JPH08501938A - ２−ヒドロキシフェニル酢酸の発酵法による製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、フェニル酢酸から２−ヒドロキシフェニル酢酸を発酵法で製造する新規方法並びにこのために好適な微生物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 ２−ヒドロキシフェニル酢酸の発酵法による製法 本発明は、フェニル酢酸から２−ヒドロキシフェニル酢酸を製造する新規方法 に関する。 微生物による芳香族化合物の分解は、屡々、その環が引き続く酸素原子の導入 下に分解されるヒドロキシル化された芳香族中間体を経て進行することは公知で ある。 一連の真菌及び細菌が存在する、フェニル酢酸の物質変換工程は、最初の生成 物として２−ヒドロキシフェニル酢酸まで進行する。次いで、第２のモノヒドロ キシル化で、芳香環の５又は６位に更に１個のＯＨ基が導入される。この反応順 序は、例えば、アスペルギルス ニゲル（Aspergillus niger）及びシユードモ ナス フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）で認められている（Grazi a Baggi等のStyrene Catabolism by a Strain of Pseudomonas fluorescens，Sy stem．Appl．Microbiol．4，141-147，（1983）;J.K．Faulkner and D．Woodcoc k，The Metabilism of Phenylacetic Acid by Aspergillus niger，Phytochemis try 7，1741-1742，（1968）;Fumiki Yoshizako等、.The Metabolism of Phenyla cetic acid by Aspergillus fumigatus ATCC 28282:Identification of 2,6-Dih ydroxyphenylacet ic Acid，Can.J.Microbiol.23，1140-1142（1977））． これらの微生物は、フェニル酢酸から２−ヒドロキシフェニル酢酸を経済的に 製造する方法には好適ではない。それというのも、これらは、２−ヒドロキシフ ェニル酢酸を物質代謝中間体としてのみ少量形成し、直ちに更に分解するからで ある。 従って、前記の欠点を有しない微生物を提供し、これら微生物の使用下に、フ ェニル酢酸からの２−ヒドロキシフェニル酢酸の発酵法による製造法を提供する 課題が存在した。 冒頭に記載の方法のために、一方でフェニル酢酸をｏ−位でヒドロキシル化す る能力を有し、他方で、生じた２−ヒドロキシフェニル酢酸をもはや更に変換さ せない（この際、これは、例えば炭素源として評価される）微生物が好適である ことが判明した。 このような微生物は、有利に、２−ヒドロキシフェニル酢酸を経てフェニル酢 酸を分解する能力を有する野生菌株の突然変異により得られる。野生菌株として は、細菌類、放線菌類及び、真菌類が好適である。特に好適な代表は、例えば次 の種属に存在する：バシルス（Bacillus）、ロドコッカス（Rhodococcus）、ス トレプトマイセス（Streptomysces）、アブシジア（Absidia）、アルテルナリア （Alternaria）、アスペルギルス（Aspergillus）、ベアウベリア（Beauveria） 、ボトリオジプロジア（Botryodiplodia）、ボトリチス （Botrytis）、ビソクラミス（Byssochlamys）、カンジダ（Candida）、セファ ロスポリウム（Cephalosporium）、ケトミウム（Chaetomium）、クニングハメラ （Cunninghamella）、クルブラリア（Curvularia）、ダクチリウム（Dactylium ）、ドレクスレラ（Drechslera）、エピコックム（Epicoccum）、フサリウム（F usarium）、ゲオトリクム（Geotrichum）、ギベラリア（Gibberella）、グレオ フィルム（Gleophyllum）、グリオクラジウム（Gliocladium）、ヘルミントスポ リウム（Helminthosporium）、フミコラ（Humicola）、ハイフォツイマ（Hyphoz yma）、メタリツイウム（Metarrhizium）、ミクロアスクス（Microascus）、ム コル（Mucor）、ノイロスポラ（Neurospora）、パエシロミセス（Paecilomyces ）、ペニシリウム（Penicillium）、フィコマイセス（Phycomyces）、フィロス チクタ（Phyllosticta）、ピチウム（Pythium）、リゾプス（Rhizopus）、セプ トリア（Septoria）、スファセロマ（Sphceloma）、トリコデルマ（Tricoderma ）、トリコスポロン（Trichosporon）、トリクルス（Trichurus）、ベルテイシ リウム（Verticillium）。 好適な微生物は、例１に記載の簡単な試験で容易に同定されうる。 好適な微生物から、有利に、もはや２−ヒドロキシフェニル酢酸を分解するこ とができない突然変異体を入手するか又は単離する。 このような突然変異体を得るためには、公知の微生物学的技術を使用すること ができる。突然変異の開始のために、全ての慣用法を使用でき、例えば、突然変 異生成物質例えば、ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホネート、亜硝酸ナ トリウムを使用するか、又は電磁線、例えばＵＶ線、ガンマ線又はレントゲン線 を作用させることができる。更に、突然変異生成のために、移送可能な遺伝的エ レメントも使用できる。突然変異体の単離のために、例えば、フェニル酢酸上で 固有のＣ−源としてもはや生長しない特性を利用することができる。 フミコラ（Humicola）又はケトミウム（Chaetomium）属の新規真菌が発見され 、これは、ドイツ菌寄託局（Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zel lkurturen GmbH，Braunschweig，）にＤＳＭ７０４７として寄託した。 更に、この真菌ＤＳＭ７０４７は、特に、芳香族化合物、殊に芳香酸及び酸誘 導体のヒドロキシル化のために使用されうることが判明した。更に、この真菌Ｄ ＳＭ７０４７をフェニル酢酸の存在で培養することにより、フェニル酢酸からの ２−ヒドロキシフェニル酢酸の有利な製法が得られることが判明した。 真菌ＤＳＭ７０４７は、ＣＢＳ（Centraalbureau voor Schimmelcultures，Ba arn，Niederlande）によればフミコラ フスコアトラ トラエン（Humicola fus co atra Traaen）として確認され、これは、ＤＳＭ によれば、ケトミウム（Chaet omium）おそらく、ケトミウム セミニドウム（Chaetomium Seminudum）と称さ れた。フミコラ属又はケトミウム属への最終的帰属は現時点では不可能である。 菌株ＤＳＭ７０４７は、フェニル酢酸をオルト−位でヒドロキシル化するが、生 じた２−ヒドロキシフェニル酢酸を代謝しないことで優れている。 このことがフミコラ又はケトミウム屬の一般的特徴であるか否かを試験するた めに、これら種屬の種々の菌株を例１に従って試験した： フミコラ ブレビスポラ（Humicola brevispora） ＡＴＣＣ２８４０３ 〃 ブルネア（Brunnea） ＡＴＣＣ２２６２９ 〃 フスコアトラ（fuscoatra） ＡＴＣＣ２２７２３ 〃 〃 ＡＴＣＣ２２７２１ 〃 〃 Ｌｉ ６６４ 〃 グリセア（Grisea） ＡＴＣＣ２２７２４ 〃 〃 Ｌｉ １９３ 〃 パルビスポラ（parvispora） ＡＴＣＣ２２７１５ ケトミウム アルバ−アベヌルム（Chaetomiumu alba -avenulum） Ｌｉ ６９ 〃 グロボスム（Globosum） ＡＴＣＣ６２０５ 〃 〃 Ｌｉ ７０ 〃 〃 Ｌｉ ４４４ Ｌｉで記載の菌株は、Ｌｉｍｂｕｒｇｅｒｈｏｆ在ＢＡＳＦ ＡＧ社の農業実 験ステーシヨンの菌株寄託所に由来する。 