JPH08503705A - 哺乳動物雄における不妊症の治療および受精能の増強 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、受精促進量の受精促進サイモシン・ポリペプチドまたは受精促進抗−サイモシン抗体の投与による哺乳動物雄の不妊症の治療に関する。好ましい態様において、該治療はサイモシンα₁またはサイモシンα₁に対する抗体あるいはサイモシンβ₄の投与よりなる。

Description

【発明の詳細な説明】 哺乳動物雄における不妊症の治療および受精能の増強 発明の分野 本発明は、哺乳動物雄における不妊症を治療する方法に関する。さらに詳しく は、本発明は、ある種のサイモシン・ポリペプチドおよび抗体の、雄不妊症を治 療するための使用に関する。 発明の背景 胸腺は、身体の免疫学的および内分泌学的ホメオスタシスに関係する。ベセド ブスキィ（Besedovsky）ら［ネイチャー（Nature）２４９：３５６−３６１（１ ９７４）］参照。発育における胸腺の重要性および哺乳動物における免疫学的能 力の老化は、今日、一般的に受け入れられている。胸腺の種々の因子は、自然発 生的および実験的に誘導された自己免疫病を引き起こし、妊娠中に免疫応答を変 化させ得る性ホルモンのレベルを変調させると認められている。オーテス（Oate s）ら［トレンズ・ファルマコル・サイエンス（Trends Pharmacol．Sci.）５： ３４７（１９８４）］参照。ホルモン様活性を有するいくつかの液性因子が胸腺 またはその抽出物から単離され、特徴付けられている。例えば、ゴルドシュタイ ン（Goldstein）ら［プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オ ブ・サイエンシズ（Proc．Natl．Acad．Sci.）７４：７２５−７２９（１９７７ ）］参照。単離されている因子はプロサイモシン−α（ＰｒｏＴα）、サイモシ ン−α₁（Ｔα₁）およびサイモシン−β₄（Ｔβ₄）を含む。Ｔα₁およびＴβ₄は 配列決定され、合成されている。Ｔα₁の配列は、例えば、米国特許第４，０７ ９，１２７号（ゴルドシュタイン（Goldstein）ら）に示されている。Ｔβ₄の配 列は米国特許第４，２９７，２７６号（ゴルドシュタイン（Goldstein）ら）で 提供されている。 ヒト精漿における、およびヒト卵胞液におけるＴα₁の存在が報告されている 。引用して本明細書の一部とみなすナズ（Naz）らのインターナショナル・ジャ ーナル・オブ・ファーティリティ（Int．J．Fertil.）３２：３７５（１９８７ ）参照。 ナズらは、精漿中のＴα₁の量と精子カウント数および精液容量の間に相関関係 があり、欠陥のある精子機能を持つ雄においてはそのレベルは有意に低いことを 報告している。 受精は、卵形質膜との融合前に一連の事象を受ける精子が必要とする複雑な過 程である。この事象鎖は、透明帯に結合する精子の受精能獲得、先体反応、およ び透明体を通過する貫通を含み、これらは、すべてナズらのカラント・オピニオ ンオブ・イミュノロジー（Current Opin．Immunol.）２：７４８−７５１（１９ ９０）に記載されている。受精能獲得は、哺乳動物精子細胞が卵母細胞に受精で きる前に受けなければならない生理学的過程である。 不妊症は、集団の実質的部分につき問題が残っている。累積するデータは、子 供が欲しい米国の結婚したカップル４人のうち１人もと多くの者が子供を孕むの に困難を有している。該問題の原因のいくつかを克服するために、人工受精、配 偶子のマイクロマニピュレーションおよび試験管受精のごとき多数の技術が、近 年、精力的に開発されてきた。しかしながら、これらの技術の多くはかなり費用 がかかり、かつ成功率は低い。従って、不妊症の治療に有用な組成物および方法 についての実質的な必要性が存在する。 発明の概要 本発明の目的は、哺乳動物雄における不妊症を治療するための組成物およびそ の治療方法を提供することにある。さらに詳しくは、本発明の目的は、欠陥のあ る精子機能によって引き起こされる哺乳動物雄における不妊症の治療を提供する ことにある。 本目的および他の目的は、Ｔα₁のごとき受精促進サイモシン・ペプチド、ま たは抗−Ｔα₁もしくは抗−Ｔβ₄のごとき受精促進抗−サイモシン抗体を受精促 進量投与することによって達成される。該サイモシン・ペプチドまたは抗−サイ モシン抗体は、不妊症雄の精液から精子を収集し、それを、受精促進サイモシン ペプチドもしくは抗−サイモシン抗体と共に、精子の受精能を促進するのに十分 な時間インキュベートすることによってin vitroで投与することができる。次い で、該精子を洗浄し、卵が受精できる条件下で、卵子と共にインキュベートする 。 別法として、該受精促進サイモシンは、精子の受精能を促進するのに十分な量 をin vivo投与することもできる。 発明の詳細な記載 本発明の１の具体例は、受精促進サイモシン・ペプチドの、不妊症哺乳動物雄 を治療するための使用に関する。本明細書中で用いる「受精促進サイモシン・ペ プチド」なる語は、卵に受精する精子の能力を促進するサイモシン・ペプチドを 意味する。精子が卵に受精する能力は、例えば、精子の受精能獲得を促進するこ とによって、または精子による先体反応を促進することによって改善することが でき、また、卵を貫通する精子の増加によって証明することができる。