JPH084497B2 - 組換え単純ヘルペスウイルスワクチンおよび方法 - Google Patents
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
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-
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Description
【発明の詳細な説明】 寄託の陳述 本明細書中でATCC受託番号で示される幾つかのウイル
スおよびプラスミドは、特許手続のための微生物の寄託
の国際認識に関するプタペスト条約の規程に従って、米
国 20852 メリーランド州 ロックビル市 パークロ
ーン ドライブ 12301のアメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクション（American Type Culture Collecti
on）に寄託された。
スおよびプラスミドは、特許手続のための微生物の寄託
の国際認識に関するプタペスト条約の規程に従って、米
国 20852 メリーランド州 ロックビル市 パークロ
ーン ドライブ 12301のアメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクション（American Type Culture Collecti
on）に寄託された。
発明の背景 〔産業上の利用分野〕 本発明は、組換えウイルス株、生ウイルスワクチン、
およびウイルス株およびワクチンの製造法、ならびにウ
イルスに対する宿主の免疫方法に関する。より特別に
は、本発明は、組換えヘルペスウイルス株、かかるウイ
ルス株を含む生ウイルスワクチン、および組換えウイル
ス株およびワクチンの製造法、ならびに該ワクチンを用
いてヒト宿主を単純ヘルペスウイルスＩ型およびII型
（それぞれHSV−１およびHSV−２と称す）に対して免疫
する方法に関する。
およびウイルス株およびワクチンの製造法、ならびにウ
イルスに対する宿主の免疫方法に関する。より特別に
は、本発明は、組換えヘルペスウイルス株、かかるウイ
ルス株を含む生ウイルスワクチン、および組換えウイル
ス株およびワクチンの製造法、ならびに該ワクチンを用
いてヒト宿主を単純ヘルペスウイルスＩ型およびII型
（それぞれHSV−１およびHSV−２と称す）に対して免疫
する方法に関する。
単純ヘルペスウイルスの識別可能なセロタイプ（HSV
−１およびHSV−２）は共に、比較的軽度な唇の発熱性
疱疹から重篤な遺伝的感染および新生児のび慢性感染ま
での範囲の感染および疾病の原因となる。
−１およびHSV−２）は共に、比較的軽度な唇の発熱性
疱疹から重篤な遺伝的感染および新生児のび慢性感染ま
での範囲の感染および疾病の原因となる。
潜在的感染を確立することができてもできなくてもよ
くかつ両方の型の単純ヘルペスウイルスに対して有効
な、安定で形質転換しない生ウイルスワクチンは長い間
求められて来た。
くかつ両方の型の単純ヘルペスウイルスに対して有効
な、安定で形質転換しない生ウイルスワクチンは長い間
求められて来た。
原理的には、ウイルスは感染した細胞に特異的な蛋白
質を生産させる。これらの蛋白質は互いにおよび細胞蛋
白質またはDNAあるいはRNAと相互作用してウイルス子孫
を作らせ、感染細胞を破壊し、以前には感染していなか
った細胞へ感染を広げる。これらの蛋白質の幾つかは宿
主の免疫応答をも刺激する。HSV−１とHSV−２とは免疫
学的には関連しているが、その蛋白質のほとんどはそれ
らを区別する特性をもっている。モース（Morse）ら、
“単純ヘルペスウイルス（HSV）DNAの解剖学:X.HSV−１
×HSV−２組換え体によって指定されるポリペプチドお
よび機能の分析によるウイルス遺伝子のマッピング（An
atomy of Herpes Simplx Virus（HSV） DNA:X.Mapping
of Viral Genes by Analysis of Polypeptides and Fun
ctions Specified by HSV−１×HSV−2 Reconbinant
s）",J.Virol.,Vol.26,No.2,389−410（1978年５月）を
参照されたい。この文献の記載の参照文として本明細書
に含まれるものとする。
質を生産させる。これらの蛋白質は互いにおよび細胞蛋
白質またはDNAあるいはRNAと相互作用してウイルス子孫
を作らせ、感染細胞を破壊し、以前には感染していなか
った細胞へ感染を広げる。これらの蛋白質の幾つかは宿
主の免疫応答をも刺激する。HSV−１とHSV−２とは免疫
学的には関連しているが、その蛋白質のほとんどはそれ
らを区別する特性をもっている。モース（Morse）ら、
“単純ヘルペスウイルス（HSV）DNAの解剖学:X.HSV−１
×HSV−２組換え体によって指定されるポリペプチドお
よび機能の分析によるウイルス遺伝子のマッピング（An
atomy of Herpes Simplx Virus（HSV） DNA:X.Mapping
of Viral Genes by Analysis of Polypeptides and Fun
ctions Specified by HSV−１×HSV−2 Reconbinant
s）",J.Virol.,Vol.26,No.2,389−410（1978年５月）を
参照されたい。この文献の記載の参照文として本明細書
に含まれるものとする。
組換え子孫の生成から、HSV−１の蛋白質はHSV−２の
蛋白質と相互作用して感染子孫を生成することができる
ことが知られている。HSV感染に対する免疫は数種の蛋
白質に対する宿主の応答で決定されることも知られてい
る。
蛋白質と相互作用して感染子孫を生成することができる
ことが知られている。HSV感染に対する免疫は数種の蛋
白質に対する宿主の応答で決定されることも知られてい
る。
HSV−１およびHSV−２に対するワクチン中の有用なウ
イルス株は無毒性で、安定（すなわち毒性状態に戻らな
い）であり、HSV−１およびHSV−２の両方の野生型株の
大量挑戦に対して実証された免疫を与えなければならず
かつ病原性が低くなければならず、かつ宿主細胞を形質
転換する能力があってはならない。ある場合には、ワク
チンウイルスは宿主の免疫後消失することが望ましいこ
とがあるが、ある場合にはウイルスは宿主中に潜在形で
残留することが望ましいことがある。
イルス株は無毒性で、安定（すなわち毒性状態に戻らな
い）であり、HSV−１およびHSV−２の両方の野生型株の
大量挑戦に対して実証された免疫を与えなければならず
かつ病原性が低くなければならず、かつ宿主細胞を形質
転換する能力があってはならない。ある場合には、ワク
チンウイルスは宿主の免疫後消失することが望ましいこ
とがあるが、ある場合にはウイルスは宿主中に潜在形で
残留することが望ましいことがある。
現在まで、上に挙げた特性を示しかつ両型の単純ヘル
ペスウイルスに対して有効なワクチンは知られていな
い。
ペスウイルスに対して有効なワクチンは知られていな
い。
発明の要約 〔発明が解決しようとする問題点〕 本発明の目的は、毒性の病原性（野生型）HSV−１お
よびHSV−２に対して有効な、生きた組換えウイルス株
およびかかるウイルス株を含むワクチン、および該ワク
チンの製造法ならびに該ワクチンを用いるヒト宿主の免
疫方法を提供することである。
よびHSV−２に対して有効な、生きた組換えウイルス株
およびかかるウイルス株を含むワクチン、および該ワク
チンの製造法ならびに該ワクチンを用いるヒト宿主の免
疫方法を提供することである。
本発明によれば、HSV−２遺伝子を担持する変性HSV−
１ゲノムからなる組換えウイルス株が提供される。これ
らの組換え体はHSV−１およびHSV−２感染に対する免疫
に適したウイルス株の必要条件を満たし、かつ異種遺伝
子のベクターとして用いることもできるが、組換え体は
幾つかのHSV−２遺伝子以外のかかる異種遺伝子を含む
必要はない。
１ゲノムからなる組換えウイルス株が提供される。これ
らの組換え体はHSV−１およびHSV−２感染に対する免疫
に適したウイルス株の必要条件を満たし、かつ異種遺伝
子のベクターとして用いることもできるが、組換え体は
幾つかのHSV−２遺伝子以外のかかる異種遺伝子を含む
必要はない。
本発明の他の特徴および利益は添付図面および特許請
求の範囲と共に以下の詳細な説明を読むことによって明
らかになるであろう。
求の範囲と共に以下の詳細な説明を読むことによって明
らかになるであろう。
発明の詳細な説明 予備段階 単純ヘルペスウイルス２型（HSV−２）遺伝子を担持
する単純ヘルペスウイルス１型（HSV−１）ゲノムから
なる２種の代表的組換えウイルスの調製を以下に示す。
本明細書中でR7017（ATCC VR2121）およびR7020（ATCC
VR2123）と称するこれらの組換え体はHSV−１およびHSV
−２感染に対する免疫のために適したウイルス株の必要
条件を満たすために設計されたものであり、異種遺伝子
のベクターとして用いることもできる。作製されたまゝ
の（as constructed）代表的組換え体はHSV−２からの
遺伝子以外の異種遺伝子を含まない。
する単純ヘルペスウイルス１型（HSV−１）ゲノムから
なる２種の代表的組換えウイルスの調製を以下に示す。
本明細書中でR7017（ATCC VR2121）およびR7020（ATCC
VR2123）と称するこれらの組換え体はHSV−１およびHSV
−２感染に対する免疫のために適したウイルス株の必要
条件を満たすために設計されたものであり、異種遺伝子
のベクターとして用いることもできる。作製されたまゝ
の（as constructed）代表的組換え体はHSV−２からの
遺伝子以外の異種遺伝子を含まない。
HSV DNAの構造は文献に記載されている。ワドスウォ
ース（Wadsworth）ら、・Virol.ol.15、No.6,1487−1497
（1979）ヘイワード（Hayward）ら、Proc.Nat.Acad.Sc
i.USA,Vol.72,No.11 4243−4247（1975），モース（Mor
se）ら、J.Virol.Vol.26,No.2 389−410（1978）を参照
されたい。HSV−１ゲノムおよびHSV−２ゲノムは、おの
おのがＬおよびＳと称する２種の共有結合で結合された
成分からなる。各成分は逆位反復（inverted repeats）
によってフランキングされた独特の配列（Ｌ成分では
Ul,S成分ではUs）からなるＬ成分の逆位反復はabおよび
ｂ′ａ′と示される。Ｓ成分の逆位反復はａ′ｃおよび
caと示される。HSV−1DNAとHSV−2DNAの両方の付加的な
性質は、Ｌ成分およびＳ成分が互いに対して逆位しても
っぱら２成分の相対的配向が異なる４種の異性体を生じ
るようになっていることである〔共に上で挙げたワッド
スウォース（Wadsworth）ら、1975;およびヘイワード
（Hayward）ら、1975参照〕。
ース（Wadsworth）ら、・Virol.ol.15、No.6,1487−1497
（1979）ヘイワード（Hayward）ら、Proc.Nat.Acad.Sc
i.USA,Vol.72,No.11 4243−4247（1975），モース（Mor
se）ら、J.Virol.Vol.26,No.2 389−410（1978）を参照
されたい。HSV−１ゲノムおよびHSV−２ゲノムは、おの
おのがＬおよびＳと称する２種の共有結合で結合された
成分からなる。各成分は逆位反復（inverted repeats）
によってフランキングされた独特の配列（Ｌ成分では
Ul,S成分ではUs）からなるＬ成分の逆位反復はabおよび
ｂ′ａ′と示される。Ｓ成分の逆位反復はａ′ｃおよび
caと示される。HSV−1DNAとHSV−2DNAの両方の付加的な
性質は、Ｌ成分およびＳ成分が互いに対して逆位しても
っぱら２成分の相対的配向が異なる４種の異性体を生じ
るようになっていることである〔共に上で挙げたワッド
スウォース（Wadsworth）ら、1975;およびヘイワード
（Hayward）ら、1975参照〕。
これら４種の異性体は“原型（Ｐ）”、Ｓ成分の逆位
（IS）、Ｌ成分の逆位（IL）、Ｌ成分とＳ成分の両方の
逆位（ISL）と示されている。
（IS）、Ｌ成分の逆位（IL）、Ｌ成分とＳ成分の両方の
逆位（ISL）と示されている。
センチファント・フィッツジェラルド（Centifanto−
Fitzgerald）ら、J.Exp.Med.,Vol.155、475−489ページ
（1982）中に記載されているように、HSV DNAのＬ成分
の右手末端は、その突然変異が神経毒性ならびに角膜に
負傷を起こさせる能力の喪失に導く遺伝子を含んでいる
ということは確立されている。これらの遺伝子はほぼ0.
