釈した。脱塩試料を、24℃で0.001Mリン酸カリウム、pＨ 7.00、1×1 0^-5M CaCl₂、1.0×10^-5ジチオトレイトールで平衡したセラミックヒドロキシアパタイト（“HA”）（ペンタックス（Pentax）、アメリカン・インターナショナル・ケミカル社（American InternationalChemical、Inc）、ナチック（Natick 、MA）、2μm）の0.8×10cmカラムに負荷した。負荷は0.8ml／分（95.5cm／時間）の流速で行われた。カラムを0.5ml／分の流速で、0.001M〜0.0375Mの範囲のリン酸カリウムの50ml直線勾配で展開した。好中球抑制活性はリン酸カリウム0.02 5Mの位置に鋭く溶出し、次いでリン酸カリウム0.0325Mの位置まで尾を引いた（分画37〜48）。この工程の活性収率は約48％であった。図３はスーパーデックス／コンカナバリンＡ精製鉤虫溶解物のセラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを示し、分画番号に対する280nm吸光度およびリン酸カリウム濃度をプロットしたものである。好中球抑制活性は分画37〜 48に溶出した。（E）逆相HPLC コンカナバリンＡセファローズ、スーパーデックス、およびセラミックハイドロキシルアパタイトクロマトグラフィーで分画した鉤虫溶解物（〜100μg）を30 0オングストローム C4（バイダック（vydac））の0.48×15cmカラムに負荷し、次いで0.1％トリフルオロ酢酸中の0〜60％アセトニトリル直線勾配、アセトニトリル変化１％／分の1ml／分で展開した。好中球抑制活性は典型的には41〜45％アセトニトリルの間に溶出し、活性は広いピークに対応する。図４は好中球抑制因子の逆相HPLCの結果を示す。抑制活性は43〜45％アセトニトリルの間に溶出し、活性は43〜45分の広いピークに対応した。実施例３分取用等電点電気泳動を用いる鉤虫溶解物からの好中球抑制因子の単離鉤虫溶解物は、同種のカラムを直列につないだ分取用スーパーデックス200の2 .6cm×60cmカラム（合わせた寸法2.6×120cm）による分子ふるいクロマトグラフィーにより部分的に分画し脱塩した。双方のカラムは24℃で、0.01Mリン酸ナトリウム、pH 7.00、グリセロール10％（v／v）であらかじめ平衡化された。350〜 370mlに溶出する接着抑制分画を1.4mlの40％バイオライト（Biolyte）3-10アンフォライト（バイオラッド（BioRad））、および10％（v／v）グリセロールを添加して55mlに希釈した。この混合液をロトフォール（Rotofor）分取用等電点電気泳動調製セル（バイオラッド）中、定常電力12Wで5時間、４℃で泳動させた。 20分画を採集したところ、抑制活性は分画６〜９に検出したが、これは等電点4. 5に相当する。この工程に対する抑制活性の総収率は約30％であった。実施例４イオン交換クロマトグラフィースーパーデックス75（ファルマシア）による分子ふるいクロマトグラフィーで分画した鉤虫溶解物を等容積のモノＱ緩衝液（0.02Mトリス‐HCl、pH 7.5）と混合し、モノＱ緩衝液で平衡した0.5×5.0cmのモノＱアニオン交換カラム上に１ml ／分（306cm／時間）の流速で負荷した。カラムを0.5ml／分（153cm/時間）で0 〜0.5M NaClインカラム直線勾配で展開した。好中球抑制活性はNaClの0.4Mの位置に一致して溶出した。抑制活性の総収率は約２〜５％であった。実施例５ SDS‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動鉤虫溶解物と分画溶解物のタンパク質組成を、銀染色後に（モリセイ（Morris ey、J.H.）、1981年、Anal．Biochem．117、307）ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）で分析した(レムリー（Laemmli、U.K ．1970年、ネイチャー（Nature）227、680）。試料を等容積の20％グリセロール、５％SDS、および0.125M トリス‐HCl、pH 6.8と混合し、沸騰水浴中に５分間置いた。次に試料を厚さ0.75mmの10％SDSポリアクリルアミドスラブゲル上に導入し、定電圧（125V）で２時間、電気泳動を行った。図５はSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す。試料を10％ポリアクリルアミドスラブゲルに導入した（ノバックス、ラ・ジョラ、CA）。左から右にレーン1〜10は（1）分子量標準；（2）分子量標準；（3）HA分画＃37〜41のHP LC貯蔵液、非還元；（4）ブランク；（5）HA分画＃37〜41のHPLC貯蔵液、還元；（6）ブランク；（7）HA分画＃37〜41のIIPLC貯蔵液、還元；（8）HA分画＃37〜 41のHPLC貯蔵液、非還元；（9）HAすそ野分画＃42〜48のHPLC貯蔵液、非還元；（10）分子量標準である。使用した分子量標準は：ミオシン、200,000、（ウサギ筋肉）；ベーターガラクトシダーゼ、116,300、（大腸菌）；ホスホリラーゼb 、97,400、（ウサギ筋肉）；ウシ血清アルブミン、66,300；グルタミン酸デハイドロキシラーゼ、55,400（ウシ肝臓）；カルボン酸アンハイドロゲナーゼ、31,0 00、（ウシ赤血球）；トリプシン抑制剤、21、500、（大豆）であった。単離方法の最終工程（逆相HPLC）によれば、見かけの分子量33,000〜47,000の範囲のを有する単一泳動帯のみがSDS-PAGE上に観察された（図５参照）。煮沸前に50 mMジチオトレイトールを試料に添加した場合、泳動帯は見積分子量43,000〜54,0 00に泳動した。実施例６単離した好中球抑制因子のレーザー脱吸着飛行時間型質量分析実施例２（E）記載の様に単離したNIFの見積質量をレーザー脱吸着飛行時間型質量分析（Leaser-Desorption-Time-of F1ight Spectrometry）で測定した。試料の１mｌ分を、30％CH₃CN水溶液、0.1％TFAに溶解した等容積の3,5-ジメトキシ-4-ヒドロキシケイ皮酸の飽和溶液で希釈した。希釈試料を銅試料台上にスポットし、風乾した。質量分析を島津LAMS-50KSレーザー脱吸着飛行時間型質量分析計（島津（株）、京都、日本）を用いて行った。試料のイオン化は、Nd-YAG レーザー（スペクトラフィジックス社（Spactra-Physics、Inc.）、マウント・ビュー（Mt．View、CA））の500レーザーパルス（355nm）パルス幅＜５ nsec）を試料台上にフォーカスして行った。得られたイオンを５kV電位で質量分析計中に加速した。装置の更正は質量既知の標準タンパク質を用いて行った。図６は単離した好中球接着抑制剤のレーザー脱吸着飛行時間型質量分析の結果を示す。精製好中球機能抑制剤の５ピコモルをレーザー脱吸着飛行時間型質量分析で分析した。見積質量は41,200であった。試料の少量の分画は82,400の質量を有していたが、これは２量体であると説明された。実施例７好中球抑制因子は糖タンパク質である精製NIF（実施例２（E）により調製、〜2μg）を10％SDSポリアクリロアミドゲル中で電気泳動し、分離したタンパク質をウエスターンブロッティング（トゥビン（Towbin)ら、1979年、プロシーデイングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユ-エスエー、76、4350〜4354）によりゼ-タープローブ（Zeta-Probe^R）ニトロセルロース膜（バイオラッド、エメリービル（Emery ville、CA））に転移した。炭化水素をアルデヒドに酸化するため膜をグリコトラック（GlycoTrack^TM）キットに対する指示書（オックスフォード・グリコシステムズ（Oxford GlycoSystems）、ローゼダール（Rosedale、NY））に記載の通り処理し、次いでビオチン‐ヒドラジドと反応させて存在する任意の炭化水素中にビオチンを取り込ませた。ビオチン化炭化水素を次いでストレプトアビジン‐アルカリホスファターゼ複合体と反応させて検出した。膜上の糖タンパク質と結合したアルカリホスファターゼと反応する基質を用い、着色沈澱物を形成して可視化した。好中球抑制因子をこの方法を用いて染色した結果、炭化水素を含有し、従って糖タンパク質であることが示された。実施例８鉤虫溶解物の有機溶剤抽出好中球接着試験で抑制活性を有することが知られている鉤虫ホモジエネートの１mlを、15mlのガラスコレックス（Corex）試験管中で１mlのクロロホルム／メタノール（2:1）混合液で１分間ボルテックスして抽出した。有機層を取り出し、窒素ガス流下で乾燥した。残存脂質を0.5mlのHSA中で２分間超音波処理で再懸濁した（ブランソン（Branson）モデル1200、ダンブリー（Danbury、CT））。最終希釈１:２で試験した場合、再懸濁脂質は好中球‐プラスチック接着試験において何等の活性も持たなかった。実施例９好中球抑制因子のペプチド断片のアミノ酸配列の製造と決定 NIFの試料を実施例２記載の通りに得た。それぞれ約10μgのNIFを含有する二本の溶液をそれぞれ、最初にスピードバック（Speed Vac）上で試料が凍結するまで脱ガスし、次いで凍結乾燥した。乾燥試料を50mM N-エチルモルホリン、pH 8.5中に再懸濁し、エンドプロテアーゼAspN（ベーリンガー・マンハイム（Boehr inger Mannheim）、インデイアナポリス（Indianapolis、IN））、Lys C（ベーリンガー・マンハイム、インディアナポリス、IN）またはトリプシン（ワーシントン（Worthington）、フリーホールド（Freehol、NJ））のいづれかで基質対酵素比25:１で消化した。室温で24時間インキュベートし、微生物汚染を防止するため少量のイソプロパノールを消化混合液に添加しておいた。消化の最終段階で試料をスピードバック上で脱ガスし凍結乾燥した。逆相HPLC（RP HPLC）による分画のため、消化混合物を６Mグアニジン／HCl中に再懸濁した。クラトス検出器（ABI、フォスターシティー（Foster City、CA））を有するLKB HPLCシステムを用い、東洋ソーダ120T C18カラム（4.5×250mm）HPLCでペプチドを単離した。カラムを0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）中のアセトニトリル直線勾配で展開した。流速0.5ml／分、120分で５〜54％アセトニトリルの勾配とした。A₂₀₆およびA₂ ₈₀ でモニターしたペプチドピークを、補正ピーク検出を有するLKB スーパーラック（SuperRac）を用いて採集した。採集分画を炭酸アンモニウムで中和、20μ gのSDSを添加し、分画を配列決定前にN₂下で乾燥した。ペプチドを470A／120A／ 900A気相シーケンサー（ABI、フォスターシティー、CA）で配列決定した。残査同定はHPLCクロマトグラムの解析により手動で行われ、PTH残査の定量は900Aコンピューターのオンライン解析で行われた。タンパク質をアルキル化しなかったため、システイン残基はこの解析では検出されなかった。タンパク質がトリプシンで消化された実験では断片化の前にタンパク質がビニルピリジンでアルキル化されたため、トリプシン断片中にシステインが検出された。HPLC溶離でバックグラウンドピークがPTH残基と重なったため、アスパラギン酸とトリプトファン残基は同定されたが定量されなかった。初期収量は1pmole〜10pmoleの範囲であり、繰り返し収率は通常92〜95％の間であった。図７はタンパク質加水分解断片から得られたアミノ酸配列を示す。図７で括弧で囲まれた位置は絶対的な確度で決定されなかった。大文字で始まるアミノ酸の記号はより高い収率で観測され、この場合は好ましい。ペプチドのエドマン（Edman）分解中に特定のアミノ酸が同定されなかった位置では、記号Xxxにより未決定のアミノ酸を示す。スカルボラフ（Scarborough）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J． Biol．Chem．266:9359、1991年；ペリン（Perin）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー266:3877、1991年参照。実施例１０鉤虫由来好中球抑制因子のクローニングと配列決定 NIFを以下のように構築されたイヌ鉤虫cDNAライブラリーからクローン化した。全RNAをグアニジンチオシアネート抽出により鉤虫全体から単離した（マクドナルド（McDonald）ら、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Meth．Enzymol.）152 ：21 9（1987年））。ポリ（A）⁺RNAをオリゴd（T）セルロースアフィニティークロマトグラフィー（ポリＡクイック；ストラタジーン（Stratagene）、ラ・ジョラ、 CA）を用いて500μgの全鉤虫RNAから精製した。ランダムヘキサマープライマー（ramdom hexamer primer）およびエビアンマイオブラストーシスウイルス（avi an myoblastosis virus（AMV））逆転写酵素（アマーシャム（Amersham）、アーリントン・ヒルズ（Arlington Hills）、IL）を用いて、二重らせんcDNAをポリ（A）⁺RNAから合成した。１キロ塩基対より大きいcDNA断片を６％ポリアクリルアミドゲル上で精製し、標準手法を用いてEcoRIリンカー（ストラタジーン）に連結（1igate）した。連結したcDNAをラムダgt10（ストラタジーン、ラ・ジョラ、CA）中に連結し、ギガパックゴールドII（Gigapack Gold II、ストラタジーン）を用いてパッケージ化した。鉤虫NIF用二重らせんcDNAプローブを、NIFペプチド配列由来のプライマーを用いて鉤虫RNAのポリメラーゼ連鎖反応により作成した。二本のNIFペプチドのために得られた配列（図７参照）、T-20（Leu-AIa-Ile-Leu-Gly-Trp-Ala-Arg）およびT-22-10（Leu-Phe-Asp-Arg-Phe-Pro-Glu-Lys）を、プライマー30.2および43.3 .RCそれぞれを設計するために使用した。30.2および43.3.RCの配列はそれぞれ５ ’-CTCGAATTCT(GATC)GC(ATC)AT(ATC)(CT)T(GATC)GG(ATC)TGGGC-３’および５’- CTCGAATTCTT(TC)TCTGG(GA)AA(GA)CG(GA)TC(GA)AA-３’であった。括弧にいれた位置は余分なヌクレオチドを表す。一本鎖cDNAを、１μgの鉤虫ポリ（A）＋RNA （調製法は上記）をランダムヘキサヌクレオチドとプライムし、AMV逆転写酵素（アマーシャム、アーリントンヒルズ、IL）で伸長させて合成した。400pmolの3 0.1および43.RC（リサーチジェネチックス（Research Genetics）、ハントスビル（Huntsville）、AL製）を有するPCRジ−ンアンプキット（GeneAmp kit）パーキンエルマー（Perkin Elmer）、ノルオーク（Norwalk）、CT）を用い、パーキンエルマーDNAサーマルサイクラー（Thermal Cycler）で反応生成物の20分の１を増幅した。PCR条件は：サイクル１〜２、変性94℃、２分間、アニーリング5 8℃、２分間および伸長72℃、２分間；サイクル3〜42、変性94℃、45秒間、アニーリング58℃、45秒間および伸長72℃、２分間であった。30.2／43.3.RC断片と呼ばれる〜430塩基対増幅生成物を反応汚染物から6％、ポリアクリルアミドゲル（ノベックス（Novex ）、サンディエゴ（San Diego）、CA）からの電気溶出により分離した。30.2／4 3.3.RC断片を、ランダムプライマーラベリング（ストラタジーン、ラ・ジョラ、 CA）を用いて［a-³²P］-dCTP（アマーシャム）で標識した。クロマスピン（Chro maSpin）カラム（クロンテック（Clontech）、パロ・アルト（Palo Alto）、CA ）を用いて標識DNAを非取り込みヌクレオチドから分離した。プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション条件は6X SSC（SS C：150mM NaCl、15mMクエン酸ナトリム）、0.02Mリン酸ナトリウム pH 6.5、5X デンハルト（Denhardt）液、0.5％（w／v）SDS、0.01M EDTA、100μg／ml切断変性サケ精子DNA、0.23％デキストラン硫酸、50％ホルムアミドであった。プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションは42℃であり、2X SSCで 15分間の２回の前洗浄の後、フィルターを60℃、0.2X SSCで20分間洗浄した。フィルターを-70℃で、２枚の増感スクリーンを有するX-線フィルムに終夜露光した。ランダムプライム鉤虫ライブラリーの約300,000個の組み替えファージ（非増幅）を30.2／43.3.RC NIF PCR断片でスクリーニングした。約120個の組み替えファージがこのプローブにハイブリダイズし、その7個をヌクレオチド配列解析のために単離した。これらのファージ単離物中に含まれるEcoRI cDNA断片をp−ブルースクリプトIIベクター（ストラタジーン、ラ・ジョラ、CA）中にサブクローン化することにより、二重鎖配列決定は効率的となった。シーケナーゼバージョン2.0キット（U.S.バイオケミカル、クリーブランド、OH）、および合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてDNAを配列決定した。 NIFファージ単離物は、精製NIFに対して得られたアミノ酸配列に顕著に類似するポリペプチドをコードするDNAを含んでいた（図７参照）。図８は好中球抑制因子cDNA（クローン1FL）のコード領域と、これより推測されるアミノ酸配列を示す。単一単離物NIF-1FLは、メチオニンで開始しTGA停止コドンで終わる825nt のオープンリーディングフレームをコードした（図８）。NIF-1FLでコードされるNIFポリペプチドは計算上の分子量30,680ダルトンを有する274アミノ酸残基である。図９は数個の好中球抑制因子アイソフォームクローンから推測されるアミノ酸配列の並びを示す。それぞれの配列は、単離された様々なクローンに対応した配列断片を表す。それぞれのセグメントはそのクローン名により同定される。（例えば 1FL、3P、2FL、3FL、4FL、6FLおよび1P）。クローン1FLの完全なアミノ酸配列を標準３文字アミノ酸コードでそれぞれの配列セグメントの上に表記した。特定の位置にクローンIFLと同一アミノ酸を有するクローンは゛「・」で表される。アミノ酸置換は適当な３文字コードで示される。「---」は配列の並びを維持するために挿入されたスペースである。1FLおよび1P配列のカルボキシ末端はアステリスクで表される。他の６個のNIFファージ単離物は部分NIFポリペプチドをコードした；すなわちそれらはNIF-1FLポリペプチドと比較してＮ-末端メチオニン残基も、Ｃ-末端停止コドンも含まない（図９）。これらの部分NIF単離物は、プロトタイプNIF-1FLポリペプチドとかなり類似しているが同一でない６個の予測されたNIFアイソフォームを包含する。実施例１１機能性組み替え好中球抑制因子の動物細胞による発現（A）発現 NIF-1FLアイソフォームをコードするDNAセグメントを、コード領域の５’-および３’-末端に対する特異的プライマーを用いて原λgt10単離DNAから増幅した。５’-プライマーはエンドヌクレアーセ部位（EcoR1）一致リボソーム結合部位（コザク（Kozak、M）、セル 44：283（1986年））、NIFのATG開始コドンおよびそれに続く遺伝子の６コドンから構成される。３’-プライマーはNIFのTGA終止コドンの３’-側に対する特異的ヌクレオチド配列、および制限エンドヌクレアーゼ部位（EcoR1）から構成される。５’-および３’-プライマーのヌクレオチド配列はそれぞれ５’-ACC-GAA-TTC-ACC-ATG-GAG-GCC-TAT-CTT-GTG-GTCおよび５’-CTG-GAA-TTC-TCG-CTT-ACG-TTG-CCT-TGG-Cであった。１mlの希釈緩衝液に懸濁した５μlのラムダプラークをDNA鋳型として使用した。増幅は５’-および３’-プライマー（リサーチ・ジェネティクス製）それぞれ 400pmolを有するPCRジーンアンプキット（パーキンエルマー、ノルウオーク、CT ）を用いて、パーキンエルマーDNAサーマルサイクラーで行った。PCR条件は：サイクル１、97℃で１分間変性、37℃で１分間プライマーアニーリング、37℃から 72℃へ２分間で勾配、および72℃で２分間増幅；サイクル３および4、94℃で１分間変性、37℃で１分間プライマーアニーリング、37℃から72℃へ２分間で勾配、および72℃で２分間増幅；サイクル５〜34、94℃で１分間変性、45℃で１分間プライマーアニーリング、および72℃で２分間増幅；とした。増幅生成物（887bp）を反応混合物からクロマスピン（ChromaSpin）400カラム（クローンテック・ラボラトリーズ（Clontech Laboratories、Inc）、パロアルト（Palo Alto）、CA）を用いて分離した。増幅生成物の末端は制限エンドヌクレアーゼEcoR1で刈り込み、得られたDNA断片（875bp）を標準技法を用いてEcoR1 消化プラスミドpSG5（ストラタジーン、ラ・ジョラ、CA）に結合した。得られた結合混合物をスール^TM（SURE^TM）コンピテント細胞（ストラタジーン、ラ・ジョラ、CA）を形質転換するために使用した。適切な配位の875bp挿入部を含む単離物（pSG5 SV40ロモーターに近接したコード領域の５’-末端）を50mg／mlのアンピシリンを有する250mlのサークルグロー（Circle Grow^TM、バイオロ（Biolo）、サンディエゴ、CA）中で生育させ、プラスミドDNAをマジックマキシプレップ^TM（Magic Maxi Prep^TM）DNA精製システム（プロメガ（Promega）、マディソン（Madison）、WI）を用いて調製した。精製プラスミッドDNAの10μgを3.5×10⁶COS7細胞（ATCC No．CRL 1651）中にエレクトロポーレーション（electroporation）、（0.4cmエレクトロポーレーションセル、325V）250F、無限抵抗、ヘペス（Hepes）緩衝生理食塩水中７×10⁶／mlで0. 5ml細胞、pH 7.0、４℃）により導入した。エレクトロポーレーション後、37℃ であらかじめ暖めらた10％胎児ウシ血清を添加した14mlの温DMEM：RPMI 1640（１:１比）で希釈する前に細胞を氷上に２〜３分間置いた。細胞を100mm細胞培養ディッシュに入れ、８％CO₂下で37℃でインキュベートした。静置後１、２、および３日で細胞培養上澄液を取り出し、NIF活性を試験した。（B）細胞培養培地中の好中球抑制因子の検出および定量エレクトロポーレーションされたCOS7細胞（pSG5／NIFIFLCR1）より15mlの細胞培養液を収穫した。好中球‐プラスチック接着試験（実施例１（C））により直接試験した場合、この液は１:８の希釈で好中球抑制活性を示した。過酸化水素遊離試験（実施例１（E））では約１:14のIC₅₀が測定された。対照の発現プラスミド（pCAT；プロメガ（Ptomega）、マディソン（Madison）、WI）を有するCO S7細胞から収穫した細胞培養液を試験しても何等の活性も認められなかった。（C）ＣＨＯ細胞内の安定な発現（１）プラスミドＤＮＡの調製 pSG5構築物に挿入された、上記（A）のNIF-1FL挿入物を制限エンドヌクレアーゼEcoRIにより消化して切り出した。875bpのNIF-1FLフラグメントをゲル精製（マジック・ピーシー・プレップ（Magic PC prep）プロメガ、マデイソン、ウイスコシン）にかけ、EcoRIで消化したpブルースクリプトII KS（pBluescriptII K S）（ストラタジェン、ラ・ジョラ、カリフォルニア）に、標準的方法により連結させた。得られた連結混合物をスール^TMコンピテント細胞を、販売者（ストラタジェン、ラ・ジョラ、カリフォルニア）に記載された方法に基づいて形質転換させるために用いた。形質転換された細胞をIPTGおよびX-galを含有するLB寒天培地上に蒔いた（サンブルック、フリッチュおよびマニアティス、モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリー・マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、1989、1.85から1.86ページ）。