JPH08275777A - 新規ｎ−アセチルキトオリゴ糖デアセチラーゼ及びその製造法 - Google Patents
新規ｎ−アセチルキトオリゴ糖デアセチラーゼ及びその製造法Info
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- JPH08275777A JPH08275777A JP7081079A JP8107995A JPH08275777A JP H08275777 A JPH08275777 A JP H08275777A JP 7081079 A JP7081079 A JP 7081079A JP 8107995 A JP8107995 A JP 8107995A JP H08275777 A JPH08275777 A JP H08275777A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 新規酵素デアセチラーゼＤＡ１及びデアセチ
ラーゼＤＡ２。 【効果】 高活性で、かつ、Ｎ−アセチルグルコサミン
のオリゴマーに選択的に作用する新規なデアセチラーゼ
を提供する。
ラーゼＤＡ２。 【効果】 高活性で、かつ、Ｎ−アセチルグルコサミン
のオリゴマーに選択的に作用する新規なデアセチラーゼ
を提供する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ビブリオ属に属する微
生物によって生産される新規デアセチラーゼＤＡ１及び
デアセチラーゼＤＡ２に関するものである。本発明の酵
素は、医薬品等の合成中間体として有用なＮ−アセチル
キトビオース及びＮ−アセチルキトトリオースの脱アセ
チル化物の製造に重要である。
生物によって生産される新規デアセチラーゼＤＡ１及び
デアセチラーゼＤＡ２に関するものである。本発明の酵
素は、医薬品等の合成中間体として有用なＮ−アセチル
キトビオース及びＮ−アセチルキトトリオースの脱アセ
チル化物の製造に重要である。
【０００２】
【従来の技術】Ｎ−アセチルグルコサミンあるいはその
オリゴマーを脱アセチル化する酵素に関しては従来ほと
んど研究されていなかったが、最近藤島ら（Biosci. Bi
otech.Biochem., Vol 58 193-195 1994）（特開平4-349
884) によって報告されている。
オリゴマーを脱アセチル化する酵素に関しては従来ほと
んど研究されていなかったが、最近藤島ら（Biosci. Bi
otech.Biochem., Vol 58 193-195 1994）（特開平4-349
884) によって報告されている。
【０００３】しかしながら、上記酵素は菌体内酵素であ
り、精製酵素タンパク質１mg当たりの活性が0.11ユニッ
トと非常に弱く、基質特異性において、Ｎ−アセチルグ
ルコサミンのみに選択的に作用するものであった。すな
わち、菌体外に生産され、活性が精製酵素タンパク質１
mg当たり10ユニット以上の高い活性を有し、しかも、Ｎ
−アセチルキトビオースあるいはＮ−アセチルキトトリ
オースに選択的に作用する酵素は知られていない。
り、精製酵素タンパク質１mg当たりの活性が0.11ユニッ
トと非常に弱く、基質特異性において、Ｎ−アセチルグ
ルコサミンのみに選択的に作用するものであった。すな
わち、菌体外に生産され、活性が精製酵素タンパク質１
mg当たり10ユニット以上の高い活性を有し、しかも、Ｎ
−アセチルキトビオースあるいはＮ−アセチルキトトリ
オースに選択的に作用する酵素は知られていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、Ｎ−
アセチルグルコサミンのオリゴマーであるＮ−アセチル
キトビオースあるいはＮ−アセチルキトトリオースに選
択的に作用し、従来のデアセチラーゼよりも高い活性を
有する新規なデアセチラーゼを提供することにある。
アセチルグルコサミンのオリゴマーであるＮ−アセチル
キトビオースあるいはＮ−アセチルキトトリオースに選
択的に作用し、従来のデアセチラーゼよりも高い活性を
有する新規なデアセチラーゼを提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記課題