かかるサ イモシン・ポリペプチドはＴα₁およびその生物学的に活性なアナログおよび断 片を包含する。該サイモシン・ポリペプチドは天然で単離することができ、組換 えによって生産でき、あるいは合成によって生産することができる。 サイモシン分子での治療は、in vitroまたはin vivoいずれかで行うことがで きる。in vitro治療では、サイモシン・ペプチドを、不妊症哺乳動物雄の精液か ら収集した精子に添加し、精子の受精能を増大させるのに十分な時間、典型的に は、約５ないし１０時間インキュベートする。インキュベーション後、精子試料 を洗浄し、単離した卵子と共にインキュベートすることができる。該インキュベ ーションは公知の技術に従って、in vitroまたはin vivoで行うことができる。 別法として、サイモシン・ペプチドはin vivoで投与することもできる。１の 具体例において、サイモシンは、不妊症雄の精漿中のサイモシンの量および当該 雄精子の受精能を増加させるのに十分な一連の注射によって当該雄に投与するこ とができる。別法として、該サイモシンは哺乳動物雌に投与して、雌の膣管にサ イモシンを提供することができ、それにより、サイモシンは膣管に侵入する精子 と反応し、精子の受精能を増加させることができる。例えば、サイモシン・ペプ チドを注射でき、血流中のサイモシンは膜を通過して膣管に移動でき、かくして 、精子と反応することができる。別法として、サイモシンは徐放性カプセル剤に 処方でき、これを雌の膣管に挿入することができる。該カプセル剤はサイモシン をゆっくりと放出し、これは、次いで、膣管に侵入する精子細胞と反応して、該 精 子の受精能を促進することができる。 in vitroまたはin vivo投与用の好ましい受精促進サイモシン・ペプチドはＴ α₁またはその生物学的に活性なアナログもしくは断片よりなる。Ｔα₁は当業者 に知られており、例えば、マディソン州、ベセスダ（Bethesda）にあるアルファ ・ワン・バイオケミカルズ・インコーポレイテッド（Alpha 1 Biochemicals，In c.）から入手できる。Ｔα₁の構造は米国特許第４，０７９，１２７号に開示さ れている。本明細書中で用いる「Ｔα₁」は、米国特許第４，０７９，１２７号 に開示されているＴα₁の構造を有するペプチド、または米国特許第４，６１２ ，３６５号に開示されているごときその分子の生物活性アナログもしくは断片を 包含する。好ましくは、かかる断片は、４ないし１８個のアミノ酸長であり、サ イモシン活性を保持するその塩を包含する。 本発明のもう１つの具体例において、後記するごとく受精促進抗−サイモシン 抗体は哺乳動物雄において不妊症を治療するためにin vitroで投与する。本明細 書中で用いる「受精促進抗−サイモシン抗体」なる語は、精子の受精能を増加さ せるサイモシン・ペプチドに対するポリクローナルもしくはモノクローナル抗体 を意味する。サイモシン・ペプチドは天然のもの、組換えたもの、または合成し たものであり、全長ペプチドおよびその生物学的に活性なアナログもしくは断片 を包含する。受精促進抗体は抗−Ｔα₁抗体および抗−Ｔβ₄抗体を包含する。 前記したごとく、本発明の１の方法において、不妊症哺乳動物雄からの精液か らの精子を収集し、卵子と共にインキュベートするに先立って、受精促進サイモ シン・ペプチドまたは受精促進抗−サイモシン抗体で処理する。 精液を収集する方法は当業者に知られており、本発明はかかる方法に指向され るものではない。好ましくは、精液は液化し、あるいはスイム−アップ（swim-u p）精子集団を収集する。好ましくは、該液化は、３７℃で１５ないし３０分間 加熱することによって起こる。かかる手法はナズらのジャーナル・オブ・セル・ サイエンス（J．Cell Sci.）９９：１５７−１６５（１９９１）に記載されてい る。該スイム−アップ（swim-up）から収集した精子細胞は精子懸濁液を形成し 、これを洗浄する。懸濁させ洗浄する手法用の適当な培地は、（ジブコ（Gibco ）、ニュ ーヨークから得られる）Biggers，Witten and Wittingham（「ＢＷＷ」）培地お よびHam'sＦ−１０培地を含む。該培地にはウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」） を補うのが好ましい。他の補充を用いることができるが、１％補充が十分である 。試料の精子濃度は所望のものに調整する。一般に、適当な濃度は培地１ミリリ ットル当たり約５ないし約１０×１０⁶運動型精子の範囲内である。次いで、該 精子を受精促進サイモシン・ペプチドと共にインキュベートする。好ましくは、 該インキュベーションは、二酸化炭素を増やした雰囲気下、約３７℃で行う。好 ましい雰囲気は９５％空気および５％二酸化炭素よりなるものと決定された。イ ンキュベーション時間は変えることができる。しかしながら、通常、約５ないし 約１０時間、好ましくは約５ないし８時間のインキュベーション時間が受精能獲 得が起こるのに十分である。 また、精子含有試料に添加すべきサイモシンの量も変化させることができる。 効果的な濃度は本発明の開示を理解する当業者ならば決定することができる。