これらの全ての菌株で、２−ヒドロキシフェニル酢酸は、少量で立証できた。 しかしながら、それらは、常に、再び完全に分解された。 ＵＶ−線を用いる突然変異生成により、ＤＳＭ７０４７から１工程で、前記の フミコラ及びケトミウム野生型菌株と同様にフェニル酢酸を分解する先祖返り体 （Revertanten）を得ることができた。これにより、ＤＳＭ７０４７は、フェニ ル酢酸分解体の突然変異体であることが明らかになった。 フェニル酢酸からの２−ヒドロキシフェニル酢酸の本発明による製法は、慣用 の栄養培地中での適当な微生物の培養を内容とする。炭素源、窒素源、無機塩及 び場合により少量の微量元素及びビタミンを含有する栄養培地が好適である。 窒素源として、無機又は有機窒素化合物又はこれら化合物を含有する物質を使 用することができる。その例は、次の通りである：アンモニウム塩、硝酸塩、ト ウモロコシ源水、ビール酵母自己分解物、大豆粉、トウモロコシグルテン、酵母 エキス、酵母、尿素及びじ ゃがいもプロテイン。 炭素源として、例えばグルコースのような糖、グリセリンのようなポリオール 又は大豆油のような脂肪を使用することができる。無機塩の例は、カルシウム、 マグネシウム、マンガン、亜鉛、銅、鉄及び他の金属の塩である。塩の陰イオン としては、特にホスフェートイオンが挙げられる。場合によっては、栄養培地に 生長因子例えばビオチン、リボフラビン及び他のビタミンを添加する。 特に好適な栄養培地は、例２に記載の培地２である。 この培地に、フェニル酢酸を添加する。フェニル酢酸は遊離の酸として又は、 塩として、有利にアルカリ金属−又はアンモニウム塩として培地に添加すること ができる。水性栄養培地中の塩の溶解性は、一般に遊離酸のそれよりも大きいの で、フェニル酢酸のナトリウム−又はアンモニウム塩を使用するのが有利である 。相応する塩は、フェニル酢酸を塩基で適定することによりその場で製造するの が有利である。 フェニル酢酸を、一般に、栄養培地１リットル当り０．５〜３０ｇ、有利に１ 〜２０ｇの濃度に調節するような量で添加する。 フェニル酢酸は、栄養培地に、微生物の培養の開始時に、又は培養の間に数回 に分けて又は連続的に添加することができる。 更に、培養された微生物を変換の終了後に残存させ、 これをフェニル酢酸を有する新しい栄養培地中で更に培養することができる。 バイオマスの再使用のこの形は、本発明の方法の特に有利な１実施態様である 。それというのも、その場合には、例えばバイオマスの培養時間が節約されるか らである。 この微生物の培養は、更なる特別な条件を必要としない。例えば、培養温度は 一般に２０〜４０℃であってよく、２５〜３５℃の温度を選択するのが有利であ る。 培養培地のｐＨ−値をこの培養の間に、３〜９の間に保持する。４〜７の間の ｐＨ値が有利である。培養の間の培地の酸性化は、例えば塩基、例えばアンモニ アの添加により相殺することができる。 培養時間は、培養培地中で生成物が最大濃度に達するために、通例１〜１０日 を要する。 反応変換率は、試料を取りだし、例えばガスクロマトグラフィ分析により容易 に測定できる。栄養培地からの２−ヒドロキシフェニル酢酸の単離及び精製は、 公知方法で行うことができる。固体バイオマスを栄養培地から分離し、有用物質 を、場合によっては培地の予めの酸性化の後に、例えば有機溶剤を用いて抽出し 、この抽出相から有用物質を単離させるのが有利である。 次の実施例で本発明を更に説明する。 