JPH08297122A - ヒスタミンの測定方法及びその測定用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 検体中のヒスタミンをアミンオキシダーゼで
酸化反応させて得られる４−イミダゾリルアセトアルデ
ヒドと、ヒドラジノ基、アミノ基若しくはチオール基を
有する蛋白質又は多糖化合物とを反応させて４−イミダ
ゾリル基を有する蛋白質又は多糖化合物を得、それを測
定してヒスタミンを測定する方法である。 【効果】 この方法は、検体中のヒスミンを酸化反応さ
せた後、蛋白質又は多糖化合物を反応させ、その反応物
の測定からヒスタミンを測定するため、煩雑な操作を行
うことなく３０分〜１時間でヒスタミンの測定結果を得
ることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒスタミン（β−イミ
ダゾリルエチルアミン）の測定方法及びこの測定試薬に
関する。更に詳しくはヒスタミンをアミンオキシダーゼ
で酸化反応させて得られる４−イミダゾリルアセトアル
デヒドと、ヒドラジノ基、アミノ基若しくはチオール基
を有する蛋白質又は多糖化合物とを反応させて４−イミ
ダゾリル基を有する蛋白質又は多糖化合物を得、それを
測定することによるヒスタミンの測定方法である。

【０００２】

【従来の技術】ヒスタミンは、哺乳動物組織中に広く分
布し、即過敏反応の主な伝達物質であることが知られて
いる。またヒスタミンが、特にアレルギー反応に深く係
わっていることから、アレルゲンの特定、生体内でのヒ
スタミンの動態を調査するためにヒスタミンの測定法が
見い出された。

【０００３】従来、ヒスタミンの測定法は、高速液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法、ガスクロマトグラフ
ィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）法等の機器を使用した方法
で行われてきたが、多数検体の測定には対応した方法で
はなかった。そこで新たな測定方法として（イ）検体中
のヒスタミンにＳ−アデノシル−Ｌ−〔メチル−¹⁴Ｃ〕
メチオニンとヒスタミン−Ｎ−トランスフェラーゼとを
加え放射標識された¹⁴Ｃ−メチルヒスタミンを調製し、
この標識化合物を抽出した後、放射能測定によりヒスタ
ミンを測定する方法（臨床検査，Ｖｏｌ．２６（２），
１５７−１６３（１９８２））、（ロ）固相に結合され
た抗ヒスタミン抗体に、検体中のヒスタミンをアシル化
したアシル化ヒスタミンとアシル化 ¹²⁵Ｉ標識ヒスタミ
ンとを競合反応させた後、固相に結合した標識物を測定
す方法（Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．，１９８８，８２，６３８−４６頁）等が見い出さ
れた。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】前記（イ）の測定法で
は、放射標識された¹⁴Ｃ−メチルヒスタミンを調製する
ために１〜１．５時間の反応時間を要し、さらに得られ
た標識物をクロロホルムで抽出する操作を行いヒスタミ
ンの測定を行っていた。また（ロ）の測定法は、競合反
応を４℃で１８時間行い固相に結合した標識物を測定す
ることにより結果を得ていた。そのため（イ）及び
（ロ）のいずれの方法とも抽出操作、長い反応時間等を
必要とし、迅速なヒスタミンの測定法とは言い難く、測
定結果を得るまでには多大な労力と時間とを必要として
いた。また、微量のヒスタミンの測定には充分な測定感
度を有していなかった。さらにいずれの方法も放射性同
位元素を使用するため、特定の施設中で取り扱うことが
必要であり、簡便な測定法を提供するものではなかっ
た。

【０００５】

【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは、新
たなヒスタミンの測定方法を見出すべく鋭意研究を行っ
た結果、検体中のヒスタミンをアミンオキシダーゼで酸
化反応させて得られる４−イミダゾリルアセトアルデヒ
ドと、ヒドラジノ基、アミノ基若しくはチオール基を有
する蛋白質又は多糖化合物とを反応させて４−イミダゾ
リル基を有する蛋白質又は多糖化合物を得、それを測定
することによるヒスタミンの測定法を見出し本発明を完
成するに至った。

