FI113007B - Menetelmä ja koostumus siittiöiden hedelmöityskyvyn lisäämiseksi - Google Patents

Description

, 113007

Menetelmä ja koostumus siittiöiden hedelmöityskyvyn lisäämiseksi

Keksinnön ala 5 Tämä keksintö koskee menetelmää siittiöiden hedel möityskyvyn lisäämiseksi sekä koostumusta käytettäväksi siittiöiden hedelmöityskyvyn lisäämiseksi in vitro. Yksityiskohtaisemmin keksintö koskee tiettyjen tymosiinipoly-peptidien ja -vasta-aineiden käyttöä urosten hedelmättö-10 myyden hoitamiseksi in vitro.

Keksinnön tausta

Kateenkorva sisältyy kehon immunologiseen ja endo-krinologiseen homeostaasiin. Katso Besedovsky et ai., Nature 249 (1974) 356 - 361. Kateenkorvarauhasen tärkeys im-15 munologisen kompetenssin kehityksessä ja vanhenemisessa nisäkkäillä hyväksytään nyt yleisesti. Kateenkorvarauhasen eri tekijöiden havaitaan mukauttavan sukupuolisteroidien tasoja, jotka puolestaan voivat aiheuttaa spontaaneja ja kokeellisesti indusoituja autoimmuunitauteja ja muuttaa 20 immuunivastetta raskauden aikana. Katso Oates et ai., Trends Pharmacol. Sei. 5 (1984) 347. Kateenkorvasta tai sen uutteista on eristetty ja karakterisoitu useita humo- • raalisia tekijöitä, joilla on hormonityyppistä aktiivi- : : suutta. Katso esim. Goldstein et ai., Proc. Natl. Acad.

25 Sei. 74 (1977) 725 - 729. Eristetyt tekijät sisältävät • · : protymosiini-alfa' n (ProTalfa) , tymosiini-αι' n (Tai) ja • 1 · · tymosiini-B4'n (Τβ/j) . Tai ja Ta4 on sekvenoitu ja synteti- • > · soitu. Talfai'n sekvenssi nähdään esimerkiksi US-patent-.. , ti julkaisussa nro 4 079 127 (Goldstein et ai.). Th4!n sek- » i · •fi;’ 30 venssi annetaan US-patentti julkaisussa 4 297 276 (Gold- I | ’·;·1 stein et ai.) .

•:· 1: Tai' n olemassaolo ihmisen siemennesteen plasmassa ·;·: ja ihmisen munarakkulan nesteessä on raportoitu. Katso Naz et ai., Int. J. Fertil. 32 (1987) 375, liitetty tähän • · • '1 35 viitteenä. Naz et ai. raportoivat, että siemennesteen • · · ’· '! plasman Tai'n määrän ja siittiöiden määrän ja siemennes- 2 113007 teen tilavuuden välillä oli korrelaatiota ja että tasot olivat huomattavasti matalammat miehillä, joiden siittiöiden toiminnassa oli vikaa.

Hedelmöitys on monimutkainen prosessi, joka edel-5 lyttää siittiöiden käyvän läpi ketjun tapahtumia ennen kuin ne fuusioituvat munasolun plasmamembraaniin. Tämä tapahtumaketju sisältää munasolun kettoon sitoutuvien siittiöiden kapasitaation, akrosomin reaktion ja tunkeutumisen munasolun keton läpi, kukin tapahtuu kuten Naz et ai. ovat 10 kuvanneet, Current Opin. Immunol. 2 (1990) 748 - 751. Ka-pasitaatio on fysiologinen prosessi, jonka nisäkkään siit-tiösolun täytyy käydä läpi ennen kuin se voi hedelmöittää oosyytin.

Hedelmättömyys on pysyvä ongelma oleelliselle 15 osalle väestöä. Kumulatiiviset tulokset osoittavat, että Yhdysvalloissa jopa yhdellä neljästä avioituneesta parista, joka haluaa saada lapsia, on vaikeuksia saada lapsi. Useita tekniikoita, kuten keinotekoinen siitos, sukusolujen mikromanipulaatio ja in vitro hedelmöitys, on kehitet-20 ty viime vuosina yrityksenä ratkaista joitakin ongelman syitä. Monet näistä tekniikoista ovat kuitenkin melko kai-liitä ja onnistumismäärät ovat olleet pieniä. Tämän takia » ’ \i on olemassa oleellinen tarve koostumuksille ja menetelmil- i le, jotka ovat käyttökelpoisia hedelmättömyyden hoidossa.

; ,· 25 Keksinnön yhteenveto '. Esillä olevan keksinnön kohteena on antaa käyttöön ,· *. koostumuksia ja menetelmiä hedelmättömyyden hoitamiseksi • · urosnisäkkäillä in vitro. Keksinnön mukaiselle menetelmäl- .. , le on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esi- • · · • · 30 tetään ja keksinnön mukaiselle koostumukselle on tunnus- • · *···* omaista se, mitä patenttivaatimuksessa 6 esitetään. Kek- *:*·: sintö tarjoaa apua urosnisäkkäiden hedelmättömyyteen, jon- ····! ka aiheuttaa vika siittiöiden toiminnassa.

• · ..· Tämä ja muut kohteet toteutetaan antamalla hedel- • * •\ Ί 35 mällisyyttä lisäävää tymosiinipeptidiä, kuten Tai'ä tai • · * ’· '· hedelmällisyyttä lisäävää anti-tymosiini-vasta-ainetta, 3 113007 kuten anti-Ται- tai anti-Th4-vasta-ainetta, hedelmällisyyttä lisäävä määrä. Tymosiinipeptidi tai anti-tymosiini-vasta-aine annetaan in vitro keräämällä siittiöt hedelmättömän uroksen siemennesteestä ja inkuboimalla niitä hedel-5 mällisyyttä lisäävän tymosiinipeptidin tai anti-tymosiini-vasta-aineen kanssa ajanjakso, joka on riittävä lisäämään siittiöiden hedelmöityskykyä. Sen jälkeen siittiöt pestään ja niitä inkuboidaan munasolujen kanssa olosuhteissa, joissa munasolu voidaan hedelmöittää.

10 Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus

Esillä olevan keksinnön eräs suoritusmuoto koskee hedelmällisyyttä lisäävän tymosiinipeptidin käyttöä hedelmättömien urosnisäkkäiden hoidossa. Tässä käytettynä "hedelmällisyyttä lisäävä tymosiinipeptidi" tarkoittaa tymo-15 siinipeptidiä, joka lisää siittiöiden kykyä hedelmöittää munasolu. Siittiöiden kykyä hedelmöittää munasolu voidaan parantaa esimerkiksi lisäämällä siittiöiden kapasitaatiota tai edistämällä akrosomin reaktiota, ja se voidaan näyttää toteen niiden siittiöiden määrän lisäyksenä, jotka tunkeu-20 tuvat munasoluihin. Tällaisia tymosiinipolypeptidejä ovat Tai ja sen biologisesti aktiiviset analogit ja fragmentit. Tymosiinipolypeptidiä voidaan eristää luonnosta, tuottaa ' l rekombinanttitekniikoilla tai synteettisesti, ί Käsittely tymosiinimolekyylillä suoritetaan in : j 25 vitro. In vitro -käsittelyä varten tymosiinipeptidi lisä- * · : ·. tään siittiöihin, jotka on kerätty hedelmättömän uros- * t * 1 · .· ·, nisäkkään siemennesteestä, ja niitä inkuboidaan ajanjakso, * · joka riittää lisäämään siittiöiden hedelmöityskykyä, tyy- . pillisesti noin 5-10 tuntia. Inkuboinnin jälkeen siit- • · • ·’ 30 tiönäyte voidaan pestä ja sitä voidaan inkuboida eristet- ’···’ tyjen munasolujen kanssa. Inkubointi voidaan suorittaa in *:·1: vitro tai in vivo tunnettujen tekniikoiden mukaisesti.

