JPH08277299A - 抗ｉｌ−８抗体、抗ｉｌ−８モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ及び該抗体を用いたｉｌ−８の測定方法 - Google Patents
抗ｉｌ−８抗体、抗ｉｌ−８モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ及び該抗体を用いたｉｌ−８の測定方法Info
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- JPH08277299A JPH08277299A JP7104597A JP10459795A JPH08277299A JP H08277299 A JPH08277299 A JP H08277299A JP 7104597 A JP7104597 A JP 7104597A JP 10459795 A JP10459795 A JP 10459795A JP H08277299 A JPH08277299 A JP H08277299A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 抗ＩＬ−８モノクローナル抗体、抗ＩＬ−８
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ及び該抗
体を用いたＩＬ−８の測定方法。 【効果】 本発明により、７７アミノ酸残基ＩＬ−８と
特異的に反応する抗体が初めて提供され、該抗体を免疫
反応に用いることにより、従来７２アミノ酸残基ＩＬ−
８抗体によってまとめて測定されていたＩＬ−８から７
７アミノ酸残基ＩＬ−８量を検出し分けることができる
ようになった。
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ及び該抗
体を用いたＩＬ−８の測定方法。 【効果】 本発明により、７７アミノ酸残基ＩＬ−８と
特異的に反応する抗体が初めて提供され、該抗体を免疫
反応に用いることにより、従来７２アミノ酸残基ＩＬ−
８抗体によってまとめて測定されていたＩＬ−８から７
７アミノ酸残基ＩＬ−８量を検出し分けることができる
ようになった。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、抗インターロイキン８
（以下ＩＬ−８と略す）モノクローナル抗体、抗ＩＬ−
８モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ及び該
抗体を用いたＩＬ−８の測定方法に関する。更に詳しく
は、７７アミノ酸残基のＩＬ−８（以下ＩＬ−８（７
７）と略す）を特異的に認識するモノクローナル抗体、
該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ及び該
抗体を用いたＩＬ−８の測定方法に関する。
（以下ＩＬ−８と略す）モノクローナル抗体、抗ＩＬ−
８モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ及び該
抗体を用いたＩＬ−８の測定方法に関する。更に詳しく
は、７７アミノ酸残基のＩＬ−８（以下ＩＬ−８（７
７）と略す）を特異的に認識するモノクローナル抗体、
該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ及び該
抗体を用いたＩＬ−８の測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】炎症を起こした生体は、白血球や単球か
らＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ
−８、ＴＮＦα等の炎症性サイトカインを産生する。こ
の中の一つであるＩＬ−８は、好中球を炎症局所へ導く
好中球走化性のサイトカインとして知られており、炎症
や慢性疾患と深く係わっていると見られている（血液・
腫瘍科、22(1):108-115, 1191 ）。ＩＬ−８には、癌細
胞や血管内皮細胞から恒常的に産生されるＩＬ−８（７
７）と、単球やマクロファージから産生される７２アミ
ノ酸残基のＩＬ−８（以下ＩＬ−８（７２）と略す）と
が存在し（臨床免疫、22(1):140-146, 1990 ）、血液中
に共存することも知られる（検査と技術vol.19 no.10 p
880-881, 1991 年9 月）ことから、生体の炎症局所での
ＩＬ−８の役割と、ＩＬ−８（７７）及びＩＬ−８（７
２）のそれぞれのＩＬ−８の病態との係わりについて研
究が進められている。
らＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ
−８、ＴＮＦα等の炎症性サイトカインを産生する。こ
の中の一つであるＩＬ−８は、好中球を炎症局所へ導く
好中球走化性のサイトカインとして知られており、炎症
や慢性疾患と深く係わっていると見られている（血液・
腫瘍科、22(1):108-115, 1191 ）。ＩＬ−８には、癌細
胞や血管内皮細胞から恒常的に産生されるＩＬ−８（７
７）と、単球やマクロファージから産生される７２アミ
ノ酸残基のＩＬ−８（以下ＩＬ−８（７２）と略す）と
が存在し（臨床免疫、22(1):140-146, 1990 ）、血液中
に共存することも知られる（検査と技術vol.19 no.10 p
