JPH08275774A - 悪性腫瘍の処置のための組成物 - Google Patents
悪性腫瘍の処置のための組成物Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は悪性腫瘍を処置するための方法及び
組成物の提供を課題とする。 【解決手段】 悪性腫瘍の検査、モニター及び処置の方
法を開示する。悪性腫瘍に関連する活性化癌遺伝子もし
くは癌関連遺伝子のタンパク質発現生成物への試験管内
暴露に応答性のＴ細胞の増殖の検出、又は該タンパク質
発現生成物と体液中の抗体とで形成される免疫複合体の
検出は悪性腫瘍の存在の診断を可能とする。
組成物の提供を課題とする。 【解決手段】 悪性腫瘍の検査、モニター及び処置の方
法を開示する。悪性腫瘍に関連する活性化癌遺伝子もし
くは癌関連遺伝子のタンパク質発現生成物への試験管内
暴露に応答性のＴ細胞の増殖の検出、又は該タンパク質
発現生成物と体液中の抗体とで形成される免疫複合体の
検出は悪性腫瘍の存在の診断を可能とする。
Description
【０００１】本発明は、一般に悪性腫瘍に関連する活性
化癌遺伝子又は癌関連遺伝子のタンパク質発現生成物に
対する癌患者自身の免疫反応の利用を介した悪性腫瘍の
検査、モニター及び治療に関する。
化癌遺伝子又は癌関連遺伝子のタンパク質発現生成物に
対する癌患者自身の免疫反応の利用を介した悪性腫瘍の
検査、モニター及び治療に関する。
【０００２】莫大な費用及び人材の投資もかかわらず、
癌は死の主たる原因であり続けている。悪性腫瘍の一般
的な特徴は無秩序な細胞増殖である。癌細胞は正常な表
現型から自立増殖可能な悪性腫瘍表現型への形質転換プ
ロセスを受けたものと考えられる。体細胞遺伝子の突然
変異は、正常細胞から悪性腫瘍細胞への形質転換をもた
らす一般的な一次現象と考えられる。この突然変異遺伝
子によってコードされる悪性腫瘍表現型の特徴は細胞分
裂の際に形質転換細胞の子孫へと受け継がれる。形質転
換に関与する種々の遺伝子を癌遺伝子と称する。癌遺伝
子は本来癌ウイルスの遺伝子物質の成分として同定され
ていた。ヒト染色体に相同性の遺伝子を一般に癌遺伝子
又は癌原遺伝子と称する。
癌は死の主たる原因であり続けている。悪性腫瘍の一般
的な特徴は無秩序な細胞増殖である。癌細胞は正常な表
現型から自立増殖可能な悪性腫瘍表現型への形質転換プ
ロセスを受けたものと考えられる。体細胞遺伝子の突然
変異は、正常細胞から悪性腫瘍細胞への形質転換をもた
らす一般的な一次現象と考えられる。この突然変異遺伝
子によってコードされる悪性腫瘍表現型の特徴は細胞分
裂の際に形質転換細胞の子孫へと受け継がれる。形質転
換に関与する種々の遺伝子を癌遺伝子と称する。癌遺伝
子は本来癌ウイルスの遺伝子物質の成分として同定され
ていた。ヒト染色体に相同性の遺伝子を一般に癌遺伝子
又は癌原遺伝子と称する。
【０００３】癌遺伝子に関するリサーチは、悪性腫瘍細
胞を作動させ、且つ形質転換に重要又は関連する少なく
とも４０種の癌遺伝子を同定している。癌遺伝子はその
遺伝子生成物（例えばこの癌遺伝子によって発現された
タンパク質）の推定の機能又は位置に基づいて種々のグ
ループに分類されている。
胞を作動させ、且つ形質転換に重要又は関連する少なく
とも４０種の癌遺伝子を同定している。癌遺伝子はその
遺伝子生成物（例えばこの癌遺伝子によって発現された
タンパク質）の推定の機能又は位置に基づいて種々のグ
ループに分類されている。
【０００４】癌原遺伝子は正常な細胞の生理現象の一定
の局面に不可欠であると考えられている。ある癌原遺伝
子は本質的に正常な遺伝子生成物の増大した又は抑えら
れた発現に由来する多数のメカニズムを介して、細胞性
癌遺伝子へと活性化されうるものと考えられている。例
えばｍｙｃ遺伝子の種は一定のヒトリンパ腫及び癌腫の
発生及び／又は進行に関連し、そのトランスフォーミン
グ活性化は多数のメカニズムの結果である。他方、その
他の癌原遺伝子は該遺伝子のコード配列における突然変
異を含む多数のメカニズムを介してトランスフォーミン
グ細胞性癌遺伝子へと活性化されるものと考えられてい
る。これはタンパク質のアミノ酸配列における−もしく
は複数の相違の結果としての変異した一次構造及び生物
化学特性を有する遺伝子生成物をもたらす。例えば、最
も一般的な型のヒト悪性腫瘍の原因であるｒａｓ遺伝子
は単一のコドン変化の結果活性化される。
の局面に不可欠であると考えられている。ある癌原遺伝
子は本質的に正常な遺伝子生成物の増大した又は抑えら
れた発現に由来する多数のメカニズムを介して、細胞性
癌遺伝子へと活性化されうるものと考えられている。例
えばｍｙｃ遺伝子の種は一定のヒトリンパ腫及び癌腫の
発生及び／又は進行に関連し、そのトランスフォーミン
グ活性化は多数のメカニズムの結果である。他方、その
他の癌原遺伝子は該遺伝子のコード配列における突然変
異を含む多数のメカニズムを介してトランスフォーミン
グ細胞性癌遺伝子へと活性化されるものと考えられてい
る。これはタンパク質のアミノ酸配列における−もしく
は複数の相違の結果としての変異した一次構造及び生物
化学特性を有する遺伝子生成物をもたらす。例えば、最
も一般的な型のヒト悪性腫瘍の原因であるｒａｓ遺伝子
は単一のコドン変化の結果活性化される。
【０００５】癌の治療方法の開発のための研究は一般に
正常細胞と悪性腫瘍細胞との特徴の相違の利用に注目し
ている。突然変異された、転移（トランスロケーショ
ン）された又は過剰発現された癌原遺伝子及びこのよう
な遺伝子の生成物は、正常細胞と悪性腫瘍細胞との間
で、潜在的な同定可能な特徴的相違を示す。この同定で
きる相違は診断アッセイ又は治療方法の開発に利用され
ている。
正常細胞と悪性腫瘍細胞との特徴の相違の利用に注目し
ている。突然変異された、転移（トランスロケーショ
ン）された又は過剰発現された癌原遺伝子及びこのよう
な遺伝子の生成物は、正常細胞と悪性腫瘍細胞との間
で、潜在的な同定可能な特徴的相違を示す。この同定で
きる相違は診断アッセイ又は治療方法の開発に利用され
ている。
【０００６】診断アッセイを開発する手法は、固有の又
は異常な癌遺伝子生成物に対して特異的な抗体を利用し
て、組織又は体液中における癌遺伝子の発現生成物を定
量するように試まれてきた。一般に、異種移植（ｘｅｎ
ｏｇｅｎｉｃ）抗体は異常に発現する癌原遺伝子生成物
に対して作られる。異常癌遺伝子生成物の検出に基づく
診断アッセイの開発における問題は以下の要因を含んで
いる：（１）異常生成物に対する高い特異性、親和性及
び選択性を有する抗体の欠如；（２）微量の異常癌遺伝
子生成物しか腫瘍細胞から放出されないことがあるこ
と；（３）癌遺伝子生成物は腫瘍細胞より断続的にしか
放出されないことがあること；（４）癌遺伝子生成物は
抗体によって体液から排除されるか又は免疫複合体へと
形成されうることがあること；及び（５）遊離抗原は迅
速に清浄化又は分解されうることである。
は異常な癌遺伝子生成物に対して特異的な抗体を利用し
て、組織又は体液中における癌遺伝子の発現生成物を定
量するように試まれてきた。一般に、異種移植（ｘｅｎ
ｏｇｅｎｉｃ）抗体は異常に発現する癌原遺伝子生成物
に対して作られる。異常癌遺伝子生成物の検出に基づく
診断アッセイの開発における問題は以下の要因を含んで
いる：（１）異常生成物に対する高い特異性、親和性及
び選択性を有する抗体の欠如；（２）微量の異常癌遺伝
子生成物しか腫瘍細胞から放出されないことがあるこ
と；（３）癌遺伝子生成物は腫瘍細胞より断続的にしか
放出されないことがあること；（４）癌遺伝子生成物は
抗体によって体液から排除されるか又は免疫複合体へと
形成されうることがあること；及び（５）遊離抗原は迅
速に清浄化又は分解されうることである。
【０００７】癌の診断及び治療への現在の手法における