白色のコロニーについて、NIF-1FL挿入物を適当な位置に有するフラグメントを、プラスミドＤＮＡをBamHIにて消化して調べた;200bpのBamHIフラグメントが得られるプラスミドを有するコロニーを保持した。このコロニーのうちの一つからプラスミドを調製し（マジックマキシプレップ、プロメガ、マデイソン、ウィスコンシン）、HindIIIおよびNotIで消化して５’末端にHindIIIオーバーラップを、および３’末端にNotIオーバーラップを有するNIF-1FLフラグメントを得た。このＤＮＡフラグメントをゲルにより精製し、HindIII-NotIで消化したpRC/CMV（インビトロゲン（Invitrogen）、サンディエゴ、カリフォルニア）内に連結させた。得られた連結混合物をスール^TM コンピテント細胞を形質転換させるのに用いた。pRC/CMV-NIF-1FLのミリグラム量をマジックマキシプレップキットを用いて調製した。大腸菌RRI株内のプラスミドpLTRdHFR26（モレキュラー・セル・バイオロジー、３:32-43（1983）、ネイチャー275:617-623（1978））をATCC（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビル、メリーランド）から入手した。プラスミドＤＮＡはクロラムフェニコール増幅培養物（サンブルック、フリッチュおよびマニアティス、モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリー・マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、1989、1. 33ページ）から、マジック・マキシ・プレップ・キットを用いて精製した。（２）ＣＨＯ細胞のトランスフェクションジヒドロホラートデヒドロゲナーゼ遺伝子欠損（dhfr）チャイニーズ・ハムスター・卵巣細胞（CHO細胞）をATCC（カタログ番号:CRL9096）から入手し、RPMI1 640とDMEM培地（アーウィン・サイエンティフィック（Irvine Scientific）、サンタ・アナ、カリフォルニア）の１:１混合物に10％FBS、10mMヘペス、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、5×10^-5Mのβ-メルカプトエタノール、10mMのピルビン酸ナトリウムおよび2mMのグルタミンを添加した培地（コンボ（combo）培地）内で増殖させた。CH O細胞を燐酸カルシウムトランスフェクション系を用い、添付の説明書（ギブコB RL、ゲイサースブルグ、メリーランド）に従って、10cmの細胞培養ディッシュ内にて以下の割合でトランスフェクトさせた:１×106個の細胞、20gのpRC/CMV-NIF -1FLのＤＮＡおよび5gのpLTRdHFR26のＤＮＡ。細胞を共に投入したＤＮＡと共に 12時間37℃でインキュベートした。（３）CHO-NIF-1FLクローンの選択と増幅接着した細胞を新たなコンボ培地にて１度洗浄し、500μg/mlの抗生物質G418 （ギブコBRL、ゲイサースブルグ、メリーランド）を含有するコンボ培地中で２週間37℃で培養して、ネオマイシン耐性を示すクローンを選択した。G418抵抗性の細胞を標準的なトリプシン処理により培養ディッシュから取り、500μg/mlのG 418を含有する新たなコンボ培地にて１度洗浄した。洗浄した細胞を10cmの細胞培養用ディッシュへ接着させ（ディッシュあたり１×10⁶個）、500μg/mlのG418 および10、20、40、60、または80nMのメトトレキサート（methotrexate）（シグマ、セントルイス、ミズーリ）を含有するコンボ培地で覆った。２週間、37℃でインキュベーションした後、各ディッシュのコロニーおよび培養上清を好中球の接着を見るカルセイン（calcein）アッセイを用いてNIF活性を調べた。NIF活性を示した細胞をトリプシン処理により回収し、単一コロニーを得るためにプレートに蒔く前に洗浄した。NIF活性を発現している選択した単一細胞のひとつを8F5 と名付け、これをさらなるメトトレキサート増幅に用いた。 8F5細胞を10cmの細胞培養ディッシュ内でコンフルエントとなるまで増殖させ、トリプシンにより剥がし、洗浄しておいた。細胞を500μg/mlのG418を含有するコンボ培地で希釈して、１×10⁶細胞を10cm培養ディッシュ内へ蒔いた。接着した細胞を500μg/mlのG418および40、80、160、320、または640nMのメトトレキサートを含有するコンボ培地で覆った。再び２週間、37℃にてインキュベーションした後、ディッシュをNIF活性のアッセイを行ってコロニーおよび培養上清について調べた。トリプシン処理により上記のごとく細胞をプレートから剥がした。320nMのメトトレキサートのディッシュから得られた細胞を集めたものをさらに用い、個々の細胞に単離した。単一細胞単離操作を３ラウンド続けて各コロニーについて行って、クローンの純度を確保した。最終的に得られたセルラインに8F5- 1E6-8C11-1G8と名付けた。これは500μg/mlのG418および320nMのメトトレキサートの存在下で50g/ml以上のNIFを産生する株である。（D）固定化コンカナバリンＡクロマトグラフィーによる好中球抑制因子活性の分画 5mlのCOS7(pSG5／NIFIFLCR1）細胞培養液を等容積の0.02Mビストリス‐プロパン‐HCl、pH 7.3、1M NaCl、0.001M CaCｌ₂、0.001M MnSO₄と混合し、同じ緩衝液で平衡したコンカナバリンＡセファローズ（ファルマシア、ピスカタウエー（ Piscataway）、NJ）の1mlカラム上に負荷した。20℃、2ml／分で１時間、試料を閉じたループでカラムを通して循環させた。カラムを次に5mlの0.02Mビストリス ‐プロパン‐HCl、pH 7.3、1M NaCl、0.001M CaCl₂、0.001M MnSO₄で洗浄した。カラム内に残留する緩衝液を0.5M メチル‐アルファ‐マンノピラノシドを含む緩衝液で置き換え、流れを15分間止めた。流れを1ml／分で再開し、約11mlの糖含有溶離液を採集した。溶離液を１リッターの10mMリン酸カリウム、pH 7.35、1 50mM NaClに対し４℃で18時間透析し、10,000分子量分画膜（セントリプレップ1 0（CentriPrep 10）、アミコン、バーバリー（Bevely）、MA）を装着したアミコン遠心濃縮器を用いて1.1mlに濃縮した。好中球‐プラスチック接着アッセイ（実施例１（C））でアッセイした場合、この試料は１:16の希釈で実質的な活性を示し、固定化コンカナバリンＡに結合した細胞培養液中に化なりの部分の好中球機能抑制活性が存在することを示している。この挙動はアンサイロストマ・カニナム（実施例２（B））の粗抽出液で観察されたものと同等であり、好中球機能の抑制剤として作用する糖タンパク質の形質転換動物細胞COS7からの合成と分泌から得られた抑制と符合する。対照として、DNAなしにエレクトロポーレーションされた細胞からの5mlのCOS7 細胞培養培地を、上記と同じ方法でコンカナバリンＡでクロマトグラフィーを行った。好中球‐プラスチック接着試験（実施例１（C））を用いて、コンカナバリンＡ‐セファローズクロマトグラフィー後も何等の活性も認められなかった。（E）ポロスII O／Mを用いる陰イオン交換クロマトグラフィーによる好中球抑制因子活性分画 5mlのCOS7（pSG5／NIFIFLCR1）細胞培養液を１リッターの10mMビストリス‐プロパン‐HCl、pH 7.0に対し４℃で18時間透析し、同じ緩衝液で平衡したポロス（Poros）IIQ/M（パーセプティブバイオシステムズ（PerSeptive Biosystems ）、リーグシティー（League City）、TX）の0.46×10cmカラムに3ml／分で負荷した。カラムを平衡緩衝液の１容積で洗浄し、14.4カラム容積にわたって塩化ナトリウムの0〜0.5M直線勾配で展開し、2ml分画を採集した。好中球‐プラスチック接着試験（実施例１（C））で、約0.45M NaClに対応する分画17および18に有意の活性が検出された。10,000 MWCO膜（アミコン・マイクロコン 10、バーバリー、MA）を装着した遠心濃縮器を用いて分画を24倍に濃縮すると、分画16〜19 に実質的な活性が見いだされた。アンサイロストマ・カニナム由来の抽出液に存在する好中球抑制因子も、0.4M のNaClで陰イオン交換カラム（モノＱ、ファルマシア、ピスカットウエー、NJ）から同様に溶離した（実施例４）。実施例１２ピキア・パストリス（Pichia pastoris）における機能性組み替え好中球抑制因子の発現（A）ピキアシャトル/発現ベクターの説明以後言及するピキア（Pichia）GTS115株（his4）（ストロマン（Stroman）D.M ）ら、米国特許第4,855,231号（1989年8月））、および大腸菌-ピキアシャトルベクターpHILS1およびpHILD5は、フィリップス・ペトロリウム社（Phillips Pet roleum company）バートレスビル（Bartlesville）、オクラホマ）からライセンスされたピキア酵母発現システムの一部である。ピキアの取扱いの全ては、基本的にはサッカロミセス・セレビジュー（Saccha romyces cerevesiae ）について遺伝子発現技術（Gene Expression Technology）、231〜471頁、アカデミックプレス（Academic Press）、ニューヨーク（ジョーデル（D.V.Goeddel）編集、1991年）、およびストローマンら、米国特許第4,855,231号（1989年8月8日）記載の通りである。ピキア・パストリス中にNIFの発現を導くために使用したpHIL7SP8ベクターは、pHILS1およびPHILD5、および合成的により調製した断片からアセンブルした。 pHIL7SP8プラスミドはpBR322配列上にクローン化された以下の要素を含む：１）５’AOX1、ピキア・パストリスアルコールオキシダーゼの５’非翻訳、およびプロモーター配列の約1000bpセグメント（ストローマンら、米国特許第4,85 5,231（1989年8月8日）、その開示は本明細書に参考資料として含まれる）。２）PHO1 ピキア・パストリス分泌シグナル。３）PHO1シグナルに融合した19-アミノ酸合成プロ配列。このプロ配列はクレメンツら（Clements et al.，1991年、ジーン（Gene）、106：257〜272）により酵母アルファ因子リーダー配列に基づき設計された２個の19-aaプロ配列のひとつである。４）合成マルチクローニング部位５）３’AOX1、aox1末端配列の約256bpセグメント（ストローマン、D.M.ら、米国特許第4,855,231号（1989年8月8日）参照、その開示は本明細書に参考資料として含まれる）。６）ホストGTS115中の欠損his4遺伝子を補足するために2.4kb断片上に含まれるピキア・パストリスヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子his4（ストローマン、D.M.ら、米国特許第4,855,231号（1989年8月8日）参照、その開示は本明細書に参考資料として含まれる）。７）５’AOX1領域と共に部位指向組み込みに必要な３’AOX1未翻訳DNA配列領域（ストローマン、D.M.ら、米国特許第4,855,231号（1989年8月8日）参照、その開示は本明細書に参考資料として含まれる）。（B）pHIL7SP-NIcl／pHIL7SP／NIc10の構築とピキア中での発現 DNAコード化NIFのセグメントを、コード領域の５’-および３’-末端に対する特異的プライマーを用いてブルースクリプトII（ストラタジーン、ラ・ジョラ、 CA）中のNIF-1FLのサブクローンからPCR増幅した。５’-プライマーは制限エンドヌクレアーゼ部位を含まず、プロテアーゼ処理N IF の５’-末端で始まる領域およびそれに続く７コドンに対応するものである。成熟NIFの最初の残基に対するコドンはAATからAACに変えられた（双方のコドンはアスパラギンひ翻訳される)。３’-プライマーはコード領域の３’-末端で、天然遺伝子のTGA停止コドンを置き換えるTAA停止コドン、および３個の特異的制限エンドヌクレアーゼ部位（HindIII、SpeI、およびBglII）の８コドンで構成された。使用された５’-および３’-プライマーの配列はそれぞれ５’-AAC-GAA-CAC -AAC-CTG-AGG-TGC-CCGおよび５’-CCT-CCT-CCT-AGA-TCT-AAG-CTT-ACT-AGT-TTA-T AA-CTC-TCG-GAA-TCG-ATA-AAA-CTCであった。 100pmolのそれぞれのプライマー、２ユニットの1Xベント（Vent）緩衝液(ニューイングランド・バイオラブズ（New England Biolabs）、バーバリー（bervery ）、MA）、およびそれぞれ0.2mMのdATP、dCTP、dGTPおよびdTTPを用いて増幅を行った。鋳型DNAとして100ngのブルースクリプトII含有NIF-1FLを使用した。PCR 条件は10サイクルすべてで同じとした：95℃で１分間変性、60℃で１分間プライマーアニーリング、および72℃出1.5分間増幅。増幅生成物は上記の通り精製し、BglIIで消化した。次に増幅精製物を標準手法を用いてStuＩ-Bgl II開裂pHIL7SP8中に連結させた。連結混合物を用いて大腸菌WK6を形質転換し、アンピシリンプレート上でアンピシリン耐性クローンを得た。制限およびDNA配列解析に基づき、得られた２個のプラスミドクローン、pHIL7SP-NI1c1およびpHIL7SP-NI1c10中の正しい挿入配列を、ピキア・パストリス酵母株GTS115（his4）を形質転換するために選んだ。これらのベクターをNot1（A0X1領域中で発現カセットへの組み込みを目標）、またはSall（HIS4遺伝子座への組み込みを目標）で消化した。４個の制限DNA調製液を基本的にはベッカー（Becker、D.）とガレンテ（Guare nte、L.）、メソッド・イン・エンザイモロジー（Method in Enzymology）、194 巻、182〜189頁（1991年）に記載通り別々にピキア中にエレクトロポーレーションで導入した。簡単に言えば細胞をYEPD培地、30℃で0D₆₀₀ 1.3〜1.5に生育させた。細胞を４℃（1500×gで5分間）でペレット化し、500mlの氷冷無菌蒸留水中に再懸濁した。細胞を上記の通りペレット化し、250mlの氷冷蒸留水中に再懸濁した。細胞を再びペレット化後、１mlの氷冷1Mソルビトール中に再懸濁した。1Mソルビトール中の40μlの細胞を5μlの直鎖状DNAと混合し、混合液を氷冷した0.2cmギャップエレクトロポーレーションキュベット中に移した。氷上に５分間置いた後、細胞を50uF、1.5kV／cm、および抵抗200Ωでパルスした。1mlの氷冷1Mソルビトールをキュベットに添加し、100〜500μlの細胞懸濁液を最少デキストローズプレート上に散布した。コロニーが現れるまでプレートを30℃でインキューベートした。His+形質転換体を選別するため形質転換混合物を最少デキストローズ（MD）培地上にプレートした。NIF発現に対する継続選別を、ストローマン、D.W.ら、米国特許第4,855,231号（1989年８月８日）記載通りメタノールを含む最少培地中のフラスコ浸透培養で行った。（C）細胞培地中の好中球抑制活性の検出および定量メタノール誘導の48時間後に0.22μmセルローズアセテート膜を通して濾過した細胞から、1,800×g_maxで15分間遠心してピキア細胞上澄腋（pHIL7SP-N1c10）を得た。濾過した細胞上澄液を10,000 MWCO膜（アミコン・マイクロコン 10、バーバリー、MA）を装着した遠心濃縮器を用いて約３倍に濃縮し、G-25セファデクススーパーファイン（ファルマシア、ピスカタウエイ、NJ）の１×10cmカラムを用いるゲル濾過で脱塩した。好中球‐プラスチック接着試験を用いて（実施例１（C））脱塩上澄液（ゲル濾過で2Xに希釈）は１:640に希釈したものまで好中球抑制活性を示した。組み替え抗血栓症タンパク質を発現し、好中球抑制活性を欠くピキア細胞から、同様に収穫し処理した細胞上澄液を用いた場合には、何等の活性も見られなかった。（D）ピキア由来の好中球抑制因子の精製 48時間のメタノール誘導に引き続き、メタノール誘導後48時間のピキア細胞上澄液（pHIL7SP-N1c10）の75mlを1,800×g_maxで15分間の遠心、および0.22μmのセルローズアセテート膜を通す濾過によって得た。これを10,000分子量分画膜（ YM10）を装着したアミコン撹拌UFセルを用いて濃縮し、水で希釈した（約10倍）。この限外濾過操作を、伝導度が45mSから1mSに減少するまで繰り返した。濃縮液の最終容積は25mlであった。 pHを中性に調節するため、この濃縮液を４℃で６時間、１リッターの0.05Mトリス‐プロパン‐HCl、pH 7.0に対して透析し、次いで１リッターの0.001Mリン酸カリウム、pH 7.0に対して透析した。透析した細胞上澄液の15mlを0.001Mリン酸カリウム、pH 7.0で平衡したセラミックハイドロキシルアパタイト（ペンタックス、2μm；アメリカン・インタナショナル・ケミカル社、ナチック、MA）の0.8×15cmカラム上に0.4ml／分（48cm／時間）の流速で負荷した。カラムを１カラム容積の0.001Mリン酸カリウム、pH 7 .0で洗浄し、次いで20カラム容積にわたる0.001〜0.050Mリン酸カリウム直線勾配で、0.35ml／分で展開した。実質的な好中球抑制活性が約0.02〜0.035Mリン酸カリウムの位置に溶離されたが、これはアンサイロストマ・カニナム（実施例２（D））から単離された好中球抑制因子で観測されたものほとんど同じである。実質的な好中球抑制活性を示す分画（好中球‐プラスチック接着試験により評価（実施例１（C）））を合わせ、10,000分子量分画膜（セントリプレップ 10 、アミコン、バーバリー、MA）を装着したアミコン遠心濃縮器を用いて約3mlに濃縮し、0.1％トリフルオロ酢酸で平衡させた1×25cm C4 300A逆相カラム（5μm 粒径、バイダック（Vydac）、ヘスペリア（Hesperia）、CA）に導入した。カラムを４カラム容積の平衡緩衝液で洗浄し、次いで5ml／分の流速で10カラム容積にわたり15〜40％のアセトニトリル直線勾配で展開した。214、254および280nm に吸収のある主要な複合ピークが約36〜38％アセトニトリルの位置に溶離した。溶媒とトリフルオロ酢酸を除くため、このピークを含み、包含する分画を遠心エバポレーターで乾燥し、0.065Mリン酸カリウム、pH 7.0、0.08M NaClで再水和した。好中球‐プラスチック接着試験（実施例１（Ｃ））、および過酸化水素遊離試験（実施例１（E））で判断して再水和分画は実質的な好中球抑制活性を有した。実質的な活性を有する分画を合わせ、470A／120A／900A／気相シーケンサー（ ABI、フォスターシティー、CA）を用いたエドマン分解法にて配列決定して（実施例９参照）以下の配列を得た： Asn-Glu-His-Asn-Leu-Arg-Xxx-Pro-Gln-Xxx-Gly-Thr-Glu-Met-Pro-Gly-Phe-Xx x-Asp-Ser-Ile-Arg-Leu-Gln-Phe-Leu-Ala-Met-His-Asn-Gly-Tyr-Arg-Ser-Lys- Leu-Ala-Leu-Gly-His-Ile-Ser-Ile-Thr-Glu ゛Xxx¨はペプチドのエドマン分解中特定のアミノ酸が同定されなかったため、その位置で未決定アミノ酸を表す。この配列は、この構築に使用されたNIFアイソフォーム（pHIL7SP-N1c10；図８参照）であるNIF-1FLの推定されるN-末端配列と合致する。残基が検出されなかった最初の位置はシステインと予想される；タンパク質がアルキル化されなかったため、システイン残基はこの解析では検出できなかった。残基が検出できない他の二つの位置は、１残基離れたセリンまたはトレオニンが続くアスパラギン残基に対応する。これはグリコシレーションコンセンサス配列（Asn-Xxx-（Ser／T hr））であり、アスパラギンが検出されなかった事実は、これらのアスパラギンがグリコシル化されたことを強く示唆する。C4-精製調製物は、過酸化水素遊離試験（実施例１（E）参照）によって約5〜10nMのIC₅₀値を有すると評価された。実施例１３好中球抑制因子の特異性の測定本発明の好中球抑制因子の特異性を試験し、それが一般的な細胞毒性機構で好中球活性を抑制するのではないことを確認するため、抑制剤の活性を非好中球細胞接着系アッセイである血小板凝集で評価した。鉤虫好中球抑制因子の血液血小板凝集に対する効果を調べた。血小板凝集はヒト血小板濃縮血漿（PRP）で行った。PRPをアグリゴメーター（aggregometer、サイエンコ（Scienco）モデル247、モリソン（Morrison）、CO）中で37℃で撹拌し、10μMのADP（シグマ、セントルイス、MO）を添加して凝集を開始した。凝集を光透過率の変化でモニターし、凝集の初期速度で表した。好中球‐HUVECおよび好中球‐プラスチック接着試験、血液型好中球凝集および好中球による過酸化水素遊離で評価した場合には、好中球機能を完全にブロックする濃度である約150n Mの濃度の好中球抑制因子はヒト血小板のADP誘起凝集に対して何等の抑制効果も持たなかった。実施例１４ CD11b/CD18インテグリンが鉤虫由来好中球抑制因子に対する一次受容体である（A）好中球抽出液存在下のCD11b/CD18に対するモノクローナル抗体を用いる¹²⁵ I標識NIFの免疫沈降以下の方法を用いてアンサイロストマ・カニナムから精製したNIFを放射線標識した。エンザイモビーズ（バオラッド、ヘラキュールズ、CA）を用いて約30μ gのNIFを2mCiのNa¹²⁵I（キャリアフリー；アマーシャム（Amersham）、アーリントンヒルズ（Arlington Hills）、IL）で標識した。簡単に言うと、1.5mlのエッペンドルフ試験管に360μlのエンザイモビーズ懸濁液を、180μLの1％ベータ‐ Ｄ‐グルコース溶液、NIFおよびNa¹²⁵Iと共に入れた。この混合液を室温で30分間反応させた。溶離緩衝液として1％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝化生理食塩水（0.1M リン酸ナトリウム、pH 7.2、0.15M 塩化ナトリウム）を用いて、PD10-DGカラム（バイオラッド、ヘラキュールズ、CA）上で標識NIFを脱塩して非結合¹²⁵I‐ヨウ素から分離した。NIFを含む放射能活性分画を貯蔵した。¹²⁵ I-NIFの比活性は13.9μCi/μgであった。様々な白血球タンパク質について、免疫沈降実験によりNIF捕捉能について評価した。特異的モノクローナル抗体を用いて、白血球の界面活性剤抽出物からNI Fに対する強い細胞受容体を選別した。モノポリ（ICN、バイオメディカルズ（Bomedicals Inc.）、（コスタメサ（Co staMasa）、CA）を用いてヒト血液から白血球を調製した。白血球細胞ペレットを1mlの再懸濁緩衝液（20mM トリス pH 7.5、150mM NaCl、1mM CaCl₂）に再懸濁し、次いで1mlの抽出緩衝液（2％トリトン X-100、20mM トリス pH 7.5、1 50mM NaCl、1mM CaCl₂）を添加した。10分間毎に短くボルテックスしながら細胞を氷上で30〜60分間インキュベートした。４℃で細胞破砕物を5000g、５分間でペレット化した。 10μgの特異的モノクローナル抗体を、200μLの白血球界面活性剤抽出液と４ ℃、４時間インキュベートして、モノクローナル抗体‐試験タンパク質複合体を形成した。この混合物に2.5μLの¹²⁵I-NIFを加え、これらの反応試薬を４℃で18 時間インキュベーとした。この混合物を50μlのタンパク質G‐セファローズ（ファルマシア、ピツタカウエー、NJ；1%ウシ血清アルブミンと共にTACTS 20緩衝液（0. 05％ツイーン20、20mM トリス pH 8、120mM NaCl、2mM CaCl₂））を含有する1 .5mlのエッペンドルフ試験管に添加し、４℃で２時間おだやかに撹拌することにより複合体の沈降を促進させた。続いてタンパク質G-セファローズビーズをTACTS 20緩衝液で４回洗浄した。５％β-メルカプトエタノールを含む50μLのレムリ（Laemmli）試料緩衝液（Laemm li、U.K.、1970年、ネイチャー、227：680〜685）を次いで吸引ビーズに加えた；この材料を100℃で10分間インキュベートし、４〜12％勾配SDS-ポリアクリルアミドゲル（ノバックス、サンディエゴ、CA）上に負荷した。実験後ゲルを乾燥し、-70℃でカンタIII（QuantaIII）スクリーン（ジュポン、ウイルミントン（W ilmington）、DE）の存在でX-Omatフィルム（コダック、ロッチェスター（Roche ster）、MY）に露光して可視化した。