70と0.83の間にマッピングされているが、それらの正確
な位置は以前には知られていなかった。
Fitzgerald）ら、J.Exp.Med.,Vol.155、475−489ページ
（1982）中に記載されているように、HSV DNAのＬ成分
の右手末端は、その突然変異が神経毒性ならびに角膜に
負傷を起こさせる能力の喪失に導く遺伝子を含んでいる
ということは確立されている。これらの遺伝子はほぼ0.
70と0.83の間にマッピングされているが、それらの正確
な位置は以前には知られていなかった。
ポッフェンバーガー（Poffenberger）ら、Proc.Natl.
Acad.Sci.USA,Vol.80、2690−2694ページ（1983）およ
びポッフェンバーガー（Poffenberger）とロイズマン
（Roizman）,J.Virol.Vol.53.587−595（1985）の研究
は、内部逆位反復（ｂ′ａ′ａ′ｃ′）が細胞培養に於
けるHSV−１の増殖のために必須ではないことを立証し
た。特に、Ｌ成分の右端に於ける独特の配列の一部分な
らびに原型配列に於けるＬ成分とＳ成分との間の接合部
に於ける逆位反復のほとんどが通常Ｌ成分の左端に位置
するHindIII0から誘導される小DNA断片およびチミジン
キナーゼ（TK）遺伝子によって置換された組換えHSV−
１ウイルス（I358、ATCC VR2122と呼ばれる）が作製さ
れた。I358のＬ成分およびＳ成分の逆位反復からのHSV
−1DNAの約13Kbpの欠失は、ゲノムのパッケージングを
影響することなく付加的なDNA配列を挿入することがで
きたので、このウイルスまたはこのウイルスの誘導体が
HSV DNAまたは異種DNAのベクターとして潜在的に働くこ
とができることを示唆した。
Acad.Sci.USA,Vol.80、2690−2694ページ（1983）およ
びポッフェンバーガー（Poffenberger）とロイズマン
（Roizman）,J.Virol.Vol.53.587−595（1985）の研究
は、内部逆位反復（ｂ′ａ′ａ′ｃ′）が細胞培養に於
けるHSV−１の増殖のために必須ではないことを立証し
た。特に、Ｌ成分の右端に於ける独特の配列の一部分な
らびに原型配列に於けるＬ成分とＳ成分との間の接合部
に於ける逆位反復のほとんどが通常Ｌ成分の左端に位置
するHindIII0から誘導される小DNA断片およびチミジン
キナーゼ（TK）遺伝子によって置換された組換えHSV−
１ウイルス（I358、ATCC VR2122と呼ばれる）が作製さ
れた。I358のＬ成分およびＳ成分の逆位反復からのHSV
−1DNAの約13Kbpの欠失は、ゲノムのパッケージングを
影響することなく付加的なDNA配列を挿入することがで
きたので、このウイルスまたはこのウイルスの誘導体が
HSV DNAまたは異種DNAのベクターとして潜在的に働くこ
とができることを示唆した。
組換えウイルスI358自体は、主としてHindIII O配列
の重複のためにベクターとして適当ではない。Ｌ成分と
Ｓ成分との間の新規接合に於けるHindIII O配列はその
自然位置におけるHindIIIOと断片中に含まれる配列の直
接反復（ダイレクトリピート）であるので、HindIII O
反復間の配列は自発的に欠失し、欠損ゲノムが感染細胞
および培養中に蓄積する。潜在的に、欠損ゲノムは標準
ゲノムを妨害し、ウイルスの最適増殖を妨害することが
できた。
の重複のためにベクターとして適当ではない。Ｌ成分と
Ｓ成分との間の新規接合に於けるHindIII O配列はその
自然位置におけるHindIIIOと断片中に含まれる配列の直
接反復（ダイレクトリピート）であるので、HindIII O
反復間の配列は自発的に欠失し、欠損ゲノムが感染細胞
および培養中に蓄積する。潜在的に、欠損ゲノムは標準
ゲノムを妨害し、ウイルスの最適増殖を妨害することが
できた。
I358ゲノムが新規Ｌ−Ｓ成分接合に於ける重複された
HindIII O配列を除去するように再作製されたとして
も、ウイルスの神経毒性の原因となる遺伝子が欠失され
るかどうかは明らかでないであろう。たとえそれらの遺
伝子が欠失されたとしても、ウイルスはそのまゝではHS
V−１に対する免疫のためにのみ適当であってHSV−２に
対しては適当でないであろう。HSV−２に対して保護す
るためには、そのウイルスの糖蛋白質遺伝子の少なくと
も幾つかを重複することが必要であろう。
HindIII O配列を除去するように再作製されたとして
も、ウイルスの神経毒性の原因となる遺伝子が欠失され
るかどうかは明らかでないであろう。たとえそれらの遺
伝子が欠失されたとしても、ウイルスはそのまゝではHS
V−１に対する免疫のためにのみ適当であってHSV−２に
対しては適当でないであろう。HSV−２に対して保護す
るためには、そのウイルスの糖蛋白質遺伝子の少なくと
も幾つかを重複することが必要であろう。
HSV−２およびHSV−１に対する主免疫反答はウイルス
の表面蛋白質に対して向けられる。ウイルスの表面蛋白
質は感染細胞のビリオン外被中および原形質膜中に挿入
されたウイルス糖蛋白質である。現在、少なくとも６種
の糖蛋白質がHSV−１およびHSV−２によって特徴づけら
れることが知られている。これらはＬ成分中にマッピン
グする糖蛋白質Ｂ、Ｃ、ＨとＳ成分中にマッピング糖蛋
白質Ｄ、Ｅ、Ｇである。これらの糖蛋白質遺伝子中、中
和用抗体を誘発するものおよび恐らくは免疫を誘起する
ものは、Ｓ成分中にマッピングする糖蛋白質Ｄおよび小
さい程度にＬ成分中にマッピングする糖蛋白質Ｂおよび
Ｃである。種々の研究は、最強の中和抗体が糖蛋白質Ｄ
によって誘発されることを示唆している。この糖蛋白質
は、それ自体でも、実験動物系に於てある種の蛋白質を
誘発する。糖蛋白質Ｇ、Ｄ、ＥはHSV DNAのＳ成分中に
於て互いに近接してマッピングする。
の表面蛋白質に対して向けられる。ウイルスの表面蛋白
質は感染細胞のビリオン外被中および原形質膜中に挿入
されたウイルス糖蛋白質である。現在、少なくとも６種
の糖蛋白質がHSV−１およびHSV−２によって特徴づけら
れることが知られている。これらはＬ成分中にマッピン
グする糖蛋白質Ｂ、Ｃ、ＨとＳ成分中にマッピング糖蛋
白質Ｄ、Ｅ、Ｇである。これらの糖蛋白質遺伝子中、中
和用抗体を誘発するものおよび恐らくは免疫を誘起する
ものは、Ｓ成分中にマッピングする糖蛋白質Ｄおよび小
さい程度にＬ成分中にマッピングする糖蛋白質Ｂおよび
Ｃである。種々の研究は、最強の中和抗体が糖蛋白質Ｄ
によって誘発されることを示唆している。この糖蛋白質
は、それ自体でも、実験動物系に於てある種の蛋白質を
誘発する。糖蛋白質Ｇ、Ｄ、ＥはHSV DNAのＳ成分中に
於て互いに近接してマッピングする。
組換えウイルスがHSV−１およびHSV−２に対する保護
を与えることができるようにするため、糖蛋白質Ｄおよ
びＧ遺伝子を担持するHSV−2DNAの断片を本発明によっ
て組換えウイルス中へ挿入した。この組換え体は、組換
え体I358からＬ成分から独特の配列、TK遺伝子、および
I358ゲノムからHindIII0配列の除去によって作製され
た。
を与えることができるようにするため、糖蛋白質Ｄおよ
びＧ遺伝子を担持するHSV−2DNAの断片を本発明によっ
て組換えウイルス中へ挿入した。この組換え体は、組換
え体I358からＬ成分から独特の配列、TK遺伝子、および
I358ゲノムからHindIII0配列の除去によって作製され
た。
可能性あるHSVワクチンの望ましい性質は、それらが
形質転換領域を含んではならないということである。形
質転換領域とは、受容細胞に形態学的に転換されるよう
になる能力を与えかつ実験動物に移植時に腫瘍を生ずる
能力を与える領域と定義される。HSV−２ゲノム中の形
質転換領域のすべてはHSV−2 DNAのＬ成分中にマッピン
グされる。HSV−１ゲノムの対応する配列は細胞を不滅
にしないかあるいは細胞に悪性の形質転換性を与えな
い。糖蛋白質ＤおよびＧのための遺伝子を担持するDNA
断片は培養に於て細胞を形質転換させ得ることが知られ
ている配列を含まない。
形質転換領域を含んではならないということである。形
質転換領域とは、受容細胞に形態学的に転換されるよう
になる能力を与えかつ実験動物に移植時に腫瘍を生ずる
能力を与える領域と定義される。HSV−２ゲノム中の形
質転換領域のすべてはHSV−2 DNAのＬ成分中にマッピン
グされる。HSV−１ゲノムの対応する配列は細胞を不滅
にしないかあるいは細胞に悪性の形質転換性を与えな
い。糖蛋白質ＤおよびＧのための遺伝子を担持するDNA
断片は培養に於て細胞を形質転換させ得ることが知られ
ている配列を含まない。
TK-ウイルス（すなわちTK遺伝子欠損ウイルス）は実
験動物に於ける潜伏感染確立能力が小さいという趣旨で
多数の文献が存在する。I358の親ウイルス〔上掲のポッ
フェンバーガー（Poffenberger）ら（1983）、およびポ
ッフェンバーガー（Poffenberger）とロイズマン（Roiz
man）（1985ではΔ305と称す〕は実験動物に於て潜伏を
与えない。かくして、I358のTK遺伝子欠損誘導体も潜伏
を与えないだろうと期待することは合理的である。
験動物に於ける潜伏感染確立能力が小さいという趣旨で
多数の文献が存在する。I358の親ウイルス〔上掲のポッ
フェンバーガー（Poffenberger）ら（1983）、およびポ
ッフェンバーガー（Poffenberger）とロイズマン（Roiz
man）（1985ではΔ305と称す〕は実験動物に於て潜伏を
与えない。かくして、I358のTK遺伝子欠損誘導体も潜伏
を与えないだろうと期待することは合理的である。
しかし、本発明以前には、TK-ウイルスは潜伏を与え
る能力は小さいが、保護を与えるかどうかという問題が
存在した。それ故、組換え体R7017（ATCC VR2121）およ
びR7020（ATCC VR2123）を本発明によって作製した。両
方のウイルスゲノムは、そのBglII部位とSacI部位との
間のかつ両部位を含むTK遺伝子の領域内の約500bpの欠
失を含む。しかし、R7020の場合には、TK遺伝子が、そ
の自然位置ではなく、Ｌ成分とＳ成分との間の新規接合
部に挿入された。この場合の理由づけはTK遺伝子のその
自然部位に於ける回復によって組換え体の毒性が増す可
能性を無くすることである。試験の結果、両方の組換え
体とも野生型ウイルスによる挑戦に対して保護を与える
能力があることが示され、マウスに於ける神経毒性に関
しては弱毒化されることが示された。
る能力は小さいが、保護を与えるかどうかという問題が
存在した。それ故、組換え体R7017（ATCC VR2121）およ
びR7020（ATCC VR2123）を本発明によって作製した。両
方のウイルスゲノムは、そのBglII部位とSacI部位との
間のかつ両部位を含むTK遺伝子の領域内の約500bpの欠
失を含む。しかし、R7020の場合には、TK遺伝子が、そ
の自然位置ではなく、Ｌ成分とＳ成分との間の新規接合
部に挿入された。この場合の理由づけはTK遺伝子のその