困難さに原因して、当業界において改善された方法及び
組成物の要望が存在している。本発明はこの要望を満足
せしめ、そして更に他の関連の利点を提供する。
困難さに原因して、当業界において改善された方法及び
組成物の要望が存在している。本発明はこの要望を満足
せしめ、そして更に他の関連の利点を提供する。
【０００８】簡潔に述べると、本発明は活性化癌遺伝子
又は癌関連遺伝子が悪性腫瘍にかかわる温血動物におけ
る悪性腫瘍の検出のための種々の方法を提供する。該方
法は悪性腫瘍が予測される場合に一回限りにて利用され
るか、悪性腫瘍を有する危険性の高い個体をモニターす
るために周期的に利用されうる。ある態様において、該
方法は以下の段階を含んで成る：（ａ）温血動物から単
離せしめたＴ細胞を、悪性腫瘍に関連する活性化癌遺伝
子又は癌関連遺伝子の少なくとも１種類のタンパク質発
現生成物とインキュベートせしめ；そして（ｂ）該Ｔ細
胞の増殖の有無を検出することによって、該悪性腫瘍の
有無を調べる。他の態様において、該方法は以下の段階
を含んで成る：（ａ）悪性腫瘍に関連する活性化癌遺伝
子又は癌関連遺伝子のタンパク質発現生成物に対して特
異的な抗体を含むと予測される体液を、該悪性腫瘍に関
連する活性化癌遺伝子又は癌関連遺伝子の少なくとも１
種類のタンパク質発現生成物と接触させ；（ｂ）該体液
を免疫複合体が形成できる条件及び十分な時間にわたっ
てインキュベートせしめ；そして（ｃ）該タンパク質発
現生成物と該タンパク質発現生成物に対して特異的な体
液中の抗体とで形成される１もしくは複数種の免疫複合
体の有無を検出することにより、該悪性腫瘍の有無を調
べる。
又は癌関連遺伝子が悪性腫瘍にかかわる温血動物におけ
る悪性腫瘍の検出のための種々の方法を提供する。該方
法は悪性腫瘍が予測される場合に一回限りにて利用され
るか、悪性腫瘍を有する危険性の高い個体をモニターす
るために周期的に利用されうる。ある態様において、該
方法は以下の段階を含んで成る：（ａ）温血動物から単
離せしめたＴ細胞を、悪性腫瘍に関連する活性化癌遺伝
子又は癌関連遺伝子の少なくとも１種類のタンパク質発
現生成物とインキュベートせしめ；そして（ｂ）該Ｔ細
胞の増殖の有無を検出することによって、該悪性腫瘍の
有無を調べる。他の態様において、該方法は以下の段階
を含んで成る：（ａ）悪性腫瘍に関連する活性化癌遺伝
子又は癌関連遺伝子のタンパク質発現生成物に対して特
異的な抗体を含むと予測される体液を、該悪性腫瘍に関
連する活性化癌遺伝子又は癌関連遺伝子の少なくとも１
種類のタンパク質発現生成物と接触させ；（ｂ）該体液
を免疫複合体が形成できる条件及び十分な時間にわたっ
てインキュベートせしめ；そして（ｃ）該タンパク質発
現生成物と該タンパク質発現生成物に対して特異的な体
液中の抗体とで形成される１もしくは複数種の免疫複合
体の有無を検出することにより、該悪性腫瘍の有無を調
べる。
【０００９】他の見地において、本発明は活性化癌遺伝
子又は癌関連遺伝子が悪性腫瘍に関連する温血動物にお
ける癌治療の効果をモニターするための方法を提供しう
る。ある態様において、該方法は以下の段階を含んで成
る：（ａ）治療開始前に温血動物から採取した第１体液
試料を、悪性腫瘍に関連する活性化癌遺伝子又は癌関連
遺伝子の少なくとも１種類のタンパク質発現生成物と接
触させ；（ｂ）該体液を免疫複合体が形成できる条件及
び十分な時間にわたってインキュベートせしめ；（ｃ）
該タンパク質発現生成物と該タンパク質発現生成物に対
して特異的な体液中の抗体とで形成される免疫複合体を
検出し；（ｄ）治療を開始した後の該動物から採取した
第２体液試料に基づいて段階（ａ），（ｂ）及び（ｃ）
を繰り返し；そして（ｅ）該第１と第２体液試料におい
て検出される免疫複合体の数を比較し、これによって該
動物における該治療の効果をモニターする。
子又は癌関連遺伝子が悪性腫瘍に関連する温血動物にお
ける癌治療の効果をモニターするための方法を提供しう
る。ある態様において、該方法は以下の段階を含んで成
る：（ａ）治療開始前に温血動物から採取した第１体液
試料を、悪性腫瘍に関連する活性化癌遺伝子又は癌関連
遺伝子の少なくとも１種類のタンパク質発現生成物と接
触させ；（ｂ）該体液を免疫複合体が形成できる条件及
び十分な時間にわたってインキュベートせしめ；（ｃ）
該タンパク質発現生成物と該タンパク質発現生成物に対
して特異的な体液中の抗体とで形成される免疫複合体を
検出し；（ｄ）治療を開始した後の該動物から採取した
第２体液試料に基づいて段階（ａ），（ｂ）及び（ｃ）
を繰り返し；そして（ｅ）該第１と第２体液試料におい
て検出される免疫複合体の数を比較し、これによって該
動物における該治療の効果をモニターする。
【００１０】本発明は活性化癌遺伝子又は癌関連遺伝子
が悪性腫瘍に関連する温血動物における悪性腫瘍の治療
のために方法にも向けられている。ある態様において、
該方法は以下の段階を含んで成る：（ａ）温血動物から
Ｔ細胞を単離し；（ｂ）該Ｔ細胞を悪性腫瘍に関連する
活性化癌遺伝子又は癌関連遺伝子の少なくとも１種のタ
ンパク質発現生成物の存在下においてインキュベートせ
しめて該Ｔ細胞を増殖させ；そして（ｃ）温血動物に有
効量のこの増殖させたＴ細胞を投与せしめる。他の態様
において、該方法は以下の段階を含んで成る：（ａ）温
血動物からＴ細胞を単離し；（ｂ）該Ｔ細胞を悪性腫瘍
に関連する活性化癌遺伝子又は癌関連遺伝子の少なくと
も１種のタンパク質発現生成物の存在下においてインキ
ュベートせしめて該Ｔ細胞を増殖させ；（ｃ）該タンパ
ク質発現生成物の存在下において増殖する１もしくは複
数の種類の細胞をクローン化させ；そして（ｄ）温血動
物に有効量のこのクローン化Ｔ細胞を投与せしめる。第
三の態様において、該方法は動物を悪性腫瘍に関連する
活性化癌遺伝子又は癌関連遺伝子の少なくとも１種のタ
ンパク質発現生成物によって免疫することを含んで成
る。
が悪性腫瘍に関連する温血動物における悪性腫瘍の治療
のために方法にも向けられている。ある態様において、
該方法は以下の段階を含んで成る：（ａ）温血動物から
Ｔ細胞を単離し；（ｂ）該Ｔ細胞を悪性腫瘍に関連する
活性化癌遺伝子又は癌関連遺伝子の少なくとも１種のタ
ンパク質発現生成物の存在下においてインキュベートせ
しめて該Ｔ細胞を増殖させ；そして（ｃ）温血動物に有
効量のこの増殖させたＴ細胞を投与せしめる。他の態様
において、該方法は以下の段階を含んで成る：（ａ）温
血動物からＴ細胞を単離し；（ｂ）該Ｔ細胞を悪性腫瘍
に関連する活性化癌遺伝子又は癌関連遺伝子の少なくと
も１種のタンパク質発現生成物の存在下においてインキ
ュベートせしめて該Ｔ細胞を増殖させ；（ｃ）該タンパ
ク質発現生成物の存在下において増殖する１もしくは複
数の種類の細胞をクローン化させ；そして（ｄ）温血動
物に有効量のこのクローン化Ｔ細胞を投与せしめる。第
三の態様において、該方法は動物を悪性腫瘍に関連する
活性化癌遺伝子又は癌関連遺伝子の少なくとも１種のタ
ンパク質発現生成物によって免疫することを含んで成
る。
【００１１】関連する見地において、本発明は抗癌治療
組成物であって、悪性腫瘍に関連する活性化癌遺伝子又
は癌関連遺伝子の少なくとも１種のタンパク質発現生成
物の存在下において増殖せしめたＴ細胞を、生理学的に
受け入れられている担体又は希釈剤と組合せて含んで成
る組成物を提供する。このようなＴ細胞は温血動物にお
ける悪性腫瘍の処理のための医薬品の製造において有用
である。
組成物であって、悪性腫瘍に関連する活性化癌遺伝子又
は癌関連遺伝子の少なくとも１種のタンパク質発現生成
物の存在下において増殖せしめたＴ細胞を、生理学的に
受け入れられている担体又は希釈剤と組合せて含んで成
る組成物を提供する。このようなＴ細胞は温血動物にお
ける悪性腫瘍の処理のための医薬品の製造において有用
である。