【０００６】本発明をさらに詳しく説明すると、まず検
体中に存在するヒスタミンとアミンオキシダーゼとを反
応させると、ヒスタミンが酸化されて４−イミダゾリル
アセトアルデヒドが生成し、さらにこの４−イミダゾリ
ルアセトアルデヒドのアルデヒド基と蛋白質又は多糖化
合物のヒドラジノ基、アミノ基又はチオール基とが付加
反応して４−イミダゾリル基を有する蛋白質又は多糖化
合物が得られ、この４−イミダゾリル基を有する蛋白質
又は多糖化合物を測定する方法である。ヒスタミンを酸
化して得られる４−イミダゾリルアセトアルデヒドは、
安定性が低く分解を起こしやすいため、通常は溶液中か
ら単離せずに次の反応に用いられる。この４−イミダゾ
リルアセトアルデヒドは、例えば溶液中で１，２−ジア
ミノ−４，５−ジメトキベンゼンを用いるアルデヒド基
の蛍光分析法（下記参考例１参照）により生成を確認す
ることができる。さらにこの４−イミダゾリルアセトア
ルデヒドが反応して得られる４−イミダゾリル基を有す
る蛋白質又は多糖化合物は、抗ヒスタミン抗体を用いこ
の抗体との反応を行った結果、４−イミダゾリル基を有
する蛋白質又は多糖化合物が生成していることが確認さ
れた。

【０００７】前記蛋白質又は多糖化合物は、例えばヒド
ラジノ基、アミノ基、チオール基等のアルデヒド基との
反応性をもつ官能基を有する化合物である。蛋白質とし
ては、例えばアルブミン、キーホール・リンペット・ヘ
モシアニン（ＫＬＨ）、カゼイン等の他、パーオキシダ
ーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、クルコースオキシダ
ーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコース−６−リン酸
デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、ウレアーゼ等の酵素を
挙げることができる。多糖化合物としては例えばアミロ
ース、キトサン等を挙げることができる。

【０００８】また、蛋白質又は多糖化合物に前記ヒドラ
ジノ基、アミノ基、チオール基等の官能基が存在しない
ときには、例えばイミノチオラン化合物を用いるチオー
ル基を導入する方法（例えば生化学実験法２７巻，６０
頁（学会出版センタ−）参照）、エチレンイミンを用い
るアミノ基を導入する方法（例えば生化学実験法８巻，
６８頁（学会出版センタ−）参照）等により官能基を導
入し用いることができる。また蛋白質又は多糖化合物に
は、末端に官能基を持つ各種架橋剤により官能基を導入
することもできる。この架橋剤として例えばヒドラジノ
基を導入する試薬として４−（Ｎ−マレイミドメチル）
シクロヘキサン−１−カルボキシルヒドラジド塩酸塩
（Ｍ₂ Ｃ₂ Ｈ）、４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）
ブチリックアシッドヒドラジド塩酸塩（ＭＰＢＨ）、３
−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド（Ｐ
ＤＰＨ）等を挙げることができる。蛋白質又は多糖化合
物に導入する官能基としてはアルデヒド基との反応性が
高いヒドラジノ基を用いることが好ましい。

【０００９】また、測定に用いるアミンオキシダーゼ
は、第一級アミンを酸化するほ乳動物の腎、脳、又は
肝、微生物、豆科植物等由来のモノアミンオキシダーゼ
（Ｅ．Ｃ１．４．３．４）、ジアミンオキシダーゼ
（Ｅ．Ｃ１．４．３．６）等である。これらのアミンオ
キシダーゼは、ヒスタミンを酸化し４−イミダゾリルア
セトアルデヒドを生成する酵素であれば種、由来を問わ
ず用いることができる。測定に用いるアミンオキシダー
ゼは、１０ｍＵ／ｍｌ〜１０００ｍＵ／ｍｌであるが、
６０ｍＵ／ｍｌ〜５００ｍＵ／ｍｌ用いることが反応を
効率よく行う上で好ましい。