典 型的には、該濃度は精子懸濁液１００マイクロリットル当たり約０．０５ないし 約１０マイクログラムの範囲内である。好ましくは、サイモシンの濃度は精子懸 濁液１００マイクロリットル当たり約０．０５ないし約０．５マイクログラムの 範囲内である。適当な量の決定は、精子が受精能獲得に要する時間量に基いて当 業者ならば行うことができる。望ましくは、十分なサイモシンを添加して、約５ ないし１０時間内に精子に受精能を獲得させる。 インキュベーション時間の後、好ましくは１％ＢＳＡを補った培地で再度洗浄 する。この時点で、精子はオオキストと共にインキュベートされる準備ができて いる。接触は人工授精によるin vitroまたはin vivoで行うことができる。かく して、卵を雌から単離し、再着床に先立って、処理精子で受精させることができ る。別法として、サイモシン処理精子をin vivoで卵と共にインキュベートする ことができる。両方の例で適用できる技術は当業者に公知である。 受精促進サイモシンの有効量で精子細胞を処理する別法として、精子細胞を受 精促進抗−サイモシン抗体の有効量で処理することができる。適当な抗体は、精 子の受精能獲得を増大させることによるなどして、精子の貫通率を剌激するのに 有効な抗−サイモシン抗体を包含する。 本発明の好ましい具体例において、該抗体はＴα₁およびＴβ₄に対する抗体か ら選択される。かかる抗体はポリクローナル抗血清またはモノクローナル抗体よ りなることができる。モノクローナル抗体は、例えば、マウスまたはヒト・モノ クローナル抗体よりなることができる。一般に、モノクローナルを生起させる技 術は公知である。例えば、ナズらのサイエンス（Science）、２２５：３４２− ３４４（１９８４）およびナスらのＰＮＡＳ ＵＳＡ、８３：５７１３−５７１ ７（１９８６）参照。ポリクローナル抗体を用いる場合、それらはウサギ、マウ スまたはラットのごとき哺乳動物からのポリクローナル抗血清よりなることがで きる。好ましい抗血清を得るには、Ｔα₁またはＴβ₄を適当な担体蛋白質にカッ プリングさせることができる。かかる担体は当業者に公知であり、例えば、キー ホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ジフテリアトキソイド、破傷風トキ ソイド、チログロブリン、ヒト血清アルブミン等を包含する。該カップリングは 当業者に公知の技術を用いて行う。公知のカップリング剤を用いることができる 。好ましいカップリング剤はグルタルアルデヒドである。 適当な免疫原を得たならば、選択した動物を免疫する。適当な免疫技術は当業 者に公知である。しかしながら、典型的には、フロイントの完全アジュバント中 に乳化させた免疫原で、ウサギまたは他の動物に筋肉内または皮下部位にて注射 する。ブースター法を変形することができる一方、好ましくは、ブースターは２ 週間後、週ベースで投与することができる。ブースターは要するだけの期間継続 させることができる。典型的には、３週間のブースターが、例えば、ウサギを用 いる場合に十分であることが判明した。免疫過程における種々の時点で、血液を 動物から抜き、所望の抗体の存在について力価を測定することができる。通常、 最後のブースターの１週間後、動物から血液を採取し、抗血清を力価測定する。 所望ならば、次いで、プロテイン−Ａセファロースカラムを用いて抗体をアフィ ニティー精製することができる。動物から血液を採取するには種々の技術がある 。当業者に公知のごとく、免疫原のブースター投与は、典型的には、フロイント の不完全アジュバントで乳化した免疫原よりなる。 本発明の方法で抗体を用いる場合、サイモシン・ペプチドと共にするインキュ ベーションについて記載したごとく、それらは精子懸濁液と共にインキュベート する。典型的には、抗体の濃度は精子懸濁液１００マィクロリットル当たり約５ ないし約２５マイクロリットルで変化し得る。限定する意図ではないが、その例 としては、Ｔα₁およびＴβ₄抗血清についての好ましい濃度範囲は、精子懸濁液 １００マイクロリットル当たり約１０ないし約２０マイクロリットル、あるいは １００μｌ当たり特異的ＩｇＧ約２μｇないし約１０μｇである。 インキュベーション期間の最後において、精子細胞を洗浄する。この例におい て、該洗浄により未反応抗体が除かれる。再度、次いで、洗浄した精子細胞を前 記したごとく卵と共にインキュベートすることができる。 受精促進サイモシン・ペプチドおよび抗体での精子細胞のin vitro処理に加え 、サイモシン・ペプチドをin vivoで投与することができる。この具体例の１例 において、精子の受精能獲得を促進するのに十分な量で、１回用量またはそれ以 上の用量にて、サイモシン・ペプチドの溶液を不妊症哺乳動物雄に静脈内注射す る。投与すべきポリペプチドの量は、処理前の患者の精漿中のＴα₁のレベルお よび精子の運動性を含めた多数の因子に依存する。サイモシン・ペプチドは、雄 の精子の受精能獲得を促進するのに十分な量で投与する。これは、精漿中のＴα₁ のレベルを上げることによってなすことができる。 また、サイモシンは、不妊症雄精子を膣管に導入する前に哺乳動物雌に注射す ることもできる。血流に注射されたサイモシンは膜を通過して膣管に移動でき、 そこで、不妊症雄からの精子と反応して、精子の受精能を増大させることができ る。 