【００１２】本発明を記載する前に、その理解に役立つ
ために本明細書に用いる一定の語の定義を記載する。
ために本明細書に用いる一定の語の定義を記載する。
【００１３】活性化癌遺伝子−本明細書では、活性化さ
れた癌原遺伝子であって、正常な癌原遺伝子によって発
現されるタンパク質生成物のアミノ酸配列以外のアミノ
酸配列を有するタンパク質生成物の発現をもたらすもの
を称する。
れた癌原遺伝子であって、正常な癌原遺伝子によって発
現されるタンパク質生成物のアミノ酸配列以外のアミノ
酸配列を有するタンパク質生成物の発現をもたらすもの
を称する。
【００１４】癌関連遺伝子−本明細書では、悪性腫瘍表
現型の発現又は維持に関連する任意の変異した遺伝子
（癌遺伝子以外）に関する。このような変異遺伝子の例
にはｐ５３腫瘍サプレッサー遺伝子の突然変異体が含ま
れる。
現型の発現又は維持に関連する任意の変異した遺伝子
（癌遺伝子以外）に関する。このような変異遺伝子の例
にはｐ５３腫瘍サプレッサー遺伝子の突然変異体が含ま
れる。
【００１５】タンパク質発現生成物−本明細書では、タ
ンパク質、ポリペプチド及びペプチドを含み；そして完
全分子、そのフラグメント、又はその機能的な同等物で
あってよく；そして遺伝子操作されていてもよい。
ンパク質、ポリペプチド及びペプチドを含み；そして完
全分子、そのフラグメント、又はその機能的な同等物で
あってよく；そして遺伝子操作されていてもよい。
【００１６】Ｔ細胞の増殖−本明細書では、Ｔ細胞の増
殖及び増殖をもたらすＴ細胞の刺激、即ち、有糸分裂を
もたらす現象の開始及び有糸分裂そのものを含んでい
る。Ｔ細胞の増殖を検出する方法は以下に詳細してあ
る。
殖及び増殖をもたらすＴ細胞の刺激、即ち、有糸分裂を
もたらす現象の開始及び有糸分裂そのものを含んでい
る。Ｔ細胞の増殖を検出する方法は以下に詳細してあ
る。
【００１７】前記した通り、本発明は活性化癌遺伝子又
は癌関連遺伝子が悪性腫瘍に関連する温血動物における
悪性腫瘍を診断する、モニターする、及び治療するため
の方法並びに組成物に関する。本発明が開示するには、
活性化癌遺伝子及び癌関連遺伝子のタンパク質発現生成
物は胸腺依存性リンパ球（以降「Ｔ細胞」）によって認
識されることができ、従って、このようなタンパク質発
現生成物を発現する悪性腫瘍の診断及び処置のために自
発性免疫応答を利用することができる。
は癌関連遺伝子が悪性腫瘍に関連する温血動物における
悪性腫瘍を診断する、モニターする、及び治療するため
の方法並びに組成物に関する。本発明が開示するには、
活性化癌遺伝子及び癌関連遺伝子のタンパク質発現生成
物は胸腺依存性リンパ球（以降「Ｔ細胞」）によって認
識されることができ、従って、このようなタンパク質発
現生成物を発現する悪性腫瘍の診断及び処置のために自
発性免疫応答を利用することができる。
【００１８】癌原遺伝子の活性化は、悪性腫瘍表現型へ
の形質転換及び発現に関与するか又はそれをもたらす。
突然変異又は染色体転移（遺伝子転位）のようなメカニ
ズムによる活性化は、変異した一次構造を有する遺伝子
生成物、即ち、癌原遺伝子によって発現される正常タン
パク質と比較して、もしくは複数のアミノ酸が異なって
いるタンパク質発現生成物を生じせしめる。突然変異の
メカニズムはヌクレオチドの点突然変異、組換え、欠失
及び挿入を含む。突然変異を介する癌原遺伝子の活性化
の例はｒａｓ及びｎｅｕ癌原遺伝子の活性化が含まれ
る。染色体転移は例えば慢性骨髄性白血病に関連する融
合タンパク質をもたらす。同様に、癌関連遺伝子は変異
したアミノ酸配列を有する異常なタンパク質生成物を発
現する。例えば、ｐ５３腫瘍サップレッサー遺伝子の突
然変異はアミノ酸の置換をもたらす。
の形質転換及び発現に関与するか又はそれをもたらす。
突然変異又は染色体転移（遺伝子転位）のようなメカニ
ズムによる活性化は、変異した一次構造を有する遺伝子
生成物、即ち、癌原遺伝子によって発現される正常タン
パク質と比較して、もしくは複数のアミノ酸が異なって
いるタンパク質発現生成物を生じせしめる。突然変異の
メカニズムはヌクレオチドの点突然変異、組換え、欠失
及び挿入を含む。突然変異を介する癌原遺伝子の活性化
の例はｒａｓ及びｎｅｕ癌原遺伝子の活性化が含まれ
る。染色体転移は例えば慢性骨髄性白血病に関連する融
合タンパク質をもたらす。同様に、癌関連遺伝子は変異
したアミノ酸配列を有する異常なタンパク質生成物を発
現する。例えば、ｐ５３腫瘍サップレッサー遺伝子の突
然変異はアミノ酸の置換をもたらす。
【００１９】本発明において開示の通り、活性化癌遺伝
子及び癌関連遺伝子によって発現される、変異した一次
構造を有するタンパク質生成物はＴ細胞によって認識さ
れる。このような異常タンパク質発現生成物は細胞内で
「変化」する。即ち、タンパク質が合成され、機能し、
その後分解し、そして新しく合成される分子で置き代わ
られる周期を経る。分解したタンパク質に由来するペプ
チドフラグメントは主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）抗
原に結合する。細胞表層上のＭＨＣ抗原に結合している
異常ペプチドが見い出せること、及び宿主Ｔ細胞によっ
て異常ペプチドと自己ＭＨＣ抗原との組合せが認識され
ることにより、悪性腫瘍細胞はＴ細胞の免疫原であろ
う。Ｔ細胞レセプターの鋭敏な特異性は、単独のアミノ
酸残基により相違するタンパク質のフラグメント間の区
別を個々のＴ細胞ができるようにする。
子及び癌関連遺伝子によって発現される、変異した一次
構造を有するタンパク質生成物はＴ細胞によって認識さ
れる。このような異常タンパク質発現生成物は細胞内で
「変化」する。即ち、タンパク質が合成され、機能し、
その後分解し、そして新しく合成される分子で置き代わ
られる周期を経る。分解したタンパク質に由来するペプ
チドフラグメントは主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）抗
原に結合する。細胞表層上のＭＨＣ抗原に結合している
異常ペプチドが見い出せること、及び宿主Ｔ細胞によっ
て異常ペプチドと自己ＭＨＣ抗原との組合せが認識され
ることにより、悪性腫瘍細胞はＴ細胞の免疫原であろ
う。Ｔ細胞レセプターの鋭敏な特異性は、単独のアミノ
酸残基により相違するタンパク質のフラグメント間の区
別を個々のＴ細胞ができるようにする。
【００２０】異常ペプチドに対する免疫応答の際、ペプ
チド−ＭＨＣ複合体への高い親和結合性を有するＴ細胞
レセプターを示すＴ細胞はこのペプチド−ＭＨＣ複合体
と結合し、従って活性化されて増殖を誘発せしめる。異
常ペプチドとの第１の接触において、少量の免疫Ｔ細胞
が増殖してエフェクターＴ細胞及び記憶Ｔ細胞へと分化
するであろう。この第１の免疫応答は生体内では生ずる
が、試験管内では検出されない。記憶Ｔ細胞による同一
の抗原とのその後の接触はより迅速且つより強い免疫応
答をもたらすであろう。この第２応答は生体内でも試験
管内でも起きうる。試験管内応答は、抗原に再暴露せし
めたＴ細胞集団の増殖の程度を調べることによって容易
に測定できる。特定の抗原に応答性のＴ細胞集団の増殖
は抗原に対する第一の暴露又は感作の指標と考えられ
る。
チド−ＭＨＣ複合体への高い親和結合性を有するＴ細胞
レセプターを示すＴ細胞はこのペプチド−ＭＨＣ複合体
と結合し、従って活性化されて増殖を誘発せしめる。異
常ペプチドとの第１の接触において、少量の免疫Ｔ細胞
が増殖してエフェクターＴ細胞及び記憶Ｔ細胞へと分化
するであろう。この第１の免疫応答は生体内では生ずる
が、試験管内では検出されない。記憶Ｔ細胞による同一
の抗原とのその後の接触はより迅速且つより強い免疫応
答をもたらすであろう。この第２応答は生体内でも試験
管内でも起きうる。試験管内応答は、抗原に再暴露せし