【００１０】さらに、アミンオキシダーゼを用いるヒス
タミンの酸化反応と、この反応により得られる４−イミ
ダゾリルアセトアルデヒドと、ヒドラジノ基、アミノ基
若しくはチオール基を有する蛋白質又は多糖化合物とを
反応させるには、同一の溶液中で連続して行うことが好
ましい。反応は、通常１０〜５５℃、好ましくは３０〜
４５℃で行うことができる。さらにこの反応は５〜３０
分間行うことが好ましい。また反応は、アミンオキシダ
ーゼの由来する種により適宜変更できるが、ｐＨ４〜
９、好ましくはｐＨ６〜８の溶液中で行うことができ、
例えばリン酸、トリス、コハク酸、クエン酸、ほう酸、
塩酸、水酸化ナトリウム、ベロナール等の緩衝液を用い
行うことができる。

【００１１】以上の反応により得られる４−イミダゾリ
ル基を有する蛋白質又は多糖化合物は、引き続いてこの
化合物の測定を行うことによりヒスタミンの測定を行う
ことができる。この４−イミダゾリル基を有する蛋白質
又は多糖化合物は例えば標識抗ヒスタミン抗体を用い測
定を行うことができる。測定を行うには、この４−イミ
ダゾリル基を有する蛋白質又は多糖化合物を固相に結合
させた試薬を予め製造し、この試薬と上記反応により得
られた４−イミダゾリル基を有する蛋白質又は多糖化合
物とを、標識抗ヒスタミン抗体との競合反応に付した
後、固相に結合した抗ヒスタミン抗体の標識物を測定す
ることにより検体中のヒスタミンを測定することができ
る。

【００１２】競合反応による測定は、公知の方法に従い
前記反応により得られる４−イミダゾリル基を有する蛋
白質又は多糖化合物と、４−イミダゾリル基を有する蛋
白質又は多糖化合物が結合した固相と、標識抗ヒスタミ
ン抗体とを溶液中で混合し反応させることにより行うこ
とができる。この反応は、例えばリン酸緩衝液、トリス
−塩酸緩衝液、炭酸緩衝液等を用い行うことが好まし
い。また反応は、４℃〜４０℃、好ましくは３７℃付近
で混合することにより行うことができる。

【００１３】固相に結合させる４−イミダゾリル基を有
する蛋白質又は多糖化合物は、前記した方法で製造した
化合物を挙げることができる他、ヒスタミンのアミノ基
と蛋白質又は多糖化合物の官能基とを架橋剤を緩衝液中
で用いて反応させ製造することもできる。この架橋剤と
しては、例えばＮ−（８−マレイミドカプリロキシ）ス
ルホスクシイミド ナトリウム（ＨＭＣＳ）等を挙げる
ことができる。また、４−イミダゾリル基を有する蛋白
質又は多糖化合物を結合させる固相は、例えばポリスチ
レン、ナイロン、ＡＢＳ樹脂等のビーズ、ラテックス、
各種磁性粒子、ＥＬＩＳＡ用のマイクロプレートのウエ
ル等を挙げることができる。この固相に４−イミダゾリ
ル基を有する蛋白質又は多糖化合物を結合させるには、
物理吸着法、化学結合法等を採用するこができる。物理
吸着法は、緩衝液中で前記固相に前記４−イミダゾリル
基を有する高分子結合物を混合し吸着させるこにより行
うことができる。この反応に使用する緩衝液としては、
リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、炭酸緩衝液等であ
る。反応は、両者を４℃〜４０℃、好ましくは３７℃付
近で混合することにより容易に進行し、目的物を得るこ
とができる。また、化学結合法は、いわゆるペプチド結
合法におけるカルボジイミド法を採用するこができる。
さらにその他の化学結合法としては、グルタールアルデ
ヒドや塩化シアヌル等の二価性架橋剤の存在下に行うこ
ともできる（「ペプチド合成法」丸善株式会社（昭和５
０年発行）及び「酵素免疫測定法」共立出版株式会社、
「蛋白質・核酸・酵素」別冊第３１号（１９８７年）参
照）。