880-881, 1991 年9 月）ことから、生体の炎症局所での
ＩＬ−８の役割と、ＩＬ−８（７７）及びＩＬ−８（７
２）のそれぞれのＩＬ−８の病態との係わりについて研
究が進められている。
【０００３】しかしながら、従来のＩＬ−８測定は、Ｉ
Ｌ−８（７７）とＩＬ−８（７２）を区別できる抗体を
用いて行われてこなかったため、ＩＬ−８（７７）の作
用や役割に関しては不明な点が多く残されている。
Ｌ−８（７７）とＩＬ−８（７２）を区別できる抗体を
用いて行われてこなかったため、ＩＬ−８（７７）の作
用や役割に関しては不明な点が多く残されている。
【０００４】上述の理由によりＩＬ−８の疾患への係わ
り方を研究するために、ＩＬ−８（７７）とＩＬ−８
（７２）とを測定し分ける技術が望まれてきたが、これ
までＩＬ−８（７７）を特異的に認識する抗体は存在し
なかった。
り方を研究するために、ＩＬ−８（７７）とＩＬ−８
（７２）とを測定し分ける技術が望まれてきたが、これ
までＩＬ−８（７７）を特異的に認識する抗体は存在し
なかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、抗ＩＬ−８（７７）抗体を提供し、従来検出できな
かったＩＬ−８（７７）を特異的に測定する方法を可能
にすることにある。
は、抗ＩＬ−８（７７）抗体を提供し、従来検出できな
かったＩＬ−８（７７）を特異的に測定する方法を可能
にすることにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、従来の課
題を解決すべく鋭意研究した結果、ＩＬ−８（７７）
（J. Exp. Med. Vol.169 June 1989 1895-1901）のＮ末
端１０アミノ酸残基ペプチドを免疫原とし、ＩＬ−８
（７７）に特異的に反応する抗体を作成することに成功
した。またこの抗体を用いた免疫測定法を開発し、ＩＬ
−８（７７）の特異的な測定を可能として、本発明を完
成するに至ったものである。
題を解決すべく鋭意研究した結果、ＩＬ−８（７７）
（J. Exp. Med. Vol.169 June 1989 1895-1901）のＮ末
端１０アミノ酸残基ペプチドを免疫原とし、ＩＬ−８
（７７）に特異的に反応する抗体を作成することに成功
した。またこの抗体を用いた免疫測定法を開発し、ＩＬ
−８（７７）の特異的な測定を可能として、本発明を完
成するに至ったものである。
【０００７】すなわち、本発明は、ＩＬ−８（７７）と
特異的に反応する抗体及びＩＬ−８（７７）と特異的に
反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
を提供し、該抗体を用いたＩＬ−８（７７）の測定方法
を開発することによって、ＩＬ−８（７７）を特異的に
測定する方法を始めて提供するものである。
特異的に反応する抗体及びＩＬ−８（７７）と特異的に
反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
を提供し、該抗体を用いたＩＬ−８（７７）の測定方法
を開発することによって、ＩＬ−８（７７）を特異的に
測定する方法を始めて提供するものである。
【０００８】以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】本発明の抗体が認識するＩＬ−８（７７）
は、好中球走性サイトカインであり、炎症や慢性疾患と
深く係わる因子として多くの研究が進められているもの
である。
は、好中球走性サイトカインであり、炎症や慢性疾患と
深く係わる因子として多くの研究が進められているもの
である。
【００１０】本発明者等は、ＩＬ−８（７７）と特異的
に反応する抗体を得るための免疫原として、ＩＬ−８
（７７）のアミノ酸配列をもとに、ＩＬ−８（７７）の
Ｎ末端１０残基のアミノ酸からなるペプチド、すなわち
ＡＶＬＰＲＳＡＫＥＬ（以下ＬＵ１０と略す）を化学合
成した。
に反応する抗体を得るための免疫原として、ＩＬ−８
（７７）のアミノ酸配列をもとに、ＩＬ−８（７７）の
Ｎ末端１０残基のアミノ酸からなるペプチド、すなわち
ＡＶＬＰＲＳＡＫＥＬ（以下ＬＵ１０と略す）を化学合
成した。
【００１１】ペプチドの化学合成は、例えば市販のペプ
チド合成機（アプライドバイオシステム社 モデルABI-
430A）を用いることにより容易に合成することができ
る。
チド合成機（アプライドバイオシステム社 モデルABI-
430A）を用いることにより容易に合成することができ
る。
【００１２】このようにして得られたＬＵ１０を免疫原
として、ＩＬ−８（７７）に特異的な抗体を作成した。
として、ＩＬ−８（７７）に特異的な抗体を作成した。
【００１３】本発明における抗ＩＬ−８（７７）抗体と
は、ＩＬ−８（７７）を特異的に認識し得る抗体を意味
するものである。このような抗体の具体例として下記実
施例に詳述するモノクローナル抗体を挙げることができ
るが、本発明はモノクローナル抗体に限定されるもので
はなく、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の
いずれであってもよい。
は、ＩＬ−８（７７）を特異的に認識し得る抗体を意味
するものである。このような抗体の具体例として下記実
施例に詳述するモノクローナル抗体を挙げることができ
るが、本発明はモノクローナル抗体に限定されるもので