めたＴ細胞集団の増殖の程度を調べることによって容易
に測定できる。特定の抗原に応答性のＴ細胞集団の増殖
は抗原に対する第一の暴露又は感作の指標と考えられ
る。
【００２１】本発明のある見地において、活性化癌遺伝
子又は癌関連遺伝子が悪性腫瘍に関連する悪性腫瘍が検
出されうる。活性化癌遺伝子又は癌関連遺伝子により発
現される異常タンパク質に対する応答が一度発生した
ら、該タンパク質が検査時に体内に存在しようが存在し
ていないが関係なく、免疫後長期間存続し且つ長期間検
出されうる。ある態様において、温血動物、例えばヒト
の活性化癌遺伝子又は癌関連遺伝子への一次暴露はＴ細
胞増殖応答の有無を検査することによって検出できる。
より詳しくは、常用の技術によって個体から単離したＴ
細胞を活性化癌遺伝子又は癌関連遺伝子のタンパク質発
現生成物とインキュベートせしめる。癌遺伝子の例に
は、ｒａｓ，ｓｒｃ，ａｂｌ，ｆｇｒ，ｒｅｌ，ｙｅ
ｓ，ｆｅｓ，ｎｅｔ，ｍｏｓ，ｒａｆ，ｅｒｂＢ，ｅｒ
ｂＡ，ｆｍｓ．ｎｅｕ，ｒｏｓ，ｋｉｔ，ｓｅａ，ｓｉ
ｓ，ｍｙｃ，ｍｙｂ，ｆｏｓ，ｓｋｉ，ｊｕｎ及びｅｔ
ｓが含まれる。他方、複数の種類のタンパク質発現生成
物がＴ細胞試料によって検査できる。もしあるタンパク
質が他のタンパク質発現生成物を妨害するなら、小分け
した個々のＴ細胞試料をこのような１種のタンパク質発
現生成物のみとインキュベートすることが所望されう
る。
子又は癌関連遺伝子が悪性腫瘍に関連する悪性腫瘍が検
出されうる。活性化癌遺伝子又は癌関連遺伝子により発
現される異常タンパク質に対する応答が一度発生した
ら、該タンパク質が検査時に体内に存在しようが存在し
ていないが関係なく、免疫後長期間存続し且つ長期間検
出されうる。ある態様において、温血動物、例えばヒト
の活性化癌遺伝子又は癌関連遺伝子への一次暴露はＴ細
胞増殖応答の有無を検査することによって検出できる。
より詳しくは、常用の技術によって個体から単離したＴ
細胞を活性化癌遺伝子又は癌関連遺伝子のタンパク質発
現生成物とインキュベートせしめる。癌遺伝子の例に
は、ｒａｓ，ｓｒｃ，ａｂｌ，ｆｇｒ，ｒｅｌ，ｙｅ
ｓ，ｆｅｓ，ｎｅｔ，ｍｏｓ，ｒａｆ，ｅｒｂＢ，ｅｒ
ｂＡ，ｆｍｓ．ｎｅｕ，ｒｏｓ，ｋｉｔ，ｓｅａ，ｓｉ
ｓ，ｍｙｃ，ｍｙｂ，ｆｏｓ，ｓｋｉ，ｊｕｎ及びｅｔ
ｓが含まれる。他方、複数の種類のタンパク質発現生成
物がＴ細胞試料によって検査できる。もしあるタンパク
質が他のタンパク質発現生成物を妨害するなら、小分け
した個々のＴ細胞試料をこのような１種のタンパク質発
現生成物のみとインキュベートすることが所望されう
る。
【００２２】Ｔ細胞の増殖の検出は種々の既知の技術に
よって成し遂げられる。例えば、Ｔ細胞増殖はＤＮＡ合
成のレートを測定することによって検出できる。増殖す
るように刺激されたＴ細胞は高められたレートのＤＮＡ
合成を示す。ＤＮＡ合成のレートを測定するための典型
的な方法は例えばＴ細胞をトリチウム化チミジン、即ち
新しく合成されるＤＮＡに組込まれるヌクレオシド先駆
体とパルス標識培養することである。組込まれるトリチ
ウム化チミジンの量は液体シンチレーション光度計を用
いて測定できる。Ｔ細胞増殖を検出するためのその他の
方法には、インターロイキン−２（ＩＬ−２）生産性、
Ｃａ2+流出又は色素、例えば３−（４，５−ジメチルチ
アゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−テトラゾ
リウムの取込みの増大を測定することが含まれる。
よって成し遂げられる。例えば、Ｔ細胞増殖はＤＮＡ合
成のレートを測定することによって検出できる。増殖す
るように刺激されたＴ細胞は高められたレートのＤＮＡ
合成を示す。ＤＮＡ合成のレートを測定するための典型
的な方法は例えばＴ細胞をトリチウム化チミジン、即ち
新しく合成されるＤＮＡに組込まれるヌクレオシド先駆
体とパルス標識培養することである。組込まれるトリチ
ウム化チミジンの量は液体シンチレーション光度計を用
いて測定できる。Ｔ細胞増殖を検出するためのその他の
方法には、インターロイキン−２（ＩＬ−２）生産性、
Ｃａ2+流出又は色素、例えば３−（４，５−ジメチルチ
アゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−テトラゾ
リウムの取込みの増大を測定することが含まれる。
【００２３】Ｔ細胞を免疫化できるタンパク質生成物を
発現する活性化癌遺伝子の代表例はｒａｓ癌遺伝子であ
る。Ｒａｓ癌原遺伝子は高い率で保存される種類の包括
的にｐ「２１」と称される２１ｋｄのタンパク質（長さ
１８９個のアミノ酸）をコードする遺伝子である。ｐ２
１タンパク質は細胞膜の内側に結合し、グアノシンヌク
レオチドと一体化し、そして固有のＧＴＰａｓｅ活性を
有する。ｐ２１タンパク質は細胞増殖及び分化を調節す
る重要な仲介シグナルタンパク質として考えられてい
る。Ｒａｓ癌遺伝子はまずトランスフォーミングハービ
ーとカーステン（Ｈａｒｖｅｙ ａｎｄ Ｋｉｒｓｔｅ
ｎ）ネズミ肉腫レトロウイルスにおける遺伝子物質とし
て検出される。動物において、発癌物質は非常に特異的
且つ予想できる突然変異を、通常はｐ２１分子の固有Ｇ
ＴＰａｓｅ活性に損傷を与え、そしてトランスフォーミ
ング活性を授けるようなコドン１２，１３，５９及び／
又は６１を包含する突然変異を誘発する。ヒトゲノムは
Ｋ−ｒａｓ，Ｈ−ｒａｓ及びＮ−ｒａｓとして知られる
ウイルスｒａｓ癌遺伝子の少なくとも３種のｒａｓ癌原
遺伝子類似体を含み、これらは３種の別々のヒト染色体
上にある。この３種のうちの１種のｒａｓ癌原遺伝子の
突然変異は、膵臓腺癌、甲状腺濾泡状癌、結腸腺癌、セ
ミノーマ、肺腺癌、肝臓腺癌、黒色腫、骨髄性白血病及
び骨髄腫を含む種々の悪性疾患において一般に生ずる。
本発明の開示は、この３種のｒａｓ遺伝子のうちのいづ
れもの発現タンパク質生成物が一度突然変異されたら単
一のアミノ酸置換によって自発性Ｔ細胞によって認識さ
れうることを示す。
発現する活性化癌遺伝子の代表例はｒａｓ癌遺伝子であ
る。Ｒａｓ癌原遺伝子は高い率で保存される種類の包括
的にｐ「２１」と称される２１ｋｄのタンパク質（長さ
１８９個のアミノ酸）をコードする遺伝子である。ｐ２
１タンパク質は細胞膜の内側に結合し、グアノシンヌク
レオチドと一体化し、そして固有のＧＴＰａｓｅ活性を
有する。ｐ２１タンパク質は細胞増殖及び分化を調節す
る重要な仲介シグナルタンパク質として考えられてい
る。Ｒａｓ癌遺伝子はまずトランスフォーミングハービ
ーとカーステン（Ｈａｒｖｅｙ ａｎｄ Ｋｉｒｓｔｅ
ｎ）ネズミ肉腫レトロウイルスにおける遺伝子物質とし
て検出される。動物において、発癌物質は非常に特異的
且つ予想できる突然変異を、通常はｐ２１分子の固有Ｇ
ＴＰａｓｅ活性に損傷を与え、そしてトランスフォーミ
ング活性を授けるようなコドン１２，１３，５９及び／
又は６１を包含する突然変異を誘発する。ヒトゲノムは
Ｋ−ｒａｓ，Ｈ−ｒａｓ及びＮ−ｒａｓとして知られる
ウイルスｒａｓ癌遺伝子の少なくとも３種のｒａｓ癌原
遺伝子類似体を含み、これらは３種の別々のヒト染色体
上にある。この３種のうちの１種のｒａｓ癌原遺伝子の
突然変異は、膵臓腺癌、甲状腺濾泡状癌、結腸腺癌、セ
ミノーマ、肺腺癌、肝臓腺癌、黒色腫、骨髄性白血病及
び骨髄腫を含む種々の悪性疾患において一般に生ずる。
本発明の開示は、この３種のｒａｓ遺伝子のうちのいづ
れもの発現タンパク質生成物が一度突然変異されたら単
一のアミノ酸置換によって自発性Ｔ細胞によって認識さ
れうることを示す。
【００２４】例えば本発明において、ｐ２１の残基５−
１６，５−１７又は４−１６由来のアミノ酸配列に相当
する１２個又は１３個のアミノ酸残基より成るペプチド
を、正常グリシン（Ｇｌｙ−１２又はＧ−１２と称
す）、又はアルギニン（Ａｒｇ−１２又はＲ−１２と称