* » » 1 · * · · * · ’ 1 · • ♦ 4 113007

Edullinen hedelmällisyyttä lisäävä tymosiinipepti-di, annettaessa in vitro, sisältää Tai'n tai sen biologisesti aktiivisia analogeja tai fragmentteja. Tai on tunnettu alan ammattimiehille ja sitä on saatavissa esimer-5 kiksi Alpha 1 Biomedicals, Inc.'sta, Bethesda, MD. Ταχ'η rakenne kuvataan US-patenttijulkaisussa nro 4 079 127. Tässä käytettynä Tai sisältää peptidin, jolla on Tai'n rakenne, joka kuvataan US-patenttijulkaisussa nro 4 079 127 tai tämän molekyylin bioaktiivisia analogeja tai fragment-10 teja, sellaisia, jotka kuvataan US-patenttijulkaisussa 4 612 365. Edullisesti tällaiset fragmentit ovat 4-8 aminohapon pituisia, sisältävät niiden tymosiiniaktiivisuutta ylläpitäviä suoloja.

Esillä olevan keksinnön mukaisesti, kuten jäljem-15 pänä on esitetty, annetaan hedelmällisyyttä lisääviä anti-tymosiinivasta-aineita in vitro urosni-säkkäiden hedelmättömyyden hoitamiseksi. Tässä käytettynä "hedelmällisyyttä lisäävät anti-tymosiinivasta-aineet" tarkoittavat tymosiinipeptidin polyklonaalisia tai monoklonaalisia vas-20 ta-aineita, jotka lisäävät siittiöiden hedelmöityskykyä.

Tymosiinipeptidi voi olla luonnollinen, rekombinantti tai synteettinen, ja se sisältää kokopitkän peptidin ja sen /. biologisesti aktiivisia analogeja tai fragmentteja. Hedel- : mällisyyttä lisääviä vasta-aineita ovat anti-Tai-vasta- ,j 25 aineet ja anti-TB4~vasta-aineet.

* · : ·. Kuten edellä on mainittu, esillä olevan keksinnön * · * i · eräässä menetelmässä kerätään siittiöitä hedelmättömän • * · urosnisäkkään siemennesteestä ja niitä käsitellään hedel- .. , mällisyyttä lisäävillä tymosiinipeptideillä ja hedelmäin- • * · 30 syyttä lisäävillä anti-tymosiini-vasta-aineilla ennen in- '···’ kubointia munasolujen kanssa.

j* .· Menetelmät siemennesteen keräämiseksi ovat tunnet- ·;··· tuja alan ammattimiehille eikä keksintöä kohdisteta täl- laisiin menetelmiin. Edullisesti siemenneste nesteytetään • · 35 ja "swim-up"-siittiöpopulaatio kerätään. Edullisesti nes- • · · *· teytys tapahtuu lämmittämällä 15 - 30 minuuttia 37 °C.

5 113007 Tällaisen menetelmän kuvaavat Naz et ai., J. Cell Sei. 99 (1991) 157 - 165. Kerätyt siittiösolut "swim-up"- populaatiosta muodostavat siittiösuspension, joka pestään. Sopivia alustoja suspendointi- ja pesumenetelmiin ovat 5 Biggers, Witten ja Wittingham ("BWW") -alusta ja Ham'n ΓΙΟ -alusta (saatu Gibco'lta, N.Y.). On edullista lisätä alustaan naudan seerumin albumiinia ("BSA"). 1 %:n lisäys on riittävä, vaikka muunkinlaisia lisäyksiä voidaan käyttää. Näytteen siittiöpitoisuus säädetään halutulle tasol-10 le. Yleensä sopivat pitoisuudet ovat noin alueella 5 - 10 x 106 liikuntakykyistä siittiötä millilitrassa alustaa. Sen jälkeen siittiöitä inkuboidaan hedelmällisyyttä lisäävien tymosiinipeptidien kanssa. Edullisesti inkubointi suoritetaan noin 37 °C atmosfäärissä, johon on lisätty 15 hiilidioksidia. Edullisen atmosfäärin on määritelty sisältävän 95 % ilmaa ja 5 % hiilidioksidia. Inkubointiaika voi vaihdella. Yleensä kuitenkin noin 5-10 tunnin, edullisesti 5-8 tunnin inkubointiaika, on riittävä siihen, että kapasitaatio voi tapahtua.

20 Tymosiinin määrä, joka tulee lisätä siittiöitä si sältävään näytteeseen, voi myös vaihdella. Alan ammatti-'· miehet, joilla on käytettävissään esillä olevan keksinnön 1, /· kuvaus, voivat määrittää tehokkaat pitoisuudet. Tyypilli- .· sesti pitoisuus on alueella noin 0,05 - 10 mikrogrammaa • » ,· 25 100 mikrolitrassa siittiösuspensiota. Edullisesti tymosii- • · : nin pitoisuus on alueella noin 0,05 - 0,5 mikrogrammaa 100 * * · .· ·. mikrolitrassa siittiösuspensiota. Tavalliset alan ammatti- • · miehet voivat määrittää sopivan määrän, joka perustuu sii- .. , hen aikaan, jonka siittiöt tarvitsevat kapasitoituakseen.

• · • · \ ; 30 Edullisesti lisätään riittävä tymosiinimäärä siittiöiden '··* kapasitoitumiseksi 5-10 tunnissa.

*: * * * Inkubointijakson jälkeen siittiöt pestään alustal- ·;·· la, johon on jälleen edullisesti lisätty l-%:inen BSA.

Tässä vaiheessa siittiöt ovat valmiita inkuboitaviksi mu-*_ Ί 35 nasolujen kanssa. Kontakti voi tapahtua joko in vitro kei- • t · *· '· nosiemennyksellä tai in vivo. Tällöin munasolut voidaan 6 113007 eristää naaraista ja hedelmöittää käsitellyillä siittiöillä ennen takaisinistutusta. Vaihtoehtoisesti tymosiinilla käsiteltyjä siittiöitä voidaan inkuboida munasolujen kanssa in vivo. Aplikointitekniikat kummassakin tapauksessa 5 ovat tunnettuja alan ammattimiehille.

Vaihtoehtona siittiösolujen käsittelylle tehokkaalla määrällä hedelmällisyyttä lisäävää tymosiinia, siittiösolut voidaan käsitellä tehokkaalla määrällä hedelmällisyyttä lisäävää anti-tymosiini-vasta-ainetta. Sopivia 10 vasta-aineita ovat anti-tymosiini-vasta-aineet, jotka ovat tehokkaita stimuloimaan siittiöiden läpäisymääriä, kuten esimerkiksi lisäämällä siittiön kapasitaatiota.

Tämän keksinnön edullisissa suoritusmuodoissa vasta-aineet valitaan vasta-aineista Tai1 lie ja TB^lle. Täl-15 laiset vasta-aineet voivat sisältää polyklonaalisia vasta-aineita tai monoklonaalisia vasta-aineita. Monoklonaaliset vasta-aineet voivat sisältää esimerkiksi hiiren tai ihmisen monoklonaalisia vasta-aineita. Yleensä tekniikat mono-klonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi ovat tunnettu-20 ja. Katso esim. Naz et ai., Science 225 (1984) 342 - 344 ja Naz et ai., PNAS USA, 83 (1986) 5 713 - 5 717. Mikäli käytetään polyklonaalisia vasta-aineita ne voivat sisältää » • polyklonaalisia vasta-aineita nisäkkäistä, kuten kaneista, ! hiiristä tai rotista. Edullisen vasta-aineen saamiseksi ,· 25 Tai tai Τβ4 voidaan kytkeä sopivaan kantajaproteiiniin.

: ·, Tällaiset kantajaproteiinit ovat tunnettuja alan ammatti- * miehille ja niitä ovat esimerkiksi tulivuorikotilon he-mosyaniini (KLH), difteriatoksoidi, tetanustoksoidi, tyro- .. , globuliini, ihmisen seerumin albumiini ja niin edelleen.