はなく、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の
いずれであってもよい。
【００１４】本発明のモノクローナル抗体及び該抗体を
産生するハイブリドーマは、例えば以下のようにして得
ることができる。
産生するハイブリドーマは、例えば以下のようにして得
ることができる。
【００１５】すなわち、上述のようにして得られたＬＵ
１０を動物、例えばマウス、ラット等に免疫する。通
常、動物に抗体を作らせるために抗原を免疫する際に
は、抗原を単独またはアジュバンドと共に動物に免疫す
るが、本願の抗原は１０残基アミノ酸のペプチドである
ため、適当な担体、例えばＫＬＨ（Keyhole Limpet Hem
ocyanin ）、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ＭＳＡ
（マウス血清アルブミン）等に結合した後、免疫に用い
るのが好ましい。
１０を動物、例えばマウス、ラット等に免疫する。通
常、動物に抗体を作らせるために抗原を免疫する際に
は、抗原を単独またはアジュバンドと共に動物に免疫す
るが、本願の抗原は１０残基アミノ酸のペプチドである
ため、適当な担体、例えばＫＬＨ（Keyhole Limpet Hem
ocyanin ）、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ＭＳＡ
（マウス血清アルブミン）等に結合した後、免疫に用い
るのが好ましい。
【００１６】次いで、免疫された動物の脾細胞、リンパ
節中の抗体産生細胞等と、その腫瘍細胞であるミエロー
マ細胞とを融合し、ハイブリドーマを作成する。この
際、ポリエチレングリコール法、高電圧パルス法等を用
いると効率よくハイブリドーマを得ることができる。さ
らに、ハイブリドーマを選択培地、例えばＨＡＴ培地を
用いて未融合細胞から選択し、培養する。この培養上清
を分析して目的とする抗ＩＬ−８（７７）モノクローナ
ル抗体を産生するクローンをスクリーニングする。培養
上清の分析には、適当な免疫測定法、例えばエンザイム
イムノアッセイ法、ラジオイムノアッセイ法等を用いる
ことができる。スクリーニングで陽性のハイブリドーマ
は単クローン化する。単クローン化には限界希釈法、軟
寒天法等の適当な手法を用いることができる。これらの
各工程は、公知の方法、例えばケーラーとミルシュタイ
ンのNature 256, 495 (1975)、シェーラーのNature 28
5, 446 (1980)に記載された方法により行うことができ
る。
節中の抗体産生細胞等と、その腫瘍細胞であるミエロー
マ細胞とを融合し、ハイブリドーマを作成する。この
際、ポリエチレングリコール法、高電圧パルス法等を用
いると効率よくハイブリドーマを得ることができる。さ
らに、ハイブリドーマを選択培地、例えばＨＡＴ培地を
用いて未融合細胞から選択し、培養する。この培養上清
を分析して目的とする抗ＩＬ−８（７７）モノクローナ
ル抗体を産生するクローンをスクリーニングする。培養
上清の分析には、適当な免疫測定法、例えばエンザイム
イムノアッセイ法、ラジオイムノアッセイ法等を用いる
ことができる。スクリーニングで陽性のハイブリドーマ
は単クローン化する。単クローン化には限界希釈法、軟
寒天法等の適当な手法を用いることができる。これらの
各工程は、公知の方法、例えばケーラーとミルシュタイ
ンのNature 256, 495 (1975)、シェーラーのNature 28
5, 446 (1980)に記載された方法により行うことができ
る。
【００１７】このようにして得られたＩＬ−８（７７）
を特異的に認識する抗体を産生するハイブリドーマのう
ち、好ましいものがＤ７７及びＥ６７７である。またこ
れらのハイブリドーマは、それぞれモノクローナル抗体
Ｄ７７及びＥ６７７を産生する。なお、これらのハイブ
リドーマＤ７７及びＥ６７７細胞は生命工学工業技術研
究所に寄託され、その受託番号はそれぞれＦＥＲＭ Ｐ
−１４６６５、ＦＥＲＭ Ｐ−１４６６６である。
を特異的に認識する抗体を産生するハイブリドーマのう
ち、好ましいものがＤ７７及びＥ６７７である。またこ
れらのハイブリドーマは、それぞれモノクローナル抗体
Ｄ７７及びＥ６７７を産生する。なお、これらのハイブ
リドーマＤ７７及びＥ６７７細胞は生命工学工業技術研
究所に寄託され、その受託番号はそれぞれＦＥＲＭ Ｐ
−１４６６５、ＦＥＲＭ Ｐ−１４６６６である。
【００１８】本発明のモノクローナル抗体は、その培養
上清から、各種分離精製手段により回収することができ
る。モノクローナル抗体の分離精製手段としては、例え
ば、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、
アフィニティークロマトグラフィー等の方法を用いるこ
とができる。モノクローナル抗体を大量に取得する場合
には、前期ハイブリドーマを組織適合性動物、胸腺欠損
ヌードマウス等の腹腔内に移植して増殖させ、産生され
た腹水中に含まれる該モノクローナル抗体を分離精製し
て回収すればよい。
上清から、各種分離精製手段により回収することができ
る。モノクローナル抗体の分離精製手段としては、例え
ば、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、
アフィニティークロマトグラフィー等の方法を用いるこ