自然部位に於ける回復によって組換え体の毒性が増す可
能性を無くすることである。試験の結果、両方の組換え
体とも野生型ウイルスによる挑戦に対して保護を与える
能力があることが示され、マウスに於ける神経毒性に関
しては弱毒化されることが示された。
所望ならば、この組換えゲノム中へ、本出願と同じ譲
渡人に譲渡された、バーナードロイズマン（Bernard Ro
izman）名義の1984年６月４日出願の同時係属中米国特
許出願第616,930号に記載された方法によって異種遺伝
子（HSV−２糖蛋白質以外であってかつHSV−２糖蛋白質
遺伝子に加えて）を挿入しかつ表現することができる。
米国特許出願第616,930号およびそれに対応する、1986
年４月２日付け公告のヨーロッパ特許庁公告第176,170
号の全記載は参照文として本明細書に含まれるものとす
る。
渡人に譲渡された、バーナードロイズマン（Bernard Ro
izman）名義の1984年６月４日出願の同時係属中米国特
許出願第616,930号に記載された方法によって異種遺伝
子（HSV−２糖蛋白質以外であってかつHSV−２糖蛋白質
遺伝子に加えて）を挿入しかつ表現することができる。
米国特許出願第616,930号およびそれに対応する、1986
年４月２日付け公告のヨーロッパ特許庁公告第176,170
号の全記載は参照文として本明細書に含まれるものとす
る。
組換えウイルスの作製方法 本発明によって、おのおのがHSV−１ゲノムの突然変
異体であり、かつ毒性HSV−１および毒性HSV−２の両方
に対するワクチンとして有効であり、かつ異種遺伝子の
ベクターとして作用することもできるゲノムを有する組
換え単純ヘルペスウイルスが調製された。
異体であり、かつ毒性HSV−１および毒性HSV−２の両方
に対するワクチンとして有効であり、かつ異種遺伝子の
ベクターとして作用することもできるゲノムを有する組
換え単純ヘルペスウイルスが調製された。
組換えゲノム中には、神経毒性の原因となるが増殖の
ために必須ではなくかつ原型配列中のHSV−１ゲノムの
内部逆位反復配列のところまたはその付近に位置する部
分が欠失している。特に、HSV−１ゲノムからのα27遺
伝子の右手末端とα４遺伝子のプロモーター領域との間
の全配列の欠失はゲノムの増殖能力を抑制することなく
ゲノムを弱毒化し、同時にゲノムのパッケージングに影
響を与えることなく遺伝物質の挿入のための十分な空間
を与えることが見出された。
ために必須ではなくかつ原型配列中のHSV−１ゲノムの
内部逆位反復配列のところまたはその付近に位置する部
分が欠失している。特に、HSV−１ゲノムからのα27遺
伝子の右手末端とα４遺伝子のプロモーター領域との間
の全配列の欠失はゲノムの増殖能力を抑制することなく
ゲノムを弱毒化し、同時にゲノムのパッケージングに影
響を与えることなく遺伝物質の挿入のための十分な空間
を与えることが見出された。
上記欠失後、HSV−２の免疫誘起性糖蛋白質（例えば
糖蛋白質ＢまたはＣまたはＤ）１種以上をコードする原
因となるHSV−２からの遺伝子を突然変異ゲノム中の欠
失の端部点間に挿入する。
糖蛋白質ＢまたはＣまたはＤ）１種以上をコードする原
因となるHSV−２からの遺伝子を突然変異ゲノム中の欠
失の端部点間に挿入する。
好ましくは、HSV−２糖蛋白質Ｄをコードする遺伝子
を挿入する。この遺伝子はHSV−２糖蛋白質ＧおよびＥ
をコードする隣接遺伝子の全部または一部分と会合され
得る。
を挿入する。この遺伝子はHSV−２糖蛋白質ＧおよびＥ
をコードする隣接遺伝子の全部または一部分と会合され
得る。
前記欠失および挿入後、得られた突然変異体ゲノムを
DNA配列相同の位置に於ける組換えを許す条件下で親HSV
−１のゲノムとコトランスフェクションさせて組換え子
孫を生産させる。この子孫を親ゲノムの欠失部分を欠損
する組換えゲノムについて選択し、選択したゲノムを挿
入HSV−２糖蛋白質コード遺伝子の存在についてスクリ
ーニングする。
DNA配列相同の位置に於ける組換えを許す条件下で親HSV
−１のゲノムとコトランスフェクションさせて組換え子
孫を生産させる。この子孫を親ゲノムの欠失部分を欠損
する組換えゲノムについて選択し、選択したゲノムを挿
入HSV−２糖蛋白質コード遺伝子の存在についてスクリ
ーニングする。
一般に、HSV−１ゲノムの欠失部分（例えばチミジン
キナーゼ遺伝子のBglII部位とSacI部位との間のかつ両
部位を含む約500塩基対）はチミジンキナーゼ遺伝子が
機能性酵素を表現することを不能にする。組換えゲノム
の１つの形に於て、HSV−１ゲノムのα４遺伝子のプロ
モーター領域のようなプロモーターの調節下に於て突然
変異ゲノム中のその自然位置以外の所へチミジンキナー
ゼ遺伝子を挿入する（このチミジンキナーゼ遺伝子はHS
V−１ゲノムからでもHSV−２ゲノムからでもよい）。プ
ロモーター融合は文献に記載されている。例えば、ポス
ト（Post）ら、セル（Cell）,Vol.24、555−565（198
1）を参照されたい。
キナーゼ遺伝子のBglII部位とSacI部位との間のかつ両
部位を含む約500塩基対）はチミジンキナーゼ遺伝子が
機能性酵素を表現することを不能にする。組換えゲノム
の１つの形に於て、HSV−１ゲノムのα４遺伝子のプロ
モーター領域のようなプロモーターの調節下に於て突然
変異ゲノム中のその自然位置以外の所へチミジンキナー
ゼ遺伝子を挿入する（このチミジンキナーゼ遺伝子はHS
V−１ゲノムからでもHSV−２ゲノムからでもよい）。プ
ロモーター融合は文献に記載されている。例えば、ポス
ト（Post）ら、セル（Cell）,Vol.24、555−565（198
1）を参照されたい。
本発明の２種の代表的組換えウイルス（R7017およびR
7020）の調製に用いられる実験室的方法の詳細を次に示
す。あらゆる点で、マニアティス（Maniates）ら、モレ
キュラー・クローニング−ア・ラボラトリー・マニュア
ル（Molecular Cloning-A Laboratory Manual）コール
ド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Sprin
g Harbor Laboratory）（1982）中に詳細に記載されて
いるような標準の実験室的方法を用いてクローニングを
行った。ロイズマン（Roizman）とポスト（Post）の名
義で1981年９月16日に出願された米国特許出願第302,49
7号およびそれに対応するヨーロッパ特許公告第74,808
号（1983年３月23日）（これらのそれぞれの記載は参照
文として本明細書に含まれるものとする）は、本発明に
有用なDNA配列の挿入、欠失、置換の方法を記載してい
る。
7020）の調製に用いられる実験室的方法の詳細を次に示
す。あらゆる点で、マニアティス（Maniates）ら、モレ
キュラー・クローニング−ア・ラボラトリー・マニュア
ル（Molecular Cloning-A Laboratory Manual）コール
ド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Sprin
g Harbor Laboratory）（1982）中に詳細に記載されて
いるような標準の実験室的方法を用いてクローニングを
行った。ロイズマン（Roizman）とポスト（Post）の名
義で1981年９月16日に出願された米国特許出願第302,49
7号およびそれに対応するヨーロッパ特許公告第74,808
号（1983年３月23日）（これらのそれぞれの記載は参照
文として本明細書に含まれるものとする）は、本発明に
有用なDNA配列の挿入、欠失、置換の方法を記載してい
る。
HSV断片ライブラリーは広く入手可能でありかつ技術
上公知であるので、ATCC受託番号で示されないプラスミ
ドおよびウイルス株（ならびにATCC受託番号で示された
幾つか）は記載された方法にとって決定的なものではな
く、便宜上選ばれたものである。例えば、ポスト（Pos
t）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.77、No.7、4201−
4205（1980）参照。
上公知であるので、ATCC受託番号で示されないプラスミ
ドおよびウイルス株（ならびにATCC受託番号で示された
幾つか）は記載された方法にとって決定的なものではな
く、便宜上選ばれたものである。例えば、ポスト（Pos
t）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.77、No.7、4201−
4205（1980）参照。
本出願で用いた野生型親ウイルスはHSV−１株Ｆ〔HSV
−１（Ｆ）〕（ATCC VR733）およびHSV−２株Ｇ〔HSV−
２（Ｇ）〕（ATCC VR734）である。これら２種のウイル
スのそれぞれのゲノムから標準的方法で断片ライブラリ
ーを作製した。
−１（Ｆ）〕（ATCC VR733）およびHSV−２株Ｇ〔HSV−
２（Ｇ）〕（ATCC VR734）である。これら２種のウイル
スのそれぞれのゲノムから標準的方法で断片ライブラリ
ーを作製した。
組換え体R7017は上記組換え体I358から作製された。
目的は、I358DNAから、α27遺伝子の末端とα４遺伝子
のプロモーター領域との間に位置する配列のすべてを除
去することである。野生型ウイルスの場合には、これは
下記のものを含む。
目的は、I358DNAから、α27遺伝子の末端とα４遺伝子
のプロモーター領域との間に位置する配列のすべてを除
去することである。野生型ウイルスの場合には、これは
下記のものを含む。
（ａ）α27遺伝子とα０遺伝子との間に位置する未確認
遺伝子と、 （ｂ）内部逆位反復中に位置するα遺伝子の１つのコピ
ーと、 （ｃ）α０遺伝子とＬ成分とＳ成分との間の自然接合を
形成する１種以上のａ配列との間に位置するr134.5遺伝
子の１つのコピーと、 （ｄ）すべてのａ配列およびＣ′として示されかつａ配
列とα４遺伝子の３′未満との間に位置する配列の１つ
のコピーと、 （ｅ）α４遺伝子の暗号配列のすべておよび５′転写暗
号配列のコピーおよびBam HI Y 断片とBam HI N断片と
の間のBam HI 開裂部位までの内部逆位反復中に位置す
るα４遺伝子のコピー。
遺伝子と、 （ｂ）内部逆位反復中に位置するα遺伝子の１つのコピ
ーと、 （ｃ）α０遺伝子とＬ成分とＳ成分との間の自然接合を
形成する１種以上のａ配列との間に位置するr134.5遺伝
子の１つのコピーと、 （ｄ）すべてのａ配列およびＣ′として示されかつａ配
列とα４遺伝子の３′未満との間に位置する配列の１つ
のコピーと、 （ｅ）α４遺伝子の暗号配列のすべておよび５′転写暗
号配列のコピーおよびBam HI Y 断片とBam HI N断片と
の間のBam HI 開裂部位までの内部逆位反復中に位置す
るα４遺伝子のコピー。
I358DNAの場合には、これらの配列の幾つかは既にな
くなっていた。除去されるべき付加的な配列は下記の通