* · ’ ·* 30 Kytkeminen suoritetaan käyttäen tekniikoita, jotka ovat ’···* tunnettuja alan ammattimiehille. Voidaan käyttää tunnettu- ·:*·· ja kytkemisreagensseja. Edullinen kytkemisreagenssi on glutaraldehydi.

t.· Sen jälkeen kun on saatu sopivia immunogeeneja, • · • ” 35 valittu eläin immunisoidaan. Sopivat immunisointitekniikat • · · ’· '· ovat tunnettuja alan ammattimiehille. Tyypillisesti kui- 7 113007 tenkin kani tai muu eläin injektoidaan lihaksensisäisesti tai ihonalaisesti irrununogeenilla, joka on emulsiona Freund'n täydellisessä adjuvantissa. Vaikka tehosteohjel-mat voivat vaihdella, tehosteet annetaan kahden ensimmäi-5 sen viikon jälkeen edullisesti viikon välein. Tehosteita voidaan jatkaa niin pitkään kuin tarvitaan. Tyypillisesti on havaittu, että kolmen viikon aikana saadut tehosteet riittävät, esimerkiksi kun käytetään kaneja. Eri ajankohtina immunisaatioprosessin aikana voidaan ottaa verta 10 eläimestä ja määrittää siitä tiitteri halutun vasta-aineen määrittämiseksi. Yleensä viikon kuluttua viimeisestä boos-terista eläimistä otetaan veret ja antiseerumin tiitteri määritetään. Mikäli halutaan, vasta-aineet voidaan sen jälkeen affiniteettipuhdistaa käyttäen Proteiini-A 15 Sepharose -pylvästä. On useita tapoja ottaa eläimestä veret. Kuten alan ammattimiehet tietävät immunogeenitehos-teet sisältävät tyypillisesti immunogeenin emulsiona Freund'n täydellisessä adjuvantissa.

Kun vasta-aineita käytetään esillä olevan keksin- 20 non menetelmässä, niitä inkuboidaan siittiösuspension kanssa, kuten on aikaisemmin kuvattu tymosiinipeptidien kanssa inkuboinnin yhteydessä. Tyypillisesti vasta-aine- : pitoisuus voi vaihdella noin 5:stä 25:een mikrolitraan an- : *; tiseerumia 100 mikrolitrassa siittiösuspensiota. Esimerkki ;‘ | 25 kuvauksessa, jota ei tule pitää rajoittavana, edullinen : . pitoisuusalue sekä Tai- että Tfi4-antiseerumeille on noin , 10-20 mikrolitraa antiseerumia 100 mikrolitrassa sper- masuspensiota tai noin 2-10 mikrogrammaa spesifistä ,, , IgG:tä 100 mikrolitrassa.

» « · • *’ 30 Inkubointijakson lopuksi siittiösolut pestään.

'*·.* Tässä tapauksessa pesulla poistetaan reagoimattomat vasta- » ;·· aineet. Jälleen pestyjä siittiösoluja voidaan sen jälkeen inkuboida munasolujen kanssa, kuten edellä on kerrottu.

Tymosiinipeptidi voidaan formuloida biologisesti ^ ” 35 sopivaan, hitaasti vapauttavaan kapseliin, joka istutetaan naarasnisäkkään emättimen alueelle. Kapseli vapauttaa ajan s 113007 kuluessa hitaasti tymosiinia emättimeen, jossa se voi reagoida hedelmättömän uroksen siittiöiden kanssa siittiöiden hedelmöityskyvyn lisäämiseksi. Menetelmät biologisesti sopivien, hitaasti vapauttavien kapselien valmistamiseksi, 5 ovat alalla hyvin tunnettuja. Esimerkin sopivasta kapselista kuvaavat Radomsky et ai., Biol, of Reproduction 47 (1992) 133 - 140. Tyypillisessä naarasnisäkkääseen istu tettavaksi tarkoitetussa kapselissa voi olla noin 4 - 6 mg tymosiinipeptidiä.

10 Vaikka ei halutakaan sitoutua teorioihin, usko taan, että hedelmällisyyttä lisäävällä tymosiinipeptidillä tai anti-tymosiini-vasta-aineella käsitellyillä nisäkkään siittiösoluilla on lisääntynyt kapasitaatio ja akrosomin reaktio, mikä voi luoda pohjan niiden lisääntyneelle he-15 delmöityskyvylle. Edellä kuvatulla tavalla käsiteltyjen siittiösolujen on osoitettu vapauttavan suurempia määriä akrosiinia supernatanttiin käsittelemättömiin siittiö-soluihin verrattuna. Siten eräs keksinnön suoritusmuoto sisältää menetelmän siittiöiden kapasitaation lisäämisek-20 si, fysiologisen tapahtuman, jonka aikana siittiösolut käyvät läpi erilaisia fysiologisia ja biokemiallisia muu-toksia, jotka saavat aikaan sen, että ne kykenevät tunkeu-: tumaan munasolujen membraaneihin, mikä sisältää siittiöi- ; den saattamisen yhteen kapasitaatiota lisäävän määrän - | 25 kanssa hedelmällisyyttä lisäävää tymosiinipeptidiä tai an- ; ·. ti-tymosiinivasta-ainetta. Tällaiseen vaikutukseen tarvit- t ^ tavat määrät on kuvattu edellä.

» ·

Vielä eräässä suoritusmuodossa esillä oleva kek- , sintö sisältää menetelmän lisätä akrosomistaan reagoinei- * 30 den siittiöiden lukumäärää saattamalla siittiöt yhteen ak- * · *·-·' rosomin reaktiota indusoivan määrän kanssa tymosiinipoly- ·;··· peptidiä tai -vasta-ainetta. Akrosomi on erittäin pieni kappale, joka sijaitsee siittiöiden etupäässä, jonka täytyy vapauttaa akrosiinisisältönsä, mikäli siittiön on mää- : “ 35 rä kyetä hedelmöittämään munasolu. Tymosiinipitoisuudet, * * » 9 113007 joita tarvitaan vaikuttamaan tähän tapahtumaan, on kuvattu edellä.

Keksintö on yleisesti kuvattu, seuraavat ei-rajoittavat esimerkit esitetään keksinnön valaisemiseksi 5 edelleen.

Esimerkki 1

Polyklonaalisten vasta-aineiden valmistus

Tai ja Τβ4 kytkettiin kovalenttisesti tulivuoriko-tilon hemosyaniiniin (KLH) käyttäen yhtä suuria määriä 10 vasta-ainetta ja KLH'ta glutaraldehydin läsnäollessa. Nuoria Uuden Seelannin aikuisia kaneja injektoitiin lihaksen sisäisiin ja ihonalaisiin kohtiin Ται-KLH'lla tai TB4-KLH'lla, joista oli tehty emulsio Freund'n täydelliseen adjuvanttiin. Kahden viikon jälkeen kaneja immunisoitiin 15 vastaavilla antigeenipreparaateilla viikottain kolmen viikon ajan. Näiden viikkojen aikana annettava tehoste tehtiin emulsioksi Freund'n epätäydellisellä adjuvantilla. Viikko viimeisen injektion jälkeen eläimistä otettiin veret retro-orbitaalisella punktiolla ja antiseerumin tiit-20 teri määritettiin radioimmunomäärityksellä.

Kontrolliantiseerumin tuottamiseksi seurattiin sa-maa menetelmää paitsi, että kanit injektoitiin samalla : määrällä KLH'ta ilman siihen kytkettyjä tymosiinipeptide- jä, tai KLH'lla, joka oli konjugoitu 30 aminohappoa pit-.·. : 25 kään kontrollipeptidiin, jota nimitettiin HGP-30'ksi. Tä- ; män peptidin kuvaavat Achour, A et ai., PNAS USA 87 (1990) 1V 7 045. Kaikki antiseerumit inaktivoitiin lämmöllä 56 °C:n lämpötilassa 30 minuuttia ja niitä säilytettiin -20 °C:ssa ennen käyttöä.