とができる。モノクローナル抗体を大量に取得する場合
には、前期ハイブリドーマを組織適合性動物、胸腺欠損
ヌードマウス等の腹腔内に移植して増殖させ、産生され
た腹水中に含まれる該モノクローナル抗体を分離精製し
て回収すればよい。
【００１９】このようにして得られた抗ＩＬ−８（７
７）モノクローナル抗体を用いて、サンドイッチ法を開
発した。この測定法は、ＩＬ−８（７７）を特異的に測
定することができる。抗原には遺伝子操作技術によって
作製したＩＬ−８（７７）を用いた。
７）モノクローナル抗体を用いて、サンドイッチ法を開
発した。この測定法は、ＩＬ−８（７７）を特異的に測
定することができる。抗原には遺伝子操作技術によって
作製したＩＬ−８（７７）を用いた。
【００２０】本発明のモノクローナル抗体は、ＩＬ−８
（７７）を特異的に検出するための免疫学的測定法に広
く利用することができる。例えば、ラジオイムノアッセ
イ法、エンザイムイムノアッセイ法、凝集免疫測定法、
ウエスタンブロッティング法等である。従来ＩＬ−８
は、抗ＩＬ−８（７２）抗体が認識するＩＬ−８として
測定されており、その測定対象はＩＬ−８（７２）及び
ＩＬ−８（７７）の混合物であったが、本発明のモノク
ローナル抗体を用いたこれらの免疫学的測定法は、初め
てＩＬ−８（７７）量を特異的に検出しうる手段を提供
し、炎症性疾患、ＩＬ−８の作用機序解析の研究、臨床
診断等に広く用いることができるものである。
（７７）を特異的に検出するための免疫学的測定法に広
く利用することができる。例えば、ラジオイムノアッセ
イ法、エンザイムイムノアッセイ法、凝集免疫測定法、
ウエスタンブロッティング法等である。従来ＩＬ−８
は、抗ＩＬ−８（７２）抗体が認識するＩＬ−８として
測定されており、その測定対象はＩＬ−８（７２）及び
ＩＬ−８（７７）の混合物であったが、本発明のモノク
ローナル抗体を用いたこれらの免疫学的測定法は、初め
てＩＬ−８（７７）量を特異的に検出しうる手段を提供
し、炎症性疾患、ＩＬ−８の作用機序解析の研究、臨床
診断等に広く用いることができるものである。
【００２１】
【実施例】本発明を以下参考例及び実施例により更に詳
細に説明する。
細に説明する。
【００２２】実施例１ 免疫原LU-MSAの作製 LU10を、アプライドバイオシステム社のペプチドシンセ
サイザー（モデル AB1-430A ）にて化学合成した。逆相
カラムのHPLCでLU10を精製後、アミノ酸配列が正しいこ
とをエドマン法で確認した。マウス血清アルブミン（以
下MSA と略す）をLU10 0.5mgに加え、水溶性カルボジイ
ミドと共に１夜４℃で反応させてMSA 結合LU10（以下LU
-MSAと略す）を作製し、これを、りん酸緩衝塩類溶液
（NaCl 8g,KCl 0.2g, Na2HPO4 1.15g, KH2PO4 0.2g/l
）（以下PBS と略す）に対して４℃で透析した。 参考例１ スクリーニング用抗原LU-TG の作製 実施例１と同様にして、サイログロブリン（以下TGと略
す）とLU10を結合させた（以下LU-TG と略す）。
サイザー（モデル AB1-430A ）にて化学合成した。逆相
カラムのHPLCでLU10を精製後、アミノ酸配列が正しいこ
とをエドマン法で確認した。マウス血清アルブミン（以
下MSA と略す）をLU10 0.5mgに加え、水溶性カルボジイ
ミドと共に１夜４℃で反応させてMSA 結合LU10（以下LU
-MSAと略す）を作製し、これを、りん酸緩衝塩類溶液
（NaCl 8g,KCl 0.2g, Na2HPO4 1.15g, KH2PO4 0.2g/l
）（以下PBS と略す）に対して４℃で透析した。 参考例１ スクリーニング用抗原LU-TG の作製 実施例１と同様にして、サイログロブリン（以下TGと略
す）とLU10を結合させた（以下LU-TG と略す）。
【００２３】実施例２ IL-8(77)測定用抗原の作製 pMAL-CのstulサイトにIL-8(77)をコードするcDNAフラグ
メントを結合させ、宿主大腸菌JM109 を形質転換した。
DNA 配列によりIL-8(77)の遺伝子配列が正しく入ってい
ることを確認して、組み換え体大腸菌JM109 を大量培養
した。組み換え体培養液1lに0.3mM イソプロピル−β−
Ｄ−チオガラクト−ｐ−イラノシドを加えて、２時間培
養後、1000rpm で集菌した。ついで、30mM NaCl, 0.25%
Tween20, 10mM EDTA, 10mM EGTAを含む10mMリン酸ナト
リウム緩衝液（pH7.0 ）50mlを加えて凍結融解し、0.5M
NaCl 50mlを添加後、10000rpmで20分間遠心した。上清
をアミロースレジンカラム（5ml パック）にかけ、10mM
マルトースで溶出した。さらに、50mM トリス塩酸緩衝
液で透析し、融合タンパク質であるマルトース結合蛋白
（以下MBP-IL-8(77)と略す）を得た。MBP-IL-8(77)を二
分し、それぞれにプロテアーゼXa（New England Biolab
os社製）をMBP-IL-8の融合タンパク質に対し1%(W/W) 量
加えた。一方は、０℃３０分放置後、ただちにCM- セフ
ァロース（3ml パック）にかけた（IL-8(77)用) 。他の
一方は、３７℃４時間放置後、先と同様にCM- セファロ
ース（3ml パック）にかけた（IL-8(72)用) 。それぞれ