寸法標準には¹⁴C-レインボー（Rainbow）マーカー（アマーシャム、アーリントンヒルズ、IL）を用いた。 CD11b/CD18インテグリン複合体（OKM-1、ATCC♯ CRL8026；LM-2、ATCC＃ HB20 4）に対するモノクローナル抗体（Mab）をこれらの実験に使用した場合、オートラジオグラフィー上で見かけの分子量約41,000ダルトンの位置に¹²⁵I-NIFの泳動したバンドが沈降した。¹²⁵I-NIFの沈降はこれらの抗体の存在と共に白血球抽出物の存在に依存した。さらに¹²⁵I-NIFの沈降はコールドNIFが100倍モル過剰に存在すると観察されなかった。VLA-4（L25.3；ベクトン・ディッキンソン（Becton Dickinson）、サニーバレ（Sunnyvale）、CA）およびp150,95（SHCL-3；ベクトン・ディッキンソン、サニーバレ、CA）インテグリン複合体に対するモノクローナル抗体を含む、他の白血球インテグリンに対するモノクローナル抗体を使用した場合には¹²⁵I-NIFは沈降しなかった。CD11a/CD18（TSI／22；ATCC♯ HB202）インテグリン複合体に対するモノクローナル抗体を使用した場合、比較的少量の¹²⁵ I-NIFが観測された。これは抗−CD11a/CD18抗体のインテグリン複合体CD11b/ CD18に対する交差反応性によるものと思われる。これらの結果はCD11b/CD18が白血球上のアンサイロストマ・カニナムNIFに対する細胞表面受容体であることを示している。（B）ビオチン化NIFを用いる¹²⁵I-CD11b/CD18の沈降白血球上のNIF受容体を同定する別なアプローチとして、表面ヨウ素化白血球の界面活性剤抽出液からNIF集合タンパク質を沈降するためにビオチン標識NIFを使用した。 NIFの炭化水素部分への結合によりNIFをビオチン化した。鉤虫（アンサイロストマ・カニナム）溶解物（ハイドロキシルアパタイト溶離液；実施例２（D）参照）から精製した約8μgのNIFを、1ml 0.1M酢酸ナトリウム、pH 5.5中の50mM Na IO₄で酸化した。４℃で20分後、反応を100μL 165mMグリセロールを添加して停止した。酸化NIFを他の反応生成物からミクロコン（Microcon）10濃縮器（アミコン、バーバリー、MA）を用いて分離し、100μLの0.1M酢酸ナトリウム、pH 5.5 中へ希釈した。ビオチン化は400μLの6.25mMビオチン‐LC‐ヒドラジド（ピアース（Pierce）、スコーキー（Skokie）、IL）の添加により促進させた。反応を４ ℃で18時間続けた。ミクロコン10濃縮器を用い、リン酸緩衝生理食塩水（PBS;0. 1M リン酸ナトリウム、0.15M 塩化ナトリウム、pH7.2）に緩衝液を交換してビオチン化NIFを後処理した。250μlの濃縮液に等容積のグリセロールを加え、約1 6μg／mlの最終NIF‐ビオチン濃縮液を得た。この材料を-20℃で保管した。抗‐CD18インテグリン複合体モノクローナル抗体LM-2および0KM-1（それそれ抗‐CD11b/CD18；ATCC ♯HB204およびCRL8026）およびTS1／22（抗−CD11a/CD18 ;ATCC ＃ HB202）を上記プロトコールを用いてビオチン化した。ヒト白血球の細胞表面ヨウ素化は以下の手順を用いて行った。モノポリ密度勾配分離（ICN バイオメディカル、コスタメサ、CA）を用いて新鮮なヒト血液90m lから調製した全白血球分画を0.5mlのリン酸塩緩衝化生理食塩水中に懸濁した。細胞懸濁液に2mCiのNa¹²⁵I（キャリアフリー、アマーシャム、アーリントンハイツ、IL）、60μLの0.03％過酸化水素および100μlのラクトペルオキシダーゼ（バイオラッド、ヘラキュールズ、CA）を2mg／mlで加えた。２分間毎に穏やかに撹拌して、反応を室温で30分間続けた。25mM KIのPBS溶液を添加して反応を停止し、細胞をPBSで２回洗浄した。白血球細胞ペレットを1mlの再懸濁緩衝液に再懸濁し、実施例１４−（A）に上記記載通り白血球抽出液を調製した。 60μlのNIF‐ビオチン（32μg／ml）を40μLの再懸濁緩衝液で希釈し、室温で６時間、200μlの¹²⁵I標識白血球抽出液とインキュベートした。白血球抽出液からのNIF‐集合タンパク質の沈降は、この混合液に100μlのストレプタビジン‐アガローズ（ファルマシア、ピツカタウエー、NJ）を添加することにより促進させた。試験管を４℃で18時間、穏やかに撹拌した。続いてビーズを500μlのTACTS- 20緩衝液（0.05％ツイーン20、20mMトリス pH 8、120mM NaCl、2mM CaCl₂）で４回洗浄し、集合タンパク質を50μLの試料緩衝液（５％ β-メルカプトエタノール）で可溶化し、実施例５記載通りSDS-PAGEで分析した。CD11b/CD18およびCD 11a/CD18に対するビオチン化モノクローナル抗体で、同様の方法で対照沈降を行った。ビオチン化NIFは２種類の¹²⁵I-標識ポリペプチドを沈降したが、これは６％SD S-PAGEで分離すると約170kDaおよび95kDaの見かけの分子量を有した。これらのポリペプチドはこの実験でSDS-PAGE上、抗‐CD11b/CD18モノクローナル抗体LM-2 およびOKM-1により沈降する2種類のポリペプチドと共泳動した。このデータをCD 11b/CD18がNIFと結合することが示された先の実験（実施例１４（A））の結果と共に考察すると、CD11b/CD18が白血球上のNIFに対する主要受容体であることを強く示唆するものとなる。実施例１５トキソカラ・カニス（Toxocara canis）由来の天然好中球抑制因子の調製（A）トキソカラ溶解物の調製凍結イヌ回虫トキソカラカニスをアンタイボデーシステムズ（ベッドフォード、TX）から入手し、ホモジェナイズするまで-70℃で保管した。ホモジェナイズ緩衝液（0.02M トリス-HCl、pH 7.4、0.05M NaCl）0.001M MgCl₂、0.001M CaCl₂ 、1.0×10^-5M E-64プロテアーゼ抑制剤（CAS 66701-25-5）、1.0×1^-6MペプスタチンＡ（イソバレリル-Val-Val-4-アミノ-3-ヒドロキシ-6-メチル-ヘプタノイル-Ala-4-アミノ-3-ヒドロキシ-6-メチルヘプタン酸、CAS 26305-03−3）、1.0 ×10^-5M キモスタチン（CAS 9076-44-2）、2.0×10^-5M APMSF（アミジノフェニルメチルスルホニルフルオライド-HCl）、５%（v／v）グリセロール）中でウルトラータラックスホモジェナイザー（ヤンケ・アンド・フンケル（Janke andHun kel）、スタンフェン（Stanfen）、ドイツ）を用いてトキソカラ・カニスを氷上でホモジェナイズした。プロテアーゼ抑制剤E64、ペプスタチンＡ、キモトリプシン、およびAPMSFはカルバイオケム（ラ・ジョラ、CA）から入手した。凍結虫１グラム当りをホモジェナイズするために約3〜6mlのホモジェナイズ緩衝液を使用した。全体で24gの虫を使用した。不溶物質を２回の連続遠心工程でペレット化した：４℃、40,000×g_maxで25分、続いて４℃、105,000×g_maxで１時間。上澄液をグラスウールと0.45μmのセルロースアセテートフィルター（コスター（C oStar）、ケンブリッジ、MA）を通して透明にした。（B）トキソカラ溶解物のコンカナバリンＡセファローズクロマトグラフィートキソカラ・カニス溶解物（68ml）を、Con A緩衝液（0.02M トリス-塩酸、p H7.4、1M NaCl、0.001M CaCl₂、0.001M MnSO₄）で、緩衝液を流速4ml／分（119c m/時間）で２時間、1.6×13cmカラムを通して循環してあらかじめ平衡した26ml のコンカナバリンＡセファローズ（ファルマシア、ピツカタウエー、NJ）に吸着させた。カラムは室温（24℃）であったが、溶解物の容器は実験中氷の上に置いた。続いてカラムを100mlのCon A緩衝液で洗浄した。抗接着試験で活性を有した材料（以下のＤ節参照）を1ml／分（30cm／時間）の流速で、約３〜５カラム容積の0.5Mメチル‐ アルファ‐マンノピラノシド（CAS 617-04-09）を含有するCon A緩衝液で溶離した。10,000分子量分画膜を装着したアミコン撹拌限外濾過容器を用いて、溶離した材料を5mlに濃縮し、次いで脱イオン水で50mlに希釈、10,000分子量分画（ポリサイエンシズ（Polysciences、Inc.）、ウォーリントン（Warrington）、PA）を有する遠心限外濾過ユニットを用いて2.3mlに再濃縮した。スーパーデックス（1.5ml）による分子ふるいクロマトグラフィーに使用した材料は、10,000分子量分画（アミコン、バーバリー、MA）を有する遠心限外濾過ユニットを用いてさらに0.5mlに濃縮した。（C）スーパーデックス200HRを用いる分子ふるいクロマトグラフィー固定化コンカナバリンＡから溶離し（上記工程（B）参照）、限外濾過で濃縮した材料を1.0cm×30cmスーパーデックス200HRカラム（ファルマシア、ピツカスウエー、NJ）に負荷した。カラムは24℃、0.01M リン酸カリウム緩衝液、pH 7. 35および0.15M NaClで前もって平衡化しておいた。流速0.25ml／分でクロマトグラフィーを行った。抗接着活性は見かけの分子量約20,000の位置に溶離した。（D）トキソカラ・カニスより単離された好中球抑制活性のアッセイメチル‐アルファ‐マンノピラノシドでコンカナバリンＡセファローズから溶離した材料を好中球-HUVEC試験（実施例１（B）参照）で分析したところ、好中球の内皮細胞への接着を抑制することが見いだされた。接着抑制活性はまた、好中球-プラスチック接着試験においても示された（実施例１（C））。コンカナバリンＡセファローズおよびスーパーデックス200HR双方によるクロマトグラフィーで精製された材料は、好中球接着試験で好中球接着を抑制した（実施例１（C）参照）。実施例１６好中球抑制因子のインビボキャラクタリゼーションイヌ鉤虫から単離された好中球抑制因子を、急性炎症の動物モデルで試験した。腹膜炎症を150〜250グラムのスプラグードーレー（Sprague-Dawley）ラットに、9mlの2％カキグリコーゲン水溶液を腹膜内注射して誘導した（バロン（Baron ）ら、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッド（Journal of Immunologic al Methods）、49：305、1982年；マッカロン（McCarron）ら、メソッド・イン・エンザイモロジー（Method in Enzymology）、108：274、1984年；フェルドマン（ Feldman）ら、ジャーナル・オブ・イムノロジー、113：329、1974年；ロドリック（Rodrick）ら、インフラメーション（Inflammation）、６：１、1982年；およびキッカワ（Kikkawa）ら、ラボラトリー・インベスチゲーション（Laborator y Investigation）、30:76、1974年）。 NIFを実施例２記載通りに調製した。約20,000匹の鉤虫からの溶解物（湿量48. 2g）を調製し、ConA、スーパーデックス、およびヒドロキシアパタイト（HA）でクロマトグラフした。２つの等値のHA実験からの活性分画を合わせて41mlのHA材料を得た。1mlのNIF溶液（11μg）をグリコーゲンと同時に腹膜内ルートで、またはグリコーゲン投与の30分前に静脈ルートで投与した。４時間後、腹膜滲出液を、腹腔内を30mlのCa⁺⁺またはMg⁺⁺は含まず、0.03％EDTAを添加したハンクス（ Hanks）バランス塩溶液で置換して収穫し、血液細胞をセルダイン（Celldyn）30 00（アボットラボラトリーズ（Abbott Laboratories）、ノースシカゴ（North C hicago）、IL）自動マルチパラメーター差動細胞計数装置で計数した。滲出液中の主な細胞成分は好中球であった。図１０は、イヌ鉤虫から単離された好中球抑制因子の投与量を変えて、グリコーゲンの腹膜内投与により誘発したラットの腹膜炎症における好中球浸潤に対する効果を示す。グリコーゲン（9ml）および好中球抑制因子（1ml）を同時に腹膜内ルートで注射した。図１０は６回の独立した実験の結果を示す。NIFは、グリコーゲンに誘導されるラット腹腔への好中球浸潤の容量依存的に抑制した。 NIFの静脈内投与がグリコーゲン誘発ラット腹膜炎症を防止することができるかどうかを調べるために、第２の実験を行った。第１群ラットには、NIFとグリコーゲンを前記と同様の腹膜内ルートで投与した。第２の群のラットには、1μg のNIFをグリコーゲンの腹膜内注入の30分前に静脈内投与した。第３の群のラットには静脈内へのNIF投与を生理的食塩水と置換し、グリコーゲンを腹膜内へ投与した。４時間後、腹膜滲出液を採集し、血液細胞を計数した。図１１はイヌ鉤虫から単離された好中球抑制因子の、グリコーゲンの腹膜内注入で誘発されたラットにおける腹膜炎症での好中球滲出に対する効果を示す。好中球抑制因子（1ml）をグリコーゲンの腹膜内注入と共に腹膜内ルートで注射、またはグリコーゲン注入の30分前に静脈ルートで注射した。図11はNIFの腹膜内投与に対する６回の独立の実験のまとめと、NIFの静脈内投与の１回の実験の結果を表す。これらの結果は腹膜内または静脈内ルートいづれかで投与した場合、 NIFがラットのグリコーゲンで刺激された腹膜炎症反応を防止するのに有効であることを示す。実施例１７組替え好中球抑制因子によるインビボ好中球媒介炎症の抑制組替えNIF（γNIF）のインビボ抗炎症性をラット耳炎症試験で試験した（ヤング（Young）ら、1984年より）この試験では、アラキドン酸の局所投与によってラットの耳に炎症を誘発した。スパラグ‐ドーレーラット（250g）をペントバルビタールで麻酔した（初期投与量65mg／kg腹膜内；アンプロ・ファルマシューティカル（Anpro Pjarmaceutic al）、アーカディア（Arcadia）、CA）。実験の間中、ラットを外科手術が可能な麻酔の状態に維持した（４時間）。麻酔ラットの大腿動脈内にカテーテルを挿入した。PBS中20mg／mlの濃度で100μlの組み替えNIF（ピキア・パストリスで産生；実施例１２参照）をカテーテルを経由して注射した。対照ラットには100μl の無菌0.14M NaClを投与した。γNIFの静脈内投与の５分後、アラキドン酸（シグマ、セントルイス、MS；最終濃度500mg／mlにアセトンで１:１希釈）を右耳に、耳の内側と外側に各10μlずつ３回投与した。従って右耳には全投与量30mgのアラキドン酸が投与されたことになる。バックグラウンドコントロールとして使った左耳には全体で60μlのアセトンを投与した。アラキドン酸投与の４時間後、ラットをCO₂で殺した。アラキドン酸処置耳組織中への好中球浸潤は、ミエロパーオキシダーゼ活性を測定して間接的に定量した。7mm皮膚パンチ（ミルテックス（Miltex）；レークサクセス（Lake Success）、NY）を使用してそれぞれの耳の中心から組織試料を得た。組織試料を小片に切り、0.5ml HTAB緩衝液（50mMリン酸ナトリウム、 pH 6.4中の0.5％ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド；HTABはシグマ、セントルイス、MOから購入した）の入った16×100mm試験管に投入した。耳組織をウルトラーチュラックス（Ultra-Turrax）ヤンケ・アンド・フンケル、スタウフェン、ドイツ）を使用して20秒間、高速でホモジェナイズした。不溶物をホモジェネートから、14,000×gで10分間遠心後ナイテックス（Nytex）ガーゼで濾過して取り除いた。ミエロパーオキシダーゼ測定は96ウエルポリスチレンプレート（コースター；ケンブリッジ、MA）中で３連で行った。25μlのHTAB可溶化耳組織をそれぞれのウエルに添加し、これに100μlの基質溶液を加えた。基質溶液は二つの成分：１）0.1M酢酸ナトリウム、pH 4.5中0.012％のH₂O₂、および２）10％HCl中、0.3mg／mlの3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン;で構成されるものであり、これらを使用直前に0.125：１の比で組み合わせた。基質添加の10分後、125μlの1MH₂SO₄を加えて反応を止めた。試料を450nmで比色定量し、バックグラウンドを650nmで読みとった。ヒト白血球ミエロパーオキシダーゼ（シグマ；セントルイス、MO）を用いて標準曲線を作成した。組替えNIFは耳組織中へのアラキドン酸誘発好中球浸潤に対する保護効果を有していた。図１２はバックグラウンドミエロパーオキシダーゼ活性を差し引いた場合、γFNIを投与されたラット由来の耳組織は平均1.6ミエロパーオキシダーゼユニット／ml（MU/ml）を有したが、生理食塩水を投与されたラット由来の耳は平均4.1MU／mlを有したことを示す（それぞれのグループでn=10）。pH7.0、25℃ において、１ミエロパーオキシダーゼユニットは、基質としてグアイアコールを使用した反応の初期速度から計算して470nmでの吸光度で１分あたり1.0の増加を示す（デッサー（Desser、R.K.）ら、Arch．Biochem．Biophys.、148：452（197 2年））。すなわちγNIF（8mg／kg 静脈内）を投与されたラットで好中球注入は〜60％減少した；NIFを投与されたラットと生理食塩水を投与されたラットの間に95％の信頼計数で有意差がある（スチューデントのｔ試験）。これらの結果は、鉤虫由来NIFがグリコーゲンに誘導される腹腔中への好中球侵入を阻止したという事実と符合する（実施例１６参照）。これらのデータはさらに、γNIFがインビボで強い抗炎症剤として作用するという証拠を提供する。実施例１８好中球抑制因子DNA配列の好中球抑制因子関連タンパク質を単離するための使用 NIF cDNA配列を、機能的および構造的にNIFに関連するタンパク質をコードするDNA配列を単離するためのプローブとして使用する。標準手法を用いて遺伝子DNAまたはcDNAライブラリーを形成する（例えば分子クローニング実験室マニュアル、サムロック、フリッシュおよびマニアチス第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリーズ・プレス、CSH、NY、198 9年参照）。これらのライブラリーはアンサイロストマ・カニナム、他のアンサイロストマ株、他の寄生虫、およびヒト胎盤組織を含む任意の哺乳動物等のかび、バクテリアまたはウイルス起源由来のものでよい。この様なライブラリーから、アンサイロストマから単離されたNIF cDNA配列をプローブとして使用する核酸ハイブリダイゼーションによって有用なクローンを選択する。例えば標準手順により検出するために標識された約100〜2000塩基対のNIF cDNA断片（例えば分子クローニング実験室マニュアル、サムロック、フリッシュおよびマニアチス第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリーズ・プレス、CSH、NY、1989年参照）を、他の組織または他の種由来のライブラリーと、多様な厳密性の条件下にハイブリダイズさせる。しかしながらより好ましくはより厳密さの少ないハイブリダイゼーション条件を使用する（例えば6X SSC［SSCは150mM NaCl）15mM クエン酸３ナトリウム］、0.02M リン酸ナトリム pH 6.5、5X デンハルト溶液、0.5％（w／v）SDS、0.01M EDTA、100μg／ml 切断変性サケ精子DNA、0.23％デキストラン硫酸、20〜30％ホルムアミド、42 ℃、18時間）。またより好ましくは厳密さの少ない条件をハイブリダイゼーション後にフィルターを洗浄するために使用する（2X SSCで15分２回間予備洗浄後、 45〜60℃で20分間、0.5〜2X SCC）。上記技法を用いて単離されたNIF関連相補的DNAのヌクレオチド配列を、ジデオキシ配列決定の手順を用いて解析する（サンガー（Sanger）ら、1977年、プロシーデイングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー74：5463〜5467）。オープンリーディング枠を含む単離物（すなわちメチオニンで開始し、TAA、TGA、またはTAG停止コドンで終了する）を、バクテリア、酵母、昆虫または哺乳動物細胞のいずれかでのタンパク質発現のための適当なベクター内に挿入する。発現システムは組み替えタンパク質を培養培地内に分泌するために設計されたベクター（すなわちcDNA単離物オープンリーディングフレームと、その細胞型に対する既知の分泌信号配列との融合）を包含する。均一な分泌配列を欠くベクターもまた、発現のために使用される。使用する発現系によって調節培地または細胞溶解物のいづれかについて、以下の好中球活性化の基準のひとつまたは複数を用いて抑制活性を試験する：過酸化水素の遊離、スーパーオキシドアニオンの遊離、ミエロパオキシダーゼの遊離、エラスターゼの遊離、好中球同型凝集、プラスチック表面への接着、血管内皮細胞への接着、ケモタキシス、内皮細胞の単層を横切る移動および貪食。構造的にNIFに関連するタンパク質、および上記好中球機能試験のひとつまたは複数に対して抑制的であるタンパク質は、関連する分子のNIFファミリーに属すると考えられる。実施例１９機能性組み替えNIFの大腸菌中での発現 N-末端に対応するコドンがメチオニンで開始するNIF-1FLコード領域のDNAを大腸菌発現ベクター中に挿入する。このようなベクターの例はバルバス（Balbas、 P.）およびボリバー（Bolivar）F.）、1990年（メソッズ・イン・エンザイモロジー、185：14〜37）に記載されている。実施例１１および１２にそれぞれ記載した、NIF-1FLコード領域を哺乳動物および酵母発現ベクター中に挿入する方法と類似の方法を用いて、DNAを大腸菌発現ベクター中へ挿入する。PCRオリゴヌクレオチドプライマーを、NIF-1FLコード領域を含む増幅生成物を発生させるために設計する。NIF-1FLを哺乳動物および酵母発現ベクター中に挿入する方法と関連して記載した様に（実施例１１および１２それぞれを参照）、この断片を選択された発現ベクター中へ挿入させ得る５’および３’制限部位を含有する様にプライマーを設計する。発現構築物は、好ましくは組替えNIFが細胞周辺腔でなく細胞質中に分泌される様に設計する。これは大腸菌の分泌シグナルを構築物から除外することにより達成し得る。大腸菌細胞を標準手法を用いて、NIF-1FL発現ベクター構築物により形質転換させる。（例えばモレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリー・マニュアル、サムブルック、J.フリッシュ、E.F.、およびマニタス、T.、第2版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、1989年、1.74〜1.84参照）。細胞は適当な培地中で生育させ（例えばルリアブロス（Luria Broth）；モレキュラー・クローニング、エ・ラボラトリー・マニュアル、サムブルック、J.フリッシュ、E.F.、およびマニタス、T.、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、1989年、A.1参照）、生育の定状相に達するまでに収穫する。組替えNIFの大多数は細胞質中に、不溶性かつ機能的に不活性な凝集体として存在する。このような凝集体中に存在する組み替えタンパク質の可溶化とときほぐしは、コーノ（Kohno）ら、1990年、によって紹介されている様な既知の方法（メソッド・イン・エンザイモロジー、185：187〜195）を用いて行えばよい。再度折り畳まれた組替えNIFをときほぐされた組替えNIFおよび他の反応生成物から、C4逆相HPLCを含む多数の標準的クロマトグラフィー技術を用いて分離する（例えば実施例２（E）参照）。再度折り畳まれた組み替えDNAを、実施例１記載の好中球機能試験に供する。この組替えNIFはグリコシル化されていない。実施例２０大腸菌細胞質内で生産された「不溶性」メチオニル−ＮＩＦの再生による機能性組換えＮＩＦの調製（A）大腸菌発現ベクターpMa５−ＮＩ１／３の記述ＮＩＦ−ＩＦＬコーディング領域（coding region）を有する増幅生産物を生成させるようにＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。ＰＣＲ生産物は、増幅によってＡＡＴからＡＡＣに変化した成熟ＮＩＦ−１ＦＬの最初のAsn −コドンにおいて開始する。３’−プライマーはＴＡＡトリプレットによりＴＧＡ翻訳終止コドンと代替し、コーディング領域の下流部位にSpeI、HindIIIおよび BigIIを導入する。