• » · ·’ 30 Esimerkki 2 * » i h..* Vasta-aineen sitoutumisen analysointi ihmisen ;··· siittiöiden kanssa

Esimerkissä 1 valmistetuista vasta-aineista analysoitiin niiden sitoutuminen metanolilla kiinnitettyjen ih- • · : " 35 misen siittiöiden kanssa epäsuorassa immunofluoresenssi- tekniikassa (IFT) kuten Naz et ai. ovat kuvanneet, Proc.

10 113007

Acad. Sei., 81 (1984) 857 - 861. Siemennestenäytteet, jotka saatiin hedelmättömiltä miehiltä käyttäen menetelmää, jonka ovat kuvanneet Naz et ai., J. Cell. Sei. 99 (1991) 157 - 165, pestiin PBS:ssä. Erittäin liikuntakykyisten 5 siittiöiden "swim-up"-populaatio kerättiin ja pestiin jälleen PBS'ssä ja sen jälkeen kuivattiin ilmassa objektila-silla ja kiinnitettiin metanolilla 30 minuutin ajan huoneen lämpöti lassa. Sen jälkeen objektilasi kuivattiin ilmassa ja sitä käsiteltiin antiseerumin kanssa laimennoksen 10 ollessa 1:50 fosfaatilla puskuroituun fysiologiseen suolaliuokseen (PBS), huoneenlämpötilassa 1,5 tuntia, kosteassa kammiossa. Vasta-aineen sitoutuminen paikannettiin inku-boimalla fluoreskeiinilla leimatulla vuohen anti-kani-vasta-aineilla (laimennos 1:50), (Cappel Labs., Malvourne, 15 PA.). Objektilasit pestiin PBS:llä kolme kertaa, näyte kiinnitettiin 90-%:iseen glyseroliin PBS:ssä, joka sisältää natriumatsidia (0,1 %) ja 1,4-diatsibisyklo-(2,2,2)- oktaania (10 mg/ml) valosta aiheutuvan vaalenemisen vähentämiseksi katsomisen aikana. Näytteitä pidettiin 4 °C:ssa 20 kosteassa kammiossa tutkimiseen asti.

Anti-Tai-vasta-aine osoitti sitoutumista pääasiassa metanolilla kiinitettyjen ihmisen siittiösolujen ak-: rosomin alueelle IFT:ssä. Myös anti-TB4-vasta-aine reagoi I ; voimakkaasti akrosomien kanssa ja se reagoi heikosti me- 25 tanolilla kiinnitettyjen siittiösolujen häntäalueiden : ·. kanssa. Näiden vasta-aineiden absorptio Tai' n tai Τβ4' n , kanssa, tässä järjestyksessä, (20 mikrolitraa vasta- ainetta ja 10 mikrogrammaa Tai'tä tai TB4'ta) absorboi ,, , huomattavasti pois vasta-aineiden immunoreaktiivisuutta ‘ 30 siittiösolujen kanssa. Normaali kanin seerumi tai anti- KLH-konjugaattivasta-aineet eivät reagoineet metanolilla ;·· kiinitettyjen siittiösolujen kanssa.

Esimerkki 3 • ·

Sperman läpäisymääritys • » ” 35 Ihmisen sperman läpäisymääritys ketottomiin hams- > i · * terin oosyytteihin (SPA) suoritettiin, kuten Naz et ai.

11 113007 ovat kuvanneet, J. Cell Sei. 102 (1992) 487 - 494. Supero-vulaatio indusoitiin aikuisille naaraspuolisille kulta-hamstereille injektoimalla vatsaontelonsisäisesti 30 IU:ta eCGrtä (kantavan tamman seerumin gonadotropiini) (Sigma 5 Chemical Co., St. Louis, MO) kierron ensimmäisenä päivänä. 55 - 72 tunnin jälkeen 20 IU:ta hCG'tä (ihmisen korion-gonadotropiini) (o) annettiin vatsaontelon sisäisesti. 15 - 17 tuntia myöhemmin eläimet lopetettiin ja kypsät he-delmöittymättömät munasolut kerättiin munanjohtimista. Mu-10 nasolut eristettiin ympäröivistä munakummun soluista inku-boimalla 0,2-%:isella hyaluronidaasilla Biggers, Witten ja Wittingham (BWW) -alustassa ja munasolun ketosta käsittelemällä 0,l-%:isella haiman trypsiinillä BWW:ssä. Ketotto-mat munasolut pestiin kahdesti BWW:ssä ja asetettiin kes-15 kelle kudosviljelymaljaa.

Hedelmälliseltä mieheltä peräisin olevaa siemennestettä nesteytettiin 15 - 30 minuuttia 37 °C:ssa ja "swim-up"-spermapopulaatio kerättiin. Keräystekniikat kuvataan seuraavassa: Naz et ai., J. Cell Sei. 99 (1991) 20 157 - 165. Siittiösolut "swim-up"-populaatiosta pestiin BWW:llä, joka oli tehty l-%:iseksi BSA:n suhteen (Sigma ’· Chemical Co.), säädetty pitoisuuteen 5 - 10 x 106 liikun- : /· takykyistä siittiötä millilitraa kohden ja sen jälkeen an- : : nettu inkuboitua 5-6 tuntia 37 °C:ssa (5-%:isen C02:n ja ; ,· 25 95-%:isen ilman seoksessa) Ταχ'η tai TB^n kanssa (0,1 - : \ 10 mikrogrammaa 100 millilitraa kohden siittiösuspensiota) , ·. tai polyklonaalisten antiseerumien kanssa, jotka oli tehty » · näitä immunogeeneja vastaan (10 - 20 mikrolitraa antisee- , rumia/100 mikrolitraa siittiösuspensiota) tai saman määrän • » \ ; 30 kanssa kontrollivasta-aineita (normaali kanin seerumi, an- ti-KLH-vasta-aineet tai anti-HGP-30-vasta-aineet) tai yh-·;·: täläisen tilavuuden kanssa PBS'ää, joka sisältää 0,5 % ·;1 2·· BSA:ta (PBS/BSA) . Inkuboinnin jälkeen siittiöt pestiin reagoimattoman tymosiinin tai anti-tymosiini-vasta-aineen • i t ' 35 poistamiseksi ja sitä inkuboitiin ketottomien hamsterin • · · 2 oosyyttien kanssa (30 - 50 munaa/käsittely kussakin määri- 12 113007 tyksessä) kolmesta neljään tuntiin. Oosyytit poistettiin, pestiin huolellisesti, kiinnitettiin 3-%:isella glyseral-dehydillä ja värjättiin asetokarmiiniliuoksella. Siittiöiden läpäiseminen määritettiin siitä, kun nähtiin turvonnut 5 siittiön pää ja näkyvä häntä munasolun sytoplasmassa. Siittiön liikkuvuus ennen inkubointia munasolun kanssa ja sen jälkeen rekisteröitiin. Määritykset toistettiin ainakin 3-8 kertaa käyttäen eri hedelmällisiä luovuttajia, ja kukin näyte testattiin ainakin 82 - 480 oosyytillä.

10 Niiden munasolujen prosentuaalinen osuus, jotka oli läpäisty, laskettiin seuraavan kaavan mukaan: Lävistetyt munasolut % = lävistettyjen munasolujen koknaismäärä x 100 inkuboitujen munasolujen kokonaismäärä 15 Tätä määritystä käyttämällä määritettiin, että noin 93 -108 % munasoluista olivat hedelmällisten miesten siittiöiden läpäisemiä, keskiarvon ollessa yksi läpi tunkeutunut siittiö oosyyttiä kohti. Määrityksen tulokset nähdään tau-20 lukossa 1.

