JPH08503869A

JPH08503869A - 創傷用被覆剤

Info

Publication number: JPH08503869A
Application number: JP6513920A
Authority: JP
Inventors: マイケルハウラ; トーマスリチャードバロウ; テレンスダドリターナ; リスザードヤーンシュミト; リップヤンチューグ
Original assignee: ユニバーシティカレッジカーディフコンサルタンツリミテッド
Priority date: 1992-12-08
Filing date: 1993-12-03
Publication date: 1996-04-30
Also published as: US5667501A; GB9511571D0; AU5654694A; GB2288736A; DE69328308D1; WO1994013333A1; CA2151246C; EP0673262B1; GB2288736B; CA2151246A1; EP0673262A1; ATE191348T1; GB9225581D0; AU679954B2

Abstract

(57)【要約】創傷用被覆剤は、ＤＰＰＨ試験で遊離基活性が１５〜８０％の範囲にある化学的に変性させたポリマーからなる。該被覆剤は、持続性遊離基またはその前駆体である少なくとも一つの化学基を有する化学的に変性させたポリマーからなるものとすることができる。当該被覆剤は、創傷の環境下で分子酸素と反応して過酸化水素を形成することのできる少なくとも一つの化学基を有する化学的に変性させたポリマーからなるものとすることができる。当該被覆剤は、創傷の環境下でマクロファージの活性またはフィブロブラストの増殖あるいはその両方を剌激することのできる化学的に変性させたポリマーからなるものとすることができる。

Description

【発明の詳細な説明】創傷用被覆剤【技術の分野】本発明は創傷によい治癒環境を提供する被覆剤に関する。好ましい創傷の治癒は、損傷を受けた組織の迅速で完全な再生を特徴とする。創傷用被覆剤については、どのような被覆剤類が創傷の治癒を促進するのに最も効果的かを明らかにする目的で研究にかなりの努力が払われてきた。創傷の治癒のプロセスは複雑でまだ完全には理解されていない。第一日目を含めてとくに治癒の初期の段階では、バクテリアを殺して細胞の破片や異物を除去するためにマクロファージが活発に活動することが望ましい。この活動には通常炎症がともなう。たとえば第三日目から第七日目までのようなとくに治癒の後期の段階では、早い速度で再生が行なわれるようにフィブロブラスト（繊維芽細胞）が活発に活動することが望ましい。創傷には、活性遊離基とくにヒドロキシル基（ＯＨ・）、ヒドロペロキシル基（ＯＯＨ・）、超酸化物アニオン（Ｏ₂・^-）などの小さな酸素を含む遊離基が高い濃度で存在することが多い。最後の二つのものはプロトン付加平衡状態にあり、生理的ｐＨではアニオンが支配的である。ただしヒドロペロキシル基は、超酸化物アニオンより活性度の高い遊離基である。治癒の初期の段階ではこれらの基の存在することがマクロファージを創傷中に引き込んで呼吸バーストを促進するため好ましいと考えられている。しかし、これらの基が存在し続けることは好ましくないとされる。これらの基によって炎症が持続して治癒が遅れ、ひどい場合には組織の壊死や恒久的な組織の損傷が生じると考えられるからである。これに対して、過酸化水素（Ｈ₂Ｏ₂）などの対でない電子をもたない酸化剤ははるかに害が少ないと考えられている。実際にバードン、ジル、ライス・エヴァンスなどは「Free Rad. Res. Commun.，Vol. 7(1989)」の１４９〜１５９頁において低レベルの過酸化水素（約１０^-8〜１０^-6Ｍ）がフィブロブラストの増殖を促進させると記している。【背景技術】フローエ、ジアーツ、ベックマンなどは「炎症ハンドブック第５巻：炎症の薬理学」（Elsevier Sience Publishers BV,1985）の２５５〜２８１頁において遊離基スカヴェンジャ（捕捉剤）を炎症抑制剤として使用することを論じている。超酸化物アニオンは、捕食された微生物を殺すという不可決の作用に役立つといわれている。過酸化物アニオンおよびヒドロキシル基などの反応生成物は細胞外環境下において有害であり、おそらく炎症反応の自動維持および組織の損傷を招くと考えられている。上記の著者などは、酵素過酸化物ディスムターゼ（ＳＯＤ）の注射により各種の炎症状態の処置に成功したとしている。該酵素過酸化物ディスムターゼは下記の反応に対して触媒の作用をする。２Ｏ₂・^-＋２Ｈ⁺Ｏ₂＋Ｈ₂Ｏ₂ これらの著者は、酵素によるよりも薬物による遊離基の捕捉の考え方に多くの困難があることを指摘している。とくに遊離基とスカヴェンジャが反応すると新たな遊離基が生成される。これに当初の基と同様な反応性がある場合にはなんらの利益が得られない。それほど反応性がない場合には、傷口から移動してそれまでは健康であった部分に損傷を生じるおそれがある。著者らは、生体内でのきわめて反応性の高い基の捕捉は実行可能でもなくまた好ましくもない。米国特許第４８３７０２４号は、繊維状タンパク質、コラーゲン、および、多糖類であるグリコサミノグリカンの懸濁液からなり、創傷の治癒のプロセスを増強し促進する組成物を開示している。