ＰＣＲプライマーは次の通りである： Pst４１４：５’−ＣＣＴＣＣＴＣＣＴＡ−ＧＡＴＣＴＡＡＧＣＴ−ＴＡＣＴＡＧＴＴＴＡ −ＴＡＡＣＴＣＴＣＧＧ−ＡＡＴＣＧＡＴＡＡＡ−ＡＣＴＣ（５４量体；Ｃ−末端と符合する３’−プライマー） Pst４１５：５’−ＡＡＣＧＡＡＣＡＣＡ−ＡＣＣＴＧＡＧＧＴＧ−ＣＣＣＧ（２４量体；Ｎ−末端と符合する５’−プライマー） HindIIIを用いて消化をおこなった後、適切な大きさのＰＣＲフラグメントをアガロースゲルを用いて分離し、ラムダファージＰ_Rプロモーターの下流の大腸菌発現ベクターに挿入した。受容体ベクターをNcoIを用いて開いた後、ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）を用いて処理し、次いで、HindIIIを用いて消化した。得られたベクター（pMa５−ＮＩ１／３）を図１４に模式的に示す。該ベクターの関連部分の配列を図１５に示す。このベクター中に存在するＮＩＦ−１ＦＬ領域の配列を完全に決定し、不要な突然変異の不存在を確認した。発現モジュールは次の要素（１）〜（４）から成る。（１）ラムダファージＰR プロモーター、（２）Met−ＮＩＦ−１ＦＬ領域の上流に存在する小シストロン（この上流シストロンは、ラムダファージcro遺伝子の最初の９個のコドンを含んでおり、シャイン−ダルガルノ（ＳＤ）ボックスおよびMet−ＮＩＦ−１ＦＬのＡＴＧイニシエーターコドンの間に位置するＴＡＡストップにおいて終止する（図１４および図１５参照)。リーダーシストロンは３１番目のポリペプチド残基をコードする機能を有する。多数の天然のオペロン中に存在するものを含むこの種の２シストロン配列を使用することによって、その発現レベルが翻訳の開始により制限されると考えられている非相同遺伝子の発現を改良した[次の文献参照:ショナー（Schoner）ら、ＰＮＡＳ．第８１巻、第５４０３頁〜第５４０７頁（１９８４年）；スパンジャード（Spanjaard）ら、Gene、第８０巻、第３４５頁〜第３５１頁（１９８９年）;マコッフ（Makoff）およびスモールウッド（Sma llwood）、ＮＡＲ、第１８巻、第１７１１頁〜第１７１８頁（１９９０年）］。（３）メチオニル−ＮＩＦ −１ＦＬをコードするオープンリーディングフレーム。構築スキームは、ＮＩＦ −ＦＬ１５’−末端がＡＴＧイニシエーターコドンと適切に融合するようなものである。このＡＴＧコドンの上流には、ＳＤ配列（例えば、ＧＧＡＧＧＴ；図１４および図１５参照）が存在する。（４）Met−ＮＩＦ−１ＦＬコーディング領域の下流に存在するファージfdから誘導された転写ターミネーター（fdＴ）の２個のコピー。（Ｂ）「不溶性」メチオニル−ＮＩＦの生産ＮＩＦ−１ＦＬ遺伝子の発現におけるpMa５−ＮＩ１／３の効率を評価するために、pcＩ８５７を宿すＷ３１１０細胞内へベクターを導入した。プラスミドpc １８５７はカナマイシン（２０μg／ml）に対する耐性を規定し、ラムダＰRプロモーターの感温性レプレッサーをコードし、また、pMa５−ＮＩ１／３に対して適合性を示す。培養物をＬＢ培地中において２８℃で増殖させ（密度:約２×１０⁸個細胞／ml）、次いで４２℃で２〜３時間誘発させた。誘発させた全細胞抽出物と非誘発細胞をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析したところ、プロモーターの熱誘発によって新たに約３３ｋＤａのタンパク質（ＮＩＦ−１ＦＬの分子量の計算値：約２９ｋＤａ）が合成されたことが判明した。全細胞抽出物のほかに、音波処理による誘発細胞の開放と遠心分離による溶解物（lysate）の清澄化によって得られた可溶性上澄と不溶性ペレットも分析した。この分析結果によれば、新たに合成された約３３ｋＤａのタンパク質が細胞内に沈澱し、いわゆる封入体が形成されたことが判明した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いる分画、プロブロット（ProBlott）（ＡＢＩ）上への転移およびクーマシー染色による可視化の各処理をおこなった後、約３３ｋＤａのバンドを切取し、そのＮ−末端アミノ酸配列を決定した。得られた配列はＭ−Ｎ−Ｅ−Ｈ…であった。この結果によって、イニシエーターであるメチオニンは一次翻訳生成物からは除去されなかったことおよび３３ｋＤａのバンドが組換えＮＩＦとして明確に同定されたことが判明した。組換えＮＩＦタンパク質の蓄積量はＯＤ₆₅₀ユニットあたり約10mg／リットルであった。（Ｃ）大腸菌内で発現されたＮＩＦタンパク質の再生プラスミドpMa５−ＮＩ１／３を含有するＷ３１１０大腸菌細胞を、ＬＢ培地を１.５リットル有する振盪フラスコインキュベーター（６リットル）内において、光学密度（ＯＤ）が０.６〜０.９au（５５０nm）になるまで２８℃において増殖させた。５６℃のＬＢ培地をさらに１.５リットルヘ各々のフラスコ内に添加して組換えＮＩＦの発現を誘発させ、フラスコを振盪下、４２℃においてインキュベートした。ＯＤを監視し、その値が１.０〜１.５になったときに遠心分離処理によって細胞を採取した。細胞ペレットを−８０℃で凍結させた。各チューブには約３.５gの細胞が採取された。ＴＥＳ緩衝液（０.０５Ｍトリス、０.０５Ｍエチレンジアミン四酢酸ナトリウム、１５％（w／v）ショ糖、pＨ８.０）１５mlを１本のチューブに添加し、チューブの内容物を超音波処理によって解凍させた後、細胞ペレットを均一に懸濁させた。懸濁液を２本のガラス製の遠心分離用チューブ（３０ml）に分配させた。元のチューブはＴＥＳ２.５mlを用いて洗浄し、この洗浄液もガラス製チューブ内へ添加した。ガラス製チューブ内の懸濁液をブランソン・ソニック・パワー社（ダンバリー、コネクチカット）製装置を用いる超音波処理（３０秒間）に４回付した。超音波処理の全過程を通して、懸濁液の温度は、氷を用いて１０℃以下に保持した。このチューブは遠心分離処理（１０,０００rpm）に４℃で２０分間付した（１２,１００×gmax）。上澄を捨て、各々のペレットをＰＳＸ緩衝液（０.０２Ｍリン酸カリウム、１Ｍ塩化ナトリウム、１％（v／v）トリトン（Trito n）Ｘ−１００、ｐＨ７.２）１５mlに再懸濁させた後、低出力の超音波処理によってペレットを粉砕させ、次いで中出力での超音波処理を１５秒間おこなった。チューブを氷上で冷却し、中出力での超音波処理を１５秒間おこなった後、遠心分離処理（１０,０００rpm）に２０分間付した（１２,１００×gmax）。上澄を捨てた後、上記のＰＳＸへの再懸濁と遠心分離をさらに２回おこなった。各々のペレットは、前記のようにして、ＰＢＳ緩衝液（０.０１Ｍリン酸ナトリウム、０.１５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７.３）１５mlに再懸濁させ、超音波処理を短時間おこなった後、遠心分離処理に付した。ＰＢＳへの再懸濁処理をさらに１回おこなった。各々のペレットは、ＰＢＳを１２.５ml入れた各チューブ内に超音波処理によって再懸濁させた。両方のチューブの内容物を一緒にし、ＰＢＳをさらに加えて全体積を３０mlとした。精製した封入体のタンパク質濃度は、バイオ・ラッド社（Ｂio−Rad）（ヘラクレス、カリフォルニア）製のＤＣタンパク質アッセイ装置を用いて決定した。タンパク質を５mg含有する精製封入体のアリコートをプラスチック製遠心分離管（１.７ml）内へ移した。これらの管を４℃でのマイクロ遠心分離処理に１０分間付した。上澄を捨て、各々のペレットを緩衝液（０.０５Ｍトリス、１％（w ／v）サルコシル（Sarkosyl）、pＨ７.５）１ml中に超音波処理によって再懸濁させた。これらの管をエッペンドルフ社（Eppendorf）（ハンブルグ、ドイツ）製サーモミキサー渦動装置を用いる３７℃での渦動処理に４８時間付した。このインキュベーション処理をおこなった後、試料をＮＩＦ活性アッセイ法（実施例１参照）に付した。典型的な活性は、存在するＮＩＦの３％の活性（再生）に対応するものであった。実施例２１アンサイロストマ・カニナムからのＮＩＦの分離と特性評価（Ａ）アンサイロストマ・カニナムからのＮＩＦのクローン化と配列決定ＮＩＦ−１ＦＬに関連するタンパク質をコードする新たな全コーディング領域（実施例１０参照）を、ＮＩＦ−１ＦＬのＮ−およびＣ−末端に符号する一重鎖オリゴヌクレオチドＤＮＡプライマーを用いるＰＣＲ技法によって同定した。これらのプライマーは次の通りである：ＹＧ１：５’−ＡＴＧ−ＧＡＧ−ＧＣＣ−ＴＡＴ−ＣＴＴ−ＧＴＧ−ＧＴＣ−ＴＴＡ（Ｎ−末端コーディング領域Ｍ−Ｅ−Ａ−Ｙ−Ｌ−Ｖ−Ｖ−Ｌと符号する５’−プライマー）ＹＧ−２：５’−ＴＣＡ−ＴＡＡ−ＣＴＣ−ＴＣＧ−ＧＡＡ−ＴＣＧ−ＡＴＡ−ＡＡＡ− ＣＴＣ（Ｅ−Ｆ−Ｙ−Ｒ−Ｆ−Ｒ−Ｅ−Ｌ−終止コドンに対応するＣ−末端配列と符号する３’−プライマー）ＹＧ１／ＹＧ２プライマー対は、アンサイロストマ・カニナムの全ＲＮＡ製剤（実施例１０参照）を鋳型として使用するときには、適切な大きさのＰＣＲ生成物をもたらすことが判明した。第１鎖cＤＮＡ合成［ファルマシア社（Pharmacia ）（ウプサラ、スウェーデン）製第１鎖cＤＮＡ合成キット；ＹＧ２プライマー１０pmol；全ＲＮＡ−１５μｇ］およびＰＣＲによるその後の増幅は該製造業者の使用説明所に従っておこなった。ＰＣＲはTag ＤＮＡポリメラーゼ[ベーリンガー社（マンハイム、ドイツ）］を使用し、３０回の温度サイクル（９５℃における１分間の変性段階；５５℃におけるアニーリング段階;１.５分間の延長段階）によっておこなった。得られたＰＣＲ生成物はアガロースゲルを用いて分離し、ファージミドベクター（一重鎖ＤＮＡの調製を可能にする）上でクローン化した。配列決定により、３種のクローンＰＣＲ−ＮＩＦ５、ＰＣＲ−ＮＩＦ７およびＰＣＲ−ＮＩＦ２０が保持されることが判明した。ＰＣＲ−ＮＩＦ５はＮＩＦ −１ＦＬと同一であるが、ＰＣＲ−ＮＩＦ７とＰＣＲ−ＮＩＦ２０は２種の新規なＮＩＦ配列であり、これらの配列を図１６に示す。アンサイロストマ・カニナムのＮＩＦの付加的な全配列をcＤＮＡライブラリーのスクリーニングによって分離した。この場合、ハイブリダイゼーションプローブとしては、実施例１０に記載のアンサイロストマ・カニナムの７種のＮＩＦ配列（１ＦＬ、３Ｐ、２ＦＬ、３ＦＬ、４ＦＬ、６ＦＬおよび１Ｐ）中に十分に保存された配列を標的化するプライマーを用いて得られた放射能標識化ＰＣＲフラグメントを使用した。また、下記のプライマーを使用した：ＹＧ３：５’−ＣＡＣ−ＡＡＴ−ＧＧＴ−ＴＡＣ−ＡＧＡ−ＴＣＧ−ＡＧＡ−ＣＴＴ− ＧＣＧ−ＣＴＡ−ＧＧＴ−ＣＡＣ（ＮＩＦ−１ＦＬ配列においてアミノ酸配列Ｈ −Ｎ−Ｇ−Ｙ−Ｒ−Ｓ−Ｋ−Ｌ−Ａ−Ｌ−Ｇ−Ｈをコードする領域を標的化する５’−プライマー）ＹＧ４：５’−Ｔ−ＴＴＴ−ＴＧＧ−ＧＴＡ−ＧＴＧ−ＧＣＡ−ＧＡＣ−ＴＡＣ−ＡＴＧ（ＮＩＦ−１ＦＬ配列においてＨ−Ｖ−Ｖ−Ｃ−Ｈ−Ｙ−Ｐ−Ｋ−（Ｉ）をコードする領域を標的化する３’−プライマー）ポリ（Ａ＋）ＲＮＡを、クウィックプレプ（Quick Prep）mＲＮＡ精製キット（ファルマシア）を用いて蠕虫の成虫から調製した。このポリ（Ａ＋）ＲＮＡ製剤を鋳型として使用し、ほぼ予定した長さの増幅生成物ＹＧ３／ＹＧ４プライマー対を得た（ＰＣＲの条件は前記と同様である）。ゲル電気泳動分析によれば、この増幅生成物は長さの点では幾分不均一であった。ＹＧ３／ＹＧ４プライマーは種々のＮＩＦ配列の長さが有意に相違する領域をコードする部分に隣接する配列を標的化するように設計した。ＰＣＲ生成物の不均一な性質は、プライマーが数種の異なるアイソフォームの増幅に有用なことを示す。ＰＣＲ生成物はゲルを用いる精製処理に付した後、「ランダムプライマー延長」［^T7クウィックプライム（Quick Prime^TM）キット（ファルマシア）によって放射能標識化し、ハイブリダイゼーションプローブとして使用した。cＤＮＡライブラリーは、プロメガ社（Promega Corp．）発行の「プロメガ・プロトコールズ・アンド・アプリケーションズ・ガイド（第２版）」に記載の方法によって構築した。約３μgのmＲＮＡを、オリゴ（dT）−NotＩプライマー−アダプター［５’-ＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣ（Ｔ）₁₅；プロメガ社（マディソン、ウィスコンシン）］およびＡＭＶ（トリ骨髄芽球症ウイルス）逆転写酵素（ベーリンガー）を用いて逆転写した。二重鎖cＤＮＡ合成には、ＢＲＬライフテクノロジー社（ガイテルスブルグ、メリーランド）製の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩとＲＮas eＨおよびファルマシア社製のＴ４ＤＮＡポリメラーゼを使用した。得られたcＤＮＡはＥcoＲＩメチラーゼ［プロメガ社製のリボクロン（RiboClone）ＥcoＲＩリンカー連結システム］を用いて処理した。cＤＮＡはNotＩとＥcoＲＩを用いて消化させた後、１％アガロースゲル上でのサイズ選択処理に付し［１０００〜７０００の塩基対を有するフラグメントを、ジーンクリーン（Geneclaen）プロトコール［バイオ１０１社（ＢＩＯ１０１Ｉnc．）（ラジョラ、カリフォルニア）］に従って溶出させ、次いで、ラムダgt１１ Sfi−Notベクター（プロメガ）のＥcoＲＩ−NotＩアームに一方向から連結させた。ストラタジーン社（Stratagene）（ラジョラ、カリフォニルア）製のギガパックII−ゴールド（GigapackII−Gold）を用いる生体外パーケージング処理をおこなった後、菌株Ｙ１０９０（プロメガ）を感染させることによって組換えファージを得た。cＤＮＡライブラリーの有用性は、多数の任意に選択されたクローンについて、ラムダgt１１プライマー＃１２１８［ニューイングランド・バイオラブズ社（ビバリー、マサチューセッツ）製］および前記のオリゴ（dＴ）−NotＩプライマー−アダプターを用いるＰＣＲ分析によって示された［ベーリンガー社製Taq ポリメラーゼ；３０回の温度サイクル（９５℃／１分間、５０℃／１分間、７２℃／３分間）］。大部分のクローンには、種々のサイズを有するcＤＮＡ挿入断片が含まれることが判明した。約１×１０⁶個のcＤＮＡクローン［アメルシャム社（Amersham）（バッキンガムシャー、イングランド）製の「ハイボンド−Ｎ」を用いてプラーク−リフト重複フィルターを調製した］を、次のプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション条件下において、放射能標識化ＹＧ３／ＹＧ４ＰＣＲフラグメントを用いるスクリーニング処理に付した:５ＸＳＳＣ（ＳＳＣ:１５０mＭＮａＣｌ、１５mＭクエン酸三ナトリウム）、５Ｘデンハルト溶液、０.５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、１００μg／mlの超音波処理した魚の精液のＤＮＡ（ベーリンガー）、４２℃／一夜。フィルターを２ＸＳＳＣ、０.１％ＳＤＳを用いて３７℃で４回洗浄した。Ｘ線フィルムに一夜さらした後、プローブとハイブリダイズした多数のプラークを同定した。クローンの約０.１〜０.２％で正のスコアを示した。２回目のハイブリダイズラウンド後（２４個の正のスコアを低プラーク密度で分析することによって単一の純粋なクローンを分離し、多数のファージクローンをＰＣＲ分析処理に付した後、全コーディング領域を包囲するのに十分なcＤＮＡ挿入断片をSfiＩ−NotＩフラグメントとしてｐＧＥＭ型ファージミド（プロメガ）上でサブクローン化した。８種のＮＩＦcＤＮＡ、即ち、Ａc aＮＩＦ３，ＡcaＮＩＦ４,ＡcaＮＩＦ６，ＡcaＮＩＦ７，ＡcaＮＩＦ９，ＡcaＮＩＦ１８，ＡcaＮＩＦ１９，およびＡcaＮＩＦ２４の配列を決定した。これらのデータを図１６に示す。（Ｂ）アンサイロストマ・カニナムからの機能性ＮＩＦタンパク質のピキア・パストリス（Pichia Pastoris）中での発現ＡcaＮＩＦ２４，ＡcaＮＩＦ６，ＡcaＮＩＦ４およびＡcaＮＩＦ９をコードするＤＮＡセグメントを、上記の各々のｃＤＮＡを有するｐＧＥＭ型ベクターを鋳型として使用することによって増幅した。５’−プライマーは制限部位を有しておらず、また、成熟タンパク質のコーディング領域の５’−末端部分に符号する。第１コドンはＡＡＴからＡＡＣに変わる（両方のコドンはアスパラギンへ翻訳する）。種々のＮＩＦ配列に対する５’−プライマーの配列は次の通りである：ＡcaＮＩＦ２４：５’−ＡＡＣ−ＧＡＡ−ＣＡＣ−ＡＡＣ−ＣＴＧ−ＡＣＧ− ＴＧＣ−ＣＣＡcaＮＩＦ６：５’−ＡＡＣ−ＧＡＡ−ＣＡＣ−ＡＡＡ−ＣＣＧ−ＡＴＧ− ＴＧＣ−ＣＡＧ−ＣＡcaＮＩＦ４：５’−ＡＡＣ−ＧＡＡ−ＣＡＣ−ＡＡＡ−ＣＣＧ−ＡＴＧ− ＴＧＣ−ＧＡＧＡcaＮＩＦ９：５’−ＡＡＣ−ＧＡＡ−ＣＡＣ−ＧＡＣ−ＣＣＡ−ＡＣＧ− ＴＧＴ−ＣＣ３’−プライマーはコーディング領域の３’末端の８個のコドン、天然遺伝子のＴＧＡストップと代替するＴＡＡストップおよび３種の特有の制限エンドヌクレアーゼ部位（SpeＩ、HindIIIおよびBglII）から成る。次の３’−プライマーを使用した：ＡcaＮＩＦ２４：５’−ＣＣＴ−ＣＣＴ−ＣＣＴ−ＡＧＡ−ＴＣＴ−ＡＡＧ−ＣＴＴ−ＡＣＴ− ＡＧＴ−ＴＴＡ−ＡＡＡ−ＴＣＧ−ＡＴＡ−ＡＡＡ−ＣＴＣ−ＣＴＴ−ＧＣＴ− −ＡＴＣＡcaＮＩＦ６：５’−ＣＣＴ−ＣＣＴ−ＣＣＴ−ＡＧＡ−ＴＣＴ−ＡＡＧ−ＣＴＴ−ＡＣＴ− ＡＧＴ−ＴＴＡ−ＴＡＡ−ＣＴＣ−ＴＣＧ−ＧＡＡ−ＴＣＧ−ＡＴＡ−ＡＡＡ− ＣＴＣＡcaＮＩＦ４：５’−ＣＣＴ−ＣＣＴ−ＣＣＴ−ＡＧＡ−ＴＣＴ−ＡＡＧ−ＣＴＴ−ＡＣＴ− ＡＧＴ−ＴＴＡ−ＴＡＡ−ＣＴＣ−ＴＣＧ−ＧＡＡ−ＴＣＧ−ＡＴＡ−ＡＡＡ− ＣＴＣＡcaＮＩＦ９：５’−ＣＣＴ−ＣＣＴ−ＣＣＴ−ＡＧＡ−ＴＣＴ−ＡＡＧ−ＣＴＴ−ＡＣＴ− ＡＧＴ−ＴＴＡ−ＴＡＧ−ＣＴＣ−ＴＣＧ−ＡＡＡ−ＣＧＧ−ＡＴＡ−ＡＡＡ− ＡＴＡ増幅は、各々のプライマー１００pmol）１×ヴェント（Vent）緩衝液（ニューイングランド・バイオラブズ）中のヴェントポリメラーゼ２単位、各々のdＮＴＰ０.２mＭおよび鋳型ＤＮＡ１００ngを用いて完結させた。ＰＣＲ条件は、２０回の全サイクルを通じて同一にした（９０℃での変性／１分間、６０℃でのプライマーアニーリング／１分間、７２℃での増幅／１.５分間）。増幅生成物はゲル精製処理に付した後、SpeＩを用いて消化した。増幅生成物は、標準的な方法により、StuＩ−SpeＩで切断したpＨＩＬ７ＳＰ８に連結させた。この連結反応混合物を用いて、アンピシリン耐性クローンを選択する大腸菌ＷＫ６を形質転換させた。いずれの場合も、制限とＤＮＡ配列解析によって適切なクローンが同定された。実施例１２（Ｂ）に記載のようにして、これらのプラスミド（ｐＹＡＭ７ＳＰ−ＡcaＮＩＦ２４、ｐＹＡＭ７ＳＰ−ＡcaＮＩＦ６、ｐＹＡＭ７ＳＰ−Ａ caＮＩＦ４およびｐＹＡＭ７ＳＰ−ＡcaＮＩＦ９）を使用してピキア−パストリス酵母菌株ＧＴＳ１１５（his４）を形質転換させた。His 形質転換細胞の選択およびその後のＮＩＦ発現のための選択は実施例１２（Ｂ）に記載のようにしておこなった。機能性ＮＩＦタンパク質のピキア細胞上澄中での蓄積は、ＬＭ２／ＣＤ１１b／ＣＤ１８に基づくＥＬＩＳＡを用いる３Ｄ２−ＨＲＰ検出法（実施例１参照）（ＡcaＮＩＦ２４、ＡcaＮＩＦ６およびＡcaＮＩＦ４の場合）またはＬＭ２／ＣＤ１１b／ＣＤ１８に対する競合アッセイ法（実施例１参照）（Ａca ＮＩＦ９の場合）を利用することによって検出し、定量した。（Ｃ）ＮＩＦタンパク質（ＡcaＮＩＦ２４、ＡcaＮＩＦ６、ＡcaＮＩＦ４およびＡcaＮＩＦ２４）の精製と特性評価機能的に活性な組換えタンパク質（ＡcaＮＩＦ２４、ＡcaＮＩＦ６およびＡca ＮＩＦ４）を精製し、詳細に特性を評価した。メタノールを用いて４８時間誘発させた後、遠心分離処理（１,８００×g；１５分間）によってピキア細胞上澄を得た。組換えタンパク質ＡcaＮＩＦ２４およびＡcaＮＩＦ６の場合、上澄２５０mlにトリス−ＨＣｌを添加することによってpＨを７.０に調整した後、４℃で一夜保存した。遠心分離によって沈澱物を除去し、透明な上澄は３Ｄ２−免疫親和性樹脂を用いて処理し、結合物をグリシン−ＨＣｌ溶液（ｐＨ２.５）を用いて溶離させた（実施例２７参照）。溶離フラクションを中和した後、限外濾過によって濃縮した。いずれのタンパク質もＳＤＳ−ＰＡＧＥ［ノヴェックス社（Novex）製；４〜２０％傾斜ゲル］上では単一バンドとして移動した。エドマン分解法により、適切に処理されたタンパク質が生成されたことを確認した。Ｎ−末端アミノ酸配列は次の通りである（Ｘは未同定残基を示す）：ＡcaＮＩＦ２４:Ｎ−Ｅ−Ｈ−Ｘ−Ｌ−Ｔ−Ｘ−Ｐ−Ｑ−ＮＡcaＮＩＦ６: Ｎ−Ｅ−Ｈ−Ｋ−Ｐ−Ｍ−Ｘ−Ｑ−Ｑ−Ｘ−Ｅ−Ｔ−Ｅ−Ｍ −Ｐ濃度は分光光度法によって測定し、試料のアッセイは、プラスチック接着アッセイ法と過酸化物放出アッセイ法（実施例１参照）によっておこなった。両方の組換えタンパク質（ＡcaＮＩＦ２４およびＡcaＮＩＦ６）は組換えＮＩＦ−１ＦＬ（図１７参照）としては同等の活性を示した。組換えＡcaＮＩＦ４の精製は、実施例２３に実質上記載されたようにして、ヒドロキシアパタイトと逆相クロマトグラフィーによっておこなった（但し、Supe rdex上でのゲル濾過処理は省略した）。精製したタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ノヴェックス社製；４〜２０％傾斜ゲル）上では単一のバンドとして移動した。濃度は分光光度法によって測定した。ビオチン化ＮＩＦ−１ＦＬを用いる競合結合アッセイにおいて得られた結果により、ＡcaＮＩＦ４はＮＩＦ−１ＦＬに比べて、ＬＭ２／ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８複合体に対して著しく低い親和性を示すことが判明した（図１８参照）。組換えＡcaＮＩＦ９は逆相クロマトグラフィーによって部分的に精製した（実施例２３参照）。エドマン分解により、Ｎ末端アミノ酸配列がＮ−Ｅ−Ｈ−Ｄ− Ｐであることが明らかになり、これによって、適切に処理されたＡcaＮＩＦ９タンパク質が生成されたことが確認された。この部分的に精製されたタンパク質はピキアで生産されたＮＩＦ−１ＦＬタンパク質に比べて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ノヴェックス社製；４〜２０％傾斜ゲル）上でかなり高い移動度を示した（４０〜８０ｋＤａに対して３０〜３５ｋＤａ）。このことは、ＮＩＦ−１ＦＬには７個のＮ−グリコシル化部位が存在するのに対し、ＡcaＮＩＦ９にはわずかに２個の有効なＮ−グリコシル化部位が存在するに過ぎないことに対応する。ＡcaＮＩＦ９を含有する試料を、実施例１に記載の競合結合アッセイによって試験した。この結果、ビオチン化組換えＮＩＦ−１ＦＬのＬＭ２／ＣＤ１１b／ＣＤ１８複合体に対する競合は組換えＡcaＮＩＦ９によって妨げられることが判明した。実施例２２アンサイロストマ・セイラニカム（Ancylostoma ceylanicum）からのＮＩＦタンパク質の分離と特性評価（Ａ）アンサイロストマ・セイラニカムからのＮＩＦ配列のクローン化と配列決定アンサイロストマ・セイラニカムの全ＮＩＦ遺伝子を、同じ種から得られたＰＣＲフラグメントをハイブリダイゼーションプローブとして使用するｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによって分離した。ＰＣＲフラグメントは、実施例１０に記載のアンサイロストマ・カニナムからの７種類のアイソフォームＮＩＦ（１ＦＬ、３Ｐ、２ＦＬ、３ＦＬ、４ＦＬ、６ＦＬおよび１Ｐ）内に良好に保存された配列を標的化するプライマーを用いて得た。これらのプライマー（ＹＧ３およびＹＧ４）は実施例２０に記載したものである。ポリ（Ａ＋）ＲＮＡを、タウィックプレプｍＲＮＡ精製キット（ファルマシア）を使用してアンサイロストマ・セイラニカムの成虫から調製した。このポリ（Ａ＋）ＲＮＡ調製品を鋳型として使用し、ほぼ予想通りの長さ、即ち、アンサイロストマ・カニナムのＲＮＡを鋳型としたときのＰＣＲフラグメントとほぼ同じ長さの増幅生成物をＹＧ３／ＹＧ４プライマー対を用いて得た。ファルマシア社製の第１鎖ｃＤＮＡ合成キットを用いる第１鎖ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲによるその後の増幅は、該製造業者の使用説明書に従い、ＹＧ２プライマー（実施例２０参照）１０pmolおよびアンサイロストマ・セイラニカムのｍＲＮＡ１００ngを使用しておこなった。ＰＣＲは、ベーリンガー社製のＴaq ＤＮＡポリメラーゼおよびＹＧ３とＹＧ４１００pmolを使用する３０回の温度サイクル（９５℃での変性／１分間、５５℃でのアニーリング／１分間、伸長／１.５分間）の条件下でおこなった。ＰＣＲ生成物はゲルを用いて精製した後、^T7クウィックプライムキット（ファルマシア）を用いる「ランダムプライマー延長（random primerextensi on）」によって放射能標識化し、ハイブリダイゼーションプローブとして使用に供した。アンサイロストマ・セイラニカムのｃＤＮＡライブラリーは、実施例２０に記載の手順に従い、ラムダgt１１内で構築した。