Kuten taulukosta 1 voidaan nähdä Tai merkittävästi . (P < 0,001) lisäsi (aina 2,6-kertaisesti) läpäistyjen mu- :* nasolujen prosenttiosuutta verrattuna PBS-BSA-käsi- teltyihin kontrollisiittiöihin, jotka testattiin pitoi-.·, : 25 suuksilla 0,05 - 0,5 mikrogrammaa Tai/100 mikrolitraa ; ·, siittiösuspensiota.

'h/ Kuten taulukosta 2 nähdään, vasta-aineet sekä

Tai'lie että Töille merkittävästi (P<0,001) lisäsivät (aina 4,7-kertaisesti) tunkeutumisnopeuksia pitoisuudesta ·' 30 riippuvalla tavalla. Vasta-aineet KLH-kantajalle, HGP-30/ » · KLH-konjugaatille tai normaalille kanin seerumille, jotka *;*·· oli testattu samassa pitoisuudessa (20 mikrolitraa/100 mikrolitraa) , eivät vaikuttaneet tunkeutumisnopeuksiin verrattuna PBS/BSA-käsiteltyihin kontrollisiittiöihin. An- • ” 35 ti-Ται- ja anti-TB4-vasta-aineiden immunoadsorptio vastaa- • · · *· *: vien peptidien kanssa aiheutti merkittävän (P < 0,001) 13 113007 alenemisen vasta-aineen hedelmöittymistä edistävässä aktiivisuudessa .

SPA suoritettiin myös hedelmättömille (n=18) ja hedelmällisille (n = 5) miehille, kuten taulukossa 3 on 5 osoitettu Syms'n et ai. menetelmällä, Fertil. Steril. 43 (1985) 766. Tässä määrityksessä nesteytetty siemenneste yhdistettiin yhtä suuren määrän kanssa esilämmitettyä (37 °C) munankeltuaistestipuskuria (kuvattu esimerkiksi julkaisussa Naz et ai., J. Cell Sei. 99 (1991) 157) ja an-10 nettiin kapasitoitua 24 tuntia 4 °C:ssa. Sen jälkeen siittiöt pestiin, lisättiin ketottomiin hamsterin oosyyt-teihin ja munasolua kohden tunkeutuneiden siittiöiden lukumäärä määritettiin edellä kuvatulla menetelmällä. Hedelmällisten miesten siittiöt tunkeutuivat 100 %:iin mu-15 nasoluista keskiarvon ollessa 26,2 - 34,9 tunkeutunutta siittiötä oosyyttiä kohden (taulukko 3) . Mikäli siittiöiden funktio oli epänormaali, oosyyttiä kohden tunkeutuvien siittiöiden lukumäärä laski samoin kun laski läpäistyjen munasolujen prosentuaalinen määrä, mikäli siittiöt olivat 20 vakavasti epänormaaleja. Τα-tasot olivat huomattavasti (P = 0,002) matalammat hedelmättömien miesten siemennes-teen plasmassa verrattuna hedelmällisten miesten siemen-: nesteen plasmaan (keskiarvo ± SD, hedelmättömät miehet, ; 1321,89 + 516,63; hedelmälliset miehet 2962,20 ± 1811,25).

: j 25 Ται-tasot korreloivat hyvin (R = 0,566, P oli < 0,01) : ·. siittiöiden lukumäärään munasolua kohden SPA'11a (taulukko 3)· * ·

Esimerkki 4 ,, , Akrosomin reaktion arviointi • ·* 30 Tymosiinipeptidien ja niiden vasta-aineiden vaiku- tusta ihmisen siittiöiden akrosomin reaktioon tutkittiin. ;··· Vaikutus akrosomin reaktioon arvioitiin määrittämällä ak- rosomin tila inkuboinnin jälkeen vasta-aineiden ja peptidien kanssa, sekä tutkimalla akrosiinin jakautuminen ak- : " 35 rosomin reaktion jälkeen.

* » · i ♦ i4 113007 A. Akrosomin tilan arviointi

Liikkuvat siittiöt kerättiin hedelmällisiltä miehiltä swim up -menetelmällä, kuten ovat esittäneet Naz et ai., viite edellä. Hyvälaatuisia siittiönäytteitä, ts.

5 (5 x 106 liikkuvaa siittiötä millilitraa kohden), yli 75 %:n liikkuvuus, +3 - +4 eteneminen asteikolla 0 - +5, inkuboitiin Tai'n tai ΤΒί'η kanssa tai anti-Tai-vasta-ai-neiden tai anti-Tfii-vasta-aineiden kanssa. Kontrollit käsiteltiin samalla määrällä normaalia kanin seerumia, anti-10 KLH-vasta-aineita, anti-HGP 30 -vasta-aineita tai PBS-BSA:ta, kuten aikaisemmin kuvattiin. Inkuboinnin jälkeen siittiöt sentrifugoitiin, pestiin PBS:ssä ja jaettiin kahteen erään. Toisessa erässä indusoitiin akrosomin reaktio kalsiumionoforilla (Calcium ionophore A23187 (o) ja sitä 15 inkuboitiin siittiösuspension kanssa tunnin ajan. Toisessa erässä akrosomin annettiin spontaanisti reagoida ilman kalsiumionofori-käsittelyä. Kalsiumionoforikäsittely suoritettiin kapasitoitujen akrosomien reaktion indusoimisek-si. Akrosomin tila arvioitiin käyttämällä kolminkertaista 20 värjäysmenetelmää, jonka ovat kuvanneet Jager et ai., Arch. Androl. 12 (1984) 53 - 58. Siittiöt pestiin kahdesti PBS:ssä ja niitä inkuboitiin sen jälkeen 37 °C:ssa 15 minuuttia 2-%:isella Tryptan-sinisellä (Sigma 1:1 v/v) : : PBSrssä. Inkuboinnin jälkeen siittiöt pestiin kahdesti, ! ',· 25 kiinnitettiin 3-%:isessa glutaraldehydissä, 0,1 M kakody- • laattipuskurissa 60 minuuttia ja sen jälkeen pestiin taas kahdesti PBS:llä. Pisara tätä suspensiota pantiin objekti- » · lasille ja sen annettiin kuivua ilmassa yön yli. Kuivattu .. . objektilasi värjättiin 0,8-%:isella Bismark-ruskealla • · 30 (Sigma) deionisoidussa vedessä (pH 1,8, 2N HClrllä), huuh-deltiin deionisoidussa vedessä ja värjättiin 45 minuuttia huoneen lämpötilassa 0,8-%:isessa Rose Bengal'ssa (o) ·;·*: 0,1 M kakodylaattipuskurissa, pH 6,0. Objektilasit pestiin jälleen deionisoidussa vedessä, vesi poistettiin alkoho- • · • · · *. , 35 lisarjassa, kirkastettiin ksyleenissä ja peitettiin Per- • · · ’· mountilla ja peitinlasilla. Kaikenkaikkiaan 200 - 500 15 113007 siittiötä näytettä kohden arvioitiin ja kirjattiin joko elävinä tai kuolleina. Elävät siittiöt arvioitiin edelleen akrosomistaan koskemattomina tai akrosomistaan eikös kematt omina (reagoineina) siittiöinä. Kokeet toistet-5 tiin 3 -5 kertaa käyttäen ainakin kolmen eri hedelmällisen luovuttajan siittiöitä.

Tai, testattuna pitoisuudessa 0,5 mikrogram-maa/mikrolitraa (annos, jossa Tai lisäsi huomattavasti lä-päisymääriä), lisäsi huomattavasti kapasitaatiota ja ihmi-10 sen siittiösolujen akrosomin reaktiota (taulukko 4). Inku-baatiossa Tai'n kanssa 5-6 tuntia näyte antoi huomattavasti suuremman prosentuaalisen osuuden akrosomistaan reagoineille siittiöille verrattuna spermanäytteisiin, jotka oli käsitelty PBS-BSA:lla (taulukko 4). Tai'llä käsitellyt 15 spermanäytteet antoivat suuremman prosentuaalisen osuuden akrosomistaan reagoiville siittiöille, jos ne testattiin spontaanin akrosomin reaktion suhteen (ilman ionoforikä-sittelyä) tai tutkittuna ionoforilla indusoidun akrosomin reaktion jälkeen. Vaikutukset olivat paljon vallitsevampia 20 ionoforikäsittelyn jälkeen. TB^llä ei ollut huomattavaa vaikutusta.