【００１４】また、抗ヒスタミン抗体の標識物には、例
えば酵素、発光物質、放射性同位元素等を用いることが
できるが、通常は安定で取扱いが容易であり、高感度測
定が可能な酵素を用いることが好ましい。これらの標識
物の測定は、それぞれ公知の酵素免疫測定法（ＥＩ
Ａ）、化学発光法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）等に従い
行うことができる。

【００１５】この抗ヒスタミン抗体は、４−イミダゾリ
ル基を有する蛋白質又は多糖化合物を認識する抗体であ
ればよく容易に入手可能なポリクローナル抗体又はモノ
クローナル抗体である。さらにこれらの抗体はＦ（ａ
ｂ’）₂ 、Ｆａｂ’、Ｆａｂ等の抗体フラグメントであ
ってもよい。モノクローナル抗体は、ケラー、ミルシュ
タインらの方法に従い例えばヒスタミンのアミノ基に蛋
白質又は多糖化合物を結合させた免疫原誘導体、前記４
−イミダゾリル基を有する蛋白質又は多糖化合物等をマ
ウスに注射した後、常法により免疫マウス脾臓細胞を取
り出しミエローマ細胞と融合してハイブリドーマを得、
このハイブリドーマからモノクローナル抗体を得ること
ができる（ネイチャー第２６６巻、５５０頁〜５５２頁
（１９７７年）参照）。また抗体の標識に用いる酵素と
しては、例えばパーオキシダーゼ、アルカリ性ホスファ
ターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダー
ゼ等を挙げることができる。酵素を抗体へ標識する方法
は、公知の化学結合方法等を利用して容易に行うことが
できる（「蛋白質・核酸・酵素」別冊第３１号（１９８
７年）共立出版株式会社参照）。

【００１６】この標識酵素の活性測定に用いる基質は、
酵素に対応した化合物であり、例えば３，３’，５，
５’−テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）、２，２’−
アジノジ（３−エチルベンズチアゾリン）−６’−スル
ホン酸（ＡＢＴＳ）、ルミノール−過酸化水素（パーオ
キシダーゼ用）、ｐ−ニトロフェニルホスフェート、メ
チルウンベリフェニルホスフェート，３−（２’−スピ
ロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−ホスフ
ォリルオキシ）フェニル−１，２−アダマンタン二ナト
リウム塩（ＡＭＰＰＤ）（アルカリ性ホスファターゼ
用）、Ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトース、メ
チルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトース（β−ガ
ラクトシダーゼ用）等の発色基質、蛍光基質、発光基質
等を使用することができる。測定は、４〜４０℃で酵素
と基質との反応を行い、生じた発色、蛍光、発光量を検
出装置により行うことができる。これらの測定法は、公
知の発色法、蛍光法又は発光法のＥＩＡであり、検出装
置としては、例えば分光光度計、蛍光光度計、フォトン
カウンター等を用い行うことができる。

【００１７】化学発光測定法は、例えばイソルミノール
誘導体、アクリジニウムアシルスルホンアミド誘導体、
アクリジニウムエステル誘導体等の化学発光物質を標識
物質とし、抗体に標識して用いることができる。また放
射免疫測定法は、前記標識物質の代わりに ¹²⁵Ｉ、トリ
チウム等の放射性同位元素をボルトンハンター試薬等を
用い抗体に標識した試薬を用いて反応を行った後、放射
活性の測定を行うものである。

【００１８】また、本発明においては、前記ヒドラジノ
基、アミノ基若しくはチオール基を有する蛋白質又は多
糖化合物を前記物理吸着法、化学結合法等により前記し
た固相に結合させた試薬を用い、ヒスタミンを酸化させ
て得られる４−イミダゾリルアセトアルデヒドを反応さ
せた後、固相に結合した４−イミダゾリルアセトアルデ
ヒドを測定することによりヒスタミンの測定を行うこと
ができる。この測定は、前記標記抗ヒスタミン抗体を用
た方法に従い標識物の測定を行うこにより実施すること
ができる。