グリコサミノグリカンは、フィブロブラストまたは内皮細胞のために化学走性（走化性）を示すものであり、好ましいグリコサミノグリカンは、ヘパリン、硫酸ヘパリン、およびヘパリンアルジネートであるといわれる。ただし、アルジネートは、厳密にはグリコサミノグリカンではない。国際公開番号ＷＯ９１／１１２０５の国際特許出願は、創傷の治癒に役立つ創傷用被覆剤に用いることのできる生物高分子物質を開示している。その生物高分子物質とは、少なくとも７０％のマヌロン酸残分、たとえば、ある種の細菌性アルジネート、酸化グアーゴム、または、酸化マンナンを含む多糖類である。国際公開番号ＷＯ９１／１２２６７の国際特許出願は、酸化抑制および炎症抑制活性をもつ金属：ペプチド複合体を開示している。金属は、通常、銅（II）またはマンガン（II）であり、ペプチドはトリペプチドまたはテトラペプチドである。これらの可溶性複合体は活性治療物質として、また、傷または炎症部分の処置用薬剤の調合に用いることができる。これらの複合体はＳＯＤとよく似た作用をもつといわれる。【発明の開示】本発明の一側面に基づけば、創傷用被覆剤は、以下で定義するＤＰＰＨ試験で１５〜８０％、好ましくは５０〜７０％の範囲内の遊離基活性を有する化学的に変性させたポリマからなることを特徴とする。ある場合には、ＤＰＰＨ試験でのポリマの遊離基活性は、好ましくは５０〜８０％の範囲内、より好ましくは６０〜７０％の範囲内である。他の場合には、当該活性は、好ましくは１５〜７０％、より好ましくは１５〜５０％、さらに好ましくは２５〜４０％の範囲内である。本発明の他の一側面に基づけば、創傷用被覆剤は、持続性の遊離基またはその前駆体である少なくとも一つの化学基を有する化学的に変性させたポリマからなることを特徴とする。本発明のさらに他の一側面に基づけば、創傷用被覆剤は、傷の環境下で分子酸素と反応して過酸化水素を形成することのできる少なくとも一つの化学基を有する化学的に変性させたポリマからなることを特徴とする。本発明のさらに他の一側面に基づけば、創傷用被覆剤は、マクロファージの活性またはフィブロブラストの増殖を刺激することのできる化学的に変性させたポリマからなることを特徴とする。化学的に変性させたポリマなる用語は、望ましい基を有しないまたは望ましい活性をもたない基礎ポリマと望ましい基または望ましい活性を導入するための化学試薬との反応生成物を意味するものである。基礎ポリマは、前記試薬と反応することができる官能基を有する。本発明のさらに他の一側面に基づけば、創傷の処置方法は、本発明創傷用被覆剤が創傷に適用されることを特徴とする。当該方法はさらに、創傷の治癒のプロセスの異なる段階で本発明の異なる創傷用被覆剤を適用することを特徴とする。この出願では、ＤＰＰＨ試験と称して後に試験方法１として記載する方法によりポリマの遊離基の活性が評価される。これはより活性の高いポリマがより大きい色の変化を生じる比色定量法である。持続性遊離基はまた安定性遊離基とも呼ばれる。これらは活性遊離基と区別されるが、この区別は程度の問題である。ヒドロキシル基およびヒドロペロキシル基は活性遊離基の例である。これらは各種の電子対を有する分子と反応して新しい基を形成することができる。とくに、これらは、下に図式的に示すように電子対を有する分子から水素原子を取り去ることができる。Ｘ¹Ｈ＋ＯＨ・→Ｘ¹・＋Ｈ₂ＯＸ¹Ｈ＋ＨＯＯ・→Ｘ¹・＋Ｈ₂Ｏ₂ ただし、Ｘ¹・は有機基をあらわす。この反応が起こるためにはＸ¹−Ｈ結合がやや不安定でなければならない。Ｘ¹Ｈが生物的に重要な分子である場合には、この種の反応が炎症反応の中で発生して創傷の治癒のプロセスの後の段階でこれらの活性遊離基の有害な作用を誘起すると考えられる。これに対して、持続的遊離基は、Ｘ¹−Ｈ結合がきわめて不安定な場合を除いて、通常、創傷の環境下で存在する種類の分子から水素を取り去ることができない。一般化学の分野で知られるきわめて持続性の高い遊離基の例としては、トリフェニルメチルおよびジフェニルピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）基をあげることができる。ある種の遊離基は、分子酸素と迅速に反応することができる。この種の反応の三つの例を下に図式的に示す。Ｘ²・＋Ｏ₂→Ｘ²ＯＯ・Ｘ³Ｈ・＋Ｏ²→Ｘ³＋ＨＯＯ・Ｘ⁴・^-＋Ｏ₂ →Ｘ⁴＋Ｏ₂・^- ただし、Ｘ²・、Ｘ³Ｈ・、Ｘ⁴・^- 有機基をあらわす。この種の反応により新しい活性遊離基が形成され、それがマクロファージの活性を刺激する可能性がある。持続性の遊離基の前駆体である化学基は対でない電子を含まない。これらの基は、活性遊離基と反応して持続性の遊離基を生成することができる。この種の前駆基を有するポリマは、通常、多くの理由から、最初から持続性の遊離基を有するものよりも好ましいとされる。この種の基にはさまざまなものがあり、一般に化学的に安定で調製が容易である。適応に選ばれた基は、一以上の遊離基反応に参加することができる。それに対して持続性の遊離基は一つの反応にしか参加することができない。そのような場合には、前駆基は活性遊離基と反応して持続性の遊離基を形成し、生成された持続性の遊離基がその後に第二代の活性遊離基を抑制する。この種の前駆基は関係する物質の化学的性質に応じ、種々の形で一以上の遊離基反応に参加することができる。