を解決すべく、海洋性細菌由来のデアセチラーゼの探索
を行った結果、ビブリオ属に属するＨ−８株が、高いデ
アセチラーゼ活性を有し、かつＮ−アセチルキトビオー
スあるいはアセチルキトトリオースに選択的に作用する
デアセチラーゼを産生することを見出し、本発明を完成
した。
を解決すべく、海洋性細菌由来のデアセチラーゼの探索
を行った結果、ビブリオ属に属するＨ−８株が、高いデ
アセチラーゼ活性を有し、かつＮ−アセチルキトビオー
スあるいはアセチルキトトリオースに選択的に作用する
デアセチラーゼを産生することを見出し、本発明を完成
した。
【０００６】即ち、本発明は、下記の酵素化学的性質を
有するデアセチラーゼＤＡ１又はデアセチラーゼＤＡ２
である。 Ａ．デアセチラーゼＤＡ１ （１）Ｎ−アセチルキトビオースあるいはＮ−アセチル
キトトリオースに作用して、脱アセチル化する。 （２）至適 pH ：37℃で8.５−9.０ （３）至適温度：pH8.５で45℃ （４）pH安定性：37℃で6.０−11.0で安定 （５）熱安定性：pH8.５で50℃で１時間の処理に安定 （６）分子量：20,000−60,000（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法） （７）等電点：3.３ Ｂ．デアセチラーゼＤＡ２ （１）Ｎ−アセチルキトビオースあるいはＮ−アセチル
キトトリオースに作用して、脱アセチル化する。 （２）至適 pH ：37℃で8.０−8.５ （３）至適温度：pH8.５で40℃ （４）pH安定性：37℃で7.０−11.0で安定 （５）熱安定性：pH8.５で50℃で１時間の処理に安定 （６）分子量：20,000−60,000（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法） （７）等電点：3.５ また、本発明は、ビブリオ属に属し、デアセチラーゼＤ
Ａ１またはデアセチラーゼＤＡ２産生能を有する微生物
を培養し、その培養物からデアセチラーデＤＡ１または
デアセチラーゼＤＡ２を採取することを特徴とするデア
セチラーゼＤＡ１またはデアセチラーゼＤＡ２の製造法
である。
有するデアセチラーゼＤＡ１又はデアセチラーゼＤＡ２
である。 Ａ．デアセチラーゼＤＡ１ （１）Ｎ−アセチルキトビオースあるいはＮ−アセチル
キトトリオースに作用して、脱アセチル化する。 （２）至適 pH ：37℃で8.５−9.０ （３）至適温度：pH8.５で45℃ （４）pH安定性：37℃で6.０−11.0で安定 （５）熱安定性：pH8.５で50℃で１時間の処理に安定 （６）分子量：20,000−60,000（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法） （７）等電点：3.３ Ｂ．デアセチラーゼＤＡ２ （１）Ｎ−アセチルキトビオースあるいはＮ−アセチル
キトトリオースに作用して、脱アセチル化する。 （２）至適 pH ：37℃で8.０−8.５ （３）至適温度：pH8.５で40℃ （４）pH安定性：37℃で7.０−11.0で安定 （５）熱安定性：pH8.５で50℃で１時間の処理に安定 （６）分子量：20,000−60,000（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法） （７）等電点：3.５ また、本発明は、ビブリオ属に属し、デアセチラーゼＤ
Ａ１またはデアセチラーゼＤＡ２産生能を有する微生物
を培養し、その培養物からデアセチラーデＤＡ１または
デアセチラーゼＤＡ２を採取することを特徴とするデア
セチラーゼＤＡ１またはデアセチラーゼＤＡ２の製造法
である。
【０００７】以下、本発明を詳細に説明する。Ｈ−８株
は、静岡県浜名湖にて採取した底泥より分離された。Ｈ
−８株の菌学的性質は下記に示すが、培地は、マリンア
ガー（Bacto MarineAgar 2216)(Difco 社製）あるいは
マリンブロス（Bacto Marine Broth 2216)(Difco社製）
を用いた。これらの培地に本菌株を植菌し30℃で24から
48時間培養し、光学顕微鏡及び透過型電子顕微鏡を用い
て形態観察を行った。また、本菌株は、塩化ナトリウム