のカラムを、0.7 M NaCl及び0.001% BSAを含む50mMりん
酸ナトリウム緩衝液（pH7.4 ）で溶出し、逆相カラム V
ydac C4 によるHPLCを用いて、それぞれ単一のIL-8(77)
及びIL-8(72)に精製した。
メントを結合させ、宿主大腸菌JM109 を形質転換した。
DNA 配列によりIL-8(77)の遺伝子配列が正しく入ってい
ることを確認して、組み換え体大腸菌JM109 を大量培養
した。組み換え体培養液1lに0.3mM イソプロピル−β−
Ｄ−チオガラクト−ｐ−イラノシドを加えて、２時間培
養後、1000rpm で集菌した。ついで、30mM NaCl, 0.25%
Tween20, 10mM EDTA, 10mM EGTAを含む10mMリン酸ナト
リウム緩衝液（pH7.0 ）50mlを加えて凍結融解し、0.5M
NaCl 50mlを添加後、10000rpmで20分間遠心した。上清
をアミロースレジンカラム（5ml パック）にかけ、10mM
マルトースで溶出した。さらに、50mM トリス塩酸緩衝
液で透析し、融合タンパク質であるマルトース結合蛋白
（以下MBP-IL-8(77)と略す）を得た。MBP-IL-8(77)を二
分し、それぞれにプロテアーゼXa（New England Biolab
os社製）をMBP-IL-8の融合タンパク質に対し1%(W/W) 量
加えた。一方は、０℃３０分放置後、ただちにCM- セフ
ァロース（3ml パック）にかけた（IL-8(77)用) 。他の
一方は、３７℃４時間放置後、先と同様にCM- セファロ
ース（3ml パック）にかけた（IL-8(72)用) 。それぞれ
のカラムを、0.7 M NaCl及び0.001% BSAを含む50mMりん
酸ナトリウム緩衝液（pH7.4 ）で溶出し、逆相カラム V
ydac C4 によるHPLCを用いて、それぞれ単一のIL-8(77)
及びIL-8(72)に精製した。
【００２４】実施例３ 抗IL-8(77)モノクローナル抗体の作製 （１）免疫法 抗IL-8(77)モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、
実施例１で作製したLU-MSAを免疫原として作製した。６
〜８週齢のBALB/Cマウス(female)に、LU-MSA(0.5mg/ml)
100 μl を100 μl の完全フロイントアジュバントと混
ぜ、初回免疫としてその全量を３カ所に皮下注射した。
２次免疫は初回免疫の２週間後に、最終免疫は細胞採取
の３日前に行った。この際、LU-MSA 70 μl を等量の不
完全フロイントアジュバントと混ぜ、その全量を皮下注
射した。
実施例１で作製したLU-MSAを免疫原として作製した。６
〜８週齢のBALB/Cマウス(female)に、LU-MSA(0.5mg/ml)
100 μl を100 μl の完全フロイントアジュバントと混
ぜ、初回免疫としてその全量を３カ所に皮下注射した。
２次免疫は初回免疫の２週間後に、最終免疫は細胞採取
の３日前に行った。この際、LU-MSA 70 μl を等量の不
完全フロイントアジュバントと混ぜ、その全量を皮下注
射した。
【００２５】（２）脾臓細胞の細胞融合 LU-MSAを免疫したマウスから摘出した脾臓細胞を、RPMI
-1640 培地中に懸濁した。0.17M NH4Cl 5ml を加え、０
℃で１０分間放置して溶血させた後、1200rpmで３分間
遠心し、RPMI-1640 培地で洗浄した。融合させるミエロ
ーマ細胞にはPAI 株を用い、細胞融合の３日前に対数増
殖期の細胞10mlを10% ウシ胎児血清（以下FCS と略す）
を含むPRMI-1640 培地（以下PRMI-1640-FCS と略す）90
mlで希釈した後、75cm2 のフラスコにて培養した。細胞
融合はPEG 法と電気融合法を用いた。
-1640 培地中に懸濁した。0.17M NH4Cl 5ml を加え、０
℃で１０分間放置して溶血させた後、1200rpmで３分間
遠心し、RPMI-1640 培地で洗浄した。融合させるミエロ
ーマ細胞にはPAI 株を用い、細胞融合の３日前に対数増
殖期の細胞10mlを10% ウシ胎児血清（以下FCS と略す）
を含むPRMI-1640 培地（以下PRMI-1640-FCS と略す）90
mlで希釈した後、75cm2 のフラスコにて培養した。細胞
融合はPEG 法と電気融合法を用いた。
【００２６】（３）ハイブリドーマの作製とスクリーニ
ング ハイブリドーマは、RPMI-1640-FCS とHAT 選択培地によ
り培養し、以下の方法によりスクリーニングした。ハイ
ブリドーマ培養上清を、1 μg/ml LU-TG 100μl を吸着
させたウエルに分注し、１時間反応させた。PBS で洗浄
後、ペルオキシダーゼ標識抗マウス免疫グロブリンヤギ
IgG （オルガノンテクニカル社製3211-0081 ）（以下HR
P 標識抗マウスIgG 抗体と略す）と１時間反応させた。
PBS でよく洗浄した後、0.4mg/mlｏ−フェニレンジアミ
ン溶液を加え、室温で１０分反応後、492nm の吸光度を
測定した。スクリーニングの結果、IL-8(77)を特異的に
認識する抗体を産生するハイブリドーマとして、D77 、
E677クローンを得た。なお、このハイブリドーマD77 、
E677細胞は生命工学工業技術研究所に寄託され、その受
託番号はそれぞれＦＥＲＭ Ｐ−１４６６５、ＦＥＲＭ