たとえば、ＩＰ¹＋Ｒ・→（Ｐ¹Ｒ）・（Ｐ¹Ｒ）・＋Ｒ・→Ｐ¹Ｒ₂ II Ｐ²Ｈ＋Ｒ・→Ｐ²・＋ＲＨＰ²・＋Ｒ・→Ｐ²ＲＰ²・＋Ｐ²・→Ｐ²Ｐ² III Ｐ³Ｈ₂＋Ｒ・→（Ｐ³Ｈ）・＋ＲＨ（Ｐ³Ｈ）・＋Ｒ・→Ｐ³＋ＲＨＩの場合においては、Ｐ¹が活性遊離基Ｒ・を捕捉して持続性遊離基（Ｐ¹Ｒ）・を形成する。この持続性遊離基はさらにその後他の活性遊離基Ｒ・を抑制する。IIの場合においては、活性遊離基Ｒ・がポリマＰ²Ｈから水素原子を取り去って持続性遊離基Ｐ²・を形成し、この持続性遊離基はさらにその後他の活性遊離基Ｒ・または他の持続性遊離基Ｐ²・を抑制する。III の場合においては、活性遊離基Ｒ・が連続的にポリマＰ³Ｈ₂から、また、さらに持続性遊離基（Ｐ³ Ｈ）・から水素原子を取り去る。他の場合には、前駆基の直接的な反応生成物と活性遊離基が中間的な基を生成し、それが分解して持続性遊離基および電子対をもつ基を生じる。たとえば、カルボキシル基Ｐ⁴ ＣＯ₂・は分解して持続性遊離基Ｐ⁴・およびＣＯ₂・を生じる。ある種の化学基には可逆的に解離して一対の持続性遊離基を形成するものがあり、したがってこの種の基は持続性遊離基の前駆体である。一般化学の分野で知られる例としては、へキサフェニルエタンは、可逆的に解離して二つのトリフェニルメチル基となる。遊離基は、一般的に不飽和基との共役により安定させることができ、したがって、より持続性をもたせることができる。一般的には共役が大きいほど安定性が大きくなる。したがって、やはり一般化学の分野から例をあげるとすれば、ＮＨ₂ ・は高度に活性の遊離基であり、ＰｈＮＨ・の活性はははるかに低く、Ｐｈ₂ Ｎ・はよく知られた持続性遊離基である。遊離基を安定させる不飽和基の例としては、芳香族環および複素環式芳香族環、たとえばアゾ芳香族環、脂肪族二重結合、たとえばオレフィン二重結合をあげることができる。対でない電子が、さらに、たとえばヒドロキシ基またはエーテル基の中の酸素原子あるいはアミノ基の中の窒素原子のように孤立電子対を有するヘテロ原子の上あるいはカルボニル基またはイミノ基などの電子を取り上げる不飽和基の上に非局在化している場合は、とくに遊離基を安定させるのに有効である。場合によっては、遊離基が遊離基の中心の回りでの立体障害によって安定することもある。芳香族−脂肪族、および、複素環式芳香族−脂肪族第二級アミンは、とくに芳香族または複素環式芳香族環がさらに上述したように置換される場合には、持続性遊離基の前駆体である化学基の好ましい例としてあげることができる。創傷用被覆剤として利用されて分子スケール上で創傷から隔てられたポリマが、創傷の生物活性部位からくる遊離基と反応する能力によって創傷の治癒のプロセスに明白に影響することは考えられない。低濃度の過酸化水素（約１０^-8〜１０^-6Ｍ）がフィブロブラストの増殖を刺激することは実証されている。これは、傷の治癒の後期の段階ではとくに好ましい。遊離基の前駆体である基を有するポリマは、生理的環境下で分子酸素と頻繁に反応して過酸化水素を生成することができる。このプロセスは、下記の過程をたどるものと考えられる。Ｆｅ²⁺／Ｆｅ³⁺ Ｐ²Ｈ＋Ｏ₂ → Ｐ^2・＋ＨＯＯ・Ｐ²Ｈ＋ＨＯＯ・ → Ｐ²・＋Ｈ₂Ｏ₂ ただし、Ｐ²Ｈはこれまでのようにポリマをあらわす。この種のポリマは、本発明の創傷用被覆剤に用いて価値がある。上のプロセスは中間基としてヒドロペロキシ基を生成し、この基の存在は傷の治癒の後の段階を遅らせると考えられる。しかし、ある種のポリマは、ヒドロペロキシ基が傷の環境の中に入る前にそれを抑制することができ、上に示したように過酸化水素を形成する。過酸化水素の濃度がたとえば１０^-5Ｍ以上に高まると、フィブロブラストの増殖が抑制されることが実証されている。したがって、創傷の環境の中でこのような高濃度の過酸化水素の形成を招くポリマは、創傷の治癒の後の段階で用いられる本発明の創傷用被覆剤には好ましくない。この種のポリマは、炎症活動の開始が望まれる創傷の治癒の初期の段階で使用するのが好ましいであろう。本発明の創傷用被覆剤にも用いられるポリマおよび活性遊離基を有するそれらの反応生成物は、生理的に有害な作用のないことが重要である。また、創傷用被覆剤の中のいずれか特定のポリマの有効性は創傷の環境の複雑な生理作用に左右され、また、そのような生理作用はまだ完全には理解されていないことを認識する必要がある。ポリマ構造のわずかな変化でも比較的大きな影響がある場合もあり得る。いずれにせよ、理論的予測は、常に実際の試行で実証されることが必要である。本発明の創傷用被覆剤に利用されるポリマは、持続性の遊離基またはその前駆体である化学基を導入するための官能基を有する基礎ポリマの化学的変性によって製造される。基礎ポリマは、たとえばヒドロキシ官能ポリマとすることができる。この種のポリマの例としては、自然に得られる多糖類または人工的に変性させた多糖類をあげることができる。この種のポリマの他の例としては、ヒドロキシエチルまたはヒドロキシプロピルアクリレートまたはメタクリレートなどのヒドロキシ官能モノマ単位を組み込んだ付加ポリマをあげることができる。一例として、持続性遊離基の前駆体たる化学基を導入するために官能基を有するポリマが化学的に変性される場合を説明する。たとえば、はじめにヒドロキシ官能ポリマを塩化シアヌル酸で処理し、つぎに第一級アミンＲＮＨ₂で処理する。この場合、つぎのような反応が起こると考えられる。ただし、Ｑはポリマリックバックボーンをあらわす。