す）、又はセリン（Ｓｅｒ−１２又はＳ−１２と称す）
のいづれかを含むように作製する。Ｃ５７ＢＬ／６マウ
スをＡｒｇ−１２ペプチドの単独投与によって免疫す
る。免疫化マウス由来のリンパ球をその後試験管内で上
記のペプチドに対する増大応答について試験し、そして
図１に示す通り、それらはＡｒｇ−１２ペプチドに対し
て特異的に応答して増殖するがＧｌｙ−１２，Ｃｙｓ−
１２又はＳｅｒ−１２ペプチドに対しては応答性でない
ことが見い出せた。更に、Ａｒｇ−１２ペプチドによっ
て免疫したマウス由来のリンパ球は、同一のアミノ酸置
換を含む完全ｐ２１タンパク質（Oncogene Science, In
c., Mahasset, New York）による刺激に特異的に応答し
て増殖することが示された（図３）。
１６，５−１７又は４−１６由来のアミノ酸配列に相当
する１２個又は１３個のアミノ酸残基より成るペプチド
を、正常グリシン（Ｇｌｙ−１２又はＧ−１２と称
す）、又はアルギニン（Ａｒｇ−１２又はＲ−１２と称
す）、又はセリン（Ｓｅｒ−１２又はＳ−１２と称す）
のいづれかを含むように作製する。Ｃ５７ＢＬ／６マウ
スをＡｒｇ−１２ペプチドの単独投与によって免疫す
る。免疫化マウス由来のリンパ球をその後試験管内で上
記のペプチドに対する増大応答について試験し、そして
図１に示す通り、それらはＡｒｇ−１２ペプチドに対し
て特異的に応答して増殖するがＧｌｙ−１２，Ｃｙｓ−
１２又はＳｅｒ−１２ペプチドに対しては応答性でない
ことが見い出せた。更に、Ａｒｇ−１２ペプチドによっ
て免疫したマウス由来のリンパ球は、同一のアミノ酸置
換を含む完全ｐ２１タンパク質（Oncogene Science, In
c., Mahasset, New York）による刺激に特異的に応答し
て増殖することが示された（図３）。
【００２５】本発明において適切な他の例のペプチドは
ｒａｓ ｐ５４−６６〔Ｌ６１〕である。このペプチド
はｐ２１の残基５４−６６からのアミノ酸配列に相当す
る１３個のアミノ酸残基より成り、但し位置６１にて通
常見い出せるグルタミン（Ｑ）がロイシン（Ｌ）に置換
されている。ｐ５４−６６〔Ｌ６１〕によって免疫した
マウス由来のリンパ球は図４において示す通り、試験管
内で、Ｇｌｎ−６１又はＬｓｙ−６１ペプチドに対して
ではなく、Ｌｅｕ−６１ペプチドに対して特異的に応答
して増殖することが見い出せた。更に、Ｌｅｕ−６１ペ
プチドにより免疫したマウス由来のリンパ球は同一のア
ミノ酸置換を含む完全ｐ２１タンパク質による刺激に特
異的に応答して増殖することが見い出せた。
ｒａｓ ｐ５４−６６〔Ｌ６１〕である。このペプチド
はｐ２１の残基５４−６６からのアミノ酸配列に相当す
る１３個のアミノ酸残基より成り、但し位置６１にて通
常見い出せるグルタミン（Ｑ）がロイシン（Ｌ）に置換
されている。ｐ５４−６６〔Ｌ６１〕によって免疫した
マウス由来のリンパ球は図４において示す通り、試験管
内で、Ｇｌｎ−６１又はＬｓｙ−６１ペプチドに対して
ではなく、Ｌｅｕ−６１ペプチドに対して特異的に応答
して増殖することが見い出せた。更に、Ｌｅｕ−６１ペ
プチドにより免疫したマウス由来のリンパ球は同一のア
ミノ酸置換を含む完全ｐ２１タンパク質による刺激に特
異的に応答して増殖することが見い出せた。
【００２６】同様に、ｐ２１以外のタンパク質（又はそ
れを基礎とするペプチドもしくはその誘導体）は種々の
既知の技術によって単離又は作製されうる。当業者に理
解されている通り、Ｔ細胞応答の誘発を促進させるため
にペプチド全体の長さ又は天然のフランキング領域の長
さを長くすることが所望されうる。前記した通り、ｒａ
ｓ以外の活性化癌遺伝子又は癌関連遺伝子（即ち、正常
な癌原遺伝子又は正常遺伝子により発現されるタンパク
質のアミノ酸配列と異なるものを有すもの）のタンパク
質発現生成物は本明書詳細の方法において用いるのに適
している。
れを基礎とするペプチドもしくはその誘導体）は種々の
既知の技術によって単離又は作製されうる。当業者に理
解されている通り、Ｔ細胞応答の誘発を促進させるため
にペプチド全体の長さ又は天然のフランキング領域の長
さを長くすることが所望されうる。前記した通り、ｒａ
ｓ以外の活性化癌遺伝子又は癌関連遺伝子（即ち、正常
な癌原遺伝子又は正常遺伝子により発現されるタンパク
質のアミノ酸配列と異なるものを有すもの）のタンパク
質発現生成物は本明書詳細の方法において用いるのに適
している。
【００２７】治療目的のため、活性化癌遺伝子又は癌関
連遺伝子の１もしくは複数種のタンパク質発現生成物の
存在下において増殖するＴ細胞を試験管内又は生体体に
おいて増加させることができる。試験管内でのこのよう
なＴ細胞の増殖は種々の方法において成し遂げることが
できる。例えば、Ｔ細胞を１もしくは複数種のタンパク
質発現生成物に再暴露せしめてよい。増殖を誘発せしめ
るために該タンパク質へのＴ細胞の暴露の反復が所望さ
れうる。図２に示す通り、タンパク質発現生成物に特異
的なＴ細胞は試験管内で、免疫用ペプチドによる断続的
刺激に応答して特異性を保持しながら大量の数へと増殖
することができる。
連遺伝子の１もしくは複数種のタンパク質発現生成物の
存在下において増殖するＴ細胞を試験管内又は生体体に
おいて増加させることができる。試験管内でのこのよう
なＴ細胞の増殖は種々の方法において成し遂げることが
できる。例えば、Ｔ細胞を１もしくは複数種のタンパク
質発現生成物に再暴露せしめてよい。増殖を誘発せしめ
るために該タンパク質へのＴ細胞の暴露の反復が所望さ
れうる。図２に示す通り、タンパク質発現生成物に特異
的なＴ細胞は試験管内で、免疫用ペプチドによる断続的
刺激に応答して特異性を保持しながら大量の数へと増殖
することができる。
【００２８】他方、タンパク質発現の存在下において増
殖するしもしくは複数種のＴ細胞をクローニングによっ
て増やすこともできる。細胞をクローニングする方法は
当業界によく知られている。例えば、Ｔ細胞系を試験管
内で樹立し、そして限界希釈によってクローン化せしめ
ることができる。応答性Ｔ細胞を感作せしめた患者の末
梢血液より密度勾配遠心、次いでヒツジ赤血球ロゼッテ
ィングによって精製し、そして照射せしめた自己充填
（ｆｉｌｌｅｒ）細胞の存在下において正常抗原によっ
て刺激せしめることにより培養物において樹立させる。
ＣＤ４＋Ｔ細胞系を作るため、関連のアミノ酸置換を有
する完全ｒａｓ ｐ２１タンパク質を抗原刺激剤として
用い、そしてエプスタイン−バ−ウイルスによる感染に
よって不朽化せしめた自己末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）
又はリンパ芽球細胞系（ＬＣＬ）を抗原提供細胞として
用いた。ＣＤ８＋Ｔ細胞系を作るため、関連の突然変異
ｒａｓ ｐ２１タンパク質を生産する発現ベクターによ
ってトランスフェクトした自己抗原−提供細胞を刺激細
胞として用いた。抗原刺激に次いで樹立Ｔ細胞系を、９
６穴平底プレートにおいて、１ウェル当り０．５個の細
胞の頻度にて刺激化Ｔ細胞を、１×１０6 個の照射せし
めたＢＬ又はＬＣＬ細胞及び組換インターロイキン２
（ｒＩＬ２）（５０Ｕ／ml）と一緒に培養し、２〜４日
間クローン化させた。樹立したクローナル増殖を有する
ウェルが培養してから約２〜３週間後に同定され、そし
てこれを自己抗原−提供細胞の存在下において適当な抗
原によって再刺激せしめ、次いで抗原刺激の２〜３日後
に低投与量のｒＩＬ２（１０Ｕ／ml）の添加によって増
殖せしめた。Ｔ細胞クローンを約２週間ごとに抗原及び
ｒＩＬ２による周期的再刺激によって２４穴プレートの
中で維持せしめた。
殖するしもしくは複数種のＴ細胞をクローニングによっ
て増やすこともできる。細胞をクローニングする方法は
当業界によく知られている。例えば、Ｔ細胞系を試験管