雌または雄への注射については、一般に、サイモシン・ペプチドの適当な医薬 投与単位は、医薬上許容される担体中、約９００ないし約１２００μｇ／ｍ²体 表面積の範囲内である。マンニトールおよびリン酸緩衝液を含有するサイモシン ・ペプチドの凍結乾燥調製物は分配に先立って希釈剤に溶解させる。サイモシン は１ｍｌの投与バイアルに分配するのが便宜である。 ヒトについては、約１５００ないし約１７００μｇの毎週２回の注射の投与法 が便利である。用量および治療の長さは融通が効き、サイモシンに対する患者の 臨床的応答によって決定できる。 別法として、前記したごとく、サイモシン・ペプチドは生体適合性の徐放性カ プセルに処方でき、これを哺乳動物雌の膣管に移植することができる。該カプセ ルは長時間にわたってサイモシンをゆっくりと膣に放出し、そこで、サイモシン は不妊症雄からの精子と反応して、精子の受精能を増加させることができる。生 物学的に適合する徐放性カプセル剤の製法は当該分野でよく知られている。適当 なカプセル剤の例はラドモスキィー（Radomosky）らのバイオロジー・オブ・リ プロダクション（Biol．of Reproduction）、４７：１３３−１４０（１９９２ ）に記載されている。典型的には、ヒト雌における移植用カプセルは約４ないし 約６ｍｇのサイモシン・ペプチドを有し得る。 理論に拘束されるつもりはないが、受精促進サイモシンペプチドまたは抗−サ イモシン抗体で処理した哺乳動物精子細胞は受精能獲得および先体反応を促進し 、その促進された受精能の基礎を提供することができると信ずる。前記したごと く処理した精子細胞は、非処理精子細胞と比較した場合、上澄み中により多量の アクロシンを放出することが示された。かくして、本発明の１の具体例は、受精 促進サイモシン・ペプチドまたは抗−サイモシン抗体の受精能獲得増大量と精子 とを接触させることを特徴とする、精子細胞が卵の細胞膜を貫通することを可能 とする種々の生理学的および生化学的変化を受ける間に生理学的現象である精子 受精能獲得を増大させる方法よりなる。かかる効果に必要な量は前記した。 さらにもう１つの具体例において、本発明は、サイモシン・ポリペプチドまた は抗体の先体反応誘導量と精子とを接触させることによって、先体反応した精子 の数を増加させる方法よりなる。先体は精子の前端に位置する非常に小さな体で あり、精子が卵と受精すべき場合に、アクロシンのその内容物を放出しなければ ならない。この事象を行うのに必要なサイモシンの濃度は前記した。 本発明を一般的に記載してきたが、以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳し く説明する。 実施例１−ポリクローナル抗血清の調製 グルタルアルデヒドの存在下で、等しい量の抗体およびＫＬＨを用い、Ｔα₁ およびＴβ₄をキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に共有結合でカッ プリングさせた。若い成体ニュージランド・ウサギに、フロイントの完全アジュ バントで乳化したＴα₁−ＫＬＨまたはＴβ₄−ＫＬＨを筋肉内および皮下部位に て注射した。２週間後、該ウサギを各抗原調製物で３週間免疫した。これらの３ 週間の間のブースターはフロイントの不完全アジュバントで乳化した。最後の注 射後１週間後、後眼窩穿剌によって動物から血液採取し、ラジオイムノアッセイ を用いて抗血清を力価測定した。 対照抗血清を供するため、カップリングしたサイモシン・ペプチド無くして同 量のＫＬＨをウサギに注射するか、あるいはＨＧＰ−３０と命名された対照の３ ０個のアミノ酸長のペプチドに連結したＫＬＨを注射する以外は、同一手法を行 った。このペプチドはエイカー，エイ（Achour，A.）らのＰＮＡＳ ＵＳＡ８７ ：７０４５（１９９０）に記載されている。すべての抗血清を５６℃の温度で３ ０分間加熱不活化し、使用するまで−２０℃で貯蔵した。 実施例２−ヒト精子との抗体結合の分析 ナズらのプロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ ンシズ（Proc．Acad．Sci,）８１：８５７−８６１（１９８４）によって記載さ れているごとくに、実施例１で調製した抗体を、間接免疫蛍光技術（ＩＦＴ）に て、メタノール固定したヒト精子とのその結合について分析した。ナズらのジャ ーナル・オブ・セル・サイエンス（J．Cell Sci.）９９：１５７−１６５（１９ ９１）に記載されている手法を用い、妊性男性から得られた精液試料をＰＢＳ中 で洗浄した。高度に運動性の精子のスイム−アップ（swim-up）集団を収集し、 再度ＰＢＳ中で洗浄し、次いで、スライド上で風乾し、室温にて３０分間メタノ ールで固定した。引き続いて、該スライドを風乾し、湿潤チャンバー中、リン酸 緩衝セーライン（ＰＢＳ）での１：５０希釈にて、室温で１・１／２時間抗血清 で処理した。フルオレセイン標識したヤギ抗−ウサギ抗体（１：５０希釈）と共 にインキュベートすることによって、抗体結合の位置決めをした（カペル・ラボ ラトリーズ（Cappel Labs.）、マルボーネ（Malvourne）、ペンシルベニア州） 。ス ライドをＰＢＳで３回洗浄し、アジ化ナトリウム（０．