水素をこの種のポリマのアミノ基から取り去って持続性の遊離基を形成することができると考えられる。適当なアミンＲＮＨ₂としては、イプシロンアミノカプロン酸およびグルコースアミンをあげることができる。二種類以上のアミンを混合物としてあるいは順次付加して使用することもできる。あるいは、塩素含有ポリマ中間体を一種類のアミン等価物と反応させ、残留塩素基を加水分解で除去することもできる。これによって、下記の式の基を含むポリマが接触されると考えられる。またはその互変異性形。他の例としては、ヒドロキシ官能ポリマをベンゾキノンと反応させ、酸化し、さらに第一級アミンＲＮＨ₂で処理することも可能である。この場合、次の反応が起こると考えられる。中間体（IV）は、ハイドロキノン環を有することがわかる。活性遊離基がこの種の分子から水素原子を取り去って持続性遊離基を生成することは知られており、したがってこの種の中間体は、それ自身が本発明の創傷用被覆剤における化学的に変性されたポリマとして有用である。付加物（VI）が遊離基酸化を受けて持続性遊離基を介してベンゾキノン誘導体となること、また、このベンゾキノン誘導体自身が環に付いたアミノ基の存在のために持続性遊離基の前駆体であることがわかる。さらに他の例としては、アルデヒド基などの反応性カルボニル基を有するポリマをアミンとくに第一級脂肪族アミンで処理して化学的に変性することも可能である。この処理によりポリマにイミンまたはエナミン基が導入され、また、少なくとも二重結合に対してαの位置に取り去りが可能な水素原子が存在する場合にはこの種の基は持続性の遊離基の前駆体であると考えられている。イミン形成のメカニズムはつぎのとおりであると考えられる。ＱＣＨＯ＋ＲＮＨ₂→ＱＣＨ＝ＮＲポリマにアルデヒド基を導入する一つの適当な方法は、アミド官能ポリマをジアルデヒドで処理するものである。その場合に起こる主な反応はつぎのとおりであると考えられる。 QCONH2 +CHOR'CHO→QCON=CHR'CHO ただし、Ｒ’はたとえばアルキレン基などの二価の有機基である。適当なアミド官能ポリマの例としては、アクリルアミドの付加ポリマおよびコポリマによって得られるものをあげることができる。ジアルデヒドのとくに適当な例はグルタルアルデヒドである。これは入手が容易な化合物で、とくに持続性遊離基の前駆体である第一級アミンとの反応によってその形成を促すことができる複雑な化学的性質をもっている。グルタルアルデヒドは、自己縮合が可能でα、β−不飽和カルボニル基を形成し、また、上の観察もこの共役の伸張によってよく説明できると考えられる。ポリマにアルデヒド基を導入する他の方法としては、ヒドロキシ官能ポリマを、（１）ジオキシラン、（２）ジアミン、および（３）ジアルデヒドで処理するものがあげられる。つぎのような反応の構成が考えられる。ただし、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³は、たとえばアルキレン基などの二価の有機基である。したがって、これらのポリマは持続性遊離基の前駆体として二つのイミン基を含む側鎖をもつと考えられる。適当なジオキシランの例としては、ブタン−１、４−ジオルジグリシジルエーテルがあげられる。適当なジアミンの例としては、１、２−ジアミノエタンがあげられる。適当なジアルデヒドの例としてはグルタルアルデヒドがあげられる。本発明の創傷用被覆剤の一つの効果は、さまざまな基礎ポリマを使用できること、および、基礎ポリマの化学的変性を行なうためにさまざまな化学試薬を使用できることである。これによって遊離基の活性のレベルを任意に選び、効果的にポリマを調製して使用することが可能となる。本発明の創傷用被覆剤には、かなりの大きさのスペーサ基、たとえばバックボーンが６〜２０の原子を含む基によってポリマのバックボーンから持続性遊離基の前駆体である基が分離されたポリマを用いることが好ましい場合もある。この種のポリマの前駆体である基は、創傷の環境からくる活性遊離基によりアクセス可能であり、また、その結果それらとより容易に反応すると考えられる。この種のポリマの例としては、ヒドロキシ官能ポリマが連続的にジオキラン、ジアミン、ジアルデヒド、およびアミンと反応する場合をあげることができる。持続性遊離基の前駆体である基を導入するために化学的に変性された付加ポリマおよび多糖類は、本発明の創傷用被覆剤のポリマとしてとくに好ましいものである。ポリマは、架橋することができる。これは、付加ポリマの生成に多官能モノマを低い割合で組み込むことによって達成することができる。あるいは、官能基を有するポリマを多官能架橋剤で処理することもできる。たとえば、ヒドロキシ官能ポリマを塩化シアヌル酸またはジオキシランなどの試薬で処理することによってほぼある程度の架橋を起こすことができる。架橋は、ポリマの親水性を調節する方法に用いることができる。一般に、架橋の程度を高めるとそれに対応して親水性が低下する。かなりの量の流体を滲出する創傷の処置に用いられる創傷用被覆剤には親水性の高いポリマを用いることが好ましいであろう。本発明の創傷用被覆剤の一つの効果は、ポリマの親水性をその遊離基の活性の制御とは独立に制御できることである。創傷用被覆剤の材料は、当該材料の存在下で適当な哺乳動物の細胞を培養することによりこれの評価を行なうことができる。マクロファージの呼吸バーストを促進する・あるいは・ファゴサイト（食細胞）を刺激する材料は、創傷の治癒の初期の段階では価値があると考えられる。