ｃＤＮＡライブラリーの特性は、ラムダgt１１プライマー＃１２１８（ニューイングランド・バイオラブズ）およびオリゴ（dＴ）−NotＩプライマー−アダプター（プロメガ）を使用し、多数の任意に選択されたクローンについてのＰＣＲ分析によって評価した（ベーリンガー社製のＴaqポリメラーゼ;３０回の温度サイクル:９５℃／１分間、５０℃／１分間、７２℃／３分間）。大多数のクローンは種々のサイズのｃＤＮＡ挿入断片を有することが判明した。実施例２０に記載のハイブリダイゼーション条件下において、放射能標識化したＹＧ３／ＹＧ４ＰＣＲフラグメントを用いて約５×１０⁵個のラムダｃＤＮＡクローンを選抜した。約６０個のポジティブクローンが同定された。前記のＰＣＲ分析によれば、ＮＩＦの全コーディング領域（約８５０bp）を包囲するのに十分なサイズの挿入断片を有することが判明した１つのポジティブクローンｃＤＮＡ挿入断片をSfiＩ−NotＩフラグメントとしてｐＧＥＭ−９Ｚｆ（−）（プロメガ）へ転移させ、その配列を決定した。ｃＤＮＡクローン（ＡceＮＩＦ３）の配列を図１９に示す。（Ｂ）ファージ接着型アンサイロストマ・セイラニカムから得られたＮＩＦ様タンパク質の発現成熟タンパク質をコードするアンサイロストマ・セイラニカムのＡceＮＩＦ３領域を、実施例２２におけるＮＩＦ−１ＦＬに関する手順に従い、ファージ表示ベクター上でクローン化した。標準的なアンサイロストマ・セイラニカムのＮＩＦタンパク質のＮ−末端アミノ酸配列は知られていないので、推定されるアミノ酸配列（図１９）において分泌シグナルのプロセシング部位の位置を正確に決めることは困難である。次のオリゴヌクレオチドプライマーを選択してＡceＮＩＦ３コーディング領域をＰＣＲ増幅した：ＹＧ１６：５’−ＧＴＣＧＣＡＡＣＴＧ−ＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣ−ＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣ −ＧＣＴＧＡＣＧＡＡＣ−ＣＡＡＣＧＴＧＣＡＡ−ＧＣＡＧ（５４量体;５’− プライマー;ＮcoＩ部位とＡceＮＩＦ３のＮ−末端は下線部である）ＹＧ１５：５’−ＧＡＧＴＴＣＴＣＧＡ−ＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧ−ＣＡＣＣＴＣＣＧＡＴ −ＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡ−ＣＧＧＡＧＴＧＡ（４８量体；３’−プライマー；NotＩ部位とＡceＮＩＦ３のＮ−末端は下線部である） NcoＩ／NotＩの消化後、ＰＣＲ生成物をゲル精製処理に付し、次いで宿主ベクターのNceＩ部位とNotＩ部位の間でクローン化した。得られたベクター（ｐＡＮ −ＡceＮＩＦ３）は、pelＢ、ＡceＮＩＦ３およびＭ１３gIIIコーディング領域の所望のインフレーム（in−frame）融合部を有する。ＡceＮＩＦ３タンパク質を表示するファージは、ＴＧｌ（su）細菌を宿すｐＡＮ−ＡceＮＩＦ３をＭ１３−ＶＣＳヘルパーファージを用いて感染させることによって得た（実施例２２参照）。ＰＢＳ中に再懸濁させたレスキューファージは、固定化したＬＭ２／ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８複合体上でのＥＬＩＳＡによってアッセイした（図２０参照）。アンサイロストマ・カニナムのアイソフォームＮＩＦ−１ＦＬ（実施例２２）を表示するファージを正の制御として用いた。ピキア中で生産された種々の量の組換えＮＩＦ−１ＦＬと共に３０分間インキュベートした後、組換えＮＩＦ−１ＦＬまたは組換えＡceＮＩＦ３を表示する１０¹⁰個のビリオンを、ＬＭ２／ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８で被覆したウェル中に添加した。インキュベーションを９０分間おこなった後、結合したファージの量を、ウサギの抗ファージ血清およびヤギの抗ウサギアルカリ性ホスファターゼ複合体を用いて決定した。固定化レセプター（実施例２０参照）へのファージの結合は、ＡceＮＩＦ３タンパク質がファージの表面にいて機能的に活性な形態で表示されなければならないことを示す。実施例２２に記載のデータは、ファージがＮＩＦタンパク質を表示するときにのみファージの結合が起こることを示す。即ち、非表示性の対照ファージはＬＭ２モノクローナル抗体に結合せず、また、ＬＭ２／ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８複合体にも結合しない。ピキア中で生産された可溶性組換えＮＩＦ−１ＦＬを増量させることによるＮＩＦ−１ＦＬ表示ファージとＡｃｅＮＩＦ３表示ファージの置換は、両方のＮＩＦタンパク質がＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８レセプターの同じ部位に対して同程度の親和性で結合することを示す。ＡceＮＩＦ３タンパク質のファージ表示はウェスタンブロットによっても証明された。ＳＤＳ−１０％ポリアクリルアミドゲルを用いて分画をおこなった後、ファージタンパク質をプロブロット（ProBlott）膜（アプライド・バイオシステムズ）上に移し、引き続き、ウサギの抗pgIII血清［ＧＡＴＣ社（ＧＡＴＣＧmbＨ）、コンスタンツ、ドイツ］およびヤギの抗ウサギアルカリ性ホスファターゼ複合体と共にインキュベートした。野性型ファージpgIIIタンパク質およびＮＩＦ−pgIII融合生成物に対応するバンドが視識された。（Ｃ）ｐＹＡＭ７ＳＰ−ＡceＮＩＦ３の構築とピキア中での発現ＡceＮＩＦ３をコードするＤＮＡセグメントを、コーディング領域の５’−末端と３’−末端に対して特有のプライマーを使用することによって、前記のｐＧＥＭ−９Ｚｆ（−）中のＡceＮＩＦ３のサブクローンからＰＣＲ増幅させた。タンパク質分解処理したＡceＮＩＦ３の５’−末端は明確には規定されなかったので、ＡceＮＩＦ９とＡceＮＩＦ３との間の配列相同性に基づいてハイブリダイゼーション５’−末端を創製した。即ち、タンパク質分解した成熟ＡceＮＩＦ９のＮ−末端コドンを５’−末端として用いた後、ＡceＮＩＦ３配列から得られた６個のコドンを使用した。得られたＮ−末端アミノ酸ハイブリダイゼーション配列はＮ− Ｅ−Ｈ−Ｅ−Ｐ−Ｔ−Ｃ−Ｋ−Ｑであり、天然のＡcaＮＩＦ９およびＡceＮＩＦ３配列はそれぞれＮ−Ｅ−Ｈ−Ｄ−Ｐ−Ｔ−Ｃ−Ｐ−ＱおよびＫ−Ｇ−Ｄ−Ｅ− Ｐ−Ｔ−Ｃ−Ｋ−Ｑであった。使用した５’−プライマーの配列は５’−ＡＡＣ −ＧＡＡ−ＣＡＣ−ＧＡＡ−ＣＣＡ−ＡＣＧ−ＴＧＣ−ＡＡＧ−ＣＡＧである。３’−プライマーはコーディング領域の３’−末端の８個のコドン、天然遺伝子のＴＧＡ終止コドンと代替するＴＡＡ終止コドンおよび３個の特有な制限エンドヌクレアーゼ部位（SpeＩ、 HindIIIおよびXbaＩ）から成る。使用した３’−プライマーの配列は次の通りである：５’−ＣＣＴ−ＣＣＴ−ＣＣＴ−ＴＣＴ−ＡＧＡ−ＡＧＣ−ＴＴＡ−ＣＴＡ− ＧＴＴ−ＴＡＧ−ＡＴＡ−ＧＧＴ−ＧＧＡ−ＴＡＡ−ＣＧＧ−ＡＧＴ−ＧＡＣ− Ｇ．増幅は、各々のプライマー１００pmol、１×ベント緩衝液（ニューイングランド・バイオラブズ）中のベントポリメラーゼ２単位およびｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰまたはｄＴＴＰ０.２mＭを用いて完結させた。ＡceＮＩＦ３を含有するｐＧＥＭ−９Ｚｆ（−）１００ngを鋳型ＤＮＡとして使用した。ＰＣＲ条件は、２０回の全サイクルにおいて同一にした（９５℃の変性／１分間、６０℃でのプライマーのアニーリング／１分間、７２℃での増幅／１.５分間）。増幅生成物はゲル精製処理に付した後、SpeＩを用いて消化した。増幅生成物は、標準的な方法により、StuＩ−SpeＩで切断したｐＨＩＬ７ＳＰ８と連結させた。連結反応混合物を使用して、アンピシリン耐性クローンを選択する大腸菌ＷＫ６を形質転換した。制限とＤＮＡ配列解析に基づき、得られたプラスミドクローン（ｐＹＡＭ７ＳＰ−ＡceＮＩＦ３）の１種について、適切な挿入断片の配列を選択することにより、実施例１２（Ｂ）に記載のようにして、ピキア・パストリス酵母菌株ＧＴＳ１１５（his４）を形質転換した。His 形質転換体の選択およびその後のＡceＮＩＦ３発現の選択は、実施例１２（Ｂ）に記載のようにしておこなった。ピキア細胞の上澄中のＡceＮＩＦ３の含有量は、ビオチン化ＮＩＦ１を用いる競合結合アッセイによって定量した（実施例１参照）。メタノール誘発を４８時間おこなった後、遠心分離によってピキア細胞の上澄を得た。粗製上澄は、ヒト好中球のプラスチックに対する接着を抑制した。実施例２３バクテリオファージ接着型または遊離の可溶性タンパク質としての機能的に活性なＮＩＦの大腸菌による生産（Ａ）ファージ表示ベクター上でのＮＩＦ−１ＦＬのクローン化ファージミドーベクターを構築した。この場合、成熟タンパク質をコードするＮＩＦ−１ＦＬ領域は、そのＮ−末端においてはpe１Ｂ遺伝子から誘導された分泌シグナル配列と融合させると共に、そのＣ−末端においては繊維状ファージＭ１３遺伝子III（gIII）と融合させた。この遺伝子融合は、Placプロモーターの転写調節下でおこなった。 pe１Ｂコドンのいくつかをシノニムトリプレットによって代替させることによって、分泌シグナルにNcoＩ制限部位を付与した。追加のAla−コドンをpe１Ｂ領域とＮＩＦ−１ＦＬ領域との間に導入し、連結部（junction）を原核原型シグナル配列のプロセシング部位により近似させた。ＮＩＦ−ＩＦＬおよびpgIII（gII Iの生成物）のコーディング領域を、（ｉ）NotＩ部位が組み込まれたリンカー配列および（ii）su^-菌株において翻訳終止コドンとして作用するが、su細菌細胞においてセンス（sense）コドンとしてしばしば読みとられるＴＡＧ（アンバー）トリプレットによって分離した。ファージミドベクター（ｐＡＮ−ＮＩＦ−１ＦＬ）を図２１に模式的に表示する。ｐＡＮ−ＮＩＦ−１ＦＬは、５’−エクステンションを有するプライマーを用いるＮＩＦ−１ＦＬコーディング領域のＰＣＲ増幅によって構築した。該５’ −エクステンションは、宿主ベクター内のゲル精製ＰＣＲフラグメントのNcoＩ／NotＩ指向性クローン化によってpe1Ｂ、ＮＩＦ−１ＦＬおよびgIIIコーディングエレメントの所望のインフレーム融合がもたらされるような配列を有するものである。ＮＩＦ−１ＦＬコーディング領域は次の２種のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲ増幅した：ＬＪＯ４５：５’−ＧＴＣＧＣＡＡＣＴＧ−ＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣ−ＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣ −ＧＣＴＡＡＴＧＡＡＣ−ＡＣＡＡＣＣＴＧＡＧ−ＧＴＧＣ（５４量体;５’− プライマー;NcoＩ部位およびＮＩＦ−１ＦＬのＮ−末端は下線部で示す）ＬＪＯ４６：５’−ＧＡＧＴＴＣＴＣＧＡ−ＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧ−ＣＡＧＧＴＧＧＴＡＡ −ＣＴＣＴＣＧＧＡＡＴ−ＣＧＡＴＡＡＡＡＣＴ−Ｃ（５１量体;３’−プライマー;NotＩ部位およびＮＩＦ−１ＦＬのＣ−末端は下線部で示す）ｐＡＮ−ＮＩＦ−１ＦＬ中に存在するＮＩＦ−１ＦＬ領域およびフランキング配列は完全に決定され、不要の変異の存在は除外された。（Ｂ）繊維状ファージによる機能性ＮＩＦの表示ＴＧ１のようなsu細菌においては、ｐＡＮ−ＮＩＦ−１ＦＬファージミドベクターは、ＮＩＦ−１ＦＬ−pgIII融合タンパク質をコードする機能を有する。ＴＧ１［ｐＡＮ−ＮＩＦ−１ＦＬ］ホスト細胞をいわゆるヘルパーファージで感染させる場合には、この融合タンパク質は形態形成中において、繊維状ビリオン（ファージミドの１つの特定鎖をカプシドで包む擬ビリオンおよびヘルパーファージ）内へ取込むことができる。ファージ粒子は以下のようにして、Ｍ１３−ＶＣＳヘルパーファージ［ストラタジーン（Stratagene）］感染によって救援される。カルベニシリン（またはアンピシリン）１００μg／mlおよびグルコース１％含有する２×ＴＹ（２×ＴＹ:トリプトン１６g／Ｌ;酵母抽出物１０g／Ｌ;ＮａＣｌ５g／Ｌ）中において３７℃で密度（ＯＤ₆₀₀nm）約０.５〜０.６まで増殖させた培養物１mlをＭ１３−ＶＣＳで感染させた（感染多重度：約２０）。この感染培養物を振盪せずに３７℃で３０分間インキュベートした後、振盪下でさらに３０分間インキュベートした。カルベニシリン（１００μg／ml）とカナマイシン（５０μg／ml）を含有する加温２×ＴＹアリコート１０mlに感染培養物１m lを接種した。この混合物を振盪下、３７℃で６０分間インキュベートした後、約３０℃で一夜インキュベートした。感染細胞を遠心分離によって除去した後、２０％ポリエチレングリコール／２.５ＭＮａＣｌの１:５（体積比）混合物を上澄に添加した。氷上で６０分間インキュベートした後、沈澱したファージを遠心分離によって捕集した後、ＰＢＳ（Ｎａ₂ＨＰＯ₄・２Ｈ₂Ｏ１.１４g/Ｌ;ＫＨ₂ＰＯ₄０.２g/Ｌ;ＮａＣｌ８.０g／Ｌ;ＫＣｌ０.２g／Ｌ;ｐＨ７.３）中に再懸濁させた。救援ファージは以下のいくつかのアッセイにおいて機能的に活性なＮＩＦを表示した。（Ａ）ウェスタンブロット法:ＳＤＳ−１０％ＰＡＧＥによって分画した後、ファージタンパク質をプロブロット（ProBlott）膜［アプライド・バイオシステムズ社（Applied Biosystems Inc．）製、フォスターシティー、カリフォルニア］上に移した後、ウサギ抗ファージ血清およびヤギ抗ウサギアルカリ性ホスファターゼ複合体と共にインキュベートした。ＮＩＦ−pgIII生成物に対応するバンドが視識された。（Ｂ）ＣＤ１１b／ＣＤ１８−ＥＬＩＳＡ法（図２２参照）:ＮＩＦファージをＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８に対する結合アッセイに付した（負対照として非表示ファージを用いた）。０.２５μg／ml免疫精製ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８レセプター［ダイアモンドら、J．Cell Biol．第１１１巻、第３１２９頁〜第３１３９頁（１９９０年）参照］を用いる直接固定化、またはモノクローナル抗体ＬＭ２（ＴＡＣＣナンバー：ＨＢ２０４）を用いる免疫捕獲によって、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８で被覆したウェルを調製した。固定化レセプターに対するファージの結合は、ＮＩＦタンパク質を表示するときにのみ観測された。ピキア中で生産された組換えＮＩＦ−１ＦＬ１mＭと共に予め３０分間インキュベートした後、ＮＩＦ−ファージはＬＭ２モノクローナル抗体に結合せず、また、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８で被覆したウェルにも結合しなかった。（Ｃ）３Ｄ２−ＥＬＩＳＡ法（３Ｄ２は、ＮＩＦに対して特異的なマウスの非中和モノクローナル抗体である。実施例２６参照）。非表示性の対照ファージとは対照的に、ＮＩＦ−ファージは３Ｄ２−被覆ウェルに結合した。ＮＩＦ−ファージの結合は、ピキア中で生産された組換えＮＩＦ−１ＦＬ１mＭで３Ｄ２−ウェルをブロックするか、またはＮＩＦ−ファージを３Ｄ２モノクローナル抗体でブロックすることによって切断された。（Ｄ）ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８に対するパンニング法（panning）: ｐＡＮ−ＮＩＦ−１ＦＬファージ（１０¹⁰ビリオン）を無関係な等量の非表示性ファージ（fd−tet;１０¹⁰ビリオン）と混合した後、結合緩衝液（ＰＢＳ、１mＭＣａＣｌ₂、１mＭＭｇＣｌ₂、０.４％Tween−２０および２％スキムミルク）１００μlで希釈し、次いでＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８で被覆したマイクロタイターウェル内でインキュベートした。１２０分間インキュベーションをおこなった後、１mＭＣａＣｌ₂、１mＭＭｇＣｌ₂および０.４％Tween−２０を含有するＰＢＳを用いて１０回洗浄し、結合したファージをグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２.０）と共に１０分間インキュベートすることによって溶出させた。１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）を用いて中和した後、テトラサイクリン耐性（fd−tet）とアンピシリン耐性（ｐＡＮ−ＮＩＦ −１ＦＬ）コロニー形成単位の数を決定した。ｐＡＮ−ＮＩＦファージは非表示性fd−tetファージに比べて３０倍多かった。上記の実験、例えば繊維状ファージ上でのＮＩＦ−１ＦＬの機能表示および結合選択によるこの種のＮＩＦ−ファージの特異的富化等は、より高い親和性を有するＮＩＦ変異体（即ち、天然に存在するアイソフォームおよび合成突然変異体）を同定するためにファージ技法が使用できることを示す。免疫グロブリンの分野における類似の試験によれば、アンサイロストマ・カニナムのＮＩＦタンパク質の非常に広い範囲をファージ上でクローン化させた後、ファージライブラリーを、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８レセプターを標的として用いる数サイクルの連続的な結合選択処理（パンニング）に付すことによって、親和性の最も高いＮＩＦアイソフォームを選択することが可能となる。本発明者による配列に関するデータによれば、成熟ＮＩＦをコードする領域の５’−末端と３’−末端の保存の程度に応じて、ＮＩＦタンパク質の範囲の実質的な部分を救援する変性オリゴヌクレオチドプライマーの設計が可能となる。例えば、所望の長さのＰＣＲ−増幅フラグメントは、プールしたアンサイロストマ・カニナムのｃＤＮＡライブラリーのラムダＤＮＡ標品を、下記のオリゴヌクレオチドのプライマーセットを有する標的として使用することによって調製した：Ｎ−末端を標的化する５’−プライマー:３’−末端に次のマッチング配列を有する３種のプライマーの等モル混合物：ＡＡＴ−ＧＡＡ−ＣＡＣ−ＡＡＣ−ＣＴＧ−ＡＳＧ−ＴＧＣ−３’ ＡＡＴ−ＧＡＡ−ＣＡＣ−ＧＡＣ−ＣＣＡ−ＡＣＧ−ＴＧＴ−３’ ＡＡＴ−ＧＡＡ−ＣＡＣ−ＡＡＡ−ＣＣＧ−ＡＴＲ−ＴＧＣ−３’ （上記配列中、ＳはＣまたはＧを示し、ＲはＡまたはＧを示す）；Ｃ−末端を標的化する３’−プライマー:３’−末端に次のマッチング配列を有する２種のプライマーの等モル混合物：ＴＡＡ−ＣＴＣ−ＴＣＧ−ＧＡＡ−ＴＣＧ−ＡＴＡ−ＡＡＡ−３’ ＴＡＡ−ＣＴＣ−ＴＣＧ−ＡＡＡ−ＣＳＧ−ＡＴＡ−ＡＡＡ−３’ （上記配列中、ＳはＣまたはＧを示す）ＰＣＲプライマーは、適当な表示ベクター内において増幅生成物の一方向のクローン化を容易にする制限部位を組込む５’−エクステンションを有する。（Ｃ）機能的に活性な可溶性ＮＩＦの分泌ＮＩＦ遺伝子（ｐＡＮ−ＮＩＦ−１ＦＬ）を有するファージミド表示ベクターは、ファージ接着型および遊離可溶性のタンパク質におけるＮＩＦ−１ＦＬの生産に適している。ＷＫ６のようなsu-細菌においては、ｐＡＮ−ＮＩＦ−１ＦＬファージミドベクターは、遊離型、即ち、非ファージ接着型のＮＩＦ−１ＦＬタンパク質の合成の指令を出す機能を有する。イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドをＷＫ６［ｐＡＮ−ＮＩＦ− １ＦＬ］培養物に最終濃度が１mＭになる量添加し、Placプロモーターを、一夜誘発させることによりＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８結合活性の増大がもたらされることが、ＬＭ２／ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８プレート上でのＥＬＩＳＡによって明らかになった（このアッセイは、ＨＲＰ複合モノクローナル抗体３Ｄ２を用いておこなった）。組換えＮＩＦ−１ＦＬタンパク質は、誘発培養物の上澄および誘発細胞の超音波処理物の清澄化によって調製された全細胞溶解物のいずれにおいても検出された。このＥＬＩＳＡシグナルを、ピキア中で生産された既知量のｒＮＩＦ１によって発生したシグナルと比較することによって、ｒＮＩＦタンパク質が大腸菌培養物１リットルあたり約１mg蓄積することが判明した。ｒＮＩＦタンパク質は、誘発されたＷＫ６［ｐＡＮ−ＮＩＦ−１ＦＬ］細胞のフレンチプレスによる溶解物を出発原料とする３Ｄ２−エンファーゼ（Emphaze）カラムを用いて免疫精製した。低ｐＨでの溶出物は、ＬＭ２／ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８ＥＬＩＳＡによれば、活性を示した。大腸菌rＮＩＦタンパク質はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上においてシャープなバンドを示し、イムノブロット分析においては、ウサギ抗ピキア− rＮＩＦ１血清によって検出された。実施例２４ピキア中で生産されたＮＩＦの別の精製法細胞不含上澄を濾過し（０.２μm）、濾液を、１mＭＥＤＴＡを含有する５０mＭクエン酸（ｐＨ３.５）１０容量部を用いるポリエーテルスルホンオメガ膜（フィルトロン社製；カットオフ値３０ｋＤａ;０.７５平方フィート）上での限外濾過（diafiltration）処理に付した。１Ｍトリス−ＨＣｌの添加によってｐＨを７.４に調整した後、溶液を氷上に少なくとも１時間放置した。沈澱物は濾去した（０.２μm）、清澄上澄を２回目の透析濾過処理に付した［１０容量部の１０mＭリン酸塩溶液（ｐＨ７.４）］。その後、塩化ナトリウムを最終濃度が０ .３mＭになるまで添加した。この溶液を、１０mＭリン酸塩溶液（ｐＨ７.４）を用いて平衡にしたマクロプレプ（MacroPrep）（４０μm）ヒドロキシアパタイト［バイオーラド・ラボラトリーズ社（Bio−Rad Laboratories）製]カラム（０. ３ｍＭＣａＣｌ₂含有）にかけた。カラムの５倍容量の平衡緩衝液を用いて洗浄した後、９０mＭリン酸塩溶液（ｐＨ７.４）を用いて組換えＮＩＦタンパク質を溶出させた。組換えＮＩＦを含有するフラクションはＬＭ２／ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８プレート上での結合アッセイによって同定し、貯留した。貯留したフラクション中に含まれるタンパク質は、１０mＭギ酸アンモニウム溶液（ｐＨ６.４）および１０％アセトニトリル溶液を用いて平衡にした多孔性Ｒ１／Ｈカラム［パーセプティブーバイオシステムズ社（Perseptive Biosystems）製］上での逆相クロマトグラフィーによってさらに精製した。組換えＮＩＦは、アセトニトリルの濃度を増加させることによって溶出させた。ＮＩＦ含有フラクションはゲル電気泳動法によって同定し、貯留した。この貯留液中のアセトニトリルは凍結乾燥前に回転蒸発機を用いて除去した。乾燥したタンパク質はＰＢＳに再溶解させた後、ＰＢＳ中で平衡にしたスーパーデックス２００ゲル濾過カラム（ファルマシア）にかけた。ＮＩＦタンパク質を含有するフラクションを貯留し、オメガ膜（フィルトロン社製；カットオフ値１０ｋＤａ）を用いる限外濾過によって濃縮した。組換えＮＩＦタンパク質は−８０ ℃で保存した。実施例２５ＮＩＦ−１ＦＬの機能性誘導体のピキア−パストリス中での発現（Ａ）ｐＭａ５−hＮＩＦ１およびｐＭｃ５−hＮＩＦ１発現構造体（Expression Construct）ＮＩＦをコードするＤＮＡのセグメントは、コーディング領域の５’末端と３ ’末端に対して特有のプライマーを用いることによって、ブルースクリプト（Bl uescript）II（ストラタジーン社製；ラジョラ、カリフォルニア）中におけるＮＩＦ−１ＦＬのサブクローンからＰＣＲ増幅させた。５’−プライマーは２つの制限部位（ＥcoＲＩおよびＨpaＩ）、タンパク質分解的に処理されたＮＩＦの５’末端から始まる最初の２３個のヌクレオチドおよびこれに続く８個のコドンから成る。成熟ＮＩＦの最初の残基に対するコドンはＡＡＴからＡＡＣに変化し（両方のコドンはアスパラギンに翻訳される）、Ｈpa Ｉ制限部位（ＧＴＴ／ＡＡＣ）の一部を構成する。使用した５’−プライマーの配列は５’−ＣＣＧ−ＧＡＡ−ＴＴＣ−ＧＴＴ−ＡＡＣ−ＧＡＡ−ＣＡＣ−ＡＡＣ−ＣＴＧ−ＡＧＧ−ＴＧＣ−ＣＣである。３’−プライマーは実施例１２（Ｂ）に示した。増幅は、各々のプライマー１００pmol、１×ベント緩衝液中のベントポリメラーゼ（ニューイングランド・バイオラブズ社製、ビバリー、マサチューセッツ）２単位並びにｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを各々０.２mＭを用いておこなった。ブルースクリプトII含有ＮＩＦ−１ＦＬ１０ngを鋳型ＤＮＡとして使用した。