【００１９】さらに、４−イミダゾリル基を有する蛋白
質又は多糖化合物の測定において、蛋白質が酵素の場合
には、例えば前記抗ヒスタミン抗体を固相に結合させた
試薬を用いて反応を行い、固相に結合した４−イミダゾ
リル基を有するの酵素の活性を測定することによりヒス
タミンの測定を行うことができる。この抗ヒスタミン抗
体結合固相は、前記した固相を用い、この固相へ抗体を
前記物理吸着法、前記化学結合法等により結合させるこ
とにより製造することができる。また、４−イミダゾリ
ル基を有する酵素と抗ヒスタミン抗体結合固相との反応
は、通常４℃〜４０℃、好ましくは３７℃付近で混合す
ることにより行うことができる。さらに酵素活性の測定
は、前記したＥＩＡと同様に酵素に対応した基質を用い
行うことができる。

【００２０】

【実施例】以下実施例及び参考例により本発明をさらに
詳細に説明する。

【００２１】実施例 １ イミノチオラン化ＫＬＨの作
製（Ｍ₂ Ｃ₂ Ｈ法） キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ，ピア
ス社）１バイアル（２０ｍｇ／ｍｌ）を精製水２ｍｌで
復元し、２００ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ＝８．２，１ｍＭ
ＥＤＴＡ２Ｎａを含む）で平衡化したＰＤ−１０（ファ
ルマシア社製）カラムを用いて緩衝液の置換を行った。
この緩衝液で置換をしたＫＬＨ溶液３ｍｌに、イミノチ
オラン２０ｍｇ（シグマ社製）を加え、３７℃で３０分
間攪拌し反応させた。反応終了後、限界濾過膜（セント
リプレップ、ミリポア社）を用いて１ｍｌまで濃縮し、
この濃縮したイミノチオラン化ＫＬＨを５０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ＝７．０，１ｍＭＥＤＴＡ２Ｎａを含む）
で平衡化したＰＤ−１０カラムを用いて分画し未反応の
イミノチオランを除き、イミノチオラン化ＫＬＨを得
た。

【００２２】実施例 ２ ヒドラジノ化ＫＬＨの作製
（ＰＤＰＨ法） 実施例１で作製したイミノチオラン化ＫＬＨ溶液５ｍｌ
にジメチルスルホキシドに溶解したＰＤＰＨ（１０ｍｇ
／ｍｌ）を少しづつ加え、２５℃で２時間反応させた。
反応後、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）を用い
て透析し、ヒドラジノ化ＫＬＨを得た。

【００２３】実施例 ３ ジアミンオキシダーゼの精製 エンドウ豆１Ｋｇを一昼夜蒸留水に浸し十分に水分を吸
わせた後、十分に蒸留水を含ませた脱脂綿を敷き詰めた
平らな浅い容器にエンドウ豆を均等にばらまき、２５℃
の暗所で８日間放置した。発芽したエンドウ豆の根と芽
を取り除き豆のみをミキサーに入れ、更に５０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ＝５．８）２リットルを加えスラリー状
になるまですり潰した。スラリーに硫安を１．３Ｍとな
るように加え、４℃で２時間攪拌した。その後、遠心機
を用いて不溶成分を取り除いた。得られた澄明な上澄み
を疎水クロマト担体（フェニルセファロース、ファルマ
シア社製）に流し５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝５．
８）で目的であるジアミンオキシダーゼ（ＤＡＯ）を溶
出させた。ＤＡＯ活性は、ヒスタミン（１００μｍ水溶
液）を基質として用い、生成する過酸化水素をトリフェ
ニルメタン化合物とパーオキシダーゼとを用いる発色法
（特開平５−２２９９９３号参照）によって波長５００
／４０５で測定した。さらに得られたＤＡＯ活性分画を
限外濾過膜（アミコン社）を用いて濃縮した。このＤＡ
Ｏをスーパーデックス−２００（ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２
００）のゲル濾過担体を用いて更に精製した。得られた
ＤＡＯは、前記ＤＡＯ活性の測定法に従い測定し、その
結果を図１及び図２に示す。