を要求することから、生化学的性状の試験は75％人工海
水を用いて培地を作成するか、あるいは培地中に３％塩
化ナトリウムを添加することによって行った。 （１）形態（好気的条件下） 細胞の形及び大きさ：曲がりのない桿菌、0.７〜1.１×
1.３〜1.８μｍ 細胞の多形成の有無：無し 運 動 性 ：あり 鞭毛の着生状態 ：極毛性、固体培地で培養した場合
菌体周辺に周鞭毛が観察される。
は、静岡県浜名湖にて採取した底泥より分離された。Ｈ
−８株の菌学的性質は下記に示すが、培地は、マリンア
ガー（Bacto MarineAgar 2216)(Difco 社製）あるいは
マリンブロス（Bacto Marine Broth 2216)(Difco社製）
を用いた。これらの培地に本菌株を植菌し30℃で24から
48時間培養し、光学顕微鏡及び透過型電子顕微鏡を用い
て形態観察を行った。また、本菌株は、塩化ナトリウム
を要求することから、生化学的性状の試験は75％人工海
水を用いて培地を作成するか、あるいは培地中に３％塩
化ナトリウムを添加することによって行った。 （１）形態（好気的条件下） 細胞の形及び大きさ：曲がりのない桿菌、0.７〜1.１×
1.３〜1.８μｍ 細胞の多形成の有無：無し 運 動 性 ：あり 鞭毛の着生状態 ：極毛性、固体培地で培養した場合
菌体周辺に周鞭毛が観察される。
【０００８】スウォーミング ：あり 胞子の有無 ：無し グラム染色性 ：陰性 （２）各培地における生育状態 マリンアガー平板培養：良好に生育、コロニーは、凸円
状に生育し、全縁湿光、不透明乳白色であり、表面は平
滑である。
状に生育し、全縁湿光、不透明乳白色であり、表面は平
滑である。
【０００９】 マリンアガー斜面培養：良好に生育、糸状、乳白色 マリンブロス培養 ：良好に生育、培養液は均一に濁
る。 マリンブロスゼラチン穿刺培養：液化する（１週間
後）。 リトマスミルク ：消化する （３）生理学的性質 硝酸塩の還元 ：還元する インドールの生成：生成する。
る。 マリンブロスゼラチン穿刺培養：液化する（１週間
後）。 リトマスミルク ：消化する （３）生理学的性質 硝酸塩の還元 ：還元する インドールの生成：生成する。
【００１０】 硫化水素の生成 ：ＴＳＩ培地では、生成しない。 でんぷんの分解 ：加水分解する。 クエン酸の利用 ：Simons培地 利用する。 ：Cristensen培地 利用する。 無機窒素源の利用：利用する。
【００１１】色素の生成 ：生成しない。 ウレアーゼ活性 ：陰性 オキシダーゼ活性：陽性 カタラーゼ活性 ：陽性 生育の範囲（温度、pH）：温度12〜45℃ 30℃で最も
良好に成育 ：pH３〜10 ６〜８で最も良好に成育 酸素に対する態度：通性嫌気 Ｏ−Ｆテスト ：ブドウ糖を発酵する。
良好に成育 ：pH３〜10 ６〜８で最も良好に成育 酸素に対する態度：通性嫌気 Ｏ−Ｆテスト ：ブドウ糖を発酵する。
【００１２】 メチルレッド試験：陽性 ＶＰ反応 ：陽性 糖類から酸及びガスの生成の有無 30℃、１週間培養後 酸の生成 ガスの生成 Ｌ−アラビノース ＋ − Ｄ−キシロース − − Ｄ−グルコース ＋ − Ｄ−マンノース ＋ − Ｄ−ガラクトース ＋ − Ｄ−フラクトース ＋ − 麦芽糖 ＋ − ショ糖 − − 乳 糖 − − トレハロース ＋ − Ｄ−ソルビット − − Ｄ−マンニット ＋ − イノシット − − グリセリン ＋ − デンプン ＋ − −：生成せず、 ＋：生成する エスクリンの分解：陰性 アルギニンの分解：陰性 ＤＮＡの分解 ：陽性 ＰＨＢの蓄積 ：蓄積しない 好 塩 性 ：１％〜10％の範囲で生育 ＯＮＰＧテスト ：陽性 Tween80 分解性 ：陽性 ＧＣ含量 ：45.8％ イソプレノイドキノン： 主たるキノン ユビキノン Ｑ-8 マイナーなキノン ユビキノン Ｑ-7, Ｑ-6, Ｑ-9 メナキノン ＭＫ-7 デメチルメナキノン ＤＭＫ-8 以上の菌学的性質からバージーズ・マニュアル・オブ・
デターミネイティブ・バクテリオロジー第８版の分類基
準に従って公知の菌株と比較した結果、グラム陰性桿菌
で、極毛性の鞭毛を有し、通性嫌気性、またＯＦテスト
で発酵性であり、好塩性で発光性をもたず、オキシダー
ゼ陽性、ＧＣ含量が４５．８％である等の理由から本菌