りであった。
くなっていた。除去されるべき付加的な配列は下記の通
りであった。
（ａ）α27遺伝子の末端とα０遺伝子と左末端との間の
未確認数の配列と、 （ｂ）I358ゲノム中に反復されかつ上掲のポッフェンバ
ーガー（Poffenberger）とロイズマン（Roizman）（198
5）が報告しているような欠損ゲノムの生成の原因とな
るHindIII O断片の部分と、 （ｃ）HindIII O断片からの配列に隣接しているTK遺伝
子。
未確認数の配列と、 （ｂ）I358ゲノム中に反復されかつ上掲のポッフェンバ
ーガー（Poffenberger）とロイズマン（Roizman）（198
5）が報告しているような欠損ゲノムの生成の原因とな
るHindIII O断片の部分と、 （ｃ）HindIII O断片からの配列に隣接しているTK遺伝
子。
所望の欠失を作るために、pRB3410（ATCC53350）と呼
ばれるプラスミドを作製した。プラスミドpRB3410は、
その中にα27遺伝子と組換えのためのフランキング配列
として働くα４遺伝子のプロモーターとが挿入されてい
るポリリンカーを含む。ポリリンカーは、フランキング
配列間に遺伝子を挿入するための便利な制限エンドヌク
レアーゼ部位をも含んでいた。組換え体R7017の場合に
はHSV−２ウイルスの糖蛋白質ＤおよびＧを含むHindIII
L断片をポリリンカー配列中へ挿入した。
ばれるプラスミドを作製した。プラスミドpRB3410は、
その中にα27遺伝子と組換えのためのフランキング配列
として働くα４遺伝子のプロモーターとが挿入されてい
るポリリンカーを含む。ポリリンカーは、フランキング
配列間に遺伝子を挿入するための便利な制限エンドヌク
レアーゼ部位をも含んでいた。組換え体R7017の場合に
はHSV−２ウイルスの糖蛋白質ＤおよびＧを含むHindIII
L断片をポリリンカー配列中へ挿入した。
組換え体R7020は、挿入されたHindIII L断片とα４プ
ロモーターとの間のサンドイッチされたTK遺伝子の構造
配列および転写非暗号配列を含む点で組換え体R7017と
異なる。TK遺伝子はα４プロモーターによって調節され
る。
ロモーターとの間のサンドイッチされたTK遺伝子の構造
配列および転写非暗号配列を含む点で組換え体R7017と
異なる。TK遺伝子はα４プロモーターによって調節され
る。
組換え体R7017の作製 第１図に略示するように、２工程でプラスミドpRB341
0を作製した。まず、プラスミドpRB404中に含まれたBam
HIからの2.4Kbp BamHI−SacI断片をpRB404からのBamHI
−EcoRIとしてプラスミドpUC13のHindIII部位中へ、T4
ポリメラーゼ処理によって挿入した。〔プラスミドpRB4
04は無傷のα27遺伝子の便利な通常源であり、HSV−１
のBamHI B断片からの小BamHI−SalI断片の形でα27遺伝
子を担持する。このプラスミドはBamHIをSalIで消化す
ることによって調製され、ポリメラーゼで処理され、pR
BI（pBR322の誘導体、ATCC31344）中でEcoRI断片として
クローニングされた（pRBIは核酸分解酵素消化によって
除去されるSalI部位を有するpBR322である）。プラスミ
ドpUC13は公知であり、米国ニュージャーシー州、ピス
カタウエイ（Piscataway）のファーマシア社（Pharmaci
a,Inc.）から市販されている。〕 次に、プラスミドpRB403中に含まれるHSV−１（Ｆ）
のBamHI N断片からの1.8Kbp EcoRI−PvuII断片を、やは
りT4ポリメラーゼ処理後、pUC13やEcoRI部位中へ挿入し
た。（プラスミドpRB403はpBR322中でBamHI−PvuII断片
としてクローニングされたBamHIの左端部を担持する。
これは、全BamHI N断片よりも小さいの便利なα４遺伝
子プロモーター源である。）2.4KB BamHI−SacI断片は
それ自体のプロモーターを含む全α27遺伝子を含むが、
EcoRI−PvuII断片はα４遺伝子のためのプロモーターの
みを含む。上掲のポスト（Post）ら（1981）およびクリ
スティー（Kristie）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.
81、4065−4069（1984）を参照されたい。野生型ゲノム
中では、この２つの断片は、Ｓ成分の内部逆位反復内
で、約8KBのBamHI B、および全BamHIS、BamHI P、およ
びBamHI Y断片で隔てられている。
0を作製した。まず、プラスミドpRB404中に含まれたBam
HIからの2.4Kbp BamHI−SacI断片をpRB404からのBamHI
−EcoRIとしてプラスミドpUC13のHindIII部位中へ、T4
ポリメラーゼ処理によって挿入した。〔プラスミドpRB4
04は無傷のα27遺伝子の便利な通常源であり、HSV−１
のBamHI B断片からの小BamHI−SalI断片の形でα27遺伝
子を担持する。このプラスミドはBamHIをSalIで消化す
ることによって調製され、ポリメラーゼで処理され、pR
BI（pBR322の誘導体、ATCC31344）中でEcoRI断片として
クローニングされた（pRBIは核酸分解酵素消化によって
除去されるSalI部位を有するpBR322である）。プラスミ
ドpUC13は公知であり、米国ニュージャーシー州、ピス
カタウエイ（Piscataway）のファーマシア社（Pharmaci
a,Inc.）から市販されている。〕 次に、プラスミドpRB403中に含まれるHSV−１（Ｆ）
のBamHI N断片からの1.8Kbp EcoRI−PvuII断片を、やは
りT4ポリメラーゼ処理後、pUC13やEcoRI部位中へ挿入し
た。（プラスミドpRB403はpBR322中でBamHI−PvuII断片
としてクローニングされたBamHIの左端部を担持する。
これは、全BamHI N断片よりも小さいの便利なα４遺伝
子プロモーター源である。）2.4KB BamHI−SacI断片は
それ自体のプロモーターを含む全α27遺伝子を含むが、
EcoRI−PvuII断片はα４遺伝子のためのプロモーターの
みを含む。上掲のポスト（Post）ら（1981）およびクリ
スティー（Kristie）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.
81、4065−4069（1984）を参照されたい。野生型ゲノム
中では、この２つの断片は、Ｓ成分の内部逆位反復内
で、約8KBのBamHI B、および全BamHIS、BamHI P、およ
びBamHI Y断片で隔てられている。
プラスミドpRB3410を、α27遺伝子とα４プロモータ
ーとの間に独特な制限エンドヌクレアーゼ開裂部位をも
つポリリンカーを含むように作製した。その結果、α27
遺伝子とα４プロモーターとによって与えられるフラン
キング相同を用いて付加的なDNA配列を部位中へ挿入し
かつI358のウイルスゲノム内に置くことができるように
なった。pRB3410中のポリリンカーのXbaI部位中へ、HSV
−２（Ｇ）の9.5Kbp HindIII L断片を、ポリメラーゼ処
理後に挿入した。この断片は、プラスミドpACYC 177（A
TCC37031）のHindIII部位中へクローニングされたHSV−
２（Ｇ）のHindIII L断片を含むプラスミドpRBのHindII
I消化物をアガロースから電気泳動後精製したものであ
る。〔プラスミドpRB804はpACYC177のHindIII部位中へ
クローニングされたHSV−２のHindIII L断片のクローン
であり、HSV−２のgG、gDの無傷の暗号領域とgEの暗号
配列の一部分とを含む。プラスミドpACYC177は広く入手
可能であり、所望ならばプラスミドpBR322で置換するこ
とができる。チャン（Chang）ら、J.Bcteriol.,Vol.13
4、1141（1978）参照〕。pRB403およびpRB404からの断
片は後に続く種々の組換え作業のためのフランキング相
同配列を与えた。
ーとの間に独特な制限エンドヌクレアーゼ開裂部位をも
つポリリンカーを含むように作製した。その結果、α27
遺伝子とα４プロモーターとによって与えられるフラン
キング相同を用いて付加的なDNA配列を部位中へ挿入し
かつI358のウイルスゲノム内に置くことができるように
なった。pRB3410中のポリリンカーのXbaI部位中へ、HSV
−２（Ｇ）の9.5Kbp HindIII L断片を、ポリメラーゼ処
理後に挿入した。この断片は、プラスミドpACYC 177（A
TCC37031）のHindIII部位中へクローニングされたHSV−
２（Ｇ）のHindIII L断片を含むプラスミドpRBのHindII
I消化物をアガロースから電気泳動後精製したものであ
る。〔プラスミドpRB804はpACYC177のHindIII部位中へ
クローニングされたHSV−２のHindIII L断片のクローン
であり、HSV−２のgG、gDの無傷の暗号領域とgEの暗号
配列の一部分とを含む。プラスミドpACYC177は広く入手
可能であり、所望ならばプラスミドpBR322で置換するこ
とができる。チャン（Chang）ら、J.Bcteriol.,Vol.13
4、1141（1978）参照〕。pRB403およびpRB404からの断
片は後に続く種々の組換え作業のためのフランキング相
同配列を与えた。
得られた組換えプラスミドpBR3498（ATCC53348）を無
傷のI358DNAと共に兎の皮膚細胞中へコトランスフェク
ションした（第２図参照）。トランスフェクションの子
孫を３％胎児牛血清およびブロモウラシルデオキシリボ
シド（BUdR）で補捉された199−Ｖの混合物を含む培地
の存在下に143TK-細胞上へ平板培養した。I358子孫は、
ウイルスがTK+であるのでBUdRによって破壊された。BUd
Rの存在下で増殖したTK-組換えウイルス（R7017と称
す）は精製されたプラークであり、制限エンドヌクレア
ーゼによって予期構造について試験し（第３図および第
４図）かつ糖蛋白質Ｇに対するHSV−２（Ｇ）特異性モ
ノクローナル抗体H966〔ロイズマン（Roizman）ら、ウ
イロロジー（Virology）,Vol.133、242−247ページ、19
84〕によるビオチン・アビジン増強表面イムノアッセイ
〔コウソウラス（Kousoulas）ら、ウイロロジー（Virol
ogy）、Vol.135、379−396ページ、1984〕によってHSV
−２（Ｇ）糖蛋白質Ｇ遺伝子の存在について試験した。
下記第１表を参照されたい。
傷のI358DNAと共に兎の皮膚細胞中へコトランスフェク
ションした（第２図参照）。トランスフェクションの子
孫を３％胎児牛血清およびブロモウラシルデオキシリボ
シド（BUdR）で補捉された199−Ｖの混合物を含む培地
の存在下に143TK-細胞上へ平板培養した。I358子孫は、
ウイルスがTK+であるのでBUdRによって破壊された。BUd