【００２４】参考例 １ ４−イミダゾリルアセトアル
デヒドの生成確認試験 ヒスタミンを０、５０、５００又は５０００ｎＭを含む
各溶液に実施例３で製造したＤＡＯ（５０００ｍＵ／ｍ
ｌ）１００μｌを加え３７℃の恒温槽で１５分間反応さ
せた。反応後アルデヒド体のラベル化剤である１，２−
ジアミノ−４，５−ジメチトキシベンゼン（同仁化学）
１０ｍＭ溶液（１００ｍＭリン酸緩衝液，ｐＨ５．４）
１００μｌを加え、直ちに蛍光光度計により３４０／３
９２ｎｍの蛍光を測定した。この結果を表１に示す。こ
の結果からアルデヒド基の生成を確認することができ
る。

【００２５】

【表１】

【００２６】実施例 ４ ４−イミダゾリル基を有する
ＫＬＨの作製 実施例２で作製したヒドラジノ化ＫＬＨ（５００μｇ／
ｍｌ，５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ＝７．０）１ｍｌに実
施例３で製造したＤＡＯを終濃度が６０ｍＵ／ｍｌにな
るように加え、更にヒスタミン水溶液（１００ｍＭ）を
終濃度が５００μＭとなるように添加し、３７℃で１５
分間反応させた。反応終了後、ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２０
０を用いて未反応ＤＡＯを取り除き、４−イミダゾリル
基を有するＫＬＨを得た。

【００２７】実施例 ５ 抗原の固相化 実施例４で作製した、４−イミダゾリル基を有するＫＬ
Ｈを１０μｇ／ｍｌとなるように、トリス塩酸緩衝液
（５０ｍＭ、ｐＨ＝８．２）で希釈し９６ウエルのＥＬ
ＩＳＡプレートに１００μｌづつ総てのウエルに分注し
た。このプレートを４℃の冷蔵庫で１０時間放置した。
放置後、０．１％トライトンＸ−１００を含むトリス塩
酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ＝７．５）で５回洗浄し、更
に１％ＢＳＡを含むトリス塩酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ
＝８．０）２５０μｌを加え４℃で一昼夜放置してマス
キングし、固定化した抗原プレートを得た。

【００２８】実施例 ６ 抗体の固相化１（ポリクロー
ナル抗体） 市販のウサギ抗ヒスタミンポリクローナル抗体（ケミコ
ン社）を１／１００倍にリン酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ
＝７．０）で希釈し、９６ウエルのＥＬＩＳＡプレート
に１００μｌづつ総てのウエルに分注した。このプレー
トを４℃〜１０℃の冷蔵庫内で１０時間放置した。放置
後、０．１％トライトンＸ−１００を含むトリス塩酸緩
衝液（５０ｍＭ，ｐＨ＝７．５）で５回洗浄し、更に１
％ＢＳＡを含むトリス塩酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ＝
８．０）２５０μｌを加え４℃で一昼夜放置しマスキン
グした。マスキング後、０．１％トライトンＸ−１００
を含むトリス塩酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ＝７．５）で
５回洗浄しこれを抗ヒスタミンポリクローナル抗体固相
とした。

【００２９】実施例 ７ ヒドラジノ基を有するアルカ
リ性ホスファターゼの作製 アルカリ性ホスファターゼ（オリエンタル社、以下ＡＬ
Ｐという）１８ｍｇ／ｍｌの溶液０．５ｍｌをＰＤ−１
０を用いて２００ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ＝８．２、１ｍ
ＭＥＤＴＡ２Ｎａを含む）に置換した。得られた溶液３
ｍｌにイミノチオラン１０ｍｇ（シグマ社製）を加え３
７℃の恒温槽で３０分間攪拌しながら反応させた。反応
後、限界濾過膜（セントリプレップ、ミリポア社）で１
ｍｌまで濃縮した。濃縮したイミノチオラン化ＡＬＰを
ＰＤ−１０を用いて５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．
０，１ｍＭＥＤＴＡ２Ｎａを含む）に置換した。緩衝液
の置換と未反応イミノチオランを取り除いたイミノチオ
ラン化ＡＬＰ溶液４ｍｌにジメチルスルホキシドに溶解
したＭ₂ Ｃ₂ Ｈ（１０ｍｇ／ｍｌ）を少しづつ加え、室
温で２時間反応させた。反応終了後、５０ｍＭ／ＭＥＳ
−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ＝７．０，１ｍＭ塩化マグネシ
ウム）に対して透析し、ヒドラジノ基を有するアルカリ
性ＡＬＰを得た。