株は、ビブリオ属に所属すると考えられた。そして、本
菌株は、ビブリオｓｐ．Ｈ−８株として工業技術院生命
工学技術研究所に寄託番号FERM P-14737として寄託され
ている（寄託日：平成７年１月19日）。
デターミネイティブ・バクテリオロジー第８版の分類基
準に従って公知の菌株と比較した結果、グラム陰性桿菌
で、極毛性の鞭毛を有し、通性嫌気性、またＯＦテスト
で発酵性であり、好塩性で発光性をもたず、オキシダー
ゼ陽性、ＧＣ含量が４５．８％である等の理由から本菌
株は、ビブリオ属に所属すると考えられた。そして、本
菌株は、ビブリオｓｐ．Ｈ−８株として工業技術院生命
工学技術研究所に寄託番号FERM P-14737として寄託され
ている（寄託日：平成７年１月19日）。
【００１３】デアセチラーゼＤＡ１及びデアセチラーゼ
ＤＡ２は、ビブリオ属に属するデアセチラーゼ生産菌を
培地で培養し、培養物から得ることができる。デアセチ
ラーゼ生産菌としては、ビブリオ属に属し、デアセチラ
ーゼＤＡ１及びデアセチラーゼＤＡ２を産生するもので
あれば、いずれの菌株でも用いることができる。また、
これら微生物の人工的変異方法、例えば紫外線照射、Ｘ
線照射、変異誘起剤処理など、あるいは自然発生による
変異株、また遺伝子操作、細胞融合による変異株でもデ
アセチラーゼＤＡ１またはデアセチラーゼＤＡ２を生産
するものであればいずれも本発明に用いることができ
る。デアセチラーゼ生産能を有する菌株を選定するに
は、菌株の培養物を取り出し、そのデアセチラーゼ活性
を測定することにより行うことができる。デアセチラー
ゼ生産株のうち、代表的な株としては、ビブリオｓｐ．
Ｈ−８株（FERM P-14737) を挙げることができる。
ＤＡ２は、ビブリオ属に属するデアセチラーゼ生産菌を
培地で培養し、培養物から得ることができる。デアセチ
ラーゼ生産菌としては、ビブリオ属に属し、デアセチラ
ーゼＤＡ１及びデアセチラーゼＤＡ２を産生するもので
あれば、いずれの菌株でも用いることができる。また、
これら微生物の人工的変異方法、例えば紫外線照射、Ｘ
線照射、変異誘起剤処理など、あるいは自然発生による
変異株、また遺伝子操作、細胞融合による変異株でもデ
アセチラーゼＤＡ１またはデアセチラーゼＤＡ２を生産
するものであればいずれも本発明に用いることができ
る。デアセチラーゼ生産能を有する菌株を選定するに
は、菌株の培養物を取り出し、そのデアセチラーゼ活性
を測定することにより行うことができる。デアセチラー
ゼ生産株のうち、代表的な株としては、ビブリオｓｐ．
Ｈ−８株（FERM P-14737) を挙げることができる。
【００１４】本発明の微生物の培養には微生物の培養に
一般的に用いられる培養方法を用いることができる。培
地としては資化可能な炭素源、窒素源、無機物および必
要な生育、生産促進物質を程よく含有する培地であれば
合成培地、天然培地いずれでも使用可能である。本酵素
は、誘導酵素のため炭素源として、キチン又はキチンオ
リゴ糖を用いることが必須である。また、そのほかに炭
素源としてグルコース、澱粉、デキストリン、麦芽糖、
マンノース、フラクトース、シュークロース、アラビノ
ース、マンニトール、糖蜜などを単独または組み合わせ
て用いられる。更に、菌の資化能によっては炭化水素、
アルコール類、有機酸なども用いられる。窒素源として
は塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウ
ム、尿素、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵
母、コーン・スチーブ・リカー、大豆粉、カザミノ酸な
どが単独または組み合わせて用いられる。そのほか、食
塩、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウ
ム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫
酸第一鉄、塩化カルシウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、
硫酸銅などの無機塩類や海水を必要に応じて加える。更