また、炎症を起こし、したがって壊死性の・または・かさぶたのある創傷、または、潰瘍などの慢性的な創傷に治癒が始まるのを刺激する目的で、この種の材料を使用することもできる。マクロファージの刺激を評価する標準的な方法を、後に試験方法２として説明する。フィブロブラストの増殖を刺激する材料は、創傷の治癒の後の段階で価値があると考えられる。標準的な評価方法は、後に試験方法３として説明する。ＤＰＰＨ試験において低成績すなわち０〜１０％の成績のポリマは、通常、マクロファージの活性も・また・フィブロブラストの増殖も刺激しないために中性的な行動を示す。ＤＰＰＨ試験で中程度の成績すなわち５０〜７０％の成績のポリマは、通常、マクロフアージの活性を刺激する。ＤＰＰＨ試験で高い成績すなわち５０〜８０％の成績のポリマは、通常、フィブルブラストの活性を刺激する。これは、遊離基の存在によってマクロファージの活性が刺激されるがフィブロブラストの増殖が抑制される点でめざましいものであるということができる。すなわち従来、中程度の活性を有するポリマはマクロファージを刺激し、高い活性のポリマはフィブロブラストを刺激することが期待されていたのかもしれないが、実際はその逆だということである。ＤＰＰＨ試験によれば、したがって、本発明にもとづく創傷用被覆剤が特定の種類の創傷の処置に適しているかあるいは創傷の治癒のプロセスのある特定の段階で使用するのに適していることを示すことができる。マクロファージの活性を刺激することが望まれる場合には、化学的に変性させたポリマが、ＤＰＰＨ試験において１５〜７０％、より好ましくは１５ないし５０％、さらに好ましくは２５〜４０％の範囲の結果を示すことが好ましい。この種のポリマは、炎症を刺激して慢性の創傷の清浄化を起こさせるための本発明にもとづく創傷用被覆剤に使用できるであろう。マクロファージの活性とフィブロブラストの増殖をともに刺激することが望ましい場合には、化学的に変性させたポリマが、ＤＰＰＨ試験において中間の５０〜７０％の範囲の結果を示すことが好ましい。この種のポリマは、本発明にもとづく汎用の創傷用被覆剤に使用することが好ましいであろう。本発明の創傷用被覆剤は、当業者には公知の各種の方法でつくることができる。一またはそれ以上の化学的に変性させたポリマを使用することができる。創傷用被覆剤は、さらに、化学的に変性させた一以上のポリマに加えて他のポリマを含むものとすることもできる。たとえば、化学的に変性させたポリマを膜状にしてそれを直接創傷に当てるようにすることもできる。あるいは、化学的に変性させたポリマを短繊維または連続する繊維の形にし、被覆剤にこの種のポリマをニット、織布、または不織布として組み込むこともできる。あるいは、化学的に変性させたポリマをパウダまたはビーズの形にして・または・ハイドロコロイド・または・ハイドロゲルにして創傷に塗布することもできる。ハイドロコロイドおよびハイドロゲルの被覆剤は、中程度または高度に親水性ポリマ、たとえばポリ（アクリルアミド）またはポリ（エチレンオキシド）を含むものとすることができる。本発明の創傷用被覆剤に薬物を含ませることもできる。本発明はまた、本発明創傷用被覆剤を創傷に適用する創傷の処置方法を含むものである。処置の異なる段階では異なる種類の被覆剤を適用することができる。通常、処置の初期の段階にはマクロファージの活性を増進する被覆剤が用いられる。この種の被覆剤はまた炎症を刺激することにより慢性的な創傷の治癒のプロセスを開始させるためにも用いることができる。ひとたび治癒が開始されれば、フィブロブラストの増殖を刺激する被覆剤が用いられる。この被覆剤はまた、ある程度までマクロファージの活性を刺激するためにも用いることができる。このことは、通常、治癒の後の段階では望ましくないため、この段階では、フィブロブラストを刺激するがマクロファージの活性に及ぼす効果は最小限度である手当て用品が用いられる。これは、処置法の中で通常はＤＰＰＨ試験で高い結果を示すポリマを使用することに対応する。本発明の創傷用被覆剤に用いられるポリマの評価には、下記の試験方法が採用された。【試験方法１：ポリマの遊離基活性】［ＤＰＰＨ試験］ポリマ材料の遊離基活性を評価するために、下記の方法が用いられた。これは専門誌「Ｎａｔｕｒｅ」第１８１巻(1958)：1199頁にエム・エス・ブロイスが、また、「Analytica1 Letters」第7巻(1974)：４１頁にピー・ダブリュー・バンダ、エー・イー・シェリー、エム・エス・ブロイスが記載しているものを適用したものである。材料４０ｍｇを２．５ｍｌの希釈水の中に懸濁させた。必要な場合には希釈ＨＣｌまたはＮａＯＨを添加して懸濁液のｐＨが７．０となるように調節した。あるいは、材料を２．５ｍｌの０．１Ｍ、ｐＨ７．０の燐酸塩緩衝液中に懸濁させてもよい。２．５ｍｌのメタノール系１０^-4Ｍジフェニルピシルヒドラジル（ＤＰＰＨ）を添加し、混合物をよく振って２０℃で暗所に保存した。試料の評価は、６時間にわたって５２４ｎｍ光の吸光度を測定し、コントロールと比較することで行なった。とくに４時間後の数字に注目した。４時間後のコントロールと比較した吸光度のパーセント値の減少をＤＰＰＨ試験と呼ぶ。ＤＰＰＨ試験の再現性は±５％のオーダーであった。ポリマ材料が水性メタノールにより高度に膨潤したり水性メタノールに溶けた場合には当該方法を修正したものを使用した。希釈水を０．