’· Vasta-aineet sekä Tai'lie että Tfii'lle aiheuttivat !(·^ huomattavaa nousua akrosomistaan reagoineiden siittiöiden prosentuaaliseen osuuteen (taulukko 4). Jälleen vaikutuk- ;’·· 25 set olivat ilmeiset joko tarkasteltuna spontaanin ak- * · : rosomin reaktion suhteen tai tutkittuna vasta-aineella kä- siteltyjen siittiöiden ionoforilla indusoitujen akrosomin » » · reaktioiden suhteen, vaikkakin vaikutukset olivat vallit- , sevampia inoforikäsittelyn jälkeen. Mitään merkittävää « · * ’i(|’ 30 vaikutusta akrosomistaan reagoineiden siittiöiden prosen- tuaaliseen osuuteen ei havaittu käsittelemällä KLH-vasta- : · · * aineilla tai vasta-aineilla HGP-30-peptidi/KLH-konjugaa- ···.: tille verrattuna PBS-BSA-kontrolliin.

• · B. Akrosiinin jakautumisen arviointi i « '' ” 35 Inkuboinnin jälkeen tymosiinipeptidien tai anti- 1 * · *· ” tymosiinivasta-aineiden tai kontrollivasta-aineiden tai 113007 16 PBS-BSA:n kanssa tai ilman käsittelyä kalsiumionoforilla A23187 yhden tunnin ajan tai käsittelyn kanssa, kuten edellä on kuvattu, siittiösolut sentrifugoitiin ja akro-siiniaktiivisuus määritettiin supernatantissa ja soluissa 5 Kennedy'n et ai. menetelmällä, J. Androl. 10 (1989) 21 - 27. 90 mikrolitraa supernatanttia tai pelletoituja siit- tiösoluja suspendoituna 90 mikrolitraan PBS:ää sekoitettiin yhden millilitran kanssa reaktioseosta. Reaktioseos sisältää yhden milligramman N-bentsoyyli-dl-arginiini-P-10 nitraniliini (ΒΑΡΝΑ) hydrokloridia millilitrassa 0,055 M HEPES-puskuria, 0,055 M NaCl:ää, 10-%:ista v/v (dimetyyli-sulfoksidia) , 0,l-%:ista v/v (triton X-100). Sen jälkeen liuosta inkuboitiin kolme tuntia huoneen lämpötilassa. Reaktio pysäytettiin lisäämällä 100 mikrolitraa 0,5 M bent-15 samidiinia ja absorbanssi mitattiin 405 nanometrissä käyttäen Beckman'n spektrofotometriä. Akrosiiniaktiivisuus ilmaistiin mikroIU/106 siittiötä. Päivittäinen määrityksen vaihtelevuus normalisoitiin käyttämällä jäädytettynä säilytettyä osittain puhdistettua ihmisen akrosiiniuutetta. 20 Tällaisten uutteiden valmistuksen kuvaavat Naz et ai., J. Cell Sei. 102 (1992) 487 - 494.

Inkubointi Tai:n (0,5 mikrog/100 mikrol), anti-Tai-; vasta-aineen (20 mikrolitraa/100 mikrolitraa) tai anti- TBi-vasta-aineen (20 mikrolitraa/100 mikrolitraa) kanssa .’I 25 osoitti huomattavasti suuremman akrosiinipitoisuuden va- .1 . ·, pautuvan supernatantissa ja pienemmän akrosiinipitoisuuden i · ]><[ siittiösoluissa verrattuna PBS-BSA-käsiteltyihin siittiöi hin (taulukko 4) (P = 0,04:stä alle 0,001:een). Vaikutuk-, set olivat ilmeisiä joko tutkittuna ionoforikäsittelyn

• » I

• ·' 30 kanssa tai ilman sitä, vaikka vaikutukset olivat vallitse- • 1 i • · *·..1 vampia ionoforikäsittelyn jälkeen. Mitkään kontrollivasta- ·;··· aineista eivät osoittaneet mitään vaikutusta siittiösolu- jen akrosiinijakautumaan. TB4 ei osoittanut mitään huomat-• tavaa vaikutusta.

I · ’1 35 • 1 • · · * 1 · • · 17 113007 C. Siittiöiden liikkuvuusanalyysi

Inkuboinnin jälkeen tymosiinipeptidien tai niiden vasta-aineiden kanssa 5-6 tuntia, kuten edellä on kuvattu, näyte (7 mikrol) siittiösuspensiosta pantiin Makler-5 kammioon (Selfi Medical Instruments, Israel) ja siittiöiden liikkuvuusominaisuudet mitattiin käyttäen tietokoneeseen kytkettyä siemennesteanalysaattoria (Cell Soft Cryo Resources, New York). Parametriasetukset olivat 30 analysoitua kehystä kuvafrekvenssillä 30 Hz, 3 kehystä minimi-10 näytteenä liikkuvuudelle, 15 kehystä miniminäytteenä lateraalisen pään liikkeen ("ALH") nopeuden sekä amplitudin mittauksille, kynnysnopeutena 10 mikroin sekunnissa, 2,5'n minimilineaarisuus ALH-mittauksille ja solukokoalue 4-40 kuva-alkiota suurennuskalibroinnilla 0,688 mikrom kuva-15 alkiota kohden.

Mitään vaikutusta ei näkynyt liikkuvien siit-tiösolujen prosenttiosuuteen näytettä käsiteltäessä joko Taiillä, TB4:lla (0,5 mikrog 100 mikrol kohden) tai niiden vastaavilla vasta-aineilla (20 mikrol 100 mikrol kohden). 20 Kuitenkin Tai, vasta-aineet Tai'lie ja vasta-aineet Töille vaikuttivat huomattavasti siittiösolujen nopeuteen, • '·' ALH:hon ja törmäysfrekvenssiin. TB-j-peptidi eivätkä kont- ^ : rollivasta-aineet vaikuttaneet siittiösolujen mihinkään liikkuvuusominaisuuksiin verrattuna PBS-BSA-käsiteltyyn • » ;\j 25 kontrolliin (taulukko 5).

• · • t 9 * » · * f i · • · · • · • · · • · • · • · » • · t · · » · • · • · • t • f · • » » t * * * « t 18 113007

Taulukko 1

Tymosiini ai: n tymosiini £4: n vaikutus ihmisen siittiöiden läpäisymääriin 5

Testatut muna- Munasolujen lä- Käsittelv solut _ päisy t>_ (μα/100 μΐ) (nro) (Keskiarvo - S.D. ) 10 1. Tymosiini om 0,01 41 120,3 ± 11,6 0,05 82 268,2 ± 26,4* 0,1 124 251,0 i 36,3* 0,5 167 204,0 i 13,9* 15 2,0 82 100,5 ± 0,7 10.0 261 102,2 i 18,9 2. Tymosiini β* 0,1 122 102,7 i 6,5 0,5 128 99,7 ± 10,1 o0 20 173 61,8 ± 27,9b 10.0 179 31,5 1 12,2* • 3. Kontrolli \ PBS-BSA 302 96,9 ± 7;2 ’ ·’ Kontrolliin nähden p < 0,001; b kontrolliin nähden, p = 0,009; » f t t ’5 Muut eivät olleet havaittavia kontrolliin nähden.

t t * · 1 » 1

• * I

• · • r * · t » » » < »

• I

t % * t t

• I

I I

I i · t II»

» I

19 113007 \ 1 Λ -3 S Λ •h r-r^in *-h cd *-i c scd ' n *_ ·*· v*. *— *"* ft Θ imnm corn (N a\ rs ui ^ w m m «a n -1