に使用菌の生育やデアセチラーゼの生産を促進する微量
成分を適当に添加することができる。
一般的に用いられる培養方法を用いることができる。培
地としては資化可能な炭素源、窒素源、無機物および必
要な生育、生産促進物質を程よく含有する培地であれば
合成培地、天然培地いずれでも使用可能である。本酵素
は、誘導酵素のため炭素源として、キチン又はキチンオ
リゴ糖を用いることが必須である。また、そのほかに炭
素源としてグルコース、澱粉、デキストリン、麦芽糖、
マンノース、フラクトース、シュークロース、アラビノ
ース、マンニトール、糖蜜などを単独または組み合わせ
て用いられる。更に、菌の資化能によっては炭化水素、
アルコール類、有機酸なども用いられる。窒素源として
は塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウ
ム、尿素、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵
母、コーン・スチーブ・リカー、大豆粉、カザミノ酸な
どが単独または組み合わせて用いられる。そのほか、食
塩、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウ
ム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫
酸第一鉄、塩化カルシウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、
硫酸銅などの無機塩類や海水を必要に応じて加える。更
に使用菌の生育やデアセチラーゼの生産を促進する微量
成分を適当に添加することができる。
【００１５】培養法としては、一般の培養方法が用いら
れるが、液体培養法、とくに深部攪拌培養法がもっとも
適している。培養温度は16〜60℃、特に30〜42℃が適当
であり、培養中の培地のpHはアンモニア水や炭酸アンモ
ニウム溶液、塩酸溶液などを添加して、６〜11、特に７
〜９に維持することが望ましい。液体培養で通常６〜96
時間培養をおこなうと、目的物質のデアセチラーゼＤＡ
１及びデアセチラーゼＤＡ２が菌体外に生成される。培
養物中の生成量が最大に達したときに培養を停止する。
れるが、液体培養法、とくに深部攪拌培養法がもっとも
適している。培養温度は16〜60℃、特に30〜42℃が適当
であり、培養中の培地のpHはアンモニア水や炭酸アンモ
ニウム溶液、塩酸溶液などを添加して、６〜11、特に７
〜９に維持することが望ましい。液体培養で通常６〜96
時間培養をおこなうと、目的物質のデアセチラーゼＤＡ
１及びデアセチラーゼＤＡ２が菌体外に生成される。培
養物中の生成量が最大に達したときに培養を停止する。
【００１６】培養物からデアセチラーゼＤＡ１及びデア
セチラーゼＤＡ２の分離、精製は、酵素をその培養物か
ら単離精製するために常用される方法に従っておこなわ
れる。例えば培養物を濾過により培養濾液と菌体に分
け、培養ろ液を硫酸アンモニウム等を用い、塩析によっ
て沈澱物を得る。この沈澱物を溶解、透析、ゲルろ過ク
ロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等の
手順で精製することができる。
セチラーゼＤＡ２の分離、精製は、酵素をその培養物か
ら単離精製するために常用される方法に従っておこなわ
れる。例えば培養物を濾過により培養濾液と菌体に分
け、培養ろ液を硫酸アンモニウム等を用い、塩析によっ
て沈澱物を得る。この沈澱物を溶解、透析、ゲルろ過ク
ロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等の
手順で精製することができる。
【００１７】以上の手順で生成されたデアセチラーゼＤ
Ａ１は、以下の酵素化学的性質を有している。 （１）Ｎ−アセチルキトビオースあるいはＮ−アセチル
キトトリオースに作用して、脱アセチル化する。 （２）至適 pH ：37℃で8.５−9.０ （３）至適温度：pH8.５で45℃ （４）pH安定性：37℃で6.０−11.0で安定 （５）熱安定性：pH8.５で50℃で１時間の処理に安定 （６）分子量：20,000−60,000（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法） （７）等電点：3.３ デアセチラーゼＤＡ２は、以下の理化学的性質を有して