１％）および１，４−ジ アザビシクロ（２，２，２）オクタン（１ミリリットル当たり１０ミリグラム） を含有するＰＢＳ中の９０％グリセロール中に入れて、観察の間にフォトブリー チングを減少させた。調べるまで試料を湿潤チャンバー中、４℃に維持した。 抗−Ｔα₁抗体は、ＩＦＴ中でメタノール固定したヒト精子細胞の先体領域と 優先的に結合することが示された。また、抗−Ｔβ₄抗体は先体領域と強力に反 応し、メタノール固定精子細胞の尾部領域とは弱く反応した。各々、これらの抗 体のＴα₁またはＴβ₄とでの吸収は、精子細胞との抗体の免疫反応性を有意に吸 収した。正常なウサギ血清または抗−ＫＬＨ複合体抗体はメタノール固定精子細 胞と反応しなかった。 実施例３−精子貫通アッセイ 無帯ハムスター卵母細胞（ＳＰＡ）のヒト精子貫通アッセイは、ナズらのジャ ーナル・オブ・セル・サイエンス（J．Cell Sci.）１０２：４８７−４９４（１ ９９２）に記載されているごとくに行った。サイクルの第１日目に３０ＩＵのｅ ＣＧ（妊馬血清ゴナドトロピン）（シグマ・ケミカル・カンパニー（Sigma Chem ical Co.）、セントルイス、ミズリーナ旧の腹腔内注射によって、過剰排卵を成 体雌ゴールデンハムスターで誘導した。５５−７２時間後、２０ＩＵ ｈＣＧ（ ヒト絨毛性ゴナドトロピン）（シグマ（Sigma））を腹腔内投与した。１５−１ ７時間後、該動物を犠牲にし、成熟未受精卵を輸卵管から収集した。Biggers，W itten and Wittingham（ＢＷＷ）培地中、０．２％ヒアルロニダーゼと共にイン キュベーションすることによって、周囲の卵丘細胞から卵子を分離し、およびＢ ＷＷ中、０．１％膵臓トリプシンで処理することによって透明膜から卵子を分離 した。無帯卵子をＢＷＷ中で２回洗浄し、組織培養皿の中央に置いた。 不妊症男性からの精液を３７℃で１５〜３０分間液化し、スイム−アップ（sw im-up）精子集団を収集した。収集技術はナズらのジャーナル・オブ・セル・サ イエンス（J．Cell Sci.）、９９：１５７−１６５（１９９１）に記載されてい る。該スイム−アップ（swim-up）からの精子細胞を、１ミリリットル当たり５ 〜１０×１０⁶運動性精子に調整した１％ＢＳＡ（シグマ・ケミカル・カンパ ニー（Sigma Chemical Co.））を補ったＢＷＷで洗浄し、次いで、Ｔα₁もしく はＴβ₄（精子懸濁液１００ミリリットル当たり０．１〜１０マイクログラム） または免疫原に応答して誘導されたポリクローナル抗血清（抗血清１０〜２０マ イクロリットル／精子懸濁液１００マイクロリットル）または同量の対照抗体（ 正常なウサギ血清、抗−ＫＬＨ抗体または抗−ＨＧＰ−３０抗体）または等容量 の０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（ＰＢＳ／ＢＳＡ）と共に３７℃で（５％ＣＯ₂お よび９５％空気混合物）５〜６時間インキュベートした。インキュベーション後 、精子を洗浄して、未反応サイモシンまたは抗−サイモシン抗体を除去し、帯裸 出ハムスター卵母細胞（各アッセイで３０〜５０個の卵／処理）と共に３ないし ４時間共インキュベートした。該卵母細胞を取り出し、徹底的に洗浄し、３％グ ルタルアルデヒドで固定し、アセトカルミン溶液で染色した。精子貫通は、卵子 の細胞質中の認め得る尾部と共に膨潤した精子頭部の存在によって判定した。卵 子と一緒のインキュベーションの前後の精子の運動性を記録した。異なる妊性提 供者を用いて少なくとも３ないし８回、該アッセイを繰り返し、各試料を少なく とも８２〜４８０個の卵母細胞でテストした。 貫通した卵のパーセントを以下の式に従って計算した。 ％貫通卵子＝（貫通卵子の合計数／インキュベート卵子の合計数）×１００ このアッセイを用いて、ほぼ９３〜１０８％の卵子が妊性男性からの精子で貫 通され、卵母細胞当たり貫通卵１個の平均値であった。該アッセイの結果を表１ に示す。 表１から分かるように、濃度０．０５ないし０．５μｇ Ｔα₁／１００μｌ 精子浮懸濁でテストして、Ｔα₁は、ＰＢＳ−ＢＳＡ処理対照精子と比較して、 貫通卵子のパーセントを有意に（Ｐ＜．００１）増加させた（２．６倍まで）。 表２に示すごとく、Ｔα₁およびＴβ₄に対する抗体は、共に、濃度依存的に、 有意に（Ｐ＜．００１）貫通率を増加させた（４．７倍まで）。同濃度（２０μ ｌ／１００μｌ）でテストした、ＫＬＨ担体に対する、ＨＧＰ−３０／ＫＬＨ複 合体 または正常なウサギ血清に対する抗体は、ＰＢＳ／ＢＳＡ処理対照精子と比較し て、貫通率に影響しなかった。各ペプチドでの抗−Ｔα₁および抗−Ｔβ₄抗体の 免疫吸収は、該抗体の受精促進活性において有意な（Ｐ＜．００１）減少を引き 起こした。 また、シムス（Syms）らのファーティリティ・アンド・ステリリティ（Fertil ．and Steril.）４３：７６６（１９８５）の方法によって、表３に示すごとく 、ＳＰＡを不妊症（ｎ＝１８）および妊性男性（ｎ＝５）について行った。この アッセイでは、液化精液を等容量の予め加温した（３７℃）テスト卵黄緩衝液（ 例えば、ナズらのジャーナル・オブ・セル・サイエンス（J．Cell Sci.）９９： １５７（１９９１）に記載）と組み合せ、４℃で２４時間受精能を獲得させた。 次いで、精子を洗浄し、無帯ハムスター卵母細胞に添加し、卵子当たりの貫通し た精子の数を前記した手法によって測定した。