Rの存在下で増殖したTK-組換えウイルス（R7017と称
す）は精製されたプラークであり、制限エンドヌクレア
ーゼによって予期構造について試験し（第３図および第
４図）かつ糖蛋白質Ｇに対するHSV−２（Ｇ）特異性モ
ノクローナル抗体H966〔ロイズマン（Roizman）ら、ウ
イロロジー（Virology）,Vol.133、242−247ページ、19
84〕によるビオチン・アビジン増強表面イムノアッセイ
〔コウソウラス（Kousoulas）ら、ウイロロジー（Virol
ogy）、Vol.135、379−396ページ、1984〕によってHSV
−２（Ｇ）糖蛋白質Ｇ遺伝子の存在について試験した。
下記第１表を参照されたい。
組換えウイルスR7017は組換えウイルスR3410（ATCC V
R2124）に相当するが、HSV−2HindIII L断片を含んでい
る。R3410ウイルスは、I358をプラスミドpRB3410とコト
ランスフェクションさせることによって調製することが
でき、あるいは、別法では、I358を挿入HSV−2HindIII
L断片を含むpRB3410とコトランスフェクションさせて付
加的にHSV−2 L断片を含む組換え体R3410の誘導体を得
ることができる。後者の組換えウイルスをR7017と称
す。
R2124）に相当するが、HSV−2HindIII L断片を含んでい
る。R3410ウイルスは、I358をプラスミドpRB3410とコト
ランスフェクションさせることによって調製することが
でき、あるいは、別法では、I358を挿入HSV−2HindIII
L断片を含むpRB3410とコトランスフェクションさせて付
加的にHSV−2 L断片を含む組換え体R3410の誘導体を得
ることができる。後者の組換えウイルスをR7017と称
す。
組換え体R7020の作製 R7017ウイルスゲノム中のα４プロモーターに最も近
いHSV−２（Ｇ）HindIII L断片からの1.8Kbp SacI−Hin
dIII断片をpRB3498からのSacI断片としてプラスミドpUC
18（ATCC37353）中へクローニングした。〔pUC18は米国
ニュージャーシー州ピスカタウエイのファーマシア社
（Pharmacia,Inc.）から市販されている〕。α４調節TK
遺伝子をプラスミドpRB316からのPvuII断片として開裂
させ〔上掲のポスト（Post）ら、1981〕、T4ポリメラー
ゼによりプラスミドpRB3498のHindIII部位中へクローニ
ングさせてプラスミドpRB3575（ATCC53349）を得た（第
１図）。〔プラスミドpRB316は便利なα−調節TK遺伝子
源である。このプラスミドは、pRB322中にクローニング
されたBamHIQのより大きいBamHI−BglII断片へ融合され
たHSV−1 BamHI Nを担持する。この融合に於て、α４遺
伝子のプロモーターはTK遺伝子の５′転写暗号および非
暗号配列へ融合されて、得られたキメリック（chimeri
c）遺伝子がβ遺伝子ではなくα遺伝子として調節され
るようになる。〕 プラスミドpRB3575は、R7017ウイルスゲノムとのフラ
ンキング相同の領域間への付加的配列の挿入のための多
重クローニング部位があるように作製された。この組換
えプラスミドpRB3575をR7017ウイルスDNAとコトランス
フェクションさせ、得られたTK+R7020組換え体を、HAT
培地の存在下で143TK-細胞中での増殖能力に基づいて単
離した（第２図および第３図参照）。この組換え体をEc
oRIを用いてDNA制限分析で立証し（第３図および第４
図）、４回プラク精製（plaqued purified）した。組換
え体をR7017およびR7020を、第１表に示すような種々の
モノクローナル抗体で試験した。
いHSV−２（Ｇ）HindIII L断片からの1.8Kbp SacI−Hin
dIII断片をpRB3498からのSacI断片としてプラスミドpUC
18（ATCC37353）中へクローニングした。〔pUC18は米国
ニュージャーシー州ピスカタウエイのファーマシア社
（Pharmacia,Inc.）から市販されている〕。α４調節TK
遺伝子をプラスミドpRB316からのPvuII断片として開裂
させ〔上掲のポスト（Post）ら、1981〕、T4ポリメラー
ゼによりプラスミドpRB3498のHindIII部位中へクローニ
ングさせてプラスミドpRB3575（ATCC53349）を得た（第
１図）。〔プラスミドpRB316は便利なα−調節TK遺伝子
源である。このプラスミドは、pRB322中にクローニング
されたBamHIQのより大きいBamHI−BglII断片へ融合され
たHSV−1 BamHI Nを担持する。この融合に於て、α４遺
伝子のプロモーターはTK遺伝子の５′転写暗号および非
暗号配列へ融合されて、得られたキメリック（chimeri
c）遺伝子がβ遺伝子ではなくα遺伝子として調節され
るようになる。〕 プラスミドpRB3575は、R7017ウイルスゲノムとのフラ
ンキング相同の領域間への付加的配列の挿入のための多
重クローニング部位があるように作製された。この組換
えプラスミドpRB3575をR7017ウイルスDNAとコトランス
フェクションさせ、得られたTK+R7020組換え体を、HAT
培地の存在下で143TK-細胞中での増殖能力に基づいて単
離した（第２図および第３図参照）。この組換え体をEc
oRIを用いてDNA制限分析で立証し（第３図および第４
図）、４回プラク精製（plaqued purified）した。組換
え体をR7017およびR7020を、第１表に示すような種々の
モノクローナル抗体で試験した。
実施例 下記の特別な実施例は、本発明の２種の代表的な組換
えウイルスの感染性、潜伏の確立能力、免疫原性、およ
び毒性の欠除を示すためのものである。もう１つの実施
例は、本発明の代表的な組換えウイルスの１種のマウス
の脳中の連続通過（serial passage）前後の毒性の比較
を示す。
えウイルスの感染性、潜伏の確立能力、免疫原性、およ
び毒性の欠除を示すためのものである。もう１つの実施
例は、本発明の代表的な組換えウイルスの１種のマウス
の脳中の連続通過（serial passage）前後の毒性の比較
を示す。
実施例１−マウスの眼経路によるウイルスR7017およびR
7020の感染性 ６週令バルブ/c/センルコ（Balb/c/Cenlco）マウス
〔IFFA−クレド（IFFA−Credo）、仏国、レ オンシン
（Les Onsins）〕の両眼にペントバルビトン麻酔下にウ
イルスR7017またはR7020で接種した。角膜を皮下注射針
で10回軽くなでて乱切りし、10μｌのウイルス懸濁液で
潤した。目蓋を閉じて穏やかにマッサージした。
7020の感染性 ６週令バルブ/c/センルコ（Balb/c/Cenlco）マウス
〔IFFA−クレド（IFFA−Credo）、仏国、レ オンシン
（Les Onsins）〕の両眼にペントバルビトン麻酔下にウ
イルスR7017またはR7020で接種した。角膜を皮下注射針
で10回軽くなでて乱切りし、10μｌのウイルス懸濁液で
潤した。目蓋を閉じて穏やかにマッサージした。
２時間後、マウスを再び麻酔し、生理的食塩水で1/10
に希釈した。16％ヒト標準免疫グロブリン溶液〔仏国、
リオン（Lyon）のインスティテュートメリュー（Instit
ut Merieux）〕50μｌで洗った。免疫グロブリン溶液を
５回眼の上にさっと流しかつ眼から吸引した。過剰の流
体を捨て、眼上に約10μｌを残した。免疫グロブリン溶
液の目的は角膜中に浸透しなかったウイルスを中和する
ことであった。
に希釈した。16％ヒト標準免疫グロブリン溶液〔仏国、
リオン（Lyon）のインスティテュートメリュー（Instit
ut Merieux）〕50μｌで洗った。免疫グロブリン溶液を
５回眼の上にさっと流しかつ眼から吸引した。過剰の流
体を捨て、眼上に約10μｌを残した。免疫グロブリン溶
液の目的は角膜中に浸透しなかったウイルスを中和する
ことであった。
ウイルス検定のための検体を1,2,3,4,7日に、マウス
を麻酔下に瀉血した直後に集めた。葡萄糖および不活性
子牛血清で補捉された燐酸塩緩衝液（PBS Glu SVI）で
眼を洗うことによって涙液膜をサンプリングした。約50
μｌを５回眼の上にさっと流しかつ吸引し、1mlのPBS G
lu SVI中へ移した。三叉神経節を適当な切開後に取り出
し、1mlのPBS Glu SVI中へ移し、ホモジナイズし、３回
凍結融解サイクルにかけた。
を麻酔下に瀉血した直後に集めた。葡萄糖および不活性
子牛血清で補捉された燐酸塩緩衝液（PBS Glu SVI）で
眼を洗うことによって涙液膜をサンプリングした。約50
μｌを５回眼の上にさっと流しかつ吸引し、1mlのPBS G
lu SVI中へ移した。三叉神経節を適当な切開後に取り出
し、1mlのPBS Glu SVI中へ移し、ホモジナイズし、３回
凍結融解サイクルにかけた。
検体はすべて氷浴中に保ち、マウスの死後１時間以内
に処理した。
に処理した。
涙液膜希釈液または神経節組織懸濁液0.5mlを25cm2の
ベロセル（Vero cell）層上で平板培養し、回転振盪機
で37℃に於て１時間吸収させた。接種物を捨て、セル層
に１％の子牛血清およびポリミキシンとニスタチンとの
混合物で補捉された199培地5mlを与えた。
ベロセル（Vero cell）層上で平板培養し、回転振盪機
で37℃に於て１時間吸収させた。接種物を捨て、セル層
に１％の子牛血清およびポリミキシンとニスタチンとの
混合物で補捉された199培地5mlを与えた。
培養物を、７日間、毎日、典型的なHSV細胞変性効果
について試験した。陽性培養では、細胞変性病巣数を概
算し、プラク発現の最初の２日について評点した。
について試験した。陽性培養では、細胞変性病巣数を概
算し、プラク発現の最初の２日について評点した。
結果は、下記の第２表および第３表に示す。
第２表は、涙液膜中および三叉神経節中でウイルスを
単離することができた全被検マウス数を示す。データ
は、両ウイルス共、それらが涙液膜中に存在することに
よって明示されるように増殖したことを示す。しかし、
第２表に示されるように、神経節の感染を確立し得たも
のはR7020のみであった。第３表は、涙液膜中のウイル
ス量に反映する細胞変性病巣数がほぼ同じであること、
すなわち両ウイルス共に接種部位に於て増殖可能である
ことを示している。
単離することができた全被検マウス数を示す。データ
は、両ウイルス共、それらが涙液膜中に存在することに
よって明示されるように増殖したことを示す。しかし、
第２表に示されるように、神経節の感染を確立し得たも
のはR7020のみであった。第３表は、涙液膜中のウイル
ス量に反映する細胞変性病巣数がほぼ同じであること、
すなわち両ウイルス共に接種部位に於て増殖可能である
ことを示している。
実施例２−マウスに於ける脳内経路によるウイルスR701
7およびR7020の毒性 ６週令雄バルブ/c/センルコ（Balb/c/Cenlco）マウス