いる。 （１）Ｎ−アセチルキトビオースあるいはＮ−アセチル
キトトリオースに作用して、脱アセチル化する。 （２）至適 pH ：37℃で8.０−8.５ （３）至適温度：pH8.５で40℃ （４）pH安定性：37℃で7.０−11.0で安定 （５）熱安定性：pH8.５で40−55℃℃で１時間の処理に
安定 （６）分子量：20,000−60,000（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法） （７）等電点：3.５ 以上の酵素化学的性質及び後述の酵素活性について、本
発明のデアセチラーゼと公知のデアセチラーゼとを比較
したところ、Ｎ−アセチルグルコサミンのオリゴマーで
あるＮ−アセチルキトビオース及びＮ−アセチルキトト
リオースに選択的に作用する点、及び、酵素活性がタン
パク質１mg当たり、10ユニット以上である点で、公知の
デアセチラーゼと明らかに相違する。そこで、デアセチ
ラーゼＤＡ１及びデアセチラーゼＤＡ２を新規酵素と認
定した。
Ａ１は、以下の酵素化学的性質を有している。 （１）Ｎ−アセチルキトビオースあるいはＮ−アセチル
キトトリオースに作用して、脱アセチル化する。 （２）至適 pH ：37℃で8.５−9.０ （３）至適温度：pH8.５で45℃ （４）pH安定性：37℃で6.０−11.0で安定 （５）熱安定性：pH8.５で50℃で１時間の処理に安定 （６）分子量：20,000−60,000（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法） （７）等電点：3.３ デアセチラーゼＤＡ２は、以下の理化学的性質を有して
いる。 （１）Ｎ−アセチルキトビオースあるいはＮ−アセチル
キトトリオースに作用して、脱アセチル化する。 （２）至適 pH ：37℃で8.０−8.５ （３）至適温度：pH8.５で40℃ （４）pH安定性：37℃で7.０−11.0で安定 （５）熱安定性：pH8.５で40−55℃℃で１時間の処理に
安定 （６）分子量：20,000−60,000（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法） （７）等電点：3.５ 以上の酵素化学的性質及び後述の酵素活性について、本
発明のデアセチラーゼと公知のデアセチラーゼとを比較
したところ、Ｎ−アセチルグルコサミンのオリゴマーで
あるＮ−アセチルキトビオース及びＮ−アセチルキトト
リオースに選択的に作用する点、及び、酵素活性がタン
パク質１mg当たり、10ユニット以上である点で、公知の
デアセチラーゼと明らかに相違する。そこで、デアセチ
ラーゼＤＡ１及びデアセチラーゼＤＡ２を新規酵素と認
定した。
【００１８】本発明の酵素は、医薬品等の合成中間体と
して有用なＮ−アセチルキトビオース及びＮ−アセチル
キトトリオースの脱アセチル化物の製造に用いることが
できる。
して有用なＮ−アセチルキトビオース及びＮ−アセチル
キトトリオースの脱アセチル化物の製造に用いることが
できる。
【００１９】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳細に説明
するが、本発明はこれに限定されるものではない。 ［実施例１］キチン粉末５g/L 、ペプトン５g/L 、酵母
エキス１g/L 、リン酸第二鉄0.01g/L 、天然海水1000ml
の組成を有する前培養培地（殺菌前 pH 7.５) 30mlを30
0mlフラスコに加え、ビブリオｓｐ．Ｈ−８株を種菌と
して植菌し、37℃、24時間培養した。このようにして得
られた前培養液を 100Ｌ容量の発酵槽中の上記組成と同
一組成の培地30Ｌに５％v/v の割合で植菌し、30℃で通
気攪拌方式（回転数300rpm, 通気量0.7vvm) により18時
間培養を行った。この際、pHは7.８になるように調整し
ながら培養した。 ［実施例２］実施例１で得られた培養液30Ｌを1000rpm
で遠心分離し、培養上清を得た。上清を硫酸アンモニウ