妊性男性からの精子では１００％ の卵子が貫通され、卵母細胞当たり貫通精子２６．２〜３４．９の平均であった （表３）。もし、精子機能が異常であれば、卵母細胞当たりの貫通精子が減少し 、もし精子の異常性が深刻であれば、貫通卵子のパーセントは減少した。Ｔαレ ベルは、妊性男性のそれと比較して、不妊症男性の精漿では有意に（Ｐ＝．００ ２）低かった（平均±Ｓ．Ｄ．、不妊症男性１３２１．８９±５１６．６３；妊 性男性２９６２．２０±１８１１．２５）。Ｔα₁のレベルは、ＳＰＡによると 、卵子当たりの精子の数と有意に相関していた（Ｒ＝０．５６６、Ｐは＜０．０ １）（表３）。 実施例４−先体反応の評価 サイモシン・ペプチドおよびその抗体の効果を、ヒト精子先体反応について調 べた。先体反応に対する効果は、抗体またはペプチドと共にインキュベートした 後、精子の先体状態を測定することによって、ならびに先体反応の後にアクロシ ンの分布を調べることによって評価した。 Ａ．先体状態の評価 ナズらの前記文献に記載されたスイム−アップ（swim-up）手法によって、運 動性精子を妊性男性から収集した。良好な性質の精子試料、すなわち、（１ミリ リットル当たり５×１０⁶運動性精子）、７５％を超える運動性で、０ないし＋ ５のス ケールで＋３ないし＋４の前進のものを、Ｔα₁もしくはＴβ₄または抗−Ｔα₁ 抗体もしくは抗−Ｔβ₄抗体と共にインキュベートした。前記したごとく、同一 量の正常ウサギ血清、抗−ＫＬＨ抗体、抗−ＨＧＰ３０抗体またはＰＢＳ−ＢＳ Ａで対照を処理した。インキュベーション後、精子を遠心し、ＰＢＳ中で洗浄し 、２つのアリコットに分けた。１のアリコットはカルシウムイオノフォア（カル シウムイオノフォアＡ２３１８７（シグマ（Sigma））で先体反応へと誘導し、 精子懸濁液と共に１時間インキュベートした。他のアリコットは、カルシウムイ オノフォア処理することなく、自然に先体反応をさせた。カルシウムイオノフォ ア処理を行って、受精能獲得精子の先体反応を誘導した。先体状態は、ヤゲール （Jager）らの、アーキ・アンドロル（Arch．Androl.）１２：５３−５８（１９ ８４）によって記載されている三重染色手法を用いて評価した。精子をＰＢＳ中 で２回洗浄し、ＰＢＳ中の２％トリパン・ブルー（Trypan blue）（シグマ（Sig ma）1:1v/v）と共に３７℃で１５分間インキュベートした。インキュベーション 後、精子を２回洗浄し、３％のグルタルアルデヒド、０．１ＩＭカコディレート 緩衝液中で６０分間固定し、次いで、ＰＢＳ中で再度２回洗浄した。この懸濁液 の一滴をスライドガラス上に置き、一晩風乾した。乾燥したスライドを脱イオン 水（ｐＨ１．８、２Ｎ ＨＣｌを含む）中の０．８％ビスマルクブラウン（シグ マ（Sigma））で染色し、脱イオン水中ですすぎ、ｐＨ６．０の０．１Ｍカコデ ィレート緩衝液中の０．８％ローズベンガル（シグマ（Sigma））中、室温で４ ５分間染色した。該スライドを再度脱イオン水中で洗浄し、一連のアルコース中 で脱水し、キシレン中で清澄化し、ペルマウント（permount）およびカバースリ ップ（coverslip）で設置した。試料当たり合計２００〜５００の精子を評価し 、生きたもの、または死滅したものとして記録した。生きた精子をさらに先体無 傷または先体非無傷（反応）精子として評価した。実験は、少なくとも３人の異 なる妊性提供者の精子を用いて３〜５回反復した。 濃度０．５マイクログラム／マイクロリットル（Ｔα₁が貫通率を有意に増加 させた用量）でテストすると、Ｔα₁は、ヒト精子細胞の受精能獲得および先体 反応を有意に増加させた（表４）。５〜６時間Ｔα₁とインキュベートするに際 し、 試料は、ＰＢＳ−ＢＳＡで処理した精子試料と比較して、先体反応した精子のよ り高いパーセントを有意に示した（表４）。Ｔα₁で処理した精子試料は、（イ オノフォア処理なくしての）自然な先体反応につきテストしたか、またはイオノ フォア誘導先体反応の後に調べたかに拘わらず、より高いパーセントの先体反応 精子を示した。効果はイオノフォア処理の後により支配的であった。Ｔβ₄は有 意な効果を示さなかった。 Ｔα₁およびＴβ₄に対する抗体は、共に、先体反応した精子のパーセントの有 意な増加を引き起こした（表４）。効果はイオノフォア処理の後により支配的で あったが、再度、自然な先体反応をチェックしたか、または抗体処理精子のイオ ノフォア誘導先体反応の後に調べたかに拘わらず、効果は明らかであった。先体 反応した精子のパーセントに対する有意な効果は、ＰＢＳ−ＢＳＡ対照と比べて 、ＫＬＨに対する抗体またはＨＧＰ−３０ペプチド／ＫＬＨ複合体に対する抗体 での処理によっては観察されなかった。 Ｂ．アクロシン分布の評価 前記したごときカルシウムイオノフォアＡ２３１８７で処理する共にあるいは それ無くして、サイモシン・ペプチドまたは抗−サイモシン抗体または対照抗体 またはＰＢＳ−ＢＳＡと共にインキュベートした後、精子細胞を遠心し、ケネデ ィ（Kennedy）ら［ジャーナル・オブ・アンドロロジー（J．Androl.）１０：２ １−２７（１９８９）］の方法によって、アクロシン活性を上澄みおよび細胞で 測定した。ＰＢＳ９０マイクロリットルに懸濁した上澄みまたはペレット化精子 細胞９０マイクロリットルを、反応混合物１ミリリットルと混合した。