【００３０】実施例 ８ ヒスタミンの測定１ ヒスタミン標準液（０，０．０５，０．５，５，５０ｎ
Ｍ）各１００μｌを実施例６で作製した９６ウエルのＥ
ＬＩＳＡプレートに入れた。更に、各ウエルに実施例７
で作製したヒドラジノ基を有するＡＬＰ１００μｇ／ｍ
ｌを５０μｌ及び実施例３で得られたＤＡＯ（１００ｍ
Ｕ／ｍｌ）を５０μｌ入れた。ＥＬＩＳＡプレートを攪
拌し、３７℃の恒温室で３０分間放置した。

【００３１】反応終了後、０．１％トライトンＸ−１０
０を含むトリス塩酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ＝７．５）
で５回洗浄した。洗浄終了後、１０ｍＭｐ−ニトロフェ
ニルリン酸を含む１Ｍ−ジエタノールアミン−塩酸緩衝
液（１ｍＭ塩化マグネシウム入り）１００μｌを加え、
室温で３０分間放置した。その後、１Ｍ水酸化ナトリウ
ム溶液５０μｌ加え酵素反応を停止した。発色した各ウ
エルの吸光度をプレートリーダーを用いて波長４０５／
６３０ｎｍで吸光度を測定した。その結果を図３に示
す。

【００３２】実施例 ９ ヒスタミンの測定２ ヒスタミン標準液（０，０．０５，０．５，５，５０ｎ
Ｍ）各５０μｌを実施例５で作製した９６ウエルのＥＬ
ＩＳＡプレートに入れた。更に各ウエルに実施例２で作
製したヒドラジノ化ＫＬＨ１００μｇ／ｍｌを５０μ
ｌ、市販抗ヒスタミン抗体（ウサギ，１／１０００倍希
釈，１％ＢＳＡを含むトリス塩酸緩衝液ｐＨ＝８．２）
５０μｌ及び実施例３で製造したＤＡＯ（１００ｍＵ／
ｍｌ）を５０μｌ加えた。このＥＬＩＳＡプレートを攪
拌し、室温で３０分間放置した。反応後、０．１％トラ
イトンＸ−１００を含むトリス塩酸緩衝液（５０ｍＭ，
ｐＨ＝７．５）で５回洗浄した。さらにＡＬＰ標識抗ウ
サギ抗体（ヤギ，１／１０，０００倍希釈）を１００μ
ｌ加え室温で２０分間放置した。その後了後、０．１％
トライトンＸ−１００を含むトリス塩酸緩衝液（５０ｍ
Ｍ，ｐＨ＝７．５）で５回洗浄した。洗浄後、１０ｍＭ
ｐ−ニトロフェニルリン酸を含む１Ｍ−ジエタノールア
ミン−塩酸緩衝液（１ｍＭ塩化マグネシウム入り）１０
０μｌを加え、室温で３０分間放置した。その後、１Ｍ
水酸化ナトリウム溶液５０μｌ加え酵素反応を停止し
た。発色した各ウエルの吸光度をプレートリーダーを用
いて波長４０５／６３０ｎｍで吸光度を測定した。その
結果を図４に示す。

【００３３】

【発明の効果】本発明の測定法は、検体中のヒスタミン
をアミンオキシダーゼで酸化して得られる化合物と蛋白
質又は多糖化合物とを反応させた後、その反応物を測定
することによって、３０分間〜１時間でヒスタミンの測
定結果を得ることができる。さらに、従来のヒスタミン
測定法に比べて１０倍以上の高感度な測定を行うことが
できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明で用いるジアミンオキシダーゼを疎水ク
ロマトグラフィー法で精製した時の結果を示す図であ
る。