９％のｗ／ｖ塩溶液で置換した。吸光度は１０⁴Ｇで１０分間遠心分離後に得られた表面浮遊物で測定した。ＤＰＰＨは、公知の持続性遊離基で５２４ｎｍに強い吸収帯域を有する。遊離基活性の高い材料は、上記の試験でより強くまたより早い脱色を生じることが知られている。本発明の創傷用被覆剤に使用するのに適したポリマ材料は、通常、４時間後に１５〜８０％の脱色を生じる。【試験方法２：マクロファージ試験】 (a) マウスの腹膜滲出物細胞の調製雌のＷＳＰマウス（生後６〜１２週）の腹膜空洞を０．５％の牛の新生児の血清を含むイーグル媒質３ｍｌで洗浄して休止マクロファージを採取した。数匹のマウスの細胞をプールして５０Ｇでゆっくり遠心分離し血小板を除いた。洗浄物中の核のある細胞の数は、白血球ピペットを用いて、アリコート（試料の一部）を希釈度「１０中の１」の塩水中、１％ｗ／ｖゲンチアナ・ヴィオレットおよび２％ｖ／ｖ酢酸からなる白血球希釈液と混合して求めた。これに続き血球計数器を用いて細胞を計数した。洗浄物中のマクロファージの相対的割合はアルファーナフチルアセテートエステラーゼ法を用いて計算した。この方法については、スチュアート、ハベショー、デビッドソンが「実験免疫学ハンドブック第２版」（ブラックエル科学出版：ロンドン）に記載している。この方法を実行するための適当なキットは、「リサーチ・キット９１−Ａ」の商品名でシグマ・ケミカル社から発売されている。マクロファージのパーセント値は５０〜６５％の間で変化した。使用前に、洗浄物は希釈して１．５〜２．５×１０⁷細胞／ｍｌを含むものとした。定量ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）試験。これはベーナーおよびネーサンらの「慢性肉芽腫疾病」（ニューイングランド、ジェイ・メッド）第２７８巻（1968）：９７１〜９７６頁に記載された定量ＮＢＴ試験をベースにしてポリマの試験ができるようにわずかに修正したものである。実験は下記のようにして行なった。［対照標準１］３本のシリコン処理した遠心分離管にアールスの均衡塩類溶液（ＢＳＳ）（０．３５ｍｌ）とシャン化カリウム（０．０１Ｍの０．１ｍｌ）とを加えた。つぎに０．１％ＮＢＴを含む塩化ナトリウム（０．８０％の０．４ｍｌ）も加えた。［対照標準２および実験管］三本のシリコン処理した遠心分離管にＢＳＳ（０．３５ｍｌ）とシャン化カリウム（０．０１Ｍの０．１ｍｌ）とを加えた。つぎに０．１％ＮＢＴを含む塩化ナトリウム（０．８５％の０．４ｍｌ）および０．０５ｍｌのラテックス粒子（直径０．８ミクロン）も加えた。上記の管を３７℃の振とう水浴中で１５分間前培養した。これらの前培養した各管にマクロファージ懸濁液の０．１ｍｌのアリコートを加えた。培養は３０分行ない、０．５Ｎ塩酸１０ｍｌを加えて終了させた。管は４℃、１００Ｇにて１５分間遠心分離した。表面浮遊物を吸い出すとともに、排気フード下の沸騰水浴中で２ｍｌのピリジンを用いて可視性の顆粒状粒子を１０分間抽出した。つぎに管を５００Ｇで１００分間遠心分離し、２ｍｌのピリジンを用いて２回目の抽出を行ない、二つの抽出物を組み合わせ、５１５ｎｍでのピリジン・ブランクに対する低下したＮＢＴの紫色の光学濃度をＰＵ８６２０紫外線分光光度計で求めた。［試験試料］３７℃の振盪水浴で３０分間前培養したマクロファージ懸濁液０．１ｍｌに、試験するポリマの殺菌済み試料を加えた（０．１％ｗ／ｖ）。細胞が試料のポリマに付着するのを防ぐために、懸濁液を攪拌し続ける必要があった。この懸濁液の０．１ｍｌのアリコートを実験用遠心分離管に加え、実験の残余部分は上述したとおりに行なった。結果は試料と対照標準との平均パーセント値の差で示した。この試験方法によって、試験用ポリマに晒されたマクロファージの呼吸バーストを評価することができ、したがって創傷の環境下で起こり得る炎症刺激活性の指標が得られる。【試験方法３：フィブロブラストの菌株】英国ハイワイコウムのＩＣＮフローからＬ９２９マウスのフィブロブラストを入手した。Ｌ９２９マウスのフィブロブラスト維持用菌株のための完全な成長媒質は、最低必須媒質イーグル（変性）と、２０ｍＭのＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルフォン酸（ＨＥＰＥＳ）に非必須アミの酸（１％ｖ／ｖ）を加えたもの、２ｍＬのＬ−グルタミン、１００単位ｍｌ^-1ペニシリン、１００μｇｍｌ^-1ストレプトマイシン、および、１０％の新生児の牛の血清（ＮＢＳ）を含むアールの塩（ＥＭＥＭ）からなる。実験用菌株には、完全な成長媒質にペニシリンとストレプトマイシンは加えなかった。ストックのＬ９２９の細胞は液体窒素中に貯蔵した。新しい菌株は冷凍した株から開始した。細胞を無菌の７５ｃｍ³菌株フラスコ内の完全なＥＭＥＭ媒質の中で３７℃で成長させた。菌株は毎週継代させ、媒質は週３回交換した。この作業の５７９回目および５９２回目の継代ではＬ９２９の細胞が用いられた。細胞のトリプシン処理にはカルシウムおよびマグネシウムを用いずトリプシン（０．２５％ｗ／ｖ）を含むアールの均衡塩類溶液（変性）が用いられた。［第０日］Ｌ９２９マウスのフィブロブラスト細胞の懸濁液（１×１０⁵細胞／ｍｌ）を調製した。懸濁液５ｍｌを２５ｃｍ³の各組織菌株フラスコに加えた。各実験ごとに三つの試験試料用フラスコと三つの対照標準用フラスコを調製した。菌株は３７℃で２４時間培養したが、その間に細胞はフラスコの表面に付着した。