IFFA−クレド（IFFA−Credo）〔仏国、レ オンシン（L
es Oncins）〕かた得た。20匹ずつのマウス群を、ペン
トバルビトン麻酔下に、ウイルスR7017またはR7020によ
り、ウイルス懸濁液の逐次10倍希釈50μｌで頭蓋内注射
した。R7017のウイルス力価は8.4（log pfu/ml）であっ
た。R7020の力価は9.3（log pfu/ml）であった。
7およびR7020の毒性 ６週令雄バルブ/c/センルコ（Balb/c/Cenlco）マウス
IFFA−クレド（IFFA−Credo）〔仏国、レ オンシン（L
es Oncins）〕かた得た。20匹ずつのマウス群を、ペン
トバルビトン麻酔下に、ウイルスR7017またはR7020によ
り、ウイルス懸濁液の逐次10倍希釈50μｌで頭蓋内注射
した。R7017のウイルス力価は8.4（log pfu/ml）であっ
た。R7020の力価は9.3（log pfu/ml）であった。
ウイルス／マウスの最大量を増すと共に添加物によっ
てひき起こされる妨害を少なくするため、本実験で用い
たウイルスは脱脂乳なしで調製しかつ貯蔵したロット95
および96（それぞれウイルスR7020およびR7017）の一部
分であった。
てひき起こされる妨害を少なくするため、本実験で用い
たウイルスは脱脂乳なしで調製しかつ貯蔵したロット95
および96（それぞれウイルスR7020およびR7017）の一部
分であった。
接種後、３週間、毎日マウスを観察した。２アークサ
イン 法（２ arc sinus method）による死亡率パターンから致死量を計算し
た。R7017およびR7020のおのおのについて、計算された
致死量（LD50）は106.43pfu/マウスであった。
イン 法（２ arc sinus method）による死亡率パターンから致死量を計算し
た。R7017およびR7020のおのおのについて、計算された
致死量（LD50）は106.43pfu/マウスであった。
結果は、第５図および第６図にグラフで示してある。
上記結果は、親ウイルス〔HSV−１（Ｆ）〕の50％致
死量（LD50）が101.5pfu/マウスであるので、両ウイル
ス共に比較的に弱毒化されていることを示す。簡単に言
うと、弱毒性ウイルスは野生型ウイルスよりも毒性が10
0,000倍低い。
死量（LD50）が101.5pfu/マウスであるので、両ウイル
ス共に比較的に弱毒化されていることを示す。簡単に言
うと、弱毒性ウイルスは野生型ウイルスよりも毒性が10
0,000倍低い。
結果は、両組換え体がマウスに於いて脳内接種によっ
て測定したとき、弱毒化度に関して異ならないことも示
している。
て測定したとき、弱毒化度に関して異ならないことも示
している。
実施例３−マウスに於ける皮下経路によるウイルスR701
7およびR7020の免疫原性 ６週令雄マウス〔OF1（IOPS Caw）〕をIFFA−クレド
（IFFA Credo）〔仏国、レ オンシン（Les Oncins）〕
から得た。
7およびR7020の免疫原性 ６週令雄マウス〔OF1（IOPS Caw）〕をIFFA−クレド
（IFFA Credo）〔仏国、レ オンシン（Les Oncins）〕
から得た。
20匹ずつの群の右足肉趾（food pad）に、ウイルス懸
濁液の逐次10倍希釈20μｌを注射した。用いたウイルス
はR7017およびR7020ならびに対照としてHSV−１（Ｆ）
を含んでいた。
濁液の逐次10倍希釈20μｌを注射した。用いたウイルス
はR7017およびR7020ならびに対照としてHSV−１（Ｆ）
を含んでいた。
ウイルス／マウスの最大量を増すと共に添加物によっ
てひき起こされる妨害を減少するため、本実験で用いた
ウイルスR7017およびR7020は、それぞれ脱脂乳無しで調
製しかつ貯蔵したロット96および95の一部分であった。
てひき起こされる妨害を減少するため、本実験で用いた
ウイルスR7017およびR7020は、それぞれ脱脂乳無しで調
製しかつ貯蔵したロット96および95の一部分であった。
４週間後に、マウスを、HSV−１（MGH 10）またはHSV
−２（Ｇ）のいずれかの300致死量を含む50μｌでペン
トバルビトン麻酔下に脳内経路によって挑戦した。
−２（Ｇ）のいずれかの300致死量を含む50μｌでペン
トバルビトン麻酔下に脳内経路によって挑戦した。
挑戦後、マウス３週間毎日観察した。２アークサイン Ｐ法によって生存パターンから保護量を計算した。
結果は、下記第４表に示し、かつ第７図−第12図にグ
ラフで示す。
ラフで示す。
これらの研究は、弱毒化組換えウイルスは挑戦ウイル
ス〔HSV−１（MGH−10〕およびHSV（Ｇ）〕の致死量か
らマウスを保護し得ることを示している。この保護は野
生型ウイルスによって得られる程良好ではない（10−50
の倍率だけ）。従って、組換えウイルスは、同じ保護を
与えるために野生型よりも10−乃至50−倍高濃度で使用
しなければならない。しかし、組換えウイルスはずっと
大きい安全限界を有しており、実施例２で示したよう
に、野生型ウイルスより100,000倍低毒性である。
ス〔HSV−１（MGH−10〕およびHSV（Ｇ）〕の致死量か
らマウスを保護し得ることを示している。この保護は野
生型ウイルスによって得られる程良好ではない（10−50
の倍率だけ）。従って、組換えウイルスは、同じ保護を
与えるために野生型よりも10−乃至50−倍高濃度で使用
しなければならない。しかし、組換えウイルスはずっと
大きい安全限界を有しており、実施例２で示したよう
に、野生型ウイルスより100,000倍低毒性である。
実施例４−潜伏確立能力 ６週令バルブ/c/センルコ（Balb/c/Cenlco）マウス
〔IFFA−クレド（IFFA−Credo）、仏国、レ オンシン
（Les Oncins）〕の右眼にペントバルビトン麻酔下にウ
イルスR7017およびR7020で接種した。皮下針で10回軽く
撫でることによって角膜を乱切りし、10μｌの未希釈ス
トックウイルス懸濁液で潤した。目蓋を閉じて穏やかに
マッサージした。
〔IFFA−クレド（IFFA−Credo）、仏国、レ オンシン
（Les Oncins）〕の右眼にペントバルビトン麻酔下にウ
イルスR7017およびR7020で接種した。皮下針で10回軽く
撫でることによって角膜を乱切りし、10μｌの未希釈ス
トックウイルス懸濁液で潤した。目蓋を閉じて穏やかに
マッサージした。
４週間後、マウスを麻酔して瀉血した。直ちに右三叉
神経節を取り出し、維持培地（199V）中で、37℃に於
て、空気−CO2雰囲気（96:4V/V）下に４日または５日間
培養した。
神経節を取り出し、維持培地（199V）中で、37℃に於
て、空気−CO2雰囲気（96:4V/V）下に４日または５日間
培養した。
次に神経節を組織摩砕機でホモジナイズした。ウイル
スの存在を検定するため、得られた懸濁液をベロセル
（Vero cell）（25cm2プラスチックフラスコ）に移し
た。回転振盪機で37℃に於て１時間吸収後、接種物を除
去し、維持培地を加え、フラスコを37℃に於て培養し
た。
スの存在を検定するため、得られた懸濁液をベロセル
（Vero cell）（25cm2プラスチックフラスコ）に移し
た。回転振盪機で37℃に於て１時間吸収後、接種物を除
去し、維持培地を加え、フラスコを37℃に於て培養し
た。
培養物を、７日間、毎日、HSV感染細胞の特徴である
細胞変性効果（CPE）について試験した。検出感度を改
良するために、HSV CPEを示さない培養物を試験期間終
了時に１回凍結、融解し、上記のようにHSVの検定を行
った。
細胞変性効果（CPE）について試験した。検出感度を改
良するために、HSV CPEを示さない培養物を試験期間終
了時に１回凍結、融解し、上記のようにHSVの検定を行
った。
結果は、下記の第５表に示す この結果は、R7020はレベルは低い（マウス20匹中１
匹）が潜伏を確立する潜在能力があることを示してい
る。R7017についての結果は、TK-ウイルスは一般に潜伏
確立能力がないかまたは潜伏確立能力がはなはだしく冒
されるという報告の結果を符合していた。
匹）が潜伏を確立する潜在能力があることを示してい
る。R7017についての結果は、TK-ウイルスは一般に潜伏
確立能力がないかまたは潜伏確立能力がはなはだしく冒
されるという報告の結果を符合していた。
実施例５−マウスの脳内のウイルスR7020の連続通過 ６週令雄マウス〔ICO:OF1（IOPS Caw）〕を仏国、レ
オンシン（Les Oncins）のIFFA−クレド（IFFA−Cred
o）から得た。８匹ずつのマウス群を、50μｌ中ウイル
スR7010およびR7020の約106プラク形成単位（pfu）で、
ペントバルビトン麻酔下に、脳内経路によって注射し
た。
オンシン（Les Oncins）のIFFA−クレド（IFFA−Cred
o）から得た。８匹ずつのマウス群を、50μｌ中ウイル
スR7010およびR7020の約106プラク形成単位（pfu）で、
ペントバルビトン麻酔下に、脳内経路によって注射し
た。
３日（時には２日）後、３匹のマウスをランダムに取
り出し、殺した。おのおのの脳を無菌形に切除し、葡萄
糖および不活性子牛血清で補捉された燐酸塩緩衝食塩水
（PBS Glu SVI）4.5ml中に移した。組織をホモジナイズ
し、３サイクルの凍結融解にかけた。次にホモジネート
を900gで10分間冷凍遠心分離によって清澄にした。
り出し、殺した。おのおのの脳を無菌形に切除し、葡萄
糖および不活性子牛血清で補捉された燐酸塩緩衝食塩水
（PBS Glu SVI）4.5ml中に移した。組織をホモジナイズ
し、３サイクルの凍結融解にかけた。次にホモジネート
を900gで10分間冷凍遠心分離によって清澄にした。
上澄液をプールし、 ｉ）ヒト免疫グロブリンで補捉された液体重層下に於て
ベロセル（Vero cell）上でのプラク計数法による感染
性力価測定、および ii）ベロセル（Vero cell）上でのウイルスストックの
調製 のために用いた。
ベロセル（Vero cell）上でのプラク計数法による感染
性力価測定、および ii）ベロセル（Vero cell）上でのウイルスストックの
調製 のために用いた。
1ml清澄化懸濁液を２個の25cm2セル層のおのおのの上
で平板培養し、回転振盪機で室温に於て１時間吸着させ
た。次に、接種物を捨て、１％の不活化子牛血清で補捉
された199培地で置換した。
で平板培養し、回転振盪機で室温に於て１時間吸着させ
た。次に、接種物を捨て、１％の不活化子牛血清で補捉
された199培地で置換した。
培養液を36℃で培養し、毎日試験した。層の90−100
％が細胞変性効果を示したとき子孫ウイルスを採取し
た。培養液を３回凍結融解し、得られた懸濁液を乳を添
加せずに−70℃に於て貯蔵した。このストックをベロ
（Vero）セル上で力価測定した後、マウス中の次回の通
過として注射した。
％が細胞変性効果を示したとき子孫ウイルスを採取し
た。培養液を３回凍結融解し、得られた懸濁液を乳を添