内で樹立し、そして限界希釈によってクローン化せしめ
ることができる。応答性Ｔ細胞を感作せしめた患者の末
梢血液より密度勾配遠心、次いでヒツジ赤血球ロゼッテ
ィングによって精製し、そして照射せしめた自己充填
（ｆｉｌｌｅｒ）細胞の存在下において正常抗原によっ
て刺激せしめることにより培養物において樹立させる。
ＣＤ４＋Ｔ細胞系を作るため、関連のアミノ酸置換を有
する完全ｒａｓ ｐ２１タンパク質を抗原刺激剤として
用い、そしてエプスタイン−バ−ウイルスによる感染に
よって不朽化せしめた自己末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）
又はリンパ芽球細胞系（ＬＣＬ）を抗原提供細胞として
用いた。ＣＤ８＋Ｔ細胞系を作るため、関連の突然変異
ｒａｓ ｐ２１タンパク質を生産する発現ベクターによ
ってトランスフェクトした自己抗原−提供細胞を刺激細
胞として用いた。抗原刺激に次いで樹立Ｔ細胞系を、９
６穴平底プレートにおいて、１ウェル当り０．５個の細
胞の頻度にて刺激化Ｔ細胞を、１×１０6 個の照射せし
めたＢＬ又はＬＣＬ細胞及び組換インターロイキン２
（ｒＩＬ２）（５０Ｕ／ml）と一緒に培養し、２〜４日
間クローン化させた。樹立したクローナル増殖を有する
ウェルが培養してから約２〜３週間後に同定され、そし
てこれを自己抗原−提供細胞の存在下において適当な抗
原によって再刺激せしめ、次いで抗原刺激の２〜３日後
に低投与量のｒＩＬ２（１０Ｕ／ml）の添加によって増
殖せしめた。Ｔ細胞クローンを約２週間ごとに抗原及び
ｒＩＬ２による周期的再刺激によって２４穴プレートの
中で維持せしめた。
【００２９】個々のＴ細胞をどのようにして試験管内で
増殖せしめるかにかかわらず、このＴ細胞を腫瘍に対す
る治療的攻撃のために個体に投与せしめることができ
る。従って、患者自身のＴ細胞（自己Ｔ細胞）が特異的
な腫瘍の治療を仲介するための試薬として利用できる。
典型的には、約１×１０9 〜１×１０11個のＴ細胞／Ｍ
2 が静脈内又は腔内、例えば胸膜もしくは腹膜腔内にお
いて、又は切除せしめた腫瘍の床に投与されるであろ
う。当業界者に明らかな通り、投与の回数及び頻度は患
者の応答に依存するであろう。Ｔ細胞のための適切な担
体又は希釈剤は生理食塩水又は血清を含む。この組成物
は除菌状態において調製すべきことが当業者には理解さ
れるであろう。
増殖せしめるかにかかわらず、このＴ細胞を腫瘍に対す
る治療的攻撃のために個体に投与せしめることができ
る。従って、患者自身のＴ細胞（自己Ｔ細胞）が特異的
な腫瘍の治療を仲介するための試薬として利用できる。
典型的には、約１×１０9 〜１×１０11個のＴ細胞／Ｍ
2 が静脈内又は腔内、例えば胸膜もしくは腹膜腔内にお
いて、又は切除せしめた腫瘍の床に投与されるであろ
う。当業界者に明らかな通り、投与の回数及び頻度は患
者の応答に依存するであろう。Ｔ細胞のための適切な担
体又は希釈剤は生理食塩水又は血清を含む。この組成物
は除菌状態において調製すべきことが当業者には理解さ
れるであろう。
【００３０】Ｔ細胞は生体内でも増殖できうる。例え
ば、活性化癌遺伝子又は癌関連遺伝子の１もしくは複数
種のタンパク質発現生成物による個体の免疫化は、腫瘍
への治療的攻撃のために必要とされるＴ細胞の数の連続
増殖を誘発せしめることができる。該タンパク質発現生
成物を繰り返し投与することが所望されうる。
ば、活性化癌遺伝子又は癌関連遺伝子の１もしくは複数
種のタンパク質発現生成物による個体の免疫化は、腫瘍
への治療的攻撃のために必要とされるＴ細胞の数の連続
増殖を誘発せしめることができる。該タンパク質発現生
成物を繰り返し投与することが所望されうる。
【００３１】本発明は更に、活性化癌遺伝子又は癌関連
遺伝子のタンパク質発現生成物がＴ細胞に対して免疫原
となることの他に、これらのタンパク質を認識すること
ができる抗体を作るようにＢ−細胞を刺激せしめること
を開示する。このような抗体の検出は、活性化癌遺伝子
又は癌関連遺伝子が悪性腫瘍に関連する悪性腫瘍の診断
のための他の方法を提供する。１もしくは複数種のタン
パク質発現生成物に対する抗体の特異性（即ち、約１０
7 リットル／モル以上の結合親和性を示す）が、血清及
び腹水を含む種々の体液において見い出せうる。タンパ
ク質発現生成物と該タンパク質に特異的な抗体とで形成
される１もしくは複数種の免疫複合体の検出は種々の既
知の技術、例えば放射性イムノアッセイ（ＲＩＡ）及び
酵素結合免疫収着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって成し
遂げられる。
遺伝子のタンパク質発現生成物がＴ細胞に対して免疫原
となることの他に、これらのタンパク質を認識すること
ができる抗体を作るようにＢ−細胞を刺激せしめること
を開示する。このような抗体の検出は、活性化癌遺伝子
又は癌関連遺伝子が悪性腫瘍に関連する悪性腫瘍の診断
のための他の方法を提供する。１もしくは複数種のタン
パク質発現生成物に対する抗体の特異性（即ち、約１０
7 リットル／モル以上の結合親和性を示す）が、血清及
び腹水を含む種々の体液において見い出せうる。タンパ
ク質発現生成物と該タンパク質に特異的な抗体とで形成
される１もしくは複数種の免疫複合体の検出は種々の既
知の技術、例えば放射性イムノアッセイ（ＲＩＡ）及び
酵素結合免疫収着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって成し
遂げられる。
【００３２】適切なイムノアッセイにはＤａｖｉｄら
（米国特許、第4,376,110 号）の二重モノクローナル抗
体サンドイッチアッセイ法；モノクローナル−ポリクロ
ーナル抗体サンドイッチアッセイ（Wideらの、Kirkham
とHunter編、RadioimmunoassayMethods，E and S. Livi
ngstone, E dinburgh, 1970);Gordonら（米国特許第4,4
52,901 号）の「ウェスタンブロット」法；標識リガン
ドの免疫沈殿（Brown ら、J. Biol. Chem. 255：4980
-4983, 1980)；例えばRainesとRoss (J.Biol. Chem.
257 ：5154-5160, 1982)に詳細の酵素結合免疫収着アッ
セイ；蛍光色素の利用を含む免疫細胞化学法（Brooks
ら、Clin. Exp. lmmunol. 39：477, 1980)；及び活性の
中和化〔Bowen-Popeら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8
1 ：2396-2400 (1984)〕が挙げられ、これらは全て本明
細書に参考文献として組入れている。上記のイムノアッ
セイの他に、多数のその他のイムノアッセイが有用であ
り、米国特許の第3,817,827 号；第3,850,752 号；第3,
901,654 号；第3,935,074 号；第3,984,533 号；第3,99
6,345 号；第4,034,074 号；及び第4,098,876 号に詳細
のものが含まれ、これらは全て本明細書に参考文献とし
て組入れている。
（米国特許、第4,376,110 号）の二重モノクローナル抗
体サンドイッチアッセイ法；モノクローナル−ポリクロ
ーナル抗体サンドイッチアッセイ（Wideらの、Kirkham
とHunter編、RadioimmunoassayMethods，E and S. Livi
ngstone, E dinburgh, 1970);Gordonら（米国特許第4,4
52,901 号）の「ウェスタンブロット」法；標識リガン
ドの免疫沈殿（Brown ら、J. Biol. Chem. 255：4980
-4983, 1980)；例えばRainesとRoss (J.Biol. Chem.