試験用試料は下記のようにして殺菌した。ビーズを７０％の水性エタノール中において０．１％ｗ／ｖの濃度で懸濁させ、３時間放置した。つぎに表面浮遊物を傾瀉法で除去した。つぎに親水性ビーズを消毒水で３回洗浄した。疎水性ビーズは９５％の水性エタノールに１時間懸濁させた。いずれの場合も回収したビーズは無菌キャビネット内で空気乾燥させた。［第１日］懸濁媒質を実験用フラスコから除去し、それを試験するポリマの試料を含む５ｍｌの媒質と交換した。対照標準のフラスコ内の媒質は、これを除去して５ｍｌの新鮮な媒質と交換した。［第３日および第６日］第３日および第６日（それぞれ試験する試料を加えてから２日目および５日目）に、一つの試験試料を入れた三つのフラスコと三つの対照標準を培養器から取り出した。フラスコは手短にトリプシンで処理して細胞をフラスコおよび試料から、また、細胞相互から離すようにした。第６日では、細胞が強固に試料に付着している場合にトリプシン処理は２０〜３０分間も要することが多かった。穏やかに振とうすると引き剥がしがうまくいった。細胞の損傷あるいは細胞の溶解を避けるために強く振盪することは避けた。つぎにターナー、スピラツー、シュミットが「J．Pharm．Pharmacol」第４１巻（1989）：７７５〜７８０頁に記載しているような血球計数計チャンバを用い、イメージアナライザを援用するか、または、視覚で計数して細胞の濃度を測定した。結果は試料および対照標準の細胞濃度の平均の間のパーセント値の差であらわした。この試験は、試料がフィブロブラストの増殖を剌激するかどうかを評価するものである。フィブロブラストの増殖は、たとえば第３日と第７日との間など、創傷の治癒の後の段階がとくに望ましい。【実施例】以下、実施例によって本発明を説明する。以下の説明中、部分および割合は、他に指定のないかぎり重量である。［実施例１］（a）ポリ（ヒドロキシプロピルメタクリレート）ビーズ（ＰＨＰＭＡビーズ）の調製２Ｌの反応フラスコにリービッヒコンデンサと攪拌器とを装備し、これをサーモスタットバス内に配置して窒素で清浄した。水１Ｌ中に１０ｇのポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（安定剤）を加えたものをフラスコに入れた。つぎに２００ｇのヒドロキシプロピルメタクリレート（モノマー）、１０ｇのエチレングリコールジメタクリレート（架橋剤）、および、０．５２５ｇのアゾビスイソブチロニトリル（開始剤）の混合物を、フラスコを攪拌しながら徐々に加えた。サーモスタットバスによって温度を７０℃まで上げ、反応混合物を４時間この温度に保持した。ポリマビーズを回収し、洗浄して未反応モノマーを除去し、乾燥させた。つぎに、得られたビーズをふるいに掛けて分別した。以下の例では、通常、直径約１００μｍのビーズを用いた。（b）ｓ−トリアジン官能性をもつポリ（ヒドロキシプロピルメタクリレート）ビーズの調製実施例１の（a）工程で説明した方法により調製した１ｇのＰＨＭＡビーズを５０ｍｌのフラスコ内に１０ｍｌの１２％水酸化ナトリウムと共に入れ、その混合物を氷−塩のバス内で冷却した。４．６ｇのシアヌル酸塩化物（２５ｍｍｏｌ）を１００ｍｌのアセトンに溶かし、新鮮な溶液を氷−塩のバス内で冷却した。この溶液２０ｍｌ部分をビーズの懸濁液に攪拌しながら加えた。９０分後、氷− 塩のバスから混合物を取り出し、さらに９０分間放置した。ついで濾過によりビーズを回収し、５０％水性アセトン、アセトン、および、水で順次洗浄した。（c）誘導ポリ（ヒドロキシプロピルメタクリレート）ビーズの調製実施例１の（b）工程で生成した処理済みビーズを、ついで他の５０ｍｌフラスコに入れた後、溶液中にイプシロン−アミノカプロン酸８ｍｍｏｌを含む４０ｍｌかつ０．５Ｍの水性燐酸塩緩衝液（ｐＨ７．８）で処理した。混合物は室温で２４時間放置し、その後に処理済みビーズと同様にして誘導ビーズを回収した。これをエタノールで洗浄し、空気乾燥させた。このビーズに元素分析（とくに窒素に関して）を行ない、誘導反応が起きたことを確認した。これらのビーズには参照番号１４２を付した。［実施例２］実施例１（a）工程と（b）工程で説明した方法によりｓ−トリアジン官能性をもつＰＨＰＭＡビーズを調製した。つぎに、イプシロン−アミノカプロン酸の代わりにＤ−グルコースアミン用いた以外は実施例１（c）で説明したと同様の方法で上記調製物を処理した。緩衝剤で処理したアミン溶液は、２４後に傾瀉法で捨てて代わりに新鮮なアリコートを用い、その後、さらに２４時間反応を継続させた。誘導ビーズは上記と同様にして回収した。［実施例３］「セファデックスＧ２５コース」の商品名でファーマシア社が発売している架橋デキストランのビーズを水で洗浄して保存剤を除去し、実施例１の（b）工程および（c）工程で説明した方法により処理した。［実施例４］「セファデックスＧ２５コース」の商品名でファーマシア社が発売している架橋デキストランのビーズを水で洗浄して保存剤を除去し、実施例１の（b）工程および実施例２で説明した方法により処理した。これらのビーズには参照番号１２２を付した。［実施例５］（a）デキストランビーズとジオキシランとの反応１０ｇのデキストランビーズ（セファデックスＧ２５コース）を水洗し、蒸留水で膨潤させた。膨潤したビーズの重量は４７ｇであった。これを磁気攪拌器を備えたフラスコ内に入れた。つぎに以下の試薬を順次加えた。