反応混合 物は０．０５５Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液中のＮ−ベンゾイル−ｄｌ−アルギニン− Ｐ−ニトロアニリン（ＢＡＰＮＡ）塩酸塩、０．０５５Ｍ ＮａＣｌ、１０％ｖ ／ｖ（ジメチルスルホキシド）、０．１％ｖ／ｖ（トリトン−Ｘ−１００）の１ ミリリットル当たり１ミリグラムよりなるものであった。次いで、該溶液を室温 で３時間インキュベートした。０．５Ｍ ベンズアミジン１００マイクロリット ルの添加によって反応を停止し、Beckmanの分光光度計を用いて、４０５ナノメ ーターで吸光度を測定した。アクロシン活性はμＩＵ／１０⁶精子として表した 。アッ セイの毎日の変化性は、寒冷保存した部分的精製ヒト・アクロシン抽出物を用い て正規化した。かかる抽出物の沈殿はナズら［ジャーナル・オブ・セル・サイエ ンス（J．Cell Sci.）１０２：４８７−４９４（１９９２）］によって教示され ている。 Ｔα₁（０．５マイクログラム／１００マイクロリットル）、抗−Ｔα₁抗体（ ２０マイクロリットル／１００マイクロリットル）または抗−Ｔβ₄抗体（２０ マイクロリットル／１００マイクロリットル）と共にインキュベートすると、Ｐ ＢＳ−ＢＳＡ処理精子比べて、上澄み中に放出された有意により高いアクロシン 濃度および精子細胞におけるより低いアクロシン濃度が示された（Ｐ＝０．０４ ないし０．００１未満）（表４）。効果はイオノフォア処理の後により支配的で あったが、イオノフォア処理の有り無しで調べたたどうかに拘わらず、効果は明 らかであった。対照抗体はいずれも精子細胞のアクロシン分布に対して効果を示 さなかった。Ｔβ₄は有意な効果を示さなかった。 Ｃ．精子の運動性分析 前記したごときサイモシン・ペプチドまたはその抗体で５ないし６時間インキ ュベートしたの後、精子懸濁液のアリコット（７マイクロリットル）をMaklerチ ャンバー（セフィ・メディカル・インストルメンツ（Sefi Medical Instruments ）、イスラエル）に入れ、コンピューター化した精液分析機（セル・セフト・ク リオ・リソーシズ（Cell Soft Cryo Resources）、ニューヨーク）を用いて精子 の運動性特質を測定した。パラメーターのセッティングは、３０Ｈｚのイメージ 周波数、運動性についての３フレームの最小サンプリング、外側頭部運動（「Ａ ＬＨ」）測定の速度および増幅についての１５フレームの最小サンプリング、第 ２閾値速度当たり１０マイクロメーター、ＡＬＨ測定についての２．５の最小直 線性および４〜４０ピクセルの細胞サイズ範囲にて、ピクセル当たり０．６８８ マイクロメーターの倍率キャリブレーションで、３０フレーム分析した。 試料における運動性精子細胞のパーセントに対する効果は、Ｔα₁、Ｔβ₄（１ ００マイクロリットル当たり０．５マイクログラム）またはその各抗体（１００ マイクロリットル当たり２０マイクロリットル）での処理に際して観察 されなかった。しかしながら、Ｔα₁、Ｔα₁に対する抗体およびＴβ₄に対する 抗体は速度、ＡＬＨおよび精子細胞のビート頻度に有意に影響した。効果はＡＬ Ｈおよびビート頻度の増加に対してより明らかであった。Ｔβ₄ペプチドまたは 対照抗体は、いずれも、ＰＢＳ−ＢＳＡ処理対照と比べて、精子細胞の運動性特 性に影響しなかった（表５）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｈ Ｕ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ ，ＮＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ， ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＶＮ (71)出願人 アルバート・アインシュタイン・カレッ ジ・オブ・メディスン・ アメリカ合衆国ニューヨーク州10461、ブ ロンクス、モーリス・パーク・アベニュー 1300番 (72)発明者 ナツ，ラジェシュ・ケイ アメリカ合衆国ニューヨーク州10467、ブ ロンクス、スウェイテス・プレイス660番 (72)発明者 ゴールドシュタイン，アラン・エル アメリカ合衆国メリーランド州20814、ベ セスダ、ブラッドリー・ブレバード6407番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．受精促進サイモシン・ペプチドまたは受精促進抗−サイモシン抗体を不妊 症を有効に治療するのに十分な量にて投与することを特徴とする哺乳動物雄不妊 症を治療する方法。 ２．該受精促進サイモシン・ペプチドがサイモシンα₁（Ｔα₁）またはその生 物学的に活性なアナログもしくは断片である請求の範囲第１項記載の方法。 ３．該受精促進抗−サイモシン抗体がポリクローナルもしくはモノクローナル の抗−Ｔα₁抗体もとくは抗−Ｔβ₄抗体である請求の範囲第１項記載の方法。 ４．不妊症哺乳動物雄からの精子を、受精促進量の受精促進サイモシン・ペプ チドまたは受精促進抗−サイモシン抗体とin vitroで接触させることを特徴とす る哺乳動物雄において不妊症を治療する方法。 ５．