【図２】本発明で用いるジアミンオキシダーゼをゲル濾
過法で精製した時の結果を示す図である。

【図３】ヒドラジノ基を有するアルカリ性ホスファター
ゼを用いてヒスタミンの標準液を測定したときの結果を
示す図である。

【図４】ヒドラジノ基を有するＫＬＨを用いてヒスタミ
ンの標準液を測定したときの結果を示す図である。

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒスタミンをアミンオキシダーゼで酸化
   反応させて得られる４−イミダゾリルアセトアルデヒド
   と、ヒドラジノ基、アミノ基若しくはチオール基を有す
   る蛋白質又は多糖化合物とを反応させて４−イミダゾリ
   ル基を有する蛋白質又は多糖化合物を得、それを測定す
   ることからなるヒスタミンの測定方法。
2. 【請求項２】 アミンオキシダーゼがモノアミンオキシ
   ダーゼ又はジアミンオキシダーゼである請求項１記載の
   測定方法。
3. 【請求項３】 蛋白質がアルブミン、キーホール・リン
   ペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）又はカゼインである請
   求項１記載の測定方法。
4. 【請求項４】 多糖化合物がアミロース又はキトサンで
   ある請求項１記載の測定方法。
5. 【請求項５】 ヒドラジノ基、アミノ基若しくはチオー
   ル基を有する蛋白質又は多糖化合物が固相に結合した蛋
   白質又は多糖化合物である請求項１記載の測定方法。
6. 【請求項６】 ４−イミダゾリル基を有する蛋白質又は
   多糖化合物を標識抗ヒスタミン抗体で測定することから
   なる請求項３、４又は５のいずれかに記載の測定方法。
7. 【請求項７】 標識が酵素である請求項６記載の測定方
   法。
8. 【請求項８】 蛋白質が酵素であり、４−イミダゾリル
   基を有する酵素を抗ヒスタミン抗体結合固相で測定する
   ことからなる請求項１記載の測定方法。
9. 【請求項９】 酵素が、パーオキシダーゼ、アルカリ性
   ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラク
   トシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナー
   ゼ、カタラーゼ又はウレアーゼである請求項８記載の測
   定方法。
10. 【請求項１０】 アミンオキシダーゼと、ヒドラジノ
    基、アミノ基若しくはチオール基を有する蛋白質又は多
    糖化合物と、標識抗ヒスタミン抗体とからなるヒスタミ
    ン測定用試薬。
11. 【請求項１１】 アミンオキシダーゼがモノアミンオキ
    シダーゼ又はジアミンオキシダーゼである請求項１０記
    載の試薬。
12. 【請求項１２】 蛋白質がアルブミン、キーホール・リ
    ンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）又はカゼインの蛋白
    質である請求項１０記載の試薬。
13. 【請求項１３】 多糖化合物がアミロース又はキトサン
    である請求項１０記載の試薬。
14. 【請求項１４】 ヒドラジノ基、アミノ基若しくはチオ
    ール基を有する蛋白質又は多糖化合物が固相に結合した
    蛋白質又は多糖化合物である請求項１０記載の試薬。
15. 【請求項１５】 標識が酵素である請求項１０に記載の
    試薬。
16. 【請求項１６】 アミンオキシダーゼと、ヒドラジノ
    基、アミノ基若しくはチオール基を有する蛋白質又は多
    糖化合物と、抗ヒスタミン抗体結合固相とからなる試
    薬。
17. 【請求項１７】 アミンオキシダーゼがモノアミンオキ
    シダーゼ又はジアミンオキシダーゼである請求項１６記
    載のヒスタミン測定用試薬。
18. 【請求項１８】 蛋白質が酵素である請求項１６記載の
    試薬。
19. 【請求項１９】 酵素がパーオキシダーゼ、アルカリ性
    ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラク
    トシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナー
    ゼ、カタラーゼ又はウレアーゼである請求項１８記載の
    ヒスタミン測定用試薬。