加せずに−70℃に於て貯蔵した。このストックをベロ
（Vero）セル上で力価測定した後、マウス中の次回の通
過として注射した。
逆力価測定（Back titration）は、感染多重度が0.01
−0.001の範囲であることを示した。10匹ずつの６週令
雄ICO OF1マウス〔IFFA−クレド（IFFA−Credo）、仏
国、レ オンシン（Les Oncins）〕の群で毒性力価測定
を行った。ウイルスストックの逐次10倍希釈50μｌをペ
ントバルビトン麻酔下に脳内に注射した。接種後３週間
生存マウスを監視し、２アークサイン 法によって死亡率パターンから50％致死量（LD50）を計
算した。
−0.001の範囲であることを示した。10匹ずつの６週令
雄ICO OF1マウス〔IFFA−クレド（IFFA−Credo）、仏
国、レ オンシン（Les Oncins）〕の群で毒性力価測定
を行った。ウイルスストックの逐次10倍希釈50μｌをペ
ントバルビトン麻酔下に脳内に注射した。接種後３週間
生存マウスを監視し、２アークサイン 法によって死亡率パターンから50％致死量（LD50）を計
算した。
試験したウイルスは、ｉ）109.17pfu/mlを含むウイル
スR7020（lot No.95）の初期ストック、およびii）マウ
ス中の最後の通過後細胞培養中１回通過のみをこのウイ
ルスが行うように第９連続通過に於てベロ（Vero）セル
上で作ったストックであった。このものの力価は109.90
pfu/ml（２回の測定の平均）と測定された。
スR7020（lot No.95）の初期ストック、およびii）マウ
ス中の最後の通過後細胞培養中１回通過のみをこのウイ
ルスが行うように第９連続通過に於てベロ（Vero）セル
上で作ったストックであった。このものの力価は109.90
pfu/ml（２回の測定の平均）と測定された。
結果を下記第６表に示す。
原理的に、欠失は永久的であり、欠失は突然変異によ
って回復されない。しかし、ゲノム中の他所で起こり得
る突然変異は欠失機能を部分的に回復させることがあり
得る。
って回復されない。しかし、ゲノム中の他所で起こり得
る突然変異は欠失機能を部分的に回復させることがあり
得る。
本実施例は、マウス脳内の連続通過は毒性ウイルスの
選択をもたらさないことを示しかつ補償突然変異が起こ
らないことを示す。
選択をもたらさないことを示しかつ補償突然変異が起こ
らないことを示す。
以上の実施例および記載は、本発明の組換えウイルス
株が免疫原性、無毒性、毒性へ戻る傾向が無いこと、お
よびウイルスR7017の場合には、免疫後宿主中に存在し
ないことの特徴を示すとうことを示す。さらに、組換え
ウイルス株は野生型HSV−１およびHSV−２の両方に対す
る免疫誘起に有効である。
株が免疫原性、無毒性、毒性へ戻る傾向が無いこと、お
よびウイルスR7017の場合には、免疫後宿主中に存在し
ないことの特徴を示すとうことを示す。さらに、組換え
ウイルス株は野生型HSV−１およびHSV−２の両方に対す
る免疫誘起に有効である。
本発明の組換えウイルスの１つの特に有用な面は、異
種遺伝子のベクターとして組換え体の使用を可能にする
ように異種遺伝子の挿入のための大きなスペースがその
ゲノム中で有効であるという事実である。例えば、ウイ
ルスI358は約13KBの欠失を含むが、組換え体R3410は約1
5KBの欠失を含む。組換え体R7017は異種遺伝子の挿入の
ために有効な約8KBを保持する。
種遺伝子のベクターとして組換え体の使用を可能にする
ように異種遺伝子の挿入のための大きなスペースがその
ゲノム中で有効であるという事実である。例えば、ウイ
ルスI358は約13KBの欠失を含むが、組換え体R3410は約1
5KBの欠失を含む。組換え体R7017は異種遺伝子の挿入の
ために有効な約8KBを保持する。
免疫経路、量および指示 本発明の１種以上の生ワクチン組換えウイルス株の免
疫誘起量を含むワクチンで、非経口経路によって、好ま
しく筋肉内または皮下注射によってヒト宿主を接種する
ことが好ましい。また、表面乱切りあるいは体腔の接種
によって接種を行うこともできる。ヒト宿主の免疫を起
こさせるためには、感染しやすいヒトまたは非ヒト霊長
類細胞系で測定して、毎回約10−1,000,000pfuの１回ま
たは数回の接種で十分である。
疫誘起量を含むワクチンで、非経口経路によって、好ま
しく筋肉内または皮下注射によってヒト宿主を接種する
ことが好ましい。また、表面乱切りあるいは体腔の接種
によって接種を行うこともできる。ヒト宿主の免疫を起
こさせるためには、感染しやすいヒトまたは非ヒト霊長
類細胞系で測定して、毎回約10−1,000,000pfuの１回ま
たは数回の接種で十分である。
ワクチン接種のための指示には ａ）ホストの免疫レベルの増加が所望または所要、 ｂ）高い自然感染確率に直面した際の免疫の欠除 ｃ）免疫の欠除およびごく近い将来またはあまり遠くな
い将来に於て免疫抑制治療のため被験者が免疫学的に屈
従するようになる可能性 が含まれる。
い将来に於て免疫抑制治療のため被験者が免疫学的に屈
従するようになる可能性 が含まれる。
本発明のワクチンは液体形または凍結乾燥形で便利に
利用でき、後者の場合には、凍結乾燥過程中にワクチン
株を保護するために１種以上の適当な保存剤および保護
剤と共に利用することができる。
利用でき、後者の場合には、凍結乾燥過程中にワクチン
株を保護するために１種以上の適当な保存剤および保護
剤と共に利用することができる。
本発明の組換えウイルス株は、野生型HSV−１およびH
SV−２に対するヒト宿主の免疫に於ける効用に加えて、
野生型HSV−１およびHSV−２で感染した患者の治療に効
用があると信ずる。治療は、上述した免疫に使用したと
同様な投与量および投与経路を用いて行うことができ
る。
SV−２に対するヒト宿主の免疫に於ける効用に加えて、
野生型HSV−１およびHSV−２で感染した患者の治療に効
用があると信ずる。治療は、上述した免疫に使用したと
同様な投与量および投与経路を用いて行うことができ
る。
本明細書中で挙げたすべての刊行物の記載は参照文と
して明白に本明細書に含まれるものとする。
して明白に本明細書に含まれるものとする。
以上の詳細な説明は明瞭に理解して頂くためのみに示
したものであり、本発明の範囲内で多くの変更が当業者
には明らかであるので、上記の詳細な説明から不必要な
限定を解釈すべきものでもなくまた推論すべきものでも
ない。
したものであり、本発明の範囲内で多くの変更が当業者
には明らかであるので、上記の詳細な説明から不必要な
限定を解釈すべきものでもなくまた推論すべきものでも
ない。
第１図は本発明の代表的な組換えウイルス株の作製に用
いられるプラスミドpRB3410、pRB3498、pRB3575の作製
の概略図である。上の線はHSV−1 DNAの順序配列を示
す。箱や逆位反復配列ab、ｂ′ａ′ａ′ｃ、caを示す。
HSV−２は同様な構造を有する。 第２図は本発明の代表的な組換えウイルス株R7017およ
びR7020の作製に於ける工程を示す１組の概略図であ
る。 第３図は第２図の組換えウイルス株R7017およびR7020の
順序配列を示す１組の概略図である。EcoRI N断片中の
中断はチミジンキナーゼ遺伝子中の欠失部位を示すもの
である。Ｌ成分とＳ成分との間の新規接合に於ける新バ
ンドはそれぞれバンド１およびバンド２として示され
る。 第4A図は野生型HSV−１ウイルス、第２図および第３図
の組換えウイルス株R7017およびR7020、およびプラスミ
ドpRB3498のそれぞれのゲノムのEcoRI制限エンドヌクレ
アーゼ地図の顕微鏡写真である。第4B図は第4A図のバン
ドをペンとインクで示したものである。 第５図および第６図は実施例２で詳細に記載するような
種々の投与量に於けるそれぞれ組換えウイルス株R7017
およびR7020のマウスに於ける毒性を示すグラフであ
る。 第７図および第８図は実施例３中で詳細に記載するよう
に種々の保護投与量の組換えウイルスR7017で接種する
ことによって与えられるHSVによる挑戦に対するマウス
の保護を示すグラフである。 第９図および第10図は実施例３中詳細に記載するように
種々の投与量の組換えウイルスR7020で接種することに
よって与えられるHSVによる挑戦に対するマウスの保護
を示すグラフである。 第11図および第12図は実施例３中に記載するように、種
々の投与量のHSV−１（Ｆ）で接種することによって与
えられるHSVによる挑戦に対するマウスの保護を示すグ
ラフである。 図面中、次の略号を用いた。 Ｅ−EcoRI;P−PvuII;H−HindIII;X−XbaI;B−BamHI;Bg
−BglII;S−SacI制限エンドヌクレアーゼ部位。TK−チ
ミジンキナーゼ;gG2−HSV−２糖蛋白質Ｇ遺伝子;gD2−H
SV−２糖蛋白質Ｄ遺伝子；らせんはベクター配列を示
す。“v"の記号はポリリンカーの位置を示す。
いられるプラスミドpRB3410、pRB3498、pRB3575の作製
の概略図である。上の線はHSV−1 DNAの順序配列を示
す。箱や逆位反復配列ab、ｂ′ａ′ａ′ｃ、caを示す。
HSV−２は同様な構造を有する。 第２図は本発明の代表的な組換えウイルス株R7017およ
びR7020の作製に於ける工程を示す１組の概略図であ
る。 第３図は第２図の組換えウイルス株R7017およびR7020の
順序配列を示す１組の概略図である。EcoRI N断片中の
中断はチミジンキナーゼ遺伝子中の欠失部位を示すもの
である。Ｌ成分とＳ成分との間の新規接合に於ける新バ
ンドはそれぞれバンド１およびバンド２として示され
る。 第4A図は野生型HSV−１ウイルス、第２図および第３図
の組換えウイルス株R7017およびR7020、およびプラスミ
ドpRB3498のそれぞれのゲノムのEcoRI制限エンドヌクレ
アーゼ地図の顕微鏡写真である。第4B図は第4A図のバン
ドをペンとインクで示したものである。 第５図および第６図は実施例２で詳細に記載するような
種々の投与量に於けるそれぞれ組換えウイルス株R7017
およびR7020のマウスに於ける毒性を示すグラフであ
る。 第７図および第８図は実施例３中で詳細に記載するよう
に種々の保護投与量の組換えウイルスR7017で接種する
ことによって与えられるHSVによる挑戦に対するマウス
の保護を示すグラフである。 第９図および第10図は実施例３中詳細に記載するように
種々の投与量の組換えウイルスR7020で接種することに
よって与えられるHSVによる挑戦に対するマウスの保護
を示すグラフである。 第11図および第12図は実施例３中に記載するように、種
々の投与量のHSV−１（Ｆ）で接種することによって与
えられるHSVによる挑戦に対するマウスの保護を示すグ
ラフである。 図面中、次の略号を用いた。 Ｅ−EcoRI;P−PvuII;H−HindIII;X−XbaI;B−BamHI;Bg
−BglII;S−SacI制限エンドヌクレアーゼ部位。TK−チ
ミジンキナーゼ;gG2−HSV−２糖蛋白質Ｇ遺伝子;gD2−H