（i）２４ｍｌかつ１ＭのＮａＯＨ、（ii）５０ｍｇのＮａＢＨ₄、および、（iii）１０ｍｌのブタン−１、４−ジオール・ジグリシジル・エーテル。５−７時間攪拌を続け、その後にビーズをガラス漏斗上で回収して水で十分に洗浄した。（b）オキシラン官能性ビーズとジアミンとの反応実施例５の（a）工程で調製したビーズを４０ｍｌの蒸留水中に１０ｍｌのエチレンジアミンを含む溶液に加えた。混合物を一晩放置した後に、ビーズをガラス漏斗上で回収して水で洗浄した。（c）アミン官能性ビーズとジアルデヒドとの反応実施例５の（b）工程により調製したビーズ１０ｇを５０ｍｌの０．５Ｍ燐酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）に加えた。１０ｍｌの２５％水性グルタルアルデヒドを加えて混合物を一晩４０℃で培養した。ビーズをガラスの漏斗上で回収してグルタルアルデヒドの臭いが残らなくなるまで水で洗浄した。（d）アルデヒド官能性ビーズとアミンとの反応実施例５の（b）工程により調製したビーズを、３．６ｇのＤ−グルコースアミンを含む１００ｍｌの０．０１５Ｍ燐酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）に加えた。混合物を一晩放置した後、ビーズをガラス漏斗上で回収し、水およびアセトンで洗浄して真空除湿器内で乾燥させた。別個の調製物には参照番号１２８および１２９を付した。［実施例６］実施例５の（d）工程においてグルコースアミンに代えてイプシロン−アミノカプロン酸を用いた以外は実施例５を繰り返した。別個の調製物には参照番号１３２および１３３を付した。［実施例７］（a）アルデヒド官能性をもつポリ（アクリルアミド）ビーズの調製１０ｇのポリ（アクリルアミド）ビーズを８０ｍｌの０．０５ＭでｐＨ７．５の燐酸塩緩衝液に加えた。２０ｍｌの５０重量％水性グルタルアルデヒド溶液を懸濁液に攪拌しながら加え、一晩４０℃で培養した。ビーズをガラスの漏斗上で回収してグルタルアルデヒドの臭いが残らなくなるまで水で洗浄した。（b）アルデヒド官能性ビーズのアミンとの反応実施例７の（a）工程で調製したビーズを実施例５の（d）工程で説明したようにＤ−グルコースアミンで処理した。別個の調製物には参照番号１３０および１３１を付した。［実施例８］実施例７の（b）工程においてＤ−グルコースアミンの代わりにイプシロン− アミノカプロン酸を用いたほかは、実施例７で説明したようにしてポリ（アクリルアミド）ビーズを処理した。別個の調製物には参照番号１３４および１３５を付した。［実施例９］ベンゾキノンの官能性をもつポリ（ヒドロキシプロプルメタクリレート）ビーズの調製実施例１の（a）工程で説明した方法によりＰＨＰＭＡビーズを調製した。１ｇのＰＨＰＭＡビーズを５０ｍｌのフラスコ内に入れ、０．３ｇ（３ｍｍｏｌ）の結晶させたばかりのベンゾキノンを１０ｍｌのエタノールに溶かした溶液で処理した。３０ｍｌの０．５Ｍ水性燐酸塩緩衝液（ｐＨ７．２）を懸濁液を攪拌しながら加えた。室温で６０分放置した後、処理したビーズを瀘過して回収し、５０％水性エタノール、エタノール、水、塩の溶液、および水で順次洗浄した。処理したビーズは、それぞれ実施例１の（c）工程および実施例２で説明したようにしてイプシロン−アミノカプロン酸およびＤ−グルコースアミンと反応させた。［実施例１０］ポリマー材料について試験方法１〜３を用いて評価し、下記の結果を得た。配列は試験方法１の結果にしたがったものである。遊離基の活性に対するポリマー構造の作用にわずかな違いがあることが明らにわかる。マクロファージ試験（試験方法２）での最良の結果は、試料１４２で得られた。この試料のＤＰＰＨ試験（試験方法１）での結果は３３％であった。フィブロブラスト試験（試験方法３）での最良の結果は、試料１３２／１３３で５日後に得られた。この試料のＤＰＰＨ試験での結果は６６％であった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者バロウトーマスリチャードイギリス国コバントリシーブイ５６エヌイーオールバニロード 207 (72)発明者ターナテレンスダドリイギリス国カーディフシーエフ３７エーゼットコウルチェスタアベニュー 86 (72)発明者シュミトリスザードヤーンイギリス国ペナースシーエフ64 ３アールピーレイバノクロード 120 (72)発明者チューグリップヤンイギリス国カーディフシーエフ２４エーエーカーセイズソールズバリロード 35エー

Claims

【特許請求の範囲】１．本明細書で定義されるＤＰＰＨ試験で遊離基活性が、１５〜８０％の範囲にある化学的に変性させたポリマーからなる創傷用被覆剤。２．ポリマーのＤＰＰＨ試験での活性が５０〜８０％の範囲にある請求の範囲第１項記載の創傷用被覆剤。３．ポリマーのＤＰＰＨ試験での活性が１５〜７０％の範囲にある請求の範囲第１項記載の創傷用被覆剤。４．持続性遊離基またはその前駆体である少なくとも一つの化学基を有する化学的に変性させたポリマーからなる創傷用被覆剤。５．傷の環境下で分子酸素と反応して過酸化水素を形成することのできる少なくとも一つの化学基を有する化学的に変性させたポリマーからなる創傷用被覆剤。６．傷の環境下でマクロファージの活性またはフィブロブラストの増殖あるいはその両方を刺激することのできる化学的に変性させたポリマーからなる創傷用被覆剤。