ムで塩析し（80％飽和）、沈澱物をろ過後、50mM リン
酸ナトリウム緩衝液（pH7.０）２Ｌに懸濁し、そのろ液
を粗酵素液とした。次に、50ＦＴ-Ｃ-110透析チューブ
（三光純薬製) に上記粗酵素を入れ、50mM リン酸ナト
リウム緩衝液40Ｌを透析液として透析を行った。透析し
た酵素懸濁液をＤＥＡＥセファロースＦＦ（ファルマシ
アバイオテク社製）カラムを用いて、NaClのグラジェン
トによりデアセチラーゼ活性画分を溶出した。溶出画分
はさらにブチルセファロース４ＦＦ（ファルマシアバイ
オテク社製) に吸着させ、硫酸アンモニウムのグラジェ
ントにより溶出した。デアセチラーゼ活性画分は２つに
分かれた。２つの画分をそれぞれセファクリルＳ-200Ｈ
Ｒ（ファルマシアバイオテク社製）を用いてゲルろ過ク
ロマトグラフィーを行った。その結果、精製デアセチラ
ーデＤＡ１を25mg及び精製デアセチラーゼＤＡ２を７mg
得ることができた。 ［実施例３］デアセチラーゼＤＡ１及びデアセチラーゼ
ＤＡ２の酵素活性の測定には、亜硝酸−インドール反応
（Z. Dische, E. Borenferund, J. Biol. Chem., 184,
517(1950)) を用いた。なお、デアセチラーゼ１ユニッ
トは１分間に１μmol のグルコサミンを遊離する活性を
有する量とする。上記の測定法に従ってデアセチラーデ
ＤＡ１及びデアセチラーゼＤＡ２の酵素活性を測定し
た。その結果、タンパク質１mgあたり、デアセチラーゼ
ＤＡ１の活性は、32.5ユニットまた、デアセチラーゼＤ
Ａ２の活性は、35ユニットであった。
するが、本発明はこれに限定されるものではない。 ［実施例１］キチン粉末５g/L 、ペプトン５g/L 、酵母
エキス１g/L 、リン酸第二鉄0.01g/L 、天然海水1000ml
の組成を有する前培養培地（殺菌前 pH 7.５) 30mlを30
0mlフラスコに加え、ビブリオｓｐ．Ｈ−８株を種菌と
して植菌し、37℃、24時間培養した。このようにして得
られた前培養液を 100Ｌ容量の発酵槽中の上記組成と同
一組成の培地30Ｌに５％v/v の割合で植菌し、30℃で通
気攪拌方式（回転数300rpm, 通気量0.7vvm) により18時
間培養を行った。この際、pHは7.８になるように調整し
ながら培養した。 ［実施例２］実施例１で得られた培養液30Ｌを1000rpm
で遠心分離し、培養上清を得た。上清を硫酸アンモニウ
ムで塩析し（80％飽和）、沈澱物をろ過後、50mM リン
酸ナトリウム緩衝液（pH7.０）２Ｌに懸濁し、そのろ液
を粗酵素液とした。次に、50ＦＴ-Ｃ-110透析チューブ
（三光純薬製) に上記粗酵素を入れ、50mM リン酸ナト
リウム緩衝液40Ｌを透析液として透析を行った。透析し
た酵素懸濁液をＤＥＡＥセファロースＦＦ（ファルマシ
アバイオテク社製）カラムを用いて、NaClのグラジェン
トによりデアセチラーゼ活性画分を溶出した。溶出画分
はさらにブチルセファロース４ＦＦ（ファルマシアバイ
オテク社製) に吸着させ、硫酸アンモニウムのグラジェ
ントにより溶出した。デアセチラーゼ活性画分は２つに
分かれた。２つの画分をそれぞれセファクリルＳ-200Ｈ
Ｒ（ファルマシアバイオテク社製）を用いてゲルろ過ク
ロマトグラフィーを行った。その結果、精製デアセチラ
ーデＤＡ１を25mg及び精製デアセチラーゼＤＡ２を７mg
得ることができた。 ［実施例３］デアセチラーゼＤＡ１及びデアセチラーゼ
ＤＡ２の酵素活性の測定には、亜硝酸−インドール反応
（Z. Dische, E. Borenferund, J. Biol. Chem., 184,
517(1950)) を用いた。なお、デアセチラーゼ１ユニッ
トは１分間に１μmol のグルコサミンを遊離する活性を
有する量とする。上記の測定法に従ってデアセチラーデ
ＤＡ１及びデアセチラーゼＤＡ２の酵素活性を測定し
た。その結果、タンパク質１mgあたり、デアセチラーゼ
ＤＡ１の活性は、32.5ユニットまた、デアセチラーゼＤ
Ａ２の活性は、35ユニットであった。
【００２０】
【発明の効果】本発明は、高活性で、かつ、Ｎ−アセチ
ルグルコサミンのオリゴマーに選択的に作用する新規な
デアセチラーゼを提供する。
ルグルコサミンのオリゴマーに選択的に作用する新規な