SV−２糖蛋白質Ｄ遺伝子；らせんはベクター配列を示
す。“v"の記号はポリリンカーの位置を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:92）
Claims (42)
- 【請求項１】組換え単純ヘルペスウイルス（HSV）であ
って、そのゲノムがHSV−１のゲノムの突然変異体を含
み、かつ該HSV−１ゲノムの、神経毒性の原因となるが
成長に対しては必須ではなくかつ該HSV−１ゲノムの内
部逆位反復配列の所またはその付近に位置する部分が欠
失しており、かつHSV−２のゲノムからの、該HSV−２の
１種以上の免疫誘起性糖蛋白質をコードする遺伝子が該
突然変異体ゲノム中の該欠失の端部点間に挿入される組
換え単純ヘルペスウイルス（HSV）。 - 【請求項２】該欠失部分が該HSV−１ゲノムのチミジン
キナーゼ遺伝子の機能のために必要なDNA配列を含む特
許請求の範囲第（１）項記載の組換えウイルス。 - 【請求項３】該チミジンキナーゼ遺伝子のBglII部位とS
acI部位との間の、これら両部位を含む約500塩基対が欠
失している特許請求の範囲第（２）項記載の組換えウイ
ルス。 - 【請求項４】α27遺伝子の右手末端とα４遺伝子のプロ
モーター領域との間の該HSV−１ゲノムの前配列が欠失
している特許請求の範囲第（１）項記載の組換えウイル
ス。 - 【請求項５】該免疫誘起性糖蛋白質が該HSV−２の糖蛋
白質Ｂ、Ｃ、Ｄからなる群から選ばれる特許請求の範囲
第（１）項記載の組換えウイルス。 - 【請求項６】HSV−２糖蛋白質Ｄをコードする遺伝子が
該突然変異ゲノム中の該欠失の端部点間に挿入される特
許請求の範囲第（１）項記載の組換えウイルス。 - 【請求項７】HSV−２糖蛋白質Ｄをコードする遺伝子がH
SV−２糖蛋白質ＧおよびＥをコードする遺伝子の全部ま
たは部分を含むDNA配列の部分として挿入される特許請
求の範囲第（６）項記載の組換えウイルス。 - 【請求項８】HSVチミジンキナーゼ遺伝子がプロモータ
ーの調節下に該突然変異ゲノム中のその自然位置以外の
所に挿入される特許請求の範囲第（１）項記載の組換え
ウイルス。 - 【請求項９】該挿入HSVチミジンキナーゼ遺伝子がHSV−
１ゲノム由来のものである特許請求の範囲第（８）項記
載の組換えウイルス。 - 【請求項１０】該プロモーターが該HSV−１ゲノムのα
４遺伝子のプロモーターである特許請求の範囲第（８）
項記載の組換えウイルス。 - 【請求項１１】そのゲノムがHSV−１のゲノムの突然変
異体を含む組換え単純ヘルペスウイルス（HSV）であっ
て、該HSV−１ゲノムのα27遺伝子の右手末端とα４遺
伝子のプロモーター領域との間のすべての配列が欠失さ
れ、かつHSV−２のゲノムからの、該HSV−２の糖蛋白質
Ｂ、Ｃ、Ｄの１種以上をコードする遺伝子が該突然変異
ゲノム中の該欠失の端部点間の挿入される特許請求の範
囲第（１）項記載の組換えウイルス。 - 【請求項１２】該欠失部分が該HSV−１ゲノムのチミジ
ンキナーゼ遺伝子の機能のために必要なDNA配列を含む
特許請求の範囲第（11）項記載の組換えウイルス。 - 【請求項１３】該チミジンキナーゼ遺伝子のBglII部位
とSacI部位との間の、これら両部位を含む約500塩基対
が欠失されている特許請求の範囲第（12）項記載の組換
えウイルス。 - 【請求項１４】HSV−２糖蛋白質Ｄをコードする遺伝子
が該突然変異ゲノム中の該欠失の端部点間に挿入される
特許請求の範囲第（11）項記載の組換えウイルス。 - 【請求項１５】HSV−２糖蛋白質Ｄをコードする該遺伝
子がHSV−２糖蛋白質ＧおよびＥをコードする遺伝子の
全部または部分を含むDNA配列の部分として挿入される
特許請求の範囲第（14）項記載の組換えウイルス。 - 【請求項１６】HSVチミジンキナーゼ遺伝子がプロモー
ターの調節下に該突然変異ゲノム中のその自然位置以外
の所に挿入される特許請求の範囲第（11）項記載の組換
えウイルス。 - 【請求項１７】該HSVチミジンキナーゼ遺伝子がHSV−１
ゲノムからのものである特許請求の範囲第（16）項記載
の組換えウイルス。 - 【請求項１８】該プロモーターが該HSV−１ゲノムのα
４遺伝子のプロモーターである特許請求の範囲第（16）
項記載の組換えウイルス。 - 【請求項１９】組換えウイルスR7017（ATCC VR2121）で
ある特許請求の範囲第（１）項記載の組換えウイルス。 - 【請求項２０】組換えウイルスR7020（ATCC VR2123）で
ある特許請求の範囲第（１）項記載の組換えウイルス。 - 【請求項２１】組換え単純ヘルペスウイルス（HSV）で
あって、そのゲノムがHSV−１のゲノムの突然変異体を
含み、かつ該HSV−１ゲノムの、神経毒性の原因となる
が成長に対しては必須ではなくかつ該HSV−１ゲノムの
内部逆位反復配列の所またはその付近に位置する部分が
欠失しており、かつHSV−２のゲノムからの、該HSV−２
の１種以上の免疫誘起性糖蛋白質をコードする遺伝子が
該突然変異体ゲノム中の該欠失の端部点間に挿入される
組換え単純ヘルペスウイルス（HSV）を有効成分として
含む毒性HSV−１および毒性HSV−２の両方に対して有効
なワクチン。 - 【請求項２２】そのゲノムがHSV−１のゲノムの突然変
異体を含む組換え単純ヘルペスウイルス（HSV）であっ
て、該HSV−１ゲノムのα27遺伝子の右手末端とα４遺
伝子のプロモーター領域との間のすべての配列が欠失さ
れ、かつHSV−２のゲノムからの、該HSV−２の糖蛋白質
Ｂ、Ｃ、Ｄの１種以上をコードする遺伝子が該突然変異
ゲノム中の該欠失の端部点間に挿入される特許請求の範
囲第（21）記載のワクチン。 - 【請求項２３】組換えウイルスR7017（ATCC VR2121）を
有効成分として含む特許請求の範囲第（21）記載のワク
チン。 - 【請求項２４】組換えウイルスR7020（ATCC VR2123）を
有効成分として含む特許請求の範囲第（21）記載のワク
チン。 - 【請求項２５】（ａ）親HSV−１のゲノムから、神経毒
性の原因となるが増殖のためには必須でなくかつ該HSV
−１ゲノムの内部逆位反復配列の所またはその付近に位
置する該ゲノムの部分を欠失させて第１突然変異ゲノム
を与える工程と、 （ｂ）該第１突然変異ゲノム中の工程（ａ）の該欠失の
端部点間に、HSV−２の免疫誘起性糖蛋白質１種以上を
コードする該HSV−２のゲノムからの遺伝子を挿入して
第２突然変異ゲノムを与える工程と、 （ｃ）DNA配列相同の部位に於ける組換えを許す条件下
で該第２突然変異ゲノムを工程（ａ）の該親HSV−１の
ゲノムとコトランスフェクションして組換え子孫を生成
させる工程と、 （ｄ）工程（ａ）の欠失部分を欠損している組換えゲノ
ムを選択する工程と、 （ｅ）工程（ｄ）の該選択されたゲノムを工程（ｂ）の
該糖蛋白質コード遺伝子の存在に関してスクリーニング
する工程 とからなる、毒性HSV−１および毒性HSV−２の両方に対
するワクチン中の有効成分として有用な組換え単純ヘル
ペスウイルス（HSV）の作製方法。 - 【請求項２６】該欠失部分が該親HSV−１ゲノムのチミ
ジンキナーゼ遺伝子の機能のために必要なDNA配列を含
む特許請求の範囲第（25）項記載の方法。 - 【請求項２７】該チミジンキナーゼ遺伝子のBglII部位
とSacI部位との間のかつ両部位を含む約500塩基対が欠
失される特許請求の範囲第（26）項記載の方法。 - 【請求項２８】該HSV−１ゲノムの、α27遺伝子の右手
末端とα４遺伝子のプロモーター領域との間の全配列が
欠失される特許請求の範囲第（25）項記載の方法。 - 【請求項２９】該免疫誘起性糖蛋白質が該HSV−２の糖
蛋白質Ｂ、Ｃ、Ｄからなる群から選ばれる特許請求の範
囲第（25）項記載の方法。 - 【請求項３０】HSV−２糖蛋白質Ｄをコードする原因と
なる遺伝子が該第１突然変異ゲノム中の欠失の該両端部
点間に挿入される特許請求の範囲第（25）項記載の方
法。 - 【請求項３１】HSV−２糖蛋白質Ｄをコードする該遺伝
子がHSV−２糖蛋白質ＧおよびＥをコードする遺伝子の
全部または一部分を含むDNA配列の一部分として挿入さ
れる特許請求の範囲第（30）項記載の方法。 - 【請求項３２】HSVチミジンキナーゼ遺伝子が、該第１
または第２突然変異ゲノム中のその自然位置以外の位置
に、プロモーターの調節下で挿入される特許請求の範囲
第（25）項記載の方法。 - 【請求項３３】該HSVチミジンキナーゼ遺伝子がHSV−１
ゲノムからのものである特許請求の範囲第（32）項記載
の方法。 - 【請求項３４】該プロモーターが該親HSV−１ゲノムの
α４遺伝子のプロモーターである特許請求の範囲第（3
2）項記載の方法。 - 【請求項３５】（ａ）親HSV−１のゲノムから、該HSV−
１ゲノムのα27遺伝子の右手末端とα４遺伝子のプロモ
ーター領域との間の該HSV−１ゲノムの全配列を欠失さ
せて第１突然変異ゲノムを与える工程と、 （ｂ）該第１突然変異ゲノム中の工程（ａ）該欠失の端
部点間に、HSV−２の糖蛋白質Ｂ、Ｃ、Ｄの１種以上を
コードする原因となるHSV−２のゲノムからの遺伝子を
挿入して第２突然変異ゲノムを与える工程と、 （ｃ）該第２突然変異ゲノムを、工程（ａ）の該親HSV
−１のゲノムと、DNA配列相同の部位に於ける組換えを
許す条件下でコトランスフェクションして組換え子孫を
生成させる工程と、 （ｄ）工程（ａ）の欠失部分を欠損している組換え遺伝
子を選択する工程と、 （ｅ）工程（ｂ）の該糖蛋白質コード遺伝子の存在に関
して工程（ｄ）の該選択されたゲノムをスクリーニング
する工程 とからなる、特許請求の範囲第（25）項記載の方法。 - 【請求項３６】該欠失部分が該親HSV−１ゲノムのチミ
ジンキナーゼ遺伝子の機能のために必須なDNA配列を含
む特許請求の範囲第（35）項記載の方法。 - 【請求項３７】該チミジンキナーゼ遺伝子のBglII部位
とSacI部位との間のかつ両部位を含む約500塩基対が欠
失される特許請求の範囲第（36）項記載の方法。 - 【請求項３８】HSV−２糖蛋白質Ｄをコードする原因と
なる遺伝子が該第１突然変異ゲノム中の該欠失の端部点
間に挿入される特許請求の範囲第（35）項記載の方法。 - 【請求項３９】HSV−２糖蛋白質Ｄをコードする該遺伝
子がHSV−２糖蛋白質ＧおよびＥをコードする遺伝子の
全部または一部分を含むDNA配列の部分として挿入され
る特許請求の範囲第（38）項記載の方法。 - 【請求項４０】HSVチミジンキナーゼ遺伝子が、該第１
または第２突然変異ゲノム中のその自然位置以外の位置
に、プロモーターの調節下に挿入される特許請求の範囲
第（35）項記載の方法。 - 【請求項４１】該HSVチミジンキナーゼ遺伝子がHSV−１
ゲノムからのものである特許請求の範囲第（40）項記載
の方法。 - 【請求項４２】該プロモーターが該親HSV−１ゲノムの
α４遺伝子のプロモーターである特許請求の範囲第（3
5）項記載の方法。
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