257 ：5154-5160, 1982)に詳細の酵素結合免疫収着アッ
セイ；蛍光色素の利用を含む免疫細胞化学法（Brooks
ら、Clin. Exp. lmmunol. 39：477, 1980)；及び活性の
中和化〔Bowen-Popeら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8
1 ：2396-2400 (1984)〕が挙げられ、これらは全て本明
細書に参考文献として組入れている。上記のイムノアッ
セイの他に、多数のその他のイムノアッセイが有用であ
り、米国特許の第3,817,827 号；第3,850,752 号；第3,
901,654 号；第3,935,074 号；第3,984,533 号；第3,99
6,345 号；第4,034,074 号；及び第4,098,876 号に詳細
のものが含まれ、これらは全て本明細書に参考文献とし
て組入れている。
【００３３】検出目的のために、該タンパク質発現生成
物（「抗原」）は標識又は未標識のいづれかでありう
る。未標識の場合、該抗原は凝集アッセイにおける利用
が見い出せる。更に、未標識抗原は免疫複合体と反応性
である標識分子との組合せ、又は該タンパク質発現生成
物に対して特異的な抗体と反応性である標識抗体（第２
抗体）、例えばイムノグロブリンに対して特異的な抗体
との組合せにおいて利用されうる。他方、該抗原を直接
標識せしめてもよい。それらが標識されている場合、こ
のリポーター基にはラジオアイソトープ、蛍光物質、酵
素、ルミネッサー又は色素粒子が含まれることができ
る。このような及びその他の標識物質は当業界によく知
られ、そして例えば以下の米国特許：第3,766,162 号；
第3,791,932号；第3,817,837 号；第3,996,345 号；及
び第4,233,402 号に詳細されている。
物（「抗原」）は標識又は未標識のいづれかでありう
る。未標識の場合、該抗原は凝集アッセイにおける利用
が見い出せる。更に、未標識抗原は免疫複合体と反応性
である標識分子との組合せ、又は該タンパク質発現生成
物に対して特異的な抗体と反応性である標識抗体（第２
抗体）、例えばイムノグロブリンに対して特異的な抗体
との組合せにおいて利用されうる。他方、該抗原を直接
標識せしめてもよい。それらが標識されている場合、こ
のリポーター基にはラジオアイソトープ、蛍光物質、酵
素、ルミネッサー又は色素粒子が含まれることができ
る。このような及びその他の標識物質は当業界によく知
られ、そして例えば以下の米国特許：第3,766,162 号；
第3,791,932号；第3,817,837 号；第3,996,345 号；及
び第4,233,402 号に詳細されている。
【００３４】ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、典型的には
抗原をマイクロタイターウェルの表面に吸着させる。こ
の表面上に残っているタンパク質結合性部位を次に適当
な試薬、例えば牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、熱不活性
化正常ヤギ血清（ＮＧＳ）、又はＢＬＯＴＴＯ（脱脂粉
乳の緩衝液；防腐剤、塩類及び発泡防止剤も含む）によ
ってブロックする。次にこのウェルを特定の抗体を含む
と予想される試料とインキュベートする。この試料は原
液のまま、又はより通常には、少量（０．１−５．０重
量％）のタンパク質を含む緩衝液、例えばＢＳＡ，ＮＧ
ＳもしくはＢＬＯＴＴＯで通常希釈して適用されうる。
特異的な結合が起こるよう十分な時間にわたってインキ
ュベートさせた後、このウェルを洗浄して未結合タンパ
ク質を除去し、次いでリポーター基によって標識した抗
−種特異的イムノグロブリン抗体とインキュベートす
る、該リポーター基は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、
ベーターガラクトシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ
及びグルコースオキシダーゼを含む種々の酵素から選ぶ
ことができる。十分な時間にわたって特異的な結合を起
こさせ、次いでこのウェルを再び洗浄して未結合コンジ
ュゲートを除去し、そしてこの酵素のための基質を加え
る。色調が現れるようにさせ、そしてこのウェルの内容
物の吸光度を目視又は装置によって測定する。
抗原をマイクロタイターウェルの表面に吸着させる。こ
の表面上に残っているタンパク質結合性部位を次に適当
な試薬、例えば牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、熱不活性
化正常ヤギ血清（ＮＧＳ）、又はＢＬＯＴＴＯ（脱脂粉
乳の緩衝液；防腐剤、塩類及び発泡防止剤も含む）によ
ってブロックする。次にこのウェルを特定の抗体を含む
と予想される試料とインキュベートする。この試料は原
液のまま、又はより通常には、少量（０．１−５．０重
量％）のタンパク質を含む緩衝液、例えばＢＳＡ，ＮＧ
ＳもしくはＢＬＯＴＴＯで通常希釈して適用されうる。
特異的な結合が起こるよう十分な時間にわたってインキ
ュベートさせた後、このウェルを洗浄して未結合タンパ
ク質を除去し、次いでリポーター基によって標識した抗
−種特異的イムノグロブリン抗体とインキュベートす
る、該リポーター基は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、
ベーターガラクトシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ
及びグルコースオキシダーゼを含む種々の酵素から選ぶ
ことができる。十分な時間にわたって特異的な結合を起
こさせ、次いでこのウェルを再び洗浄して未結合コンジ
ュゲートを除去し、そしてこの酵素のための基質を加え
る。色調が現れるようにさせ、そしてこのウェルの内容
物の吸光度を目視又は装置によって測定する。
【００３５】本発明の１つの好ましい態様において、リ
ポーター基を該タンパク質発現生成物に結合させる。免
疫複合体を検出する工程は実質的に全ての未結合タンパ
ク質発現生成物を除去し、次いでこのリポーター基の有
無を検出することを含む。
ポーター基を該タンパク質発現生成物に結合させる。免
疫複合体を検出する工程は実質的に全ての未結合タンパ
ク質発現生成物を除去し、次いでこのリポーター基の有
無を検出することを含む。
【００３６】他の好ましい態様において、リポーター基
を、タンパク質発現生成物に特異的な抗体に結合できる
第２抗体に結合させる。免疫複合体を検出する工程は、
（ａ）実質的に全ての未結合抗体を除去し、（ｂ）第２
抗体を加え、（ｃ）実質的に全ての未結合第２抗体を除
去し、その後（ｄ）該リポーター基の有無を検出するこ
と、を含む。該タンパク質発現生成物に特異的な抗体が
ヒトに由来する場合、この第２抗体は抗−ヒト抗体であ
る。免疫複合体を検出するための第３の好ましい態様に
おいて、リポーター基を免疫複合体に結合することがで
きる分子と結合させる。この工程は、（ａ）該分子を加
え、（ｂ）実質的に全ての未結合分子を除去し、その後
（ｃ）該リポーター基の有無を検出することを含む。該
免疫複合体に結合することができる分子の例はプロテイ
ンＡである。
を、タンパク質発現生成物に特異的な抗体に結合できる
第２抗体に結合させる。免疫複合体を検出する工程は、
（ａ）実質的に全ての未結合抗体を除去し、（ｂ）第２
抗体を加え、（ｃ）実質的に全ての未結合第２抗体を除
去し、その後（ｄ）該リポーター基の有無を検出するこ
と、を含む。該タンパク質発現生成物に特異的な抗体が
ヒトに由来する場合、この第２抗体は抗−ヒト抗体であ
る。免疫複合体を検出するための第３の好ましい態様に
おいて、リポーター基を免疫複合体に結合することがで
きる分子と結合させる。この工程は、（ａ）該分子を加
え、（ｂ）実質的に全ての未結合分子を除去し、その後
（ｃ）該リポーター基の有無を検出することを含む。該
免疫複合体に結合することができる分子の例はプロテイ
ンＡである。
【００３７】当業者に明らかな通り、免疫複合体を検出
するための種々の方法が本発明において利用されうる。
任意の方法における利用に適するリポーター基にはラジ
オアイソトープ、蛍光物質、酵素、ルミネッサー及び色
素粒子が含まれる。
するための種々の方法が本発明において利用されうる。
任意の方法における利用に適するリポーター基にはラジ
オアイソトープ、蛍光物質、酵素、ルミネッサー及び色
素粒子が含まれる。
【００３８】本発明に関連する態様において、活性化癌
遺伝子又は癌関連遺伝子のタンパク質発現生成物と、該
タンパク質に特異的な体液中の抗体とで形成される免疫
複合体の検出は、癌治療の効果をモニターするために用
いられうる。治療の開始の前後での個体から採取した体