デアセチラーゼを提供する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 佐野 浩 静岡県清水市袖師町1900番地 株式会社海 洋バイオテクノロジー研究所清水研究所内 (72)発明者 足立 恭子 静岡県清水市袖師町1900番地 株式会社海 洋バイオテクノロジー研究所清水研究所内 (72)発明者 大石 一男 静岡県沼津市三園町７−１職住303 (72)発明者 山岸 政昭 静岡県焼津市小川256−２ (72)発明者 太田 俊也 静岡県駿東郡清水町柿田178−３職住301 (72)発明者 本杉 正義 静岡県藤枝市２−５−12 (72)発明者 三輪 端 静岡県磐田郡福田町塩新田浜野328
Claims (2)
- 【請求項１】 下記の酵素化学的性質を有するデアセチ
ラーゼＤＡ１又はデアセチラーゼＤＡ２。 Ａ．デアセチラーゼＤＡ１ （１）Ｎ−アセチルキトビオースあるいはＮ−アセチル
キトトリオースに作用して、脱アセチル化する。 （２）至適 pH ：37℃で8.５−9.０ （３）至適温度：pH8.５で45℃ （４）pH安定性：37℃で6.０−11.0で安定 （５）熱安定性：pH8.５で50℃で１時間の処理に安定 （６）分子量：20,000−60,000（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法） （７）等電点：3.３ Ｂ．デアセチラーゼＤＡ２ （１）Ｎ−アセチルキトビオースあるいはＮ−アセチル
キトトリオースに作用して、脱アセチル化する。 （２）至適 pH ：37℃で8.０−8.５ （３）至適温度：pH8.５で40℃ （４）pH安定性：37℃で7.０−11.0で安定 （５）熱安定性：pH8.５で50℃で１時間の処理に安定 （６）分子量：20,000−60,000（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法） （７）等電点：3.５ - 【請求項２】 ビブリオ属に属し、デアセチラーゼＤＡ
１またはデアセチラーゼＤＡ２産生能を有する微生物を
培養し、その培養物からデアセチラーゼＤＡ１またはデ
アセチラーゼＤＡ２を採取することを特徴とするデアセ
チラーゼＤＡ１またはデアセチラーゼＤＡ２の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP08107995A JP3858065B2 (ja) | 1995-04-06 | 1995-04-06 | 新規ｎ−アセチルキトオリゴ糖デアセチラーゼ及びその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP08107995A JP3858065B2 (ja) | 1995-04-06 | 1995-04-06 | 新規ｎ−アセチルキトオリゴ糖デアセチラーゼ及びその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08275777A true JPH08275777A (ja) | 1996-10-22 |
| JP3858065B2 JP3858065B2 (ja) | 2006-12-13 |
Family
ID=13736391
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP08107995A Expired - Lifetime JP3858065B2 (ja) | 1995-04-06 | 1995-04-06 | 新規ｎ−アセチルキトオリゴ糖デアセチラーゼ及びその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3858065B2 (ja) |
-
1995
- 1995-04-06 JP JP08107995A patent/JP3858065B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3858065B2 (ja) | 2006-12-13 |
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