Ｐ−１４６６６である。
ング ハイブリドーマは、RPMI-1640-FCS とHAT 選択培地によ
り培養し、以下の方法によりスクリーニングした。ハイ
ブリドーマ培養上清を、1 μg/ml LU-TG 100μl を吸着
させたウエルに分注し、１時間反応させた。PBS で洗浄
後、ペルオキシダーゼ標識抗マウス免疫グロブリンヤギ
IgG （オルガノンテクニカル社製3211-0081 ）（以下HR
P 標識抗マウスIgG 抗体と略す）と１時間反応させた。
PBS でよく洗浄した後、0.4mg/mlｏ−フェニレンジアミ
ン溶液を加え、室温で１０分反応後、492nm の吸光度を
測定した。スクリーニングの結果、IL-8(77)を特異的に
認識する抗体を産生するハイブリドーマとして、D77 、
E677クローンを得た。なお、このハイブリドーマD77 、
E677細胞は生命工学工業技術研究所に寄託され、その受
託番号はそれぞれＦＥＲＭ Ｐ−１４６６５、ＦＥＲＭ
Ｐ−１４６６６である。
【００２７】（４）モノクローナル抗体の精製 ハイブリドーマD77 及びE677の106 〜107 個/0.5ml PRM
I-1640-FCSをそれぞれBALB/Cマウス（６〜１０周齢）に
腹腔内注射し移植した。１〜２週間後、開腹し腹水を得
た。この腹水を、5ml の結合バッファー（アマシァム社
製）で平衡化したプロテインＡカラムキット（アマシャ
ム社製）のカラムにかけ、5ml の結合バッファーで２回
カラムを洗浄した。次いで、3ml の溶出バッファー（ア
マシャム社製）でIgG を溶出した。溶出したIgG はただ
ちにpH調整をし、pH7.4 のバッファー（アマシャム社
製）に保存した。ハイブリドーマD77 及びE677からはそ
れぞれモノクローナル抗体D77 及びE677が得られた。
I-1640-FCSをそれぞれBALB/Cマウス（６〜１０周齢）に
腹腔内注射し移植した。１〜２週間後、開腹し腹水を得
た。この腹水を、5ml の結合バッファー（アマシァム社
製）で平衡化したプロテインＡカラムキット（アマシャ
ム社製）のカラムにかけ、5ml の結合バッファーで２回
カラムを洗浄した。次いで、3ml の溶出バッファー（ア
マシャム社製）でIgG を溶出した。溶出したIgG はただ
ちにpH調整をし、pH7.4 のバッファー（アマシャム社
製）に保存した。ハイブリドーマD77 及びE677からはそ
れぞれモノクローナル抗体D77 及びE677が得られた。
【００２８】参考例２ 抗IL-8(72)モノクローナル抗体の作製 実施例２で調整したリコンビナントIL-8(72)を免疫原と
して、実施例３と同様の方法にてIL-8(72)を認識する抗
体を産生するハイブリドーマを作製し、E72 クローンを
得た。このハイブリドーマはモノクローナル抗体E72 を
産生した。なお、このハイブリドーマE72 細胞は生命工
学工業技術研究所に寄託され、その受託番号はＦＥＲＭ
Ｐ−１４６６７である。
して、実施例３と同様の方法にてIL-8(72)を認識する抗
体を産生するハイブリドーマを作製し、E72 クローンを
得た。このハイブリドーマはモノクローナル抗体E72 を
産生した。なお、このハイブリドーマE72 細胞は生命工
学工業技術研究所に寄託され、その受託番号はＦＥＲＭ
Ｐ−１４６６７である。
【００２９】実施例４ ペルオキシダーゼ（以下HRP と略す）標識抗体の作製 4mg/mlのHRP 1ml に0.1Mメタ過ヨウ素酸ナトリウム0.2m
l を加え、室温で２０分間攪拌放置後、1mM 酢酸緩衝液
(pH4.4) に透析した。これに 10mM 炭酸緩衝液(pH9.5)
で8mg/mlに調整した精製抗体D77 及びE677をそれぞれ加
え、室温で２時間反応させた。次に4mg/mlの水素化ヨウ
素ナトリウム0.1ml を加えて反応を停止させた後、等量
の飽和硫安を加え沈殿させた。沈殿物を少量のPBS に溶
解し、PBS で平衡化したスパンカラム法により硫安を除
去した。尚、保存液の濃度は約0.5mg/mlであった。
l を加え、室温で２０分間攪拌放置後、1mM 酢酸緩衝液
(pH4.4) に透析した。これに 10mM 炭酸緩衝液(pH9.5)
で8mg/mlに調整した精製抗体D77 及びE677をそれぞれ加
え、室温で２時間反応させた。次に4mg/mlの水素化ヨウ
素ナトリウム0.1ml を加えて反応を停止させた後、等量
の飽和硫安を加え沈殿させた。沈殿物を少量のPBS に溶
解し、PBS で平衡化したスパンカラム法により硫安を除
去した。尚、保存液の濃度は約0.5mg/mlであった。
【００３０】参考例３ HRP 標識E72 の作製 実施例４と同様にして、E72 抗体のHRP 標識体を作製し
た。
た。
【００３１】実施例５ ウエスタンブロット法によるD77 及びE677抗体の反応性 実施例２で作製したリコンビナントIL-8(77)及びリコン
ビナントIL-8(72)をそれぞれ5 μg/laneでSDS-PAGEによ
り電気泳動した後、アクリルアミドゲルからイモビロン
フィルターに転写した。PBS で３回洗浄後、それぞれの
モノクローナル抗体と１時間反応させた。PBS で洗浄
後、HRP 標識抗マウスIgG 抗体と１時間反応させた。PB
S でよく洗浄した後、4-クロロ-1- ナフトールを用いて
発色させた。蛋白質の染色はクマシーブルー溶液によっ
て行った。結果を図１及び図２に示す。