例１ フェニル酢酸のオルト−ヒドロキシル化での微生物の試験 公開菌株寄託所又は土壌単離物からの微生物の純粋培養物（Drews:Mikrobiolo gisches Praktikum，3.Auflage，Springer Verlag 1976，47-48頁）を、それら が、フェニル酢酸を特異的にオルト位でヒドロキシル化できるか否かに関して試 験した。 このために、寒天プレートの菌株をフェニル酢酸を有する液体培地中へ接種し た。次の培地を使用した （Ｍ１−培地）： グルコース １０ｇ／ｌ 酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ） ５ｇ／ｌ （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ５ｇ／ｌ ＭｇＳＯ₄ｘ７Ｈ₂Ｏ ０．５ｇ／ｌ ＭｎＳＯ₄ｘ４Ｈ₂Ｏ ０．０５ｇ／ｌ 微量元素溶液 ２ｍｌ／ｌ ＫＨ₂ＰＯ₄ １．５ｇ／ｌ Ｋ₂ＨＰＯ₄ ３．６ｇ／ｌ 微量元素溶液： 硫酸鉄（ＩＩ）−１−水和物 ２００ｍｇ／ｌ 硫酸亜鉛（ＩＩ）−４−水和物 １０ｍｇ／ｌ 塩化マンガン−４−水和物 ３ｍｇ／ｌ 硼酸 ３０ｍｇ／ｌ 塩化コバルト（ＩＩ）−６−水和物 ２０ｍｇ／ｌ 塩化銅（ＩＩ）−２−水和物 １ｍｇ／ｌ 塩化ニッケル（II）−６−水和物 ２ｍｇ／ｌ モリブデン酸ナトリウム−２−水和物 ３ｍｇ／ｌ エチレンジアミン四酢酸（EDTA） ５００ｍｇ／ｌ フェニル酢酸を２５％溶液として使用し、ＮａＯＨでｐＨ７まで適定し、オー トクレーブ処理をし、別に調合した培地に加えた。 ２５０ｍｌ−エーレンマイヤーフラスコに、フェニル酢酸１ｇ／ｌを有するＭ １−培地３０ｍｌを充填し、それぞれ寒天プレートの微生物菌株を接種し、２５ ℃で１８０Ｕ／ｍｉｎで振動させ、インキュベートした。３、７及び１０日後に この培養上澄み１ｍｌを取りだし、５Ｎ塩酸１００μｌ及び酢酸エチルエステル ８００μｌを加え、１５秒間激しく混合した。酢酸エチルエステル相７００μｌ を取りだし、５０℃で軽い窒素流下に蒸発濃縮させた。残分を酢酸エチルエステ ル７０μｌ中に溶かし、その５０μｌをガスクロマトグラフィ用の試料ガラス中 に移した。これに、Ｎ−メチル−Ｎ−トリメチルシリルトリフルオロアセタミド （ＭＳＴＦＡ）５０μｌを加え、混合させた。この試料をガスクロマトグラフィ で検査した。比較のために、真性の試料２−ヒドロキシフェニル酢酸を用いた。 次の種屬からの菌株を用いて、２−ヒドロキシフェニル酢酸の形成を観察した ： 真菌類： アブシジア、アルテルナリア、アスペルギルス、ベア ウベリア、ボトリオジプロジア、ボトリチス、ビソクラミス、カンジダ、セファ ロスポリウム、ケトミウム、クニングハメラ、クルブラリア、ダクチリウム、ド レクスレラ、エピコックム、フサリウム、ゲオトリクム、ギベラリア、グレオフ ィルム、グリオクラジウム、ヘルミントスポリウム、フミコラ、ハイフォツイマ 、メタリチウム、ミクロアスクス、ムコル、ノイロスポラ、パエシロミヤス、ペ ニシリウム、フィコマイセス、フィロスチクタ、フィチウム、リゾプス、セプト リア、スファセロマ、トリコデルマ、トリコスポロン、トリクルス、ベルチシリ ウム ストレプトマイセス科の菌： ストレプトマイヤス オーレオファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕ ｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ） ストレプトマイヤス ハイグロスコピクス（Ｓｔ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ） ストレプトマイセス カスガエンシス（Ｓｔ．ｋａｓｕｇａｅｎｓｉｓ） ストレプトマイセス ニベウス（Ｓｔ．ｎｉｖｅｕｓ） ストレプトマイセス ロゼオクロモゲヌス（Ｓｔ．ｒｏｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅ ｎｕｓ） ストレプトマイセス ビリデイファシエンス（Ｓｔ．ｖｉｒｉｄｉｆａｃｉｅｎ ｓ） 細菌類： バシルス ロドコッカス 例２ ＤＳＭ７０４７を用いるフェニル酢酸の変換 培地２： グルコース ５０ｇ／ｌ 酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ） １０ｇ／ｌ （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ １０ｇ／ｌ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．５ｇ／ｌ Ｋ₂ＨＰＯ₄ ３．６ｇ／ｌ ＫＨ₂ＰＯ₄ １．５ｇ／ｌ 微量元素溶液 １０ｍｌ／ｌ 前培養物：ＤＳＭ７０４７を、寒天プレートから、１リットルエーレンマイヤ ーフラスコ中のフェニル酢酸１ｇ／１及び付加的にカルボポール９４６（Ｃａｒ ｂｏｐｏｌ：登録商標）３ｇ／１を有する培地２ １５０ｍｌに接種し、３０℃ で及び１８０Ｕ／ｍｉｎで３日間振動させた。 この前培養物を培地２及びフェニル酢酸５ｇ／１を有する１．５リットル−エ ーレンマイヤーフラスコに接種した。付加的に、プルリオール（Ｐｌｕｒｉｏｌ ）Ｐ２０００ １ｍｌ／ｌを気泡発生を阻止するために加えた。 培養物を３０℃に熱処理し、１分当り空気１リットル（＝０．６６ｖｖｍ）を 吹き付け、６００Ｕ／ｍｉｎで撹拌した。 ５日後に、フェニル酢酸は完全に２−ヒドロキシフェニル酢酸に変換した。 細胞を綿（Ｗａｔｔｅ）−濾過により分離し、水１００ｍｌで後洗浄した。細 胞不含の培養液及び洗浄水を一緒にし、ＨＣｌでｐＨ２に調節し、同量のｔ−ブ チル−メチルエーテルで２回抽出した。 有機相の蒸発濃縮乾燥の後に、８．２ｇの残分が得られ、これは２−ヒドロキ シフェニル酢酸９８％（ＧＣ−分析で測定）よりなった。生成物の構造をＮＭＲ で確認した。 例３ ＤＳＭ７Ｏ４７の改良培養 前培養及び培養物の接種を、例２におけると同様に実施した；培養培地のＰＨ −値は、この培養の間に６．８から５．６に低下した。更なる酸性化はアンモニ アの添加により相殺した。フェニル酢酸濃度が２．５〜１ｇ／ｌの値に低下した ら直ちに、フェニル酢酸１ｇ／ｌを４回配量添加した。７日後にフェニル酢酸は 完全に２−ヒドロキシフェニル酢酸に変換した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ハウアー， ベルンハルト ドイツ連邦共和国 Ｄ―6701 フースゲー ンハイム メロヴィンガーシュトラーセ １ (72)発明者 ラトナー， ヴォルフガンク ドイツ連邦共和国 Ｄ―6701 フースゲー ンハイム イン デン ベレン ５ (72)発明者 ミュラー， ウルズラ ドイツ連邦共和国 Ｄ―6701 フースゲー ンハイム メロヴィンガーシュトラーセ ８ (72)発明者 プレスラー， ウヴェ ドイツ連邦共和国 Ｄ―6701 アルトリッ プ グローセ ホルストシュトラーセ 15 (72)発明者 マイヤー， ヨアヒム ドイツ連邦共和国 Ｄ―6701 マクスドル フ カールミットシュトラーセ ４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．フェニル酢酸から２−ヒドロキシフェニル酢酸を製造する場合に、微生物を フェニル酢酸の存在で培養し、フェニル酢酸をオルト−位でヒドロキシル化し、 ２−ヒドロキシフェニル酢酸をもはや変換させないことを特徴とする、フェニル 酢酸から２−ヒドロキシフェニル酢酸を製造する方法。 ２．微生物として、フミコラ又はケトミウム属の真菌を使用する、請求項１に記 載の方法。 ３．微生物として、真菌ＤＳＭ７０４７を使用する、請求項１に記載の方法。 ４．寄託番号ＤＳＭ７０４７として寄託した、フミコラ又はケトミウム属の真菌 。 ５．請求項４に記載の真菌を芳香族化合物のヒドロキシル化のために使用するこ と。