（ａ）不妊症哺乳動物雄の精液から精子を収集し；次いで、 （ｂ）該精子を、受精促進サイモシン・ペプチドまたは受精促進抗−サイモシ ン抗体の受精促進量と共に、該精子の受精能を促進するのに有効な時間インキュ ベートすることよりなる請求の範囲第４項記載の方法。 ６．該精子を、１ｍｌ当たり約５〜１０×１０⁶の運動性精子の濃度で懸濁液 中に収集し、サイモシン・ペプチドの濃度が約０．０５ないし約１０μｇ／１０ ０μｌ精子懸濁液の範囲内である請求の範囲第５項記載の方法。 ７．該精子を、１ｍｌ当たり約５〜１０×１０⁶の運動性精子の濃度で懸濁液 中に収集し、抗−サイモシン抗体の濃度が精子懸濁液１００μｌ当たり抗血清の 約１０ないし約２０μｌの範囲内である請求の範囲第５項記載の方法。 ８．さらに、卵子受精条件下で該精子を卵子と共にインキュベートすることよ りなる請求の範囲第５項記載の方法。 ９．不妊症哺乳動物雄からの精子を受精促進サイモシン・ペプチドとin vivo で接触させることを特徴とする哺乳動物雄で不妊症を治療する方法。 １０．医薬上許容される液体担体中の受精促進サイモシン・ペプチドを、不妊 症哺乳動物雄の精子の受精能を増加させるのに十分な量で該不妊症雄に投与する ことよりなる請求の範囲第９項記載の方法。 １１．該サイモシン・ペプチドを、医薬上許容される担体中、約９００ないし 約１２００μｇ／ｍ²体表面積の投与単位で投与する請求の範囲第１０項記載の 方法。 １２．受精促進サイモシン・ペプチドを、続いて雌の膣管に侵入する精子の受 精能を促進するのに十分な量で哺乳動物雌の膣管に導入することよりなる請求の 範囲第９項記載の方法。 １３．該受精促進サイモシン・ペプチドを医薬上許容される液体担体と混合し 、雌に注射する請求の範囲第１２項記載の方法。 １４．該サイモシン・ペプチドを、医薬上許容される担体中、約９００ないし 約１２００μｇ／ｍ²体表面積の投与単位で提供する請求の範囲第１３項記載の 方法。 １５．該受精促進サイモシン・ペプチドを徐放性カプセル剤に処方し、これを 雌の膣管に挿入する請求の範囲第１２項記載の方法。 １６．該徐放性カプセル剤がサイモシン・ペプチドの約４ないし約６ｍｇより なる請求の範囲第１５項記載の方法。 １７．哺乳動物雄の精子を、受精能獲得量の受精促進サイモシン・ペプチドま たは受精促進抗−サイモシン抗体と接触させることを特徴とする哺乳動物雄にお いて精子受精能獲得を増加させる方法。 １８．該受精促進サイモシン・ペプチドがＴα₁またはその生物学的に活性な アナログもしくは断片よりなる請求の範囲第１７項記載の方法。 １９．該受精促進抗−サイモシン抗体がポリクローナルもしくはモノクローナ ルの抗−Ｔα₁抗体もしくは抗−Ｔβ₄抗体である請求の範囲第１７項記載の方法 。 ２０．先体反応誘導量の受精促進サイモシン・ペプチドまたは受精促進抗−サ イモシン抗体で精子を処理することを特徴とする先体反応した精子のパーセント を増加させる方法。 ２１．該サイモシン・ペプチドがＴα₁またはその生物学的に活性なアナログ もしくは誘導体である請求の範囲第２０項記載の方法。 ２２．該抗−サイモシン抗体がポリクローナルもしくはモノクローナルの抗− Ｔα₁もしくは抗−Ｔβ₄抗体である請求の範囲第２０項記載の方法。 ２３．受精促進サイモシン・ペプチドまたは受精促進抗−サイモシン抗体を不 妊症を有効に治療するのに十分な量で含む医薬投与単位よりなる哺乳動物雄の不 妊症治療用組成物。 ２４．該受精促進サイモシン・ペプチドがサイモシンα₁（Ｔα₁）またはその 生物学的に活性なアナログもしくは断片である請求の範囲第２３項記載の組成物 。 ２５．該受精促進抗−サイモシン抗体がポリクローナルもしくはモノクローナ ルの抗−Ｔα₁抗体もしくは抗−Ｔβ₄抗体よりなる請求の範囲第２３項記載の組 成物。 ２６．該医薬投与単位が約０．０５ないし約１０μｇ／１００μｌ精子懸濁液 の範囲内のサイモシン・ペプチドよりなる、精子懸濁液との接触によって精子不 妊症をin vitroで治療するための請求の範囲第２３項記載の組成物。 ２７．精子懸濁液１００μｌ当たり約１０ないし約２０μｌの抗血清の範囲の 濃度の抗−サイモシン抗体よりなる、精子懸濁液との接触によってin vitroで精 子不妊症を治療するための請求の範囲第２３項記載の組成物。 ２８．該医薬投与単位が注射剤であって、医薬上許容される液体担体を含む請 求の範囲第２３項記載の組成物。 ２９．該医薬投与単位が、医薬上許容される液体担体中、約９００ないし約１ ２００μｇ／ｍ²体表面積哺乳動物にてサイモシン・ペプチドを含有する請求の 範囲第２３項記載の組成物。 ３０．該医薬投与単位を雌膣管に挿入するための徐放性カプセル剤に処方する 請求の範囲第２３項記載の組成物。 ３１．該徐放性カプセル剤が約４ないし約６ｍｇのサイモシン・ペプチドより なる請求の範囲第３０項記載の組成物。 ３２．先体反応誘導量の受精促進サイモシン・ペプチドまたは受精促進抗−サ イモシン抗体を含む医薬投与単位よりなる先体反応した精子のパーセントを増加 させるために用いる組成物。 ３３．該サイモシン・ペプチドがＴα₁またはその生物学的に活性なアナログ もしくは誘導体よりなる請求の範囲第３２項記載の組成物。 ３４．該抗−サイモシン抗体がポリクローナルもしくはモノクローナルの抗− Ｔα₁抗体もしくは抗−Ｔβ₄抗体よりなる請求の範囲第３２項記載の組成物。