ビナントIL-8(72)をそれぞれ5 μg/laneでSDS-PAGEによ
り電気泳動した後、アクリルアミドゲルからイモビロン
フィルターに転写した。PBS で３回洗浄後、それぞれの
モノクローナル抗体と１時間反応させた。PBS で洗浄
後、HRP 標識抗マウスIgG 抗体と１時間反応させた。PB
S でよく洗浄した後、4-クロロ-1- ナフトールを用いて
発色させた。蛋白質の染色はクマシーブルー溶液によっ
て行った。結果を図１及び図２に示す。
【００３２】D77 抗体及びE677抗体は、リコンビナント
IL-8(77)とは反応したが、リコンビナントIL-8(72)とは
反応しなかった。この結果よりD77 抗体及びE677抗体が
IL-8(77)に特異的な抗体であることが確認された。
IL-8(77)とは反応したが、リコンビナントIL-8(72)とは
反応しなかった。この結果よりD77 抗体及びE677抗体が
IL-8(77)に特異的な抗体であることが確認された。
【００３３】参考例４ ウエスタンブロット法によるE72 抗体の反応性 実施例５と同様に、参考例３で作製したHRP 標識E72 抗
体の反応性を実施例２で作製した抗原を用いたウエスタ
ンブロット法にて調べた。結果を図３に示す。E72 抗体
は、リコンビナントIL-8(77)及びリコンビナントIL-8(7
2)の両方に同程度反応した。
体の反応性を実施例２で作製した抗原を用いたウエスタ
ンブロット法にて調べた。結果を図３に示す。E72 抗体
は、リコンビナントIL-8(77)及びリコンビナントIL-8(7
2)の両方に同程度反応した。
【００３４】実施例６ サンドイッチEIA 法によるIL-8(77)の測定 （１）10μg/ml E72抗体をELISA プレートの各ウェルに
100 μl づつ分注し、４℃１晩放置して抗体を固相に吸
着させた。実施例２で作製したリコンビナントIL-8(77)
及びリコンビナントIL-8(72)を0.001 〜1 μM の濃度で
100 μl づつウェルに分注し、実施例４で作製したHRP
標識D77 抗体を１μg/mlの濃度で100 μl づつ分注し１
時間室温で反応させた。PBS で３回洗浄後、室温で１時
間反応させた。ウェルをPBS で３回洗浄後、ｏ−フェニ
レンジアミン溶液と室温で１０分間反応後、492nm の吸
光度を測定した。結果を図４に示す。この系において
は、リコンビナントIL-8(72)は検出されず、IL-8(77)は
0.001 μM でも十分検出可能であった。
100 μl づつ分注し、４℃１晩放置して抗体を固相に吸
着させた。実施例２で作製したリコンビナントIL-8(77)
及びリコンビナントIL-8(72)を0.001 〜1 μM の濃度で
100 μl づつウェルに分注し、実施例４で作製したHRP
標識D77 抗体を１μg/mlの濃度で100 μl づつ分注し１
時間室温で反応させた。PBS で３回洗浄後、室温で１時
間反応させた。ウェルをPBS で３回洗浄後、ｏ−フェニ
レンジアミン溶液と室温で１０分間反応後、492nm の吸
光度を測定した。結果を図４に示す。この系において
は、リコンビナントIL-8(72)は検出されず、IL-8(77)は
0.001 μM でも十分検出可能であった。
【００３５】（２）（１）と同様に固相にE72 を吸着さ
せ、実施例４で作製したHRP 標識E677抗体を用いてサン
ドイッチ反応を組んだ。結果を図５に示す。この系にお
いても、リコンビナントIL-8(77)が特異的に検出され
た。
せ、実施例４で作製したHRP 標識E677抗体を用いてサン
ドイッチ反応を組んだ。結果を図５に示す。この系にお
いても、リコンビナントIL-8(77)が特異的に検出され
た。
【００３６】（３）（１）と同様に固相にD77 を吸着さ
せ、参考例３で作製したHRP 標識E72 抗体を用いてサン
ドイッチ反応を組んだ。結果を図６に示す。この系にお
いても、リコンビナントIL-8(77)が特異的に検出され
た。
せ、参考例３で作製したHRP 標識E72 抗体を用いてサン
ドイッチ反応を組んだ。結果を図６に示す。この系にお
いても、リコンビナントIL-8(77)が特異的に検出され
た。
【００３７】実施例７ ネイティブIL-8(77)の測定 Immunology Letters, 36(1993) 71-82 に記載の方法に
基づき、1ng/ml PMAで刺激して３〜２４時間培養したヒ
ト骨髄芽球白血病細胞ML-1の培養上清 100μlを検体と
し、実施例６（３）の方法を用いてネイティブIL-8(77)
を測定した。結果を表１に示す。この結果から本測定系
がネイティブIL-8(77)を測定し得ることが確認できた。
基づき、1ng/ml PMAで刺激して３〜２４時間培養したヒ
ト骨髄芽球白血病細胞ML-1の培養上清 100μlを検体と
し、実施例６（３）の方法を用いてネイティブIL-8(77)
を測定した。結果を表１に示す。この結果から本測定系
がネイティブIL-8(77)を測定し得ることが確認できた。
【００３８】 表１ ネイティブIL-8(77)の測定 ------------------------------------------------------------ ML-1 培養条件 吸光度(O.D.492) IL-8(77) 換算値 ------------------------------------------------------------ PMA無処理24時間 0.100 0 nM PMA刺激後３時間 0.900 6.0 nM PMA刺激後６時間 1.450 9.5 nM PMA刺激後24時間 1.600 11.0 nM ------------------------------------------------------------