-H

0 -t -H -0 -I Ή -· -' -1 : 0 ω o j ;* " g o m m cd o> o m in_c^ 44 o -0 ^ co 03 Is O 03 fn en qo 0 ω x cm r~ o m m o co o en 0 Λ ^ ®1 -i m N -CT (N »-« ·-> 01 CIO) 1 ‘ O 3 >ι 44 0 g W — tn

•H

e

P

0 H

<1) O

44 O

0 ., 0 ΰ o +J ,3 ·“* \/ r· 0 ! ffl jg ft ! Ό 5

1 '0 S rH

•o 2 — Λ 0 « o 4J ^ H 42 t! 0 £ r-> *r r-4 ioo *n "β· o ° h ft cnior- io r- ao oo co cd

UJ J° r4H '••H

S '§ 0) £ w H o Ή

g V

Ä -H Ph •M ' ai 0 tn 0) 44 "ö 3 θ 0 HÖ 0 0 44 ^

H Jtö C

id Ή ‘ Ή · • rsi > 0 -H 0 I 0 H 0 O 0 dl Ή Ό 44 CU ,, O’ O 40 : · 44 Ό it , , -H M !td 0 -H !? ti 0 0 0 , . , 0 CU % y. 0 0 . , 0 0 ^ Ϊ 0 0 0 • * rfl -H ti S .44-0 g· 0 n m 10 I I O I O I I I I ft • < I g ™ rH 1 1 r-4^-( ·. · 5 -s ^ -4 λ i

' . S O» Ä iJ

> 5 5 * 0

, -0 ^ > —' Λ O

• 0 44 • -0 •0 0* 0 CO 0-0 O H O > g g ' 0 • >H 0 O 0 E-i 0 0 0) Il -0 . (U 0 . 0 en ft > * -0 0 tn _ 0 '45 . 44 O -0 0 • ,.: Ί: >,nc Cu -μ 0 3. I 0 rtl Ό 0 e 22 44 OJ -0 0

• '0 O — _ -¾ rtj -H ^ ;td i—I

‘;1 ’ j 0e> rt d J C5 .0 ·η ® 0 i-t 'S ÖOOOE0OO«OXOrHOMl o 2 0 7««« .<·*" jir. jin «ch og s • '·· « a 3 5 " g S * 5 ?

V> C C C Q O Γ—t -H

; . . < < < 21 i4 O 0 ’ * 0 0 0 0

_i cn m -<r m co g S

Taulukko 3 a, 113007

Hedelmättömien ja hedelmällisten miesten tymosii-niax, ja tymosiinifl4 -tasot siemenesteen plasmassa 5 Τα, T04

Potilas Siemennesteanalyysi Tunkeutumis määrät Taso Taso (j) Koko- Liikku- Normaa- Tunkeutu- Munasolu- , (pg/mi) (pg/ml) vuus li siit- neet siit- jen läpäi- sntta.- tiot/muna- öt , (%) trot ' sy-% _:xio6)_t%) 501 Wo) ___ 1. Hedelmättömät miehet 10 __,____ 1. 476 70 70 5,9 100 1115 381 2. 165 82 76 24,1 100 1370 3. 216 64 61 - - 1222 352 4. 41 68 56 - - 1271 156 5. ' 246 69 53 7,1 100 1403 369 15 6. 19 62 69 18,1 100 1169 282 7. 128 60 58 14,6 100 2171 318 8. 73 61 77 14,2 100 1435 178 9. 43 60 59 13,4 100 1007 2643 10. 140 55 65 18,8 100 1330 805 11. 81 47 53 22,3 100 2965 452 12. 295 60 70 - 1436 294 20 13. 46 32 24 6,5 40 616 14. 230 50 64 22,14 100 1206 15. 245 79 61 21,55 100 1123 16. 28 21 19 3,2 62 942 17. 41 18 27 0,55 42 938 18. 241 59 56 17,2 100 1075 103 : 25 2. Hedelmälliset miehet_ : : ~ 632 82 84“ 34,9 TÖÖ 1438 102 : 2. 385 - 65 72 26,2 100 2175 197 / 3. 1430 65 74 32,1 100 1931 354 * 4. 383 * 76 83 29,7 100 5962 188 5. 1336 68 76_31,3_100 3305 254

Qr, 3. Siittiö uute 1. LIS-siittiö - 1626 66 ' · uute (6.94 mg/ml) » * · > • - - - - - ___ » » · > » > · i · 21 113007

•H

; +j +ι

O rH G O I

O H ™ M I Ό CNI m^o σ> sr X φ CO C -H I o"® VO CO α>" o

rt P D h I ^ P G

2 -h S a S - I -H-H -H-H-H > +1 ^

e JS > M ~ w I " « o '^ ® G

•rj III I torvi o rs «o <o '^G

e ,, -p +i I 10 m <u m p ·* „ I >1 t! O h 5 o 1? m p <u 'd t u „ +j «5 -¾ .5 -M Π3 tsl P VO CO VO ;[0 ** _, S m ρ -V rs rs N n n - 0) ™ £ £ O G W p «" Λί-Ρ

Pi ,—l CD___ P

Έ e 32 O A! a -H+l +-I-H-+I < +1 -h p .rf § < w w p o

H «OIO O «O CM CM 0P

Jj V V. ·- — ·_ S -P

Tj o CO p m p m m G

H . «oio «o (O sr sr IS o H 4j q -P ^ W H CO O ^ _ C Ή *|—ί S S w +l - “ o ^ -£ » P P O « · *a °t -rt S Λ g -ΗΦΗ ^ -rr^sreo to P> P £

H g.5 -3 -H-H -H+l-H Ή -H o S-H

+{ o ovp m Nin *Ί 1 P -H “ j? I g Ή SS SSS S S -5 ^

g m -äS

X G ®

rt -rl -H o e e Q> vo P

rt «Ö -P «T«r lOHrt 3 P :I0 ° P

> >1 PO s s. - ^ t S s +J P O

r-j to £ > encameo cm ±j \

e Q) £5 fij V-J r-4«H ri H H rH *H Π3 -P

(U P r3 p fö .fry -lH

•Ö P « g -H +1+1 -+I-H-+I -H +1 S G t> •H Ή *H tj .. i cu en i> i-t en —- y-, o to o o m o _.p<u e no -h <u o a Lv. _ - ^ «. sd 4 ® P Λί Ρ&Γ^Μ .h voioovo» m cnp

rt rt ί W -4 - '£ S G

v i » rö P fö 0 V -P w -H :(rt (0 β CO Ή C I λ . : ; x > OP rt S Vt °ja® ^ ° .s p 3 c O O G* -H ** P S J4 2 Ι'Ιρο) Gppui Φ,-ι·-1-0 rt p S ^ -H-H-H -H-H-H -H -H g^öo

H g G mm vo«o m o -3 ^ a) !h V

1 ^ e, sr vo OV VO -» to r-' *J g tl , ; : ; ^ «o is vo vo rs rs. rs pwi .G p a ti -G g o • o» p w -s t 4 p s

p : g p , p " 54 a) tJ

d 'rtM + ie P e e O m 4 ° •H I rt vnn i tsl VO esi sr m S »

h ppo a s^ -s-ssv s m 4 oi II

rt rt(U> O tO Cv| O to tsl .-+ f—I esi P^ ·' g £ S# « s -+1+I P Pl+t+l -+-1 Ή [n <« a >i O -H s' -H CO ~~ ’ B -P s

Es n o X i mm p sr o is o vo ; ooipco s |a>‘jl,

Mrt:Oa) rn' OQ sr VO rs tsl m P rt '4 +J

AitD HP W rl r-t O P P p P P «O n) P £

, CPPS'O <s| O

• “ p o 4J rt

• p <u ' rt J4 -H -H

• -H P r* PTj Ή u ^ r] ,—|

e rt d CLJ G> p < -* h P

rt rt HHW * p tn ^(ÖGn

>i -rt I · > · e: 1 O® 44 P m S

p m rtpppp-PS-ι * 4 h λ n p S titS. rn cccxc d « rt g j4 Ö ; p |HHrtC<<>«<o® :S . . · « u

« p 0Ί «O

22 113007 c

u u u *H

-H voro N OKO ro Ό Ai

to -- · --- - rO

to o O OOOO O C

>i S +1+1 +1+1+1 +1 +1 Jo

g A 1----1 O to © r— VO

! .3 toco ~t to cm cm CM +1 w g«H ^ ^ * Ö 3 M 0) > Q ^ m

3 W S

2 -Η -H > •HO 0 10 J tv, O W L·» . .