ＰＣＲ条件は２０回の全サイクルに対して同じ条件を用いた:９５℃での変性／１分間、６０℃でのプライマーアニーリング／１分間および７２ ℃での増幅／１.５分間。増幅生成物はゲルを用いて精製した後、ＥcoＲＩとHin dIIIを用いて消化した。増幅生成物は、標準的な方法によって、ＥcoＲＩ−HindIIIでの切断したｐＭａ５−８およびｐＭｃ５−８にそれぞれ連結させた［スタンセンスら、Nucl．Ac ids Res.、第１７巻、第４４４1頁〜第４４５４頁（１９８９年）参照］。アンピシリンおよびクロラムフェニコールに対してそれぞれ耐性を示す細胞を適当なプレート上において選択して採取した。制限とＤＮＡ配列解析に基づき、得られたプラスミドクローン、ｐＭａ５−ｈＮＩＦ１およびｐＭｃ５−ｈＮＩＦ１の各々の適切な挿入断片配列を選択した。（Ｂ）ｐＭａ５−ｈＮＩＦ１／△Ｇ１１−５の構築ＮＩＦ−１ＦＬタンパク質は５個の潜在的なＮ（アスパラギン）−グリコシル化部位（共通のＮ−Ｘ−Ｔ／Ｓアミノ酸配列）を有する。ｐＭａ５−ｈＮＩＦ１／△Ｇ１１−５は前述のｐＭａ５−ｈＮＩＦ１の誘導体である。この場合、ＮＩＦ−１ＦＬの５個の潜在的なＮ−グリコシル化部位は、対応する共通配列中の各々のアスパラギン残基でグルタミン残基を置換することによって修飾されている。これらの残基はAsn¹⁰、Asn¹⁸、Asn⁸⁷、Asn¹¹⁰およびA sn¹³⁰である。この場合、右上の数字は、ＮＩＦ−１ＦＬのアミノ酸残基の数に相当する（図８参照）。逐次的な部位特異的変異誘発は、スタンセンスらの報文［ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucl．Acids Res．）、第１７巻、第４４４１頁〜第４４５４頁（１９８９年）参照］に記載の手順に従い、次のオリゴヌクレオチドを用いておこなった：（Ｉ）△Ｇ１１:ｄＣＣＧＧＧＣＡＴＴＴＣＧＧＴＡＣＣＴＴＧＣＴＧＣＧＧＧＣＡＣＣＴＣ，（II）△Ｇ１２:ｄＣＣＴＡＡＴＣＧＡＧＴＣＴＴＧＧＡＡＣＣＣＧＧＧＣＡＴＴＴＣＴＧＴＴＣＣ，（III）△Ｇ１３:ｄＡＡＣＴＧＴＣＣＧＡＧＣＡＴＴＧＴＣＧＴＧＣＡＣＴＣＡＴＧＴＡＧＧＣＧＣＴＴＴＴＴＴＣ，（IV）△Ｇ１４:ｄＣＡＧＡＧＣＴＴＣＡＧＡＧＡＴＣＴＧＧＴＴＴＧＡＧＴＴＴＴＣＧ，（Ｖ）△Ｇ１５:ｄＣＴＣＣＴＴＣＴＴＴＴＧＴＴＴＴＣＴＧＣＡＧＧＴＴＧＡＡＡＧＣＣＴＣ。最初の変異誘発過程においては、オリゴヌクレオチドＩ、IVおよびＶを単鎖ＤＮＡ（ssＤＮＡ）鋳型ｐＭａ５−hＮＩＦ１と共にアニールすることによって、対応するグリコシル化部位Ｇ１１、Ｇ１４およびＧ１５を修飾した。３個の所望の変更部位を有する得られたプラスミドクローンを使用することによって、次の変異誘発過程用のssＤＮＡ鋳型を調製し、該鋳型と適当なオリゴヌクレオチド（IIおよびIII）を用いて残存部位Ｇ１２およびＧ１３を修飾した。（Ｃ）ｐＭａ５−ＮＩＦ−１ＦＬ／△ｈ、Ｇ１６−７の構築上記の（Ｂ）の手順に準拠し、別のＮＩＦ−１ＦＬ誘導体ｐＭａ５−ＮＩＦ− １ＦＬ／△ｈ、Ｇ１６−７を構築した。この場合、ＮＩＦ−１ＦＬの潜在的なＮ −グリコシル化部位Ｇ１６およびＧ１７は、対応する共通配列における各々のアスパラギン残基でグルタミン残基を置換することによって修飾した。これらの残基はAsn¹⁹⁷およびAsn²²³である。さらに、ＮＩＦ−１ＦＬコーディング配列中に存在するＨpaＩ制限部位（ＧＴＴＡＡＣ）は、サイレント突然変異を適当な位置に導入することによって除去した。Asn¹⁶⁶に対するＡＡＣコドンはＡＡＴコドンによって代替させた。逐次的な部位特異的変異誘発は、スタンセンスらの上記報文に記載の手順に従い、次のオリゴヌクレオチドを用いておこなった：（VI）△Ｇ１６:ｄＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＴＣＡＧＴＴＴＴＣＴＧＴＡＴＴＴＴＣＧＧＧＴＡＧＴＧＧＣ，（VII）△Ｇ１７:ｄＧＧＡＴＣＣＧＣＡＧＡＣＧＴＣＧＴＴＴＧＧＴＣＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴＧ，（VIII）△ｈ :ｄＣＴＣＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＡＴＴＡＡＣＡＡＣＴＧＣＧＣ。最初の変異誘発過程においては、オリゴヌクレオチドVIIおよびVIIIをssＤＮＡ鋳型に対して一緒にアニールすることによってグリコシル化部位Ｇ１７を修飾すると共に、ＨpaＩ制限部位を除去した。２個の所望の変更部位を含有する得られたプラスミドクローンを使用することによって、次の変異誘発過程用のssＤＮＡ鋳型を調製し、該鋳型と適当なオリゴヌクレオチド（VI）を用いて残存部位Ｇ１６を修飾した。（D）ｐＭａ５−ｈＮＩＦ１／△ｈ、Ｇ１１−７の構築ＮＩＦ−１ＦＬの誘導体hＮＩＦ１／△ｈ、Ｇ１１−７を標準的な方法により、ベクターｐＭａ５−ｈＮＩＦ１／△Ｇ１１−５（前記（Ｂ）のようにして調製）とｐＭａ５−ＮＩＦ１ＩＦＬ／△ｈ、Ｇ１９−７（前記（Ｃ）のようにして調製）から調製された適当なフラグメントを組合せることによって構築した。ベクターｐＭａ５−ＮＩＦ−１ＦＬ／△ｈ、Ｇ１６−７から調製されたフラグメントであって、前記（Ｃ）に記載の３個の置換部を有する３６１bpAgeＩ−HindIIIフラグメントを、ベクターｐＭａ５−ｈＮＩＦ１／△Ｇ１１−５から調製された大きなAgeＩ−HindIIIベクターフラグメント内へクローン化させ、該ベクターの対応する３６１bpAgeＩ−HindIII野性型ＮＩＦ−１ＦＬフラグメントを置換した。得られたプラスミドｐＭａ５−ｈＮＩＦ１／△ｈ、Ｇ１１−７中に７個のAsn ／Gln置換部および修飾されたHpaＩ制限部位（Asn¹⁶⁶コドン修飾）が存在することは、完全なＮＩＦ挿入断片の配列解析によって確認された。この配列解析によって明らかになったＮＩＦ配列中の１個の塩基対の欠失（Gly²⁰¹ＧＧＡコドン中のＧヌクレオチドの欠失）は、オリゴヌクレオチドｄＧＴＡＡＡＴＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＴＣＡＧＴＴＴＴＣＴＧを用いる部位特異的変異誘発によって修正した。（Ｅ）ｐＹＡＭ７ＳＰ−ｈＮＩＦ１／△Ｇ１１−５の構築およびピキア・パストリス中での発現ｈＮＩＦ１／△Ｇ１１−５をコードするＤＮＡセグメントを、実施例１２（Ｂ）に記載の手順に準拠し、同一のプライマーセットを用いて、ｐＭａ５−ｈＮＩＦ１／△Ｇ１１−５のサブクローンからＰＣＲ増幅した。増幅生成物は精製後、Spe Ｉを用いて消化し、次いで、標準的な方法によってStuＩ−SpeＩで切断したｐＨＩＬ７ＳＰ８に連結させた。この連結反応混合物を用いて大腸菌ＷＫ６を形質転換し、アンピシリンプレート上でアンピシリン耐性クローンを得た。制限とＤＮＡ配列解析に基づき、得られたプラスミドクローンの１種ｐＹＡＭ７ＳＰ− ｈＮＩＦ１／△Ｇ１１−５の適切な挿入断片配列を、実施例１２（Ｂ）に記載のようにして選択し、ピキア−パストリス酵母菌株ＧＴＳ１１５（his４）を形質転換した。His形質転換体の選択とその後のＮＩＦ−１ＦＬ／△Ｇ１１−５発現に対する選択は、実施例１２（Ｂ）に記載のようにしておこなった。ピキア細胞上澄中のＮＩＦ−１ＦＬ／△Ｇ１１−５は、３Ｄ２−ＨＲＰ検出を伴うＬＭ２／ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８に基づくＥＬＩＳＡによって定量した（実施例１参照）。（Ｆ）ｐＹＡＭ７ＳＰ−ｈＮＩＦ１／△ｈ、Ｇ１１−７の構築およびピキア・パストリス中での発現ｈＮＩＦ１／△ｈ、Ｇ１１−７をコードするＤＮＡのHpa１−SpeＩフラグメントを、ベクターｐＭａ５−ｈＮＩＦ１／△ｈ、Ｇ１１−７から調製し、標準的な方法により、StuＩ−SpeＩで切断したｐＨＩＬ７ＳＰ８と連結させた。この連結反応混合物を用いて大腸菌ＷＫ６を形質転換し、アンピシリンプレート上でアンピシリン耐性クローンを得た。制限とＤＮＡ配列解析に基づき、実施例１２（Ｂ）に記載のようにして、得られたプラスミドクローンの１種ｐＹＡＭ７ＳＰ−h ＮＩＦ１／△ｈ、Ｇ１１−７中の適切な挿入断片配列を選択し、ピキア・パストリス酵母菌株ＧＴＳ１１５（his４）を形質転換した。His形質転換体の選択とその後のＮＩＦ−１ＦＬ／△ｈ、Ｇ１１−７発現に対する選択は実施例１２（Ｂ）に記載のようにしておこなった。ピキア細胞上澄中のＮＩＦ−１ＦＬ／△ｈ、Ｇ１１−７は、３Ｄ２−ＨＲＰ検出を伴うＬＭ２／ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８に基づくＥＬＩＳＡによって定量した（実施例１参照）。（Ｇ）組換えＮＩＦ−１ＦＬ／△Ｇ１１−５および組換えＮＩＦ−１ＦＬ／△ ｈ、Ｇ１１−７の精製と特性評価メタノール誘発を４８時間おこなった後、遠心分離（１８００×g；１５分間）によってピキア細胞上澄を得た。組換えＮＩＦ−１ＦＬ／△Ｇ１１−５は実施例２３に記載の方法によって精製した。組換えＮＩＦ−１ＦＬ変異体は、非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ノベックス社製;４〜２０％傾斜ゲル）上において、見かけの分子量３６〜５０ｋＤａで移動した。このバンドは、ピキア中で生産された野性型ＮＩＦ−１ＦＬに比べて、より明確に分離し、また、非常に高い移動度を示した。組換えＮＩＦ−１ＦＬ／△ｈ、Ｇ１１−７はヒドロキシアパタイトおよび逆相クロマトグラフィーによって精製した（実施例２３参照；但し、スーパーデックス上でのゲル濾過過程は省略した）。非還元性条件下において、精製したタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ノベックス社製;４〜２０％傾斜ゲル）上において単一のバンドとして移動した（見かけの分子量:約３０ｋＤａ）。ＮＩＦ−１ＦＬ／△Ｇ１１−５とＮＩＦ−１ＦＬ／△ｈ、Ｇ１１−７はＮＩＦ−１ＦＬに比べてより高い移動度とより低い不均質性を示したが、これは、野性型タンパク質に比べてこれらの変異体のグリコシル化度が比較的低いことに起因する。両方の変異体は、プラスチック接着アッセイによって評価した（実施例２３参照）。この結果、７個の潜在的なＮ−グリコシル化部位の一部または全部を除去しても、この生体外アッセイによって評価されるようなＮＩＦ−１ＦＬ分子の特性は影響を受けないことが判明した。実施例２６ＮＩＦに対するモノクローナル抗体の調製ＮＩＦに結合するＭＡbsを生産するハイブリドーマを、次の文献に記載の方法に従い、ピキア中で生産された組換えＮＩＦ−１ＦＬを用いて免疫にしたマウスから調製した：ソウル（Ｈ．Ｒ．Soule）、リンダー（Ｅ．Linder）およびエジントン（Ｔ．Ｓ．Edgington）、プロシーデイングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Proc．Natl．Acad．Sci．ＵＳＡ）、第８０巻、第１３３２頁（１９８３年）；ケーラーおよびミルスタイン、ネイチャー（ロンドン）、第２５６巻、第４９５頁（１９７５年）。生後８〜１５週間の雌のbalb−cマウスに、完全フロインドアジュバントに加えた組換えＮＩＦ（実施例１２で調製）１０μgを皮下接種し、３週間後、不完全フロインドアジュバントに加えた組換えＮＩＦ１０μgを皮下接種し、２週間後、ミョウバン４mgに加えた組換えＮＩＦ１０μgを腹膜内接種し、３〜４週間後であって融合の４日前、塩類液に加えた組換えＮＩＦ１０μgを腹膜内接種した。組換えＮＩＦに対するポリクローナル抗体を生産するマウスは、¹²⁵Ｉで標識化した組換えＮＩＦおよびヤギの固定化抗マウスＩgＧを用いる血清のイムノアッセイによって決定した。１：２５０００〜１:５００００のタイターを示すマウスを選別した。選別したマウスから脾臓細胞を採取し、腫瘍細胞と融合させた（脾臓細胞:腫瘍細胞＝５：１）。ＮＩＦに結合するモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマ細胞を上記のイムノアッセイ法によって選別した。５×１０⁶個のハイブリドーマ細胞を、プリスタンで処置された雌のbalb−cマウスに腹膜内接種した。１種のモノクローナル抗体（３Ｄ２）が鉤虫から誘導されたＮＩＦおよびピキア中で生産された組換えＮＩＦ−１ＦＬに結合することは、抗原捕獲アッセイによって確認された［ハーロー（Ｅ．Harlow）およびレーン（Ｄ．Ｐ．Lane）、「抗体:実験マニュアル（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８８年）」、第１９２頁〜第１９３頁参照］。実施例２７３Ｄ２マウスモノクローナル抗体と「エンファーゼ・バイオサポート媒体（Em phaze Biosupport Medium）」とのカップリング（A）一段階法３Ｄ２抗体２８mgを０.５mlまで濃縮し、該濃縮物に０.６Ｍ炭酸ナトリウムおよび０.１Ｍクエン酸ナトリウムの溶液（ｐＨ９.０）を添加した。乾燥したエンファーゼ・バイオサポート媒体（３Ｍ社製；セントポール、ミネソタ）３１５mg を抗体溶液に加え、回転下で１時間混合した。エンファーゼスラリーをプラスチックフリット上に捕獲し、残存する抗体溶液を排出させた。この樹脂を、１０m Ｍリン酸ナトリウムおよび０.１５Ｍ塩化ナトリウムの溶液（ｐＨ７.３）２０ml を用いて洗浄した。捕集した樹脂をエタノールアミン３.０Ｍ溶液（ｐＨ９.０）と回転下で２.５時間混合した。この樹脂をフリット上に再び捕集し、１０mＭリン酸ナトリウムおよび０.１５Ｍ塩化ナトリウムの溶液（ｐＨ７.３）を用いて洗浄した。洗浄処理は、フリットから流出する液のｐＨが７.３になるまでおこなった。得られた樹脂は、１０mＭリン酸ナトリウム、０.１５Ｍ塩化ナトリウムおよび０.０５％アジドナトリウムの溶液（ｐＨ７.３）中に使用に供するまで保存した。この方法によって得られた３Ｄ２／エンファーゼ樹脂結合物２mlは精製したＮＩＦタンパク質１.４mgに結合することが判明した。（B）二段階法３Ｄ２抗体３０mgを０.５Ｍトリス−ＨＣｌ溶液（ｐＨ４.０）を用いて透析し、５.０ml（６mg／ml）まで濃縮した後、４℃まで冷却した。エンファーゼ・バイオサポート媒体３１５mgを抗体溶液に添加し、４℃において回転下で１０分間混合した。硫酸ナトリウムを最終濃度が０.８Ｍになるまで添加し（５６３mg）、エンファーゼスラリーと共に４℃でさらに１０分間十分に混合した。１ＭＮａＯＨ溶液を滴下することによってｐＨを９.０まで高めた。カップリング反応は、攪拌下、４℃において６０分間おこなった。エンファーゼスラリーをプラスチックフリット上に捕集し、残存する抗体溶液を排出させた。この樹脂を１０m Ｍリン酸ナトリウムおよび０.１５Ｍ塩化ナトリウムの溶液（ｐＨ７.３）２０ml を用いて洗浄した。１.０Ｍエタノールアミン溶液（ｐＨ９.３）６mlの添加によってカップリング反応を停止させ、系を４℃において回転下で２.５時間混合した。この樹脂をフリット上に再び捕集した後、０.２Ｍリン酸ナトリウムおよび０.５Ｍ塩化ナトリウムの溶液（ｐＨ７.３）を用いて洗浄した。この洗浄処理は、フリットからの流出液のｐＨが７.３になるまでおこなった。得られた樹脂は、０.０１Ｍリン酸ナトリウム、０.１５Ｍ塩化ナトリウムおよび０.０５％（w／ v）アジドナトリウムの溶液（ｐＨ７.３）中に、使用に供するまで懸濁させて保存した。この方法によって調製された３Ｄ２／エンファーゼ結合カラム２mlには、精製したＮＩＦタンパク質１.５mgが結合した。（Ｃ）カップリング反応のスケールアップすべての容量と重量を１０倍にスケールアップし、両方のカップリング方法に従って、樹脂２０mlを調製した。両方の方法により、ＮＩＦタンパク質に対して結合能を有する樹脂が得られた。二段階法によって得られた３Ｄ２／エンファーゼ樹脂カラム２０mlには、２mlカラムに比べて１０倍以上のＮＩＦタンパク質が結合した。即ち、前者および後者に対する該タンパク質の結合量はそれぞれ１５〜１９mgおよび１.５mgであった。一方、一段階法で得られた３Ｄ２／エンファーゼ樹脂カラム２０mlには、スケールアップに対応した量のＮＩＦタンパク質は結合しなかった（該タンパク質の典型的な結合量は５〜８mgであった）。このため、二段階法を利用してスケールアップしたカップリング反応をおこなった。１５０ml二段階カップリングを次の様にしておこなった。０.５Ｍトリス−ＨＣｌ４５０ml（ｐＨ４.０）に３Ｄ２抗体２.２５gを加えた溶液を、１０００m lのミクロキャリアースピナーフラスコ［ベルコ・グラス社（Be11co Ｇ1ass Inc ．）製;バインランド、ニュージャーシー］内のエンファーゼ・バイオサポート媒体１９gと４℃で１０分間混合した。硫酸ナトリウム４２gをこのエンファーゼスラリーに添加し、４℃でさらに１０分間攪拌した。１ＭＮａＯＨ溶液をスピナーフラスコのアームを通して滴下することによって系のｐＨを９.０に高めた。反応は攪拌下、４℃で６０分間おこなった。エンファーゼスラリーを９０mmの０.４５ミクロンフィルター［コ−ニング・グラス・ワークス社（Corning Ｇlas s Works）;コーニング、ニューヨーク］上に捕集し、残存する抗体溶液を排出させた。この樹脂を、０.０１Ｍリン酸ナトリウムおよび０.１５Ｍ塩化ナトリウムの溶液（ｐＨ７.３）１リットルを用いて洗浄した。反応は、１.０Ｍエタノールアミン溶液（ｐＨ９.３）５００mlを添加することによって停止させた。この停止反応は、攪拌下、４℃で２.５時間おこなった。この樹脂を９０mmの０.４５ミクロン酢酸セルロースフィルター上に捕集し、０.２Ｍリン酸ナトリウムおよび０.５Ｍ塩化ナトリウムの溶液（ｐＨ７.３）を用いて洗浄した。この洗浄処理は、フィルターからの流出液のｐＨが７.３になるまでおこなった。樹脂は０.０１Ｍリン酸ナトリウム、０.１５Ｍ塩化ナトリウムおよび０.０５％アジドナトリウムの溶液（ｐＨ７.３）中に使用に供するまで懸濁して保存した。このカップリングによって得られた樹脂２mlにはＮＩＦタンパク質が１.５mg結合した。同量のＮＩＦタンパク質は２ml反応において得られた樹脂に結合した。実施例２８３Ｄ２／エンファーゼ免疫親和性クロマトグラフィーカラムを用いることによる組換えＮＩＦタンパク質の精製組換えＮＩＦタンパク質を含有する細胞上澄をサルトブラン（Sartobran）ＰＨ０.０７ミクロンデッドエンドフィルター［サルトリウス・ノース・アメリカ社（Sartorius North America）製;ボヘミア、ニューヨーク］を用いる濾過処理に付した後、１０ｋＤａミニサルト（Minisart）ポリスルホン膜モジュールを有するミニ十字流システム（サルトリウス社製）を用いる接線流濾過によって１０〜５０倍に濃縮した。ミニ十字流装置内において、濃縮物を、０.０１Ｍリン酸ナトリウムおよび０.１５Ｍ塩化ナトリウムの溶液（ｐＨ７.３）５容量部用いる透析濾過処理に付した。濃縮物は、３Ｄ２／エンファーゼカラムにかける直前に、９０mmの０.２２ミクロン酢酸セルロースフィルター（コーニング社製）を用いる濾過処理に付した。ＮＩＦタンパク質約１５０mqを２０ml／分の流速で３Ｄ２／エンファーゼカラム４００mlを用いて処理した。濃縮物は０.１Ｍリン酸ナトリウムおよび０.１５Ｍ塩化ナトリウムの溶液（ｐＨ７.３）４００mlを用いて２０ ml／分の流速でカラムから溶出させた。カラムからの溶出液を捕集し、保存した。カラムを１ＭＮａＣｌ溶液４００mlを用いて洗浄し、洗液は廃棄した。カラムに結合した組換えＮＩＦタンパク質は、０.１Ｍグリシン溶液（ｐＨ２.５）８００mlを用いて溶出させた。溶出後、カラムからの精製ＮＩＦタンパク質に１Ｍトリス塩基溶液を滴下して中和した。０.１Ｍリン酸ナトリウムおよび０.１５Ｍ塩化ナトリウムの溶液（ｐＨ７.３）８００mlをカラムに通すことにより該カラムを平衡化させて再使用に供した。このカラム処理は、カラムからの流出液のｐＨが７.３になるまでおこなった。３Ｄ２／エンファーゼカラムによって、ＮＩＦタンパク質が約１g精製されたときに、精製タンパク質を貯留し、イーズィーフロー（Easyflow）２０ｋＤＡポリスルホン濃縮装置（サルトリウス社製）を用いて濃縮した。濃縮タンパク質はファルマシア社（ピスケートウェイ、ニュージャージー）製の６０cm×６００cm のスーパーデックス２００prepゲル濾過カラム［０.０１Ｍリン酸ナトリウムおよび０.１５Ｍ塩化ナトリウムの溶液（ｐＨ７.３）を用いて平衡化させた］を用いて処理した（流速１０ml／分）。溶出中（８７０〜１０５０ml）に観測された唯一のピークはＮＩＦタンパク質に対応した。実施例２９好中球抑制因子は、血管内皮細胞に対する好酸球の接着のインヒビターである。サイトカインで刺激された内皮細胞に対するヒト好酸球の接着についてのＮＩＦの効果をアッセイした。好酸球はモサー（Moser）らの報文［ジャーナル・オブ・イムノロジー第１４９巻、第１４３２頁〜第１４３８頁（１９９２ａ）］に記載の方法により、正常なヒトから単離した。単離された好酸球は、モサーらの上記報文に記載の方法に従い、１０ｐＭＧＭ−ＣＳＦおよび１０ｐＭＩＬ−３の存在下において２４時間培養した。へその緒の静脈から内皮細胞を採取し、組織培養フラスコ内へ接種した後、２４−ウェルプレートに移した（モサーらの上記報文参照）。接着アッセイは、モサーらの上記報文に記載の方法に従い、次の様にしておこなった。ヒトのへその緒の静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の単層を、ハンクス（Hank's）の平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）を用いて洗浄した後、ＴＮＦα５００μlと共に、最終濃度が１０ng／mlになるまで３７℃で４時間前保温した。ＨＵＶＥＣ単層は、接着アッセイに供する直前に洗浄した。次いで、ヒトの精製アルブミンを５mg／ml含有するＨＢＳＳ５００μl中の好酸球（２.５×１０⁵）を、洗浄したＨＵＶＥＣ単層上に載置した。３７℃で飽和湿度、５％ＣＯ₂の条件下において３０分間インキュベートした後、２４−ウェルプレートをＰＢＳ３００ml浴中に３回浸漬させることによって、弱く接着した好酸球を除去した。このプレートを４℃で乾燥させた後、接着好中球の数を、ペルオキシダーゼ活性の測定によって求めた［モサーら、ブロッド、第７９巻、第２９３７頁（１９９２ｂ）参照］。組換えＮＩＦ（ｒＮＩＦ）は、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３で開始されたヒト好中球のＴＮＦ−活性化ＨＵＶＥＣ単層に対する接着を、１００ｎＭで最大で約６３％抑制した。約１０nＭのｒＮＩＦの存在下では、約５０％の接着が抑制された（図１３参照）。実施例３０白血球に対するＮＩＦの結合ＮＩＦと白血球の相互作用を、ビオチン化組換えＮＩＦを用いる流動細胞計測法によってアッセイした。ビオチン化ｒＮＩＦは、鉤虫のホモジネートから精製ＮＩＦを誘導する場合の前記方法に従って調製した。但し、この場合には、ビオチン−ＩＣ−ヒドラジドの最終濃度が０.１４mＭになる条件下でｒＮＩＦを誘導した。ヒト白血球の軟層調製物を牛の新生児血清２％およびＮａＮ₃ １％含有液（ＰＢＳ−ＮＣＳ)中に懸濁させ、ビオチン化ｒＮＩＦ（０.６μg／ml）と共に室温で５分間インキュベートした。細胞をＰＢＳ−ＮＣＳ１mlを用いて２回洗浄した後、ストレプタビジンーフィコエリトリン［ファルミンゲン（Pharmingen）社製]を０.２５μg／ml含有する洗浄緩衝液（ＰＢＳ中に牛の新生児血清５％およびＮａＮ₃ ０.１％含有する溶液）５０μl中に再懸濁させた。４℃で１５分間放置した後、細胞を洗浄し、洗浄緩衝液０.５mlに再懸濁させた。ライシス（Lysys）IIソフトウェアを用いるＦＡＣＳcan装置［ベクトン・デッキンソン社（Becton Dick inson）製］を利用することによつて、フローサイトメトリーをおこなった。白血球の集団は、直角方向に前進する光スキャッターのサイトグラム（cytogram）を用い、コンピューターでゲート制御（gate）した。バックグラウンド結合はビオチン化ＢＳＡ［ピアース社（Pierce）製］を用いて測定した。リンパ細胞（パネルＡ、ＤおよびＧ）、単球（パネルＢ、ＥおよびＨ）および顆粒細胞（パネルＣ、ＦおよびＩ）に対するビオチン化ｒＮＩＦの結合は流動細胞計測法によって分析した（図２４参照）。細胞のタイプは、直角方向に前進する光スキャッターのサイトグラムを用い、コンピューターでゲート制御した。パネルＡ−Ｃは、ビオチン化ＢＳＡを用いる負の対照反応を示し、パネルＤ−Ｆは、ビオチン化ｒＮＩＦを用いたときの反応性を示し、また、パネルＧ〜Ｉは、５０倍モル過剰の未誘導体化ｒＮＩＦの存在下でビオチン化ｒＮＩＦを用いたときの反応性を示す。全反応はストレプトアビジン−フィコエリトリンを用いて開始させた。細胞の数を縦軸に示し、蛍光強度を横軸に示す。ゲート制御された顆粒細胞と単球は、ＢＳＡ−ビオチン対照に比べて、ビオチン化ｒＮＩＦに９５％以上多く結合することが判明した（図２４参照）。これに対して、ｒＮＩＦは、末梢血管のリンパ球のわずかな離散状集団をもたらした。ＮＩＦの細胞結合は特異的である。