【００３９】
【発明の効果】本発明により、ＩＬ−８（７７）と反応
する抗体が初めて提供され、該抗体を免疫反応に用いる
ことにより、従来ＩＬ−８（７２）抗体によってまとめ
て測定されていたＩＬ−８からＩＬ−８（７７）量を検
出し分けることができるようになった。
する抗体が初めて提供され、該抗体を免疫反応に用いる
ことにより、従来ＩＬ−８（７２）抗体によってまとめ
て測定されていたＩＬ−８からＩＬ−８（７７）量を検
出し分けることができるようになった。
【図１】 IL-8(77)特異的抗体D77 によるウェスタンブ
ロッティング法の結果を示したものである。
ロッティング法の結果を示したものである。
【図２】 IL-8(77)特異的抗体E677によるウェスタンブ
ロッティング法の結果を示したものである。
ロッティング法の結果を示したものである。
【図３】 IL-8抗体E72 によるウェスタンブロッティン
グ法の結果を示したものである。
グ法の結果を示したものである。
【図４】 固相IL-8抗体E72 −液相IL-8(77)特異抗体(D
77) によるサンドイッチEIA 法の結果を示したものであ
る。
77) によるサンドイッチEIA 法の結果を示したものであ
る。
【図５】 固相IL-8抗体E72 −液相IL-8(77)特異抗体(E
677)によるサンドイッチEIA 法の結果を示したものであ
る。
677)によるサンドイッチEIA 法の結果を示したものであ
る。
【図６】 固相IL-8(77)特異抗体(D77) −液相IL-8抗体
E72 によるサンドイッチEIA 法の結果を示したものであ
る。
E72 によるサンドイッチEIA 法の結果を示したものであ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (6)
- 【請求項１】 ７７アミノ酸残基インターロイキン８に
特異的に反応する抗インターロイキン８抗体。 - 【請求項２】 抗体がモノクローナル抗体である請求項
１に記載の抗体。 - 【請求項３】 抗体がＤ７７またはＥ６７７である請求
項２に記載の抗体。 - 【請求項４】 請求項２に記載のモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマ。 - 【請求項５】 ハイブリドーマがＦＭＲ Ｐ−１４６６
５またはＦＭＲ Ｐ−１４６６６である請求項３に記載
のハイブリドーマ。 - 【請求項６】 請求項１ないし３のいずれか１項に記載
の抗体を用いたインターロイキン８の測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7104597A JPH08277299A (ja) | 1995-04-06 | 1995-04-06 | 抗ｉｌ−８抗体、抗ｉｌ−８モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ及び該抗体を用いたｉｌ−８の測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7104597A JPH08277299A (ja) | 1995-04-06 | 1995-04-06 | 抗ｉｌ−８抗体、抗ｉｌ−８モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ及び該抗体を用いたｉｌ−８の測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08277299A true JPH08277299A (ja) | 1996-10-22 |
Family
ID=14384844
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7104597A Pending JPH08277299A (ja) | 1995-04-06 | 1995-04-06 | 抗ｉｌ−８抗体、抗ｉｌ−８モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ及び該抗体を用いたｉｌ−８の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08277299A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1068524C (zh) * | 1997-06-23 | 2001-07-18 | 叶庆炜 | 一种治疗顽症牛皮癣的药物 |
-
1995
- 1995-04-06 JP JP7104597A patent/JPH08277299A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1068524C (zh) * | 1997-06-23 | 2001-07-18 | 叶庆炜 | 一种治疗顽症牛皮癣的药物 |
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