P ~*ΙΊ Ί (OH

S -3 - °° oooo o * o 3 3 3 +1+1 +1+1+1 -*-1 -H .° £

!2 5 or- oor-vor- vo C

'Γΐ c -- ---- V- - o tj <r <o to to ro to to :oj Ai •H P +> Η 0) -H :<0 ui T3 :0 -h P -H > P P +J :(0

0) U) W 4J +J

(0 Ή P -h xJ

-H (0 3 3 tj g Ctn vo vc r-. 1-. cm to -r 'H'C! r; -H --1 --- — <- tOAi

-HSH OO OOOO O P

O (0 C Φ +> S +1+1 +1+1+1 +1 +1 a) 6 0) ΙΛ QJ :flj (0

10 PC ffiO ΟνΟΟνβ oo +J-H-P

M P Ή - - --- - -POO) P > O to -tr «o -r to to to >ι Π 0)

3 3 « 4JH

3¾ a: -h h

H H -HO

rd H :<0 Q< > 1-5 a ε +> II -H fO *0 m a 11 > >

0) f U o o -H C -H

ο Ό y o to h oo r- ο r- .(0 0)0) a: h - — --- — q. to

, . f , ^ <D rOcM H H H CM CM -r-taJ

. p c . to 2 3 3 3 S -H-H Ή Ή Ή +1 +1 M +> S 5 ! ! ! fdi <U H to (MD(0 H r>4 ^ h? ^ • · H iö Oi «.--- - _ . ” > »· -P O h co o o vo f'- r- C m M **-

• * * ίΛ Z vOiO vO ΙΠ lO ιΠ Ή , O rH

: . · 2» -h 3 a; o : ‘ : a S +4 g g - . : S ® i«o . , -o 2« : ; -h -h 3 o, v * -H P ^ G G ^ o G 1

: ·' (0 G ^ ~ °J™ * 3 S i* S CM

*o rl m -a· r+ vn σ\ ^ -H O

Ej "5 S ϊ o +|+| o +1+1+1 +1 +1 m ® φ o tu *r1 to P -j o Ή m c s 5 5 -i 30- °°° 3 °- 1 m ä" 'H t S3 * ££ 1 ^ S ^ εί a ; (ΛΕίΛΑί m „ 5 Φ , 0(00 -H ^ O II m ^ v § U H -H 0" ^ ® -h . ?(^cmhS w a^(0+>

Bft o — S m xl

m S0'' 15 P O

0) ·<\3 i m m _v ,,,,: +> <u _ ;iö a. ti) -h .h

• * d S ä C0.PJ -J2 C3 2l < m M O -H

: ·.. πω m 233--12 m c/j p 5 to o • o) o ΰ-~ p C c c ω c 3 λ . . p e 5 2- tn 555(¾¾ g £ m ^ p : ·,; 3 t1 ^ 3 »o g π c 5 · · · S 3 <C k

5 H (N (O O

**+ Π3 rX XJ O

Claims (9)

113007

1. Menetelmä siittiöiden hedelmöityskyvyn lisäämiseksi, tunnettu siitä, että hedelmällisyyttä li-5 säävää tymosiinipeptidiä tai hedelmällisyyttä lisäävää an-ti-tymosiini-vasta-ainetta saatetaan kosketukseen siittiöiden kanssa in vitro sellainen määrä, joka on riittävä lisäämään siittiöiden kykyä hedelmöittää munasolu tehokkaasti .

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hedelmällisyyttä lisäävä ty-mosiinipeptidi tai anti-tymosiini-vasta-aine sisältää ty-mosiini ai'ä (Tai), Ται'η biologisesti aktiivista analogia tai fragmenttia, polyklonaalista tai monoklonaalista anti-15 Ται-vasta-ainetta tai anti-TB4-vasta-ainetta.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lisätään urosnisäkkään siittiöiden kapasitaatiota, jolloin mainitussa menetelmässä saatetaan mainitun urosnisäkkään siittiöt yhteen ka-20 pasitaatiota lisäävän määrän kanssa mainittua hedelmällisyyttä lisäävää tymosiinipeptidiä tai mainittua hedelmäl-lisyyttä lisäävää anti-tymosiini-vasta-ainetta.

: ; : 4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että • < f 25 (a) kerätään siittiöt hedelmättömän urosnisäkkään : siemennesteestä ja * · /-·, (b) inkuboidaan mainittuja siittiöitä mainitun ka pasitaatiota lisäävän määrän kanssa mainittua hedelmälli- .. , syyttä lisäävää tymosiinipeptidiä tai mainittua hedelmäl- • I t *>t;' 30 lisyyttä lisäävää anti-tymosiini-vasta-ainetta ajanjakso, i ’··>* joka on riittävä mainittujen siittiöiden kapasitaation li- ·;·: säämiseksi.

.···.’ 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, ,,· tunnettu siitä, että siittiöt kerätään suspensiok- • · * “ 35 si, jonka pitoisuus on noin 5 - 10 x 106 liikkuvaa siit- i t i *· ‘ί tiötä millilitrassa, ja tymosiinipeptidin pitoisuus on 113007 noin alueella 0,05 - 10 mikrogrammaa 100 mikrolitrassa siittiösuspensiota tai anti-tymosiini-vasta-aineen pitoisuus on noin alueella 10 - 20 mikrolitraa antiseerumia 100 mikrolitrassa siittiösuspensiota.

6. Koostumus käytettäväksi siittiöiden hedelmöi tyskyvyn lisäämiseksi in vitro, tunnettu siitä, että se sisältää hedelmällisyyttä lisäävää tymosiinipepti-diä tai hedelmällisyyttä lisäävää anti-tymosiini-vasta-ainetta sellaisen määrän, joka riittää lisäämään siittiöi- 10 den kykyä hedelmöittää munasolu tehokkaasti.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että hedelmällisyyttä lisäävä ty-mosiinipeptidi tai anti-tymosiini-vasta-aine sisältävät tymosiini on' ä (Tai), Ται'η biologisesti aktiivista analo- 15 gia tai fragmenttia, polyklonaalista tai monoklonaalista anti-Tai-vasta-ainetta tai anti-T54-vasta-ainetta.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen koostumus siittiöiden hedelmöityskyvyn lisäämiseksi saattamalla se yhteen siittiösuspension kanssa, tunnettu siitä, 20 että mainittu koostumus on farmaseuttinen annosyksikkö, joka sisältää mainittua tymosiinipeptidiä noin 0,05 - 10 • ’· mikrogrammaa 100 mikrolitrassa siittiösuspensiota tai max- • » : nittua anti-tymosiini-vasta-ainetta pitoisuuden noin 10 - 20 mikrolitraa antiseerumia 100 mikrolitrassa siittiösus- ;\· 25 pensiota. • ·

9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen koostumus käy- » · * 1 t I ,·;·, tettäväksi akrosomistaan reagoineiden siittiöiden prosent- tiosuuden lisäämiseksi, tunnettu siitä, että se , sisältää farmaseuttisen annosyksikön, joka sisältää ak- • 1 · • 30 rosomin reaktiota indusoivan määrän mainittua hedelmäni- • · *···1 syyttä lisäävää tymosiinipeptidiä tai mainittua hedelmäl- ·;·1· lisyyttä lisäävää anti-tymosiini-vasta-ainetta. « · • · • I » 1 > * > t „ 113007 Zd