何故ならば、ビオチン化ｒＮＩＦを５０倍モル過剰の未誘導体ｒＮＩＦと共保温することにより、３種類の白血球細胞集団との反応が停止するからである（図２４参照）。これらの白血球細胞の各集団内に、ＮＩＦと特異的に結合する細胞が存在することをこれらのデータは示す。実施例３１ＮＩＦ結合とＣＤ１１ｂ/ＣＤ１８発現の直接的コンコーダンス（concordance ）ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８（ＬＭ２；ＡＴＣＣ♯ＨＢ２０４）に対する抗体を使用する二元反応流動細胞計測実験をおこなうことによって、ＮＩＦに結合したリンパ球集団のＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８発現を調べた。ビオチン化ｒＮＩＦで染色した白血球を実施例３０に記載の方法によって処理した。これらの実験においては、ＬＭ２（１μg／ml）をリンパ球の全調製物およびビオチン化ｒＮＩＦと共にインキュベートした。赤血球を溶解させて洗浄した後、リンパ球を、ＦＩＴＣを複合化させたヤギ（Fab'）₂抗マウスＩgＧ［カルタグ社（caltag）製］３５μg／m lおよびストレプタビジンーフィコエリトリンと反応させた。ＮＩＦ結合とＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８発現の直接的コンコーダンスは二元蛍光分析、即ち、ｒＮＩＦ結合と抗−ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８モノクローナル抗体ＬＭ２の結合に関する末稍血管リンパ球の集団を、直角方向に前進する光スキャッターのサイトグラムを用いてコンピュータでゲート制御する流動細胞計測法によって確認された。ｒＮＩＦに反応性を示す全ての細胞はＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８に対して正であった（図２５参照）。これらの実験によって、ＮＩＦに結合したリンパ球およびＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８を発現させたリンパ球との間の直接的コンコーダンスが実証された（図２５参照)。これらの結果は、インテグリンＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８が、白血球上でのＮＩＦに対する結合部位であることの有力な証拠である。実施例３２ＮＩＦは、ＣＤ１１ｂポリペプチドのＩ−ドメインの一部に結合する。ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８インテグリンのＩ−ドメイン（＝Ａドメイン）の一部は、残基Cys¹²⁸とGly³²¹に近接して結合したＣＤ１１ｂポリペプチドセグメントを含む［ミチシタ（Michishita,Ｍ）、ビデム（Videm,Ｖ）およびアーノート（Arn aout,Ｍ．Ａ．）、セル（Cell）、第７２巻、第８５７頁〜第８６７頁（１９９３年）参照］。ＮＩＦとＩ−ドメインペプチドとの直接的相互作用を証明するために、Ｉ−ドメインのペプチドを可溶性の組換え融合ペプチドとして大腸菌細胞内で発現させた。融合ペプチドは８つのアミノ酸標識ペプチド（ＦＬＡＧ）である。Ｉ−ドメインをクローン化するのに用いたＰＣＲプライマーはＣＤ１１ｂポリペプチドのアミノ酸配列（Gly¹¹¹−A1a³¹⁸）に基づいた。プライマーの配列は５’−ＣＣＡ−ＡＡＧ−ＣＴＴ−ＧＧＡ−ＴＣＣ−ＡＡＣ−ＣＴＡ−ＣＧＧ−ＣＡＧ−ＣＡＧ−ＣＣ−３’（プライマー１）および５’−ＣＣＡ−ＴＣＴ−ＡＧＡ−ＣＧＣ −ＡＡＡ−ＧＡＴ−ＣＴＴ−ＣＴＣ−ＣＣＧ−ＡＡＧ−ＣＴ−３’（プライマー２）である。プライマー１は付加的な５’−HindIII制限エンドヌクレアーゼ部位を有しており、また、プライマー２は付加的な３’−XbaＩ部位を有する。ヒトの単球全ＲＮＡから合成されたランダム開始単鎖ｃＤＮＡ［ｃＤＮＡ合成プラス、アマーシャム社（Amersham）製］と共にこれらのプライマーは対にして使用した（プロトコルとしては実施例１０参照）。出発物質としては、ヒトの単球を使用した（約０．５g）。ＲＣＲの条件（３０サイクル）は次の通りである:９５ ℃での変性／３０秒間、４５℃でのアニーリング／３０秒間、７２℃での延長／２分間。ＰＣＲに用いた全ての試薬はパーキン−エルマー社（Perkin−Elmer）製のものである。ＰＣＲ増幅によって、適当な５’−および３’−制限部位を有する約６１５個の塩基対のＩ−ドメインのコーディング領域を含むセグメントを調製した。HindIII／XbaＩで消化したフラグメントを、HindIII／XbaＩで切断したプラスミドベクターｐＦＬＡＧ−１［インターナショナル・バイオテクノロジーズ社（Inter-national Biotechnologies，Inc.，）製］に連結させた。この連結体を使用することによって、アンピシリン１００μg／mlおよびグルコース０. ４％含有する選択用ＬＢ培地寒天プレート上に載置したエピキュリーン・コリ（ Epicurean Coli）スール（ＳＵＲＥ）適格細胞（ストラタジーン社製）を形質転換した。形質転換コロニーを接種した一夜培養物３mlを、アンピシリンを１００ μg／ml含有するＬＢ中、３７℃で増殖させた。一夜培養物からのプラスミドＤＮＡの分離は、マジック・ミニプレプ・キット（Magic Miniprep kit）（プロメガ社製）を用いておこなった。分離したプラスミドＤＮＡはHindIIおよびXbaＩを用いて制限した。６１５bpおよび５３００bpの消化生成物が観測された。このことは、発現ベクター中にＣＤ１１ｂＩ−ドメインをコードする挿入断片が存在することを示す。この発現プラスミドはＰＭ１と呼ばれる。プラスミドＰＭ１を用いて形質転換した大腸菌の一夜培養物５mlを、アンピシリン１００μg／ml含有するＬＢ５００mlに接種した。この培養混合物５００μlを、ＯＤ₆₀₀が０.４００になるまで３７℃で増殖させ（約１２０分間）、次いで、イソプロピルｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（シグマ社製）を用いて誘発させた後、３７℃でさらに２時間増殖させた。細胞を遠心分離（５０００g／５分間、２５℃）によって収集した。収集した細胞を抽出緩衝液−１（５０mＭトリス、ｐＨ８.０、５mＭＥＤＴＡ、０.２５mg／mnリゾチーム、５０μg／mlＮａＮ3）に再懸濁させた後、２５℃ で５分間インキュベートした。この調製物に抽出緩衝液−２（１.５ＭＮａＣｌ、１００mＭＣａＣｌ₂、１００mＭＭｇＣｌ₂、０.０２mg／mlＤＮアーゼ１、５０μg／mlオボムコイドプロテアーゼインヒビター）５mlを添加し、この懸濁液を２５℃で５分間インキュベートした。細胞を７０Ｗで３０秒間の超音波処理を４サイクルおこなうことによって溶解させた［この処理には、ブランソン社（Branson）製のソニック・パワー・ソニファイヤー（Sonic power sonifier ）を使用した］。不溶性の細胞破片を遠心分離（２５０００g／６０分間、４℃ ）によって分離した。ＣＤ１１ｂＩ−ドメイン融合ペプチドを含有する細胞溶解物を−７０℃で保存した。上記のようにして調製した細胞溶解物を、ＣＤ１１ｂＩ−ドメイン融合タンパク質のＦＬＡＧペプチドを認識したモノクローナル抗体（抗−ＦＬＡＧＭ１；インターナショナル・バイオテクノロジーズ社製）と共にインキュベートすることによって、モノクローナル抗体／ＣＤ１１ｂＩ−ドメイン融合タンパク質複合体を調製した。これらの複合体を¹²⁵Ｉ−rＮＩＦと共にインキュベートした後、タンパク質Ａ−セファロース［カルバイオケム社（Calbiochem）製］を用いて沈澱させた。Ｍ１モノクローナル抗体１μgを、ＣＤ１１ｂＩ−ドメイン融合ペプチド含有細胞溶解物３９０μlと共に、１０⁵cpmの¹²⁵Ｉ−ｒＮＩＦ（比放射能４７.５μＣｉ／μg;実施例１４（Ｂ）参照）の存在下においてインキュベートした。全反応体積は４００μlであり、反応は４℃で１８時間おこなった。免疫複合体はタンパク質Ａ−セファロース（ファルマシア社製）１００μlを用いて沈澱させた。タンパク質Ａ−セファロースは、ＴＡＣＴＳ２０緩衝液との１：１スラリーとして調製した後、０.５％ＢＳＡを用いてプレブロックしたものである。沈澱後、セファロースビーズをＴＡＣＴＳ２０緩衝液を用いて３回洗浄し、免疫複合体は還元条件下（１００ｍＭジチオトレイトール）において、トリスーグリシンサンプル緩衝液（ノベックス社製）の添加によって遊離させた。沈澱した標識化タンパク質は、４〜２０％傾斜ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ノベックス社製）を用いて分けた後、オートラジオグラフィーによって視識した。 ¹²⁵Ｉ−ｒＮＩＦは、組換えＩ−ドメインペプチドを含有する細胞溶解物の存在下において、Ｍ１モノクーロナル抗体を用いて沈澱させた。¹²⁵Ｉ−ｒＮＩＦは、該細胞溶解物の不存在下では沈澱せず、また、融合タンパク質のＦＬＡＧ部分と反応しないモノクーロナル抗体（抗gpIIbIIIa）をＭ１モノクーロナル抗体の代わりに用いる場合にも沈澱しなかった。さらに、ＦＬＡＧと細菌アルカリ性ホスファターゼを含有する他の融合タンパク質（ｐＦＬＡＧ−ＢＡＰ；インターナショナル・バイオテクノロジーズ社製）の存在下においても、¹²⁵Ｉ−ｒＮＩＦはＭ１モノクーロナル抗体によって沈澱しなかった。これらのデータは、ＮＩＦおよびＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８のＩ−ドメインペプチドの間の直接的な特異的相互作用を実証するものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 35/72 7431−4Ｃ 35/74 Ｚ 7431−4Ｃ 38/00 49/00 Ａ 7431−4ＣＣ０７Ｈ 21/04 Ｂ 8615−4ＣＣ０７Ｋ 7/06 8318−4Ｈ 7/08 14/435 Ｃ１２Ｎ 1/19 8828−4Ｂ 1/21 8828−4Ｂ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ 21/08 9358−4ＢＣ１２Ｑ 1/68 Ａ 9453−4ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 8310−2Ｊ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｕ 9284−4Ｃ (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） 9455−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 //(Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号０８／１５１，０６４ (32)優先日 1993年11月10日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＦＩ，ＪＰ，ＫＲ，ＮＯ，ＮＺ (72)発明者フォスター、デイビッド・リーアメリカ合衆国92122カリフォルニア、サン・ディエゴ、アパートメント1705、チャーマント・ドライブ7445番 (72)発明者ブラスク、ジョージ・フィリップアメリカ合衆国92009カリフォルニア、カールズバッド、ガーボソ・ストリート3024 番

Claims

【特許請求の範囲】１．以下の群：（ａ）Ａｒｇ−Ｘ₁−Ｘ₂−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｘ₃−Ｘ₄−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｘ₅−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ −Ｘ₆−Ｘ₇−Ｉｌｅ（式中、Ｘ₁はＬｅｕまたはＡｒｇである；Ｘ₂はＧｌｎ、ＬｙｓまたはΛｒｇである；Ｘ₃はＡｌａまたはＡｒｇである；Ｘ₄はＬｅｕまたはＭｅｔである；Ｘ₅ はＬｙｓ、Ａｒｇ、ＬｅｕまたはＩｌｅである；Ｘ₆はＶａｌまたはＩｌｅである；Ｘ₇はＳｅｒ、ＧｌｙまたはＡｓｎである）、（ｂ）Ａｌａ−Ｘ₈−Ｘ₉−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｘ₁₀−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｘ₁₁− Ｌｅｕ−Ｘ₁₂−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｘ₁₃−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｘ₁₄−Ｓｅｒ −Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｘ₁₅−Ｓｅｒ−Ａｌａ（式中、Ｘ₈はＨｉｓまたはＰｒｏである；Ｘ₉はＴｈｒ、ＡｒｇまたはＳｅｒである；Ｘ₁₀はＡｒｇまたはＬｙｓである；Ｘ₁₁はＩｌｅまたはＴｙｒである；Ｘ₁₂ はＡｓｐ、ＬｙｓまたはＧｌｕである；Ｘ₁₃はＡｓｐまたはＧｌｕである；Ｘ₁₄ はＧ１ｙ、ＬｙｓまたはＡｒｇである；Ｘ₁₅はＧｌｕ、Ｍｅｔ、ＴｈｒまたはＶａｌである）、（ｃ）Ｓｅｒ−Ｘ₁₆−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｘ₁₇−Ａｌａ−Ｔｒｐ−ＡｓＰ−Ｘ₁₈−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−ＬｙＳ−Ｘ₁₉−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ −Ｖａｌ−Ｘ₂₀−Ｃｙｓ（式中、Ｘ₁₆はＡｓｎまたはＡｓｐである；Ｘ₁₇はＶａｌまたはＬｅｕである；Ｘ₁₈はＡｌａまたはＴｈｒである；Ｘ₁₉はＬｅｕ、ＶａｌまたはＰｈｅである；Ｘ₂₀はＴｈｒ、ＬｙｓまたはＡｓｎである）、（ｄ）Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｘ₂₁−Ｘ₂₂−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ（式中、Ｘ₂₁はＴｙｒまたはＩｌｅである；Ｘ₂₂はＧｌｙまたは残基のないことを示す）、（ｅ）Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｘ₂₃−Ｘ₂₄−Ｇｌｙ−Ｘ₂₅−ｐｒｏ−ｃｙｓ−Ｘ₂₆ −Ｘ₂₇−Ｃｙｓ−Ｘ28−Ｘ₂₉−Ｔｙｒ（式中、Ｘ₂₃はＴｈｒ、Ｓｅｒ、ＬｙｓまたはＧｌｕである；Ｘ₂₄はＴｈｒ、ＶａｌまたはＩｌｅである；Ｘ₂₅はＶａｌ、ＬｙｓまたはＴｈｒである；Ｘ₂₆はＡｒｇ、ＳｅｒまたはＡｓｐである；Ｘ₂₇はＡｓｎ、Ｇｌｙ、ＡｓｐまたはＡｒｇである；Ｘ₂₈はＡｓｎ、ＳｅｒまたはＴｈｒである；Ｘ₂₉はＧｌｙ、ＧｌｕまたはＡｓｐである）、および（ｆ）Ｃｙｓ−Ｘ₃₀−Ｘ₃₁−Ａｓｐ−Ｘ₃₂−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｘ₃₃ −Ｉｌｅ（式中、Ｘ₃₀はＨｉｓ、ＩｌｅまたはＡｓｎである；Ｘ₃₁はＡｌａ、ＰｒｏまたはＡｓｐである；Ｘ₃₂はＧｌｕ、Ｖａｌ、ＡｓｐまたはＩｌｅである；Ｘ₃₃はＩｌｅ、ＶａｌまたはＰｈｅである）を有するから選択されるアミノ酸配列を有する好中球抑制因子。２．好中球抑制活性を有する、請求項１記載の好中球抑制因子。３．好中球抑制活性が、血管内皮細胞に対する好中球の接着を測定するアッセイ、好中球からの過酸化水素の放出を測定するアッセイ、好中球の同型凝集を測定するアッセイおよびプラスチック表面に対する好中球の接着を測定するアッセイからなる群から選択されるアッセイによって示される、請求項２記載の好中球抑制因子。４．好中球抑制活性のＩＣ₅₀が約５００ｎＭ以下である、請求項３記載の好中球抑制因子。５．インテグリン複合体ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８への結合能を有する、請求項４記載の好中球抑制因子。６．インテグリン複合体ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８のＩ−ドメインを含有する組替えペプチドへの結合能を有する、請求項４記載の好中球抑制因子。７．さらに、好酸球抑制活性を有する、請求項１記載の好中球抑制因子。８．好酸球抑制活性が、好酸球の血管内皮細胞への結合を測定するアッセイによって示される、請求項７記載の好中球抑制因子。９．好酸球抑制活性のＩＣ₅₀が約５００ｎＭ以下である、請求項８記載の好中球抑制因子。１０．図８に示したアミノ酸配列を有する好中球抑制因子。１１．図９に３Ｐ、１Ｐ、２ＦＬ、３ＦＬ、４ＦＬおよび６ＦＬとして示したアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する好中球抑制因子。１２．図１６にＰＣＲ−ＮＩＦ＃７、ＡｃａＮＩＦ１９およびＡｃａＮＩＦ２４として示したアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、好中球抑制因子。１３．図１６にＰＣＲ−ＮＩＦ＃２０、ＡｃａＮＩＦ４、ＡｃａＮＩＦ６、ＡｃａＮＩＦ７、ＡｃａＮＩＦ９、ＡｃｅＮＩＦ１として示したアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する好中球抑制因子。１４．図８に示されたアミノ酸配列のうち、１０、１８、８７、１１０、１３０、１９７または２２３位の１または複数のアスパラギン残基がグルタミン残基で置換されている、好中球抑制因子変異体。１５．さらに好中球抑制活性を有する、請求項１４記載の好中球抑制因子変異体。１６．好中球抑制活性が、血管内皮細胞に対する好中球の接着を測定するアッセイ、好中球からの過酸化水素の放出を測定するアッセイ、好中球の同型凝集を測定するアッセイおよびプラスチック表面に対する好中球の接着を測定するアッセイからなる群から選択されるアッセイによって示される、請求項１５記載の好中球抑制因子変異体。１７．好中球抑制活性のＩＣ₅₀が約５００ｎＭ以下である、請求項１６記載の好中球抑制因子変異体。１８．インテグリン複合体ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８への結合能を有する、請求項１７記載の好中球抑制因子変異体。１９．インテグリン複合体ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８のＩ−ドメインを含有する組替えペプチドへの結合能を有する、請求項１７記載の好中球抑制因子変異体。２０．好酸球抑制活性を有する、請求項１４記載の好中球抑制因子変異体。２１．好酸球抑制活性が、好酸球の血管内皮細胞への結合を測定するアッセイによって示される、請求項２０記載の好中球抑制因子変異体。２２．好酸球抑制活性のＩＣ₅₀が約５００ｎＭ以下である、請求項２１記載の好中球抑制因子変異体。２３．５’-CTCGAATTCT(GATC)GC(ATC)AT(ATC)(CT)T(GATC)GG(ATC)TGGGC-３’ および５’-CTCGAATTCTT(TC)TCTGG(GA)AA(GA)CG(GA)TC(GA)AA-３’ からなる群から選択される配列を有するプローブへハイブリダイズするのに、十分相補的であるヌクレオチド配列によってコード化されるアミノ酸配列を有する好中球抑制因子。２４．好中球抑制活性を有する、請求項２３記載の好中球抑制因子。２５．好中球抑制活性が、血管内皮細胞に対する好中球の接着を測定するアッセイ、好中球からの過酸化水素の放出を測定するアッセイ、好中球の同型凝集を測定するアッセイおよびプラスチック表面に対する好中球の接着を測定するアッセイからなる群から選択されるアッセイによって示される、請求項２４記載の好中球抑制因子。２６．好中球抑制活性のＩＣ₅₀が約５００ｎＭ以下である、請求項２５記載の好中球抑制因子。２７．インテグリン複合体ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８への結合能を有する、請求項２６記載の好中球抑制因子。２８．インテグリン複合体ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８のＩ−ドメインを含有する組替えペプチドへの結合能を有する、請求項２６記載の好中球抑制因子。２９．好酸球抑制活性を有する、請求項２３記載の好中球抑制因子。３０．好酸球抑制活性が、好酸球の血管内皮細胞への結合を測定するアッセイによって示される、請求項２９記載の好中球抑制因子。３１．好酸球抑制活性のＩＣ₅₀が約５００ｎＭ以下である、請求項３０記載の好中球抑制因子。３２．配列：５’-CTCGAATTCT(GATC)GC(ATC)AT(ATC)(CT)T(GATC)GG(ATC)TGGGC-３’ を有するＤＮＡプローブ。３３．配列：５’-CTCGAATTCTT(TC)TCTGG(GA)AA(GA)CG(GA)TC(GA)AA-３’ を有するＤＮＡプローブ。３４．図８の配列の一部分に対して相補的である少なくとも約１２ヌクレオチドを有するプローブにハイブリダイズするよう、十分に相補的である核酸配列によりコード化されるアミノ酸配列を有する好中球抑制因子。３５．好中球抑制活性を有する、請求項３４記載の好中球抑制因子。３６．好中球抑制活性が、血管内皮細胞に対する好中球の接着を測定するアッセイ、好中球からの過酸化水素の放出を測定するアッセイ、好中球の同型凝集を測定するアッセイおよびプラスチック表面に対する好中球の接着を測定するアッセイからなる群から選択されるアッセイによって示される、請求項３５記載の好中球抑制因子。３７．好中球抑制活性のＩＣ₅₀が約５００ｎＭ以下である、請求項３６記載の好中球抑制因子。３８．インテグリン複合体ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８への結合能を有する、請求項３７記載の好中球抑制因子。３９．インテグリン複合体ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８のＩ−ドメインを含有する組替えペプチドへの結合能を有する、請求項３７記載の好中球抑制因子。４０．好酸球抑制活性を有する、請求項３４記載の好中球抑制因子。４１．好酸球抑制活性が、好酸球の血管内皮細胞への結合を測定するアッセイによって示される、請求項４０記載の好中球抑制因子。４２．好酸球抑制活性のＩＣ₅₀が約５００ｎＭ以下である、請求項４１記載の好中球抑制因子。４３．好中球抑制因子のアミノ酸配列をコード化する核酸配列を有する、単離された核酸分子。４４．請求項１、２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２９、３０、３１、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４１または４２記載の好中球抑制因子からなる群から選択される、好中球抑制因子のアミノ酸配列をコード化する核酸配列を有する単離された核酸分子。４５．核酸分子がＤＮＡ分子である、請求項４４記載の単離された核酸分子。４６．請求項４５記載の単離された核酸分子を、ベクターにより形質転換された宿主細胞により認識される調節配列に操作可能なように連結された状態で含有する発現ベクター。４７．ｐＨＩＬ７ＳＰ−Ｎ１ｃ１０、ｐＳＧ５／ＮＩＦ１ＦＬＣＲ１、ｐＭａ５−ＮＩ１／３ｐＡＮ−ＮＩＦ−１ＦＬ、ｐＹＡＭ７ＳＰ−ｈＮＩＦ１／△、Ｇｌ１−５、ｐＹＡＭ７ＳＰ−ｈＮＩＦ１／△、Ｇｌ１−５、ｐＹＡＭＳＰ−ＡｃａＮＩＦ４、ｐＹＡＭＳＰ−ＡｃａＮＩＦ６、ｐＹＡＭＳＰ−ＡｃａＮＩＦ９、ｐＹＡＭＳＰ−ＡｃａＮＩＦ２４およびｐＡＮ−ＡｃｅＮＩＦ３からなる群から選択される、請求項４６記載の発現ベクター。４８．請求項４７記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。４９．宿主細胞内に挿入された、好中球抑制因子の遺伝子をコード化する発現ベクターを有する宿主細胞を細胞培養条件下で培養して該好中球抑制因子を発現させる工程を含む、生物活性な好中球抑制因子の製造方法。５０．遺伝子が寄生虫から得られるものである、請求項４９記載の方法。５１．寄生虫が扁形動物類（Platyhelminthes）、線虫類（Nematoda）、類線形動物類（Nematomorpha）および鉤頭虫類（Acanthocephala）からなる群から選択される種である、請求項５０記載の方法。５２．寄生虫の種が線虫類の種からなる群から選択される、請求項５１記載の方法。５３．種がイヌ鉤虫である請求項５２記載の方法。５４．イヌ鉤虫がアンサイロストマ・カニナム（Ancylostoma caninum）である請求項５３記載の方法。５５．イヌ鉤虫がアンサイロストマ・セイラニカム（Ancylostoma ceylanicum ）である請求項５４記載の方法。５６．該種がイヌ蛔虫である請求項５２記載の方法。５７．イヌ蛔虫がトキソカラ・カニス（Toxocara canis）である、請求項５６記載の方法。５８．宿主細胞が細菌細胞、酵母細胞、哺乳類細胞および昆虫細胞からなる群から選択される請求項４９記載の方法。５９．宿主細胞が細菌細胞である、請求項５８記載の方法。６０．細菌細胞が、大腸菌（E．coli）ＷＫ６である請求項５９記載の方法。６１．宿主細胞が酵母細胞である、請求項５８記載の方法。６２．酵母細胞がサッカロミセス・セレビジュー（saccharomyces cerevisiae ）である請求項６１記載の方法。６３．酵母細胞が、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）である、請求項６１記載の方法。６４．宿主細胞が、哺乳類細胞である、請求項５８記載の方法。６５．哺乳類細胞がＣＯＳ−７である、請求項６４記載の方法。６６．哺乳類細胞がＣＨＯ−Ｋ１である、請求項６４記載の方法。６７．細胞培養条件下において、宿主細胞内に挿入された、好中球抑制因子の遺伝子をコード化する発現ベクターを有する宿主細胞を細胞培養条件下で培養して、該好中球抑制因子を発現させる操作を含み、遺伝子が請求項１、２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２９、３０、３１、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４１または４２記載の好中球抑制因子からなる群から選択される、生物活性な好中球抑制因子の製造方法。６８．宿主細胞が大腸菌（E. coli）ＷＫ６である、請求項６７記載の方法。６９．宿主細胞が、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）である、請求項６７記載の方法。７０．宿主細胞がＣＨＯ−Ｋ１である、請求項６７記載の方法、７１．請求項４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５または６６記載の方法により製造された、好中球抑制因子。７２．請求項６７記載の方法で製造された好中球抑制因子。７３．請求項６８記載の方法で製造された好中球抑制因子。７４．請求項６９記載の方法で製造された好中球抑制因子。７５．請求項７０記載の方法で製造された好中球抑制因子。７６．宿主細胞内に挿入された好中球抑制因子の遺伝子をコード化する発現ベクターを有する宿主細胞を、細胞培養条件下で培養することによって、好中球抑制因子が分泌される工程を含む、生物活性な好中球抑制因子を製造する方法。７７．遺伝子が寄生虫から得られたものである、請求項７６記載の方法。７８．寄生虫が扁形動物類、線虫類、類線形動物類および鉤頭虫類からなる群から選択される種である、請求項７７記載の方法。７９．寄生虫の種が線虫類の種からなる群から選択される、請求項７８記載の方法。８０．種がイヌ鉤虫である請求項７９記載の方法。８１．イヌ鉤虫がアンサイロストマ・カニナム（Ancylostoma caninum）である請求項８０記載の方法。８２．イヌ鉤虫がアンサイロストマ・セイラニカム（Ancylostoma ceylanicum ）である請求項８０記載の方法。８３．種がイヌ桐虫である請求項７９記載の方法。８４．イヌ蛔回虫がトキソカラ・カニス（Toxocara canis）である、請求項８３記載の方法。８５．宿主細胞が細菌細胞、酵母細胞、哺乳類細胞および昆虫細胞からなる群から選択される請求項７６記載の方法。８６．宿主細胞が細菌細胞である、請求項８５記載の方法。８７．細菌細胞が、大腸菌（E．coli）ＷＫ６である請求項８６記載の方法。８８．宿主細胞が酵母細胞である、請求項８５記載の方法。８９．酵母細胞がサッカロミセス・セレビジュー（saccharomyces cerevisiae ）である請求項８８記載の方法。９０．酵母細胞が、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）である、請求項８８記載の方法。９１．宿主細胞が、哺乳類細胞である、請求項８５記載の方法。９２．哺乳類細胞がＣＯＳ−７である、請求項９１記載の方法。９３．哺乳類細胞がＣＨＯ−Ｋ１である、請求項９１記載の方法。９４．細胞培養条件下において、宿主細胞内に挿入された、好中球抑制因子の遺伝子をコード化する発現ベクターを有する宿主細胞を細胞培養条件下で培養して、該好中球抑制因子を分泌させる工程を含み、遺伝子が請求項１、２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２９、３０、３１、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４１または４２記載の好中球抑制因子からなる群から選択される、生物活性な好中球抑制因子の製造方法。９５．宿主細胞が大腸菌（E. coli）ＷＫ６である、請求項９４記載の方法。９６．宿主細胞が、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）である、請求項９４記載の方法。９７．宿主細胞がＣＨＯ−Ｋ１である、請求項９４記載の方法。９８．請求項７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２または９３記載の方法により製造された、好中球抑制因子。９９．請求項９４記載の方法で製造された好中球抑制因子。１００．請求項９５記載の方法で製造された好中球抑制因子。１０１．請求項９６記載の方法で製造された好中球抑制因子。１０２．請求項９７記載の方法で製造された好中球抑制因子。１０３．好中球抑制因子が含有されていると推測されるソースからｃＤＮＡライブラリーを調製し、好中球抑制因子をコード化する核酸とハイブリダイズするのに十分相補的であるオリゴヌクレオチドを、該ｃＤＮＡとハイブリダイズさせる工程を含む、好中球抑制因子の製造方法。１０４．オリゴヌクレオチドプローブが５’-CTCGAATTCT(GATC)GC(ATC)AT(ATC)(CT)T(GATC)GG(ATC)TGGGC-３’ および５’-CTCGAATTCTT(TC)TCTGG(GA)AA(GA)CG(GA)TC(GA)AA-３’ からなる群から選択される配列を有する請求項１０３記載の方法。１０５．好中球抑制因子が好中球抑制活性を有する、請求項１０４記載の方法。１０６．好中球抑制因子の好中球抑制活性が、血管内皮細胞に対する好中球の接着を測定するアッセイ、好中球からの過酸化水素の放出を測定するアッセイ、好中球の同型凝集を測定するアッセイおよびプラスチック表面に対する好中球の接着を測定するアッセイからなる群から選択されるアッセイによって示される、請求項１０５記載の方法。１０７．好中球抑制活性のＩＣ₅₀が約５００ｎＭ以下である、請求項１０６記載の方法。１０８．好中球抑制因子が、インテグリン複合体ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８への結合能を有する、請求項１０７記載の方法。１０９．好中球抑制因子が、インテグリン複合体ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８のＩ− ドメインを含有する組替えペプチドへの結合能を有する、請求項１０７記載の方法。１１０．好中球抑制因子が好酸球抑制活性を有する、請求項１０４記載の方法。１１１．好酸球抑制活性が、好酸球の血管内皮細胞への結合を測定するアッセイによって示される、請求項１１１記載の方法。１１２．好酸球抑制活性のＩＣ₅₀が約５００ｎＭ以下である、請求項１１１記載の方法。１１３．請求項１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１１０、１１１または１１２記載の方法で調製された、好中球抑制因子。１１４．（１）好中球抑制因子をコード化する核酸にハイブリダイズするのに十分相補的である核酸プローブに試料溶液を接触させ、（２）該プローブを検出する工程を含む、試料中の好中球抑制因子をコード化する核酸分子の存在を検出する方法。１１５．（１）好中球抑制因子をコード化する核酸にハイブリダイズするのに十分相補的である核酸プローブに試料溶液を接触させ、（２）該プローブを検出する工程を含み、該プローブが請求項１、２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２および１３記載の好中球抑制因子からなる群から選択される好中球抑制因子とハイブリダイズする、試料中の好中球抑制因子をコード化する核酸分子の存在を検出する方法。１１６．好中球抑制因子が図８に示したアミノ酸配列を有する、請求項１１５記載の方法。１１７．オリゴヌクレオチドプローブが５’-CTCGAATTCT(GATC)GC(ATC)AT(ATC)(CT)T(GATC)GG(ATC)TGGGC-３’ および５’-CTCGAATTCTT(TC)TCTGG(GA)AA(GA)CG(GA)TC(GA)AA-３’ からなる群から選択される配列を有する請求項１１４記載の方法。１１８．好中球抑制因子に結合し得るモノクローナル抗体。１１９．請求項１、２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２１および２２記載の好中球抑制因子からなる群から選択される好中球抑制因子に結合し得るモノクローナル抗体。１２０．好中球抑制因子が図８の好中球抑制因子である、好中球抑制因子に結合し得るモノクローナル抗体。１２１．モノクローナル抗体がＩｇＧである、請求項１２０記載のモノクローナル抗体。１２２．モノクローナル抗体３Ｄ２が好中球抑制因子に結合する際と同じエピトープ上に結合する、請求項１２１記載のモノクローナル抗体。１２３．モノクローナル抗体が３Ｄ２である請求項１２１記載のモノクローナル抗体。１２４．請求項１２２または１２３記載のモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ。１２５．好中球抑制因子を含有すると考えられる試料を該好中球抑制因子に結合し得るモノクローナル抗体と接触させる工程を含む、好中球抑制因子を単離する方法。１２６．モノクローナル抗体が、モノクローナル抗体３Ｄ２が好中球抑制因子に結合する際と同じエピトープ上に結合する、請求項１２５記載の方法。１２７．モノクローナル抗体がモノクローナル抗体３Ｄ２である、請求項１２５記載の方法。１２８．モノクローナル抗体がクロマトグラフ用樹脂に共有結合している、請求項１２６または１２７記載の方法。１２９．クロマトグラフ用樹脂がエンファズ・バイオサポート・メディウム（ Emphaze Biosupport Medium）である、請求項１２８記載の方法。１３０．試料を好中球抑制因子と結合し得るモノクローナル抗体と接触させる工程を含む、試料中に含まれる好中球抑制因子を検出する方法。１３１．モノクローナル抗体をプラスチック表面上へ固定させる、請求項１３０記載の方法。１３２．プラスチックがポリスチレンである、請求項１３１記載の方法。１３３．モノクローナル抗体の固定化を受動吸収によって行う、請求項１３２記載の方法。１３４．モノクローナル抗体に、試料および検出可能な標識と共有結合させた好中球抑制因子を同時に作用させる操作を含む、請求項１３３項記載の方法。１３５．最初にモノクローナル抗体と試料を接触させ、その後該モノクローナル抗体を、検出可能な標識に共有結合させた好中球抑制因子と接触させる工程を含む、請求項１３３記載の方法。１３６．検出可能標識が放射性同位元素または酵素である、請求項１３５記載の方法。１３７．検出可能標識がヨウ素−１２５、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼおよびホースラディッシュパーオキシダーゼからなる群から選択される、請求項１３６記載の方法。１３８．検出可能標識がヨウ素−１２５である請求項１３７記載の方法。１３９．モノクローナル抗体が、請求項９の好中球抑制因子の、モノクローナル抗体３Ｄ２が結合するエピトープと同じエピトープに結合するものである、請求項１３８記載の方法。１４０．モノクローナル抗体が３Ｄ２である、請求項１３８記載の方法。１４１．試料をＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体と接触させる工程を含む、試料中の好中球抑制因子がＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体へ結合するのに対して競合する好中球抑制因子のミミックを検出する方法。１４２．好中球抑制因子ミミックが小分子、ペプチド、ペプチド類縁体およびタンパク質からなる群から選択される、請求項１４１記載の方法。１４３．ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体が、プラスチック表面に固定化された抗ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８モノクローナル抗体に結合している、請求項１４２記載の方法。１４４．プラスチック表面上へのモノクローナル抗体の固定化を受動吸収法によって行う、請求項１４３記載の方法。１４５．モノクローナル抗体がＬＭ２である、請求項１４４記載の方法。１４６．プラスチックがポリスチレンである、請求項１４５記載の方法。１４７．ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体、試料および検出可能標識に結合させ得る好中球抑制因子を同時に接触させる工程を含む、請求項１４６記載の方法。１４８．好中球抑制因子がビオチンと共有結合している、請求項１４７記載の方法。１４９．検出可能標識がアビジンと共有結合している、請求項１４８記載の方法。１５０．検出可能標識が酵素である、請求項１４９記載の方法。１５１．酵素がアルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびホースラディッシュパーオキシダーゼからなる群から選択される、請求項１５０記載の方法。１５２．酵素がアルカリ性ホスファターゼである、請求項１５１記載の方法。１５３．請求項１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１または１５２記載の方法によって同定され、好中球抑制活性を有する好中球抑制因子のミミック。１５４．好中球抑制活性が、血管内皮細胞に対する好中球の接着を測定するアッセイ、好中球からの過酸化水素の放出を測定するアッセイ、好中球の同型凝集を測定するアッセイおよびプラスチック表面に対する好中球の接着を測定するアッセイからなる群から選択されるアッセイによって示される、請求項１５３記載の好中球抑制因子のミミック。１５５．ＩＣ₅₀が約５００ｎＭ以下の好中球抑制活性を有する、請求項１５４記載の好中球抑制因子のミミック。１５６．請求項１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１または１５２記載の方法によって同定され、好酸球抑制活性を有する好中球抑制因子のミミック。１５７．好酸球抑制活性が、好酸球の血管内皮細胞への結合を測定するアッセイによって示される、請求項１５６記載の好中球抑制因子のミミック。１５８．好酸球抑制活性のＩＣ₅₀が約５００ｎＭ以下である、請求項１５７記載の好中球抑制因子のミミック。１５９．試料をＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体と接触させる工程を含む、試料中の好中球抑制因子がＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体へ結合するのに対して競合する好中球抑制因子のアンタゴニストを検出する方法。１６０．好中球抑制因子アンタゴニストが小分子、ペプチド、ペプチド類縁体およびタンパク質からなる群から選択される、請求項１５９記載の方法。１６１．ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体が、プラスチック表面に固定化された抗ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８モノクローナル抗体に結合している、請求項１６０記載の方法。１６２．プラスチック表面上へのモノクローナル抗体の固定化を受動吸収法によって行う、請求項１６１記載の方法。１６３．モノクローナル抗体がＬＭ２である、請求項１６２記載の方法。１６４．プラスチックがポリスチレンである、請求項１６３記載の方法。１６５．ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体、試料および検出可能標識と結合させ得る好中球抑制因子を同時に接触させる工程を含む、請求項１６４記載の方法。１６６．好中球抑制因子がビオチンと共有結合している、請求項１６５記載の方法。１６７．検出可能標識がアビジンと共有結合している、請求項１６６記載の方法。１６８．検出可能標識が酵素である、請求項１６７記載の方法。１６９．酵素がアルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびホースラディッシュパーオキシダーゼからなる群から選択される、請求項１６８記載の方法。１７０．該酵素がアルカリ性ホスファターゼである、請求項１６９記載の方法。１７１．請求項１５９、１６９、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９または１７０記載の方法によって同定され、好中球抑制活性を有さない好中球抑制因子のアンタゴニスト。１７２．好中球抑制活性が、血管内皮細胞に対する好中球の接着を測定するアッセイ、好中球からの過酸化水素の放出を測定するアッセイ、好中球の同型凝集を測定するアッセイおよびプラスチック表面に対する好中球の接着を測定するアッセイからなる群から選択されるアッセイによって調べたものである、請求項１７１記載の好中球抑制因子のアンタゴニスト。１７３．好中球抑制活性のＩＣ₅₀が１０００ｎＭから１ｍＭである、請求項１７２記載の好中球抑制因子のアンタゴニスト。１７４．請求項請求項１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９または１７０記載の方法によって同定され、好酸球抑制活性を有さない好中球抑制因子のアンタゴニスト。１７５．好酸球抑制活性が、好酸球の血管内皮細胞への結合を測定するアッセイによって調べたものである、請求項１７４記載の好中球抑制因子のアンタゴニスト。１７６．好酸球抑制活性のＩＣ₅₀が約１０００ｎＭから約１ｍＭである、請求項１７５記載の好中球抑制因子のアンタゴニスト。１７７．好中球抑制因子の治療効果量を哺乳類に投与することを含む、哺乳類の異常な好中球活性化に特徴付けられる炎症症状の治療方法方法。１７８．請求項１、４、９、１０、１１、１２、１３、１４、１７、２３、２６、３４、３７または４９いずれかに記載の好中球抑制因子の治療効果量を哺乳類に投与することを含む、哺乳類の異常な好中球活性化に特徴付けられる炎症症状の治療方法。１７９．好中球抑制因子の治療効果量を哺乳類に投与することを含む、哺乳類の異常な好酸球活性化に特徴付けられる炎症症状の治療方法。１８０．請求項１、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、２２、２３、３１、３４、４２または４９いずれかに記載の好中球抑制因子の治療効果量を哺乳類に投与することを含む、哺乳類の異常な好酸球活性化に特徴付けられる炎症症状の治療方法。１８１．試料をＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体のＩ−ドメインを含有する組替えペプチドと接触させる工程を含む、試料中の好中球抑制因子がＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体のＩ−ドメインを含有する組替えペプチドへ結合するのに対して競合する好中球抑制因子のミミックを検出する方法。１８２．好中球抑制因子のミミックが小分子、ペプチド、ペプチド類縁体およびタンパク質からなる群から選択される、請求項１８１記載の方法。１８３．組替えペプチド、試料および検出可能標識に結合していてもよい好中球抑制因子を同時に接触させる工程を含む、請求項１８２記載の方法。１８４．検出可能標識が¹²⁵Ｉである、請求項１８３記載の方法。１８５．好中球抑制因子がビオチンに共有結合している、請求項１８３記載の方法。１８６．検出可能標識がアビジンに共有結合している、請求項１８５記載の方法。１８７．検出可能標識が酵素である、請求項１８６記載の方法。１８８．酵素がアルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼおよびホースラディッシュパーオキシダーゼからなる群から選択される、請求項１８７記載の方法。１８９．酵素がアルカリ性ホスファターゼである、請求項１８８記載の方法。１９０．請求項１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８または１８９記載の方法にて同定された、好中球抑制活性を有する好中球抑制因子のミミック。１９１．好中球抑制活性が、血管内皮細胞に対する好中球の接着を測定するアッセイ、好中球からの過酸化水素の放出を測定するアッセイ、好中球の同型凝集を測定するアッセイおよびプラスチック表面に対する好中球の接着を測定するアッセイからなる群から選択されるアッセイによって示される、請求項１９０記載の好中球抑制因子のミミック。１９２．ＩＣ₅₀が約５００ｎＭ以下の好中球抑制活性を有する、請求項１９１記載の好中球抑制因子のミミック。１９３．請求項１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８または１８９記載の方法によって同定され、好酸球抑制活性を有する好中球抑制因子のミミック。１９４．好酸球抑制活性が、好酸球の血管内皮細胞への結合を測定するアッセイによって示される、請求項１９３記載の好中球抑制因子のミミック。１９５．好酸球抑制活性のＩＣ₅₀が約５００ｎＭ以下である、請求項１９４記載の好中球抑制因子のミミック。１９６．ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体のＩ−ドメインを含有する組替えペプチドと接触させる工程を含む、試料中の好中球抑制因子がＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体のＩ−ドメインを含有する組替えペプチドへ結合するのに対して競合する好中球抑制因子のアンタゴニストを検出する方法。１９７．好中球抑制因子アンタゴニストが小分子、ペプチド、ペプチド類縁体およびタンパク質からなる群から選択される、請求項１９６記載の方法。１９８．組替えペプチド、試料および検出可能標識に結合させ得る好中球抑制因子を同時に接触させる工程を含む、請求項１９７記載の方法。１９９．検出可能標識が¹²⁵Ｉである、請求項１９８記載の方法。２００．好中球抑制因子がビオチンに共有結合している、請求項１９８記載の方法。２０１．検出可能標識がアビジンに共有結合している、請求項２００記載の方法。２０２．検出可能標識が酵素である、請求項２０１記載の方法。２０３．酵素がアルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼおよびホースラディッシュパーオキシダーゼからなる群から選択される、請求項２０２記載の方法。２０４．酵素がアルカリ性ホスファターゼである、請求項２０３記載の方法。２０５．請求項１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３または２０４記載の方法によって同定され、好中球抑制活性を有さない好中球抑制因子のアンタゴニスト。２０６．好中球抑制活性が、血管内皮細胞に対する好中球の接着を測定するアッセイ、好中球からの過酸化水素の放出を測定するアッセイ、好中球の同型凝集を測定するアッセイおよびプラスチック表面に対する好中球の接着を測定するアッセイからなる群から選択されるアッセイによって調べたものである、請求項２０５記載の好中球抑制因子のアンタゴニスト。２０７．好中球抑制活性のＩＣ₅₀が１０００ｎＭから約１ｍＭである、請求項２０６記載の好中球抑制因子のアンタゴニスト。２０８．請求項１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３または２０４記載の方法によって同定され、好酸球抑制活性を有さない好中球抑制因子のアンタゴニスト。２０９．好酸球抑制活性が、好酸球の血管内皮細胞への結合を測定するアッセイによって調べたものである、請求項２０８記載の好中球抑制因子のアンタゴニスト。２１０．好酸球抑制活性のＩＣ₅₀が約１０００ｎＭから約１ｍＭである、請求項２１０記載の好中球抑制因子のアンタゴニスト。