液の試料は前記した方法によって免疫複合体に関して分
析されうる。簡単に述べると、再試料中において検出さ
れる免疫複合体の数を比較する。第２試料（治療開始
後）中の免疫複合体の数の第１試料（治療開始前）中の
免疫複合体の数に対する実質的な変化は有効な治療を反
映する。以下の実施例を例示であって限定ではない目的
で提供する。
遺伝子又は癌関連遺伝子のタンパク質発現生成物と、該
タンパク質に特異的な体液中の抗体とで形成される免疫
複合体の検出は、癌治療の効果をモニターするために用
いられうる。治療の開始の前後での個体から採取した体
液の試料は前記した方法によって免疫複合体に関して分
析されうる。簡単に述べると、再試料中において検出さ
れる免疫複合体の数を比較する。第２試料（治療開始
後）中の免疫複合体の数の第１試料（治療開始前）中の
免疫複合体の数に対する実質的な変化は有効な治療を反
映する。以下の実施例を例示であって限定ではない目的
で提供する。
【００３９】
例１突然変異Ｒａｓ癌遺伝子生成物に対する特異的クラス−
II制限化Ｔ細胞応答の誘発 Ａ．免疫化 Ｃ５７ＢＬ／６及びＢ６．Ｃ−Ｈ−２bm12マウス（Jack
son Laboratories, Bar Harbor, Me.)を合成ペプチド
（アミノ酸配列KLVVVGARGVGK ; MicrobiologicalAssoci
ates, Bethesda, Md.）であってグリシン（Ｇ）をアル
ギニン（Ｒ）に置換した残基１２をコードする突然変異
ｒａｓ癌原遺伝子のｐ２１タンパク質生成物の残基５〜
１２に相当するペプチドで感染せしめた。このペプチド
は１mg／mlにて蒸留水に可溶化し、完全フロインドアジ
ュバント（ｓｉｇｍａ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍ
ｏ．）に１：１の割合で乳化させ、次いで２５ゲージ針
を用いて尾の底部に皮下注射した。他方、ペプチドＲｉ
ｂｉ ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳアジュバント（Ｒｉｂｉ
Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，Ｈａｍｉｌｔｏ
ｎ，Ｍｔ．）に乳化せしめ、そして両後四半部に皮下注
射した。注射した該ペプチドの総量はマウス当り５０μ
ｇとした。７日後、この動物を殺し、そして流出する大
動脈のまわり及び鼡径部のリンパ腺を取り出した。ペト
リ皿の中で緩衝食塩水に懸濁したリンパ腺を１８ゲージ
針で引き裂いた。追い出したリンパ球を集め、そして緩
衝食塩水で洗い、次いで増殖アッセイにおいて利用する
ために培養培地にml当たり１×１０6 個の細胞にて懸濁
した。
II制限化Ｔ細胞応答の誘発 Ａ．免疫化 Ｃ５７ＢＬ／６及びＢ６．Ｃ−Ｈ−２bm12マウス（Jack
son Laboratories, Bar Harbor, Me.)を合成ペプチド
（アミノ酸配列KLVVVGARGVGK ; MicrobiologicalAssoci
ates, Bethesda, Md.）であってグリシン（Ｇ）をアル
ギニン（Ｒ）に置換した残基１２をコードする突然変異
ｒａｓ癌原遺伝子のｐ２１タンパク質生成物の残基５〜
１２に相当するペプチドで感染せしめた。このペプチド
は１mg／mlにて蒸留水に可溶化し、完全フロインドアジ
ュバント（ｓｉｇｍａ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍ
ｏ．）に１：１の割合で乳化させ、次いで２５ゲージ針
を用いて尾の底部に皮下注射した。他方、ペプチドＲｉ
ｂｉ ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳアジュバント（Ｒｉｂｉ
Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，Ｈａｍｉｌｔｏ
ｎ，Ｍｔ．）に乳化せしめ、そして両後四半部に皮下注
射した。注射した該ペプチドの総量はマウス当り５０μ
ｇとした。７日後、この動物を殺し、そして流出する大
動脈のまわり及び鼡径部のリンパ腺を取り出した。ペト
リ皿の中で緩衝食塩水に懸濁したリンパ腺を１８ゲージ
針で引き裂いた。追い出したリンパ球を集め、そして緩
衝食塩水で洗い、次いで増殖アッセイにおいて利用する
ために培養培地にml当たり１×１０6 個の細胞にて懸濁
した。
【００４０】Ｂ．増殖アッセイ 免疫マウスより得たリンパ球を培養培地（１０％の仔牛
血清、２mMのＬ−グルタミン、１００Ｕ／mlのストレプ
トマイシン、１００Ｕ／mlのペニシリン及び２．５×１
０-5Ｍの２−メルカプトエタノールの添加したＲＰＭＩ
１６４０ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）より成る）に懸濁し、そ
して９６穴平底マイクロタイタ−プレート（Ｃｏｓｔａ
ｒ Ｃｏ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ）に１×１
０5 細胞／ウェルにて培養した３０００ｒａｄｓで照射
せしめた同系脾臓細胞を、ウェル当り２×１０5 個の細
胞にて加え、抗原提供細胞として働かせた。免疫用ペプ
チド及び標示のコントロールペプチド（５０μｇ／ml）
を３個のウェルに加えた（最終容量２００μｌ／ウェ
ル)。このプレートを５％のＣＯ2 を含む多湿空気中で３
７℃にて７２時間インキュベートし、次いでウェル当り
１μCiのトリチウム化チミジン（３Ｈ−ＴｄＲ；２０Ci
／mmol；ＮＥＮ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍ
ａ．）によって６時間パルスにかけた。個々のウエルか
らのリンパ球をマルチチャンネルハーベスターを用いて
濾紙ディスクに集め、次いで独立の計測管中のシンチレ
ーション液に移し入れた。Ｂａｃｋｍａｎ液体シンチレ
ーション光度系を用いてβ励起を測定した。図１に示す
データーは３回の測定の平均を示している。
血清、２mMのＬ−グルタミン、１００Ｕ／mlのストレプ
トマイシン、１００Ｕ／mlのペニシリン及び２．５×１
０-5Ｍの２−メルカプトエタノールの添加したＲＰＭＩ
１６４０ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）より成る）に懸濁し、そ
して９６穴平底マイクロタイタ−プレート（Ｃｏｓｔａ
ｒ Ｃｏ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ）に１×１
０5 細胞／ウェルにて培養した３０００ｒａｄｓで照射
せしめた同系脾臓細胞を、ウェル当り２×１０5 個の細
胞にて加え、抗原提供細胞として働かせた。免疫用ペプ
チド及び標示のコントロールペプチド（５０μｇ／ml）
を３個のウェルに加えた（最終容量２００μｌ／ウェ
ル)。このプレートを５％のＣＯ2 を含む多湿空気中で３
７℃にて７２時間インキュベートし、次いでウェル当り
１μCiのトリチウム化チミジン（３Ｈ−ＴｄＲ；２０Ci
／mmol；ＮＥＮ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍ
ａ．）によって６時間パルスにかけた。個々のウエルか
らのリンパ球をマルチチャンネルハーベスターを用いて
濾紙ディスクに集め、次いで独立の計測管中のシンチレ
ーション液に移し入れた。Ｂａｃｋｍａｎ液体シンチレ
ーション光度系を用いてβ励起を測定した。図１に示す
データーは３回の測定の平均を示している。
【００４１】例２突然変異Ｒａｓ癌原遺伝子のタンパク質生成物に対する
特異性を有するＴ細胞系及びクローンの作製 前記した免疫マウスの流出するリンパ腺由来のリンパ球
を２４−ウェル培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ Ｃｏ．）
に（ウェル当り４×１０6 個の細胞）、照射同系脾臓細
胞（１０，０００ｒａｄｓ；２×１０6 個の細胞／ウェ
ル）及び免疫用ペプチド（５μｇ／ウェル）と一緒に、
最終容量２ml（培養培地）となるようにして培養した。
プレートを５日間（３７℃，５％ＣＯ2 ）で培養し、そ
してレプリケートプレート上に１：２に分けた。１０日
後、５×１０5 個の培養リンパ球を４×１０6 個の照射
同系脾臓細胞及び５μｇ／mlのペプチドと培養すること
によって再刺激せしめた。３日後、個々のウェルを１０
ユニットのインターロイキン−２（ヒト組換え体；Ｈｏ
ｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）を含む２〜４個のウェル
の培養培地の中に再分配せしめ、細胞増殖を促進せしめ
た。系を抗原、次いでＩＬ−２で前記の通りに、３〜４
週ごとに再刺激せしめた。試験管内で抗原によって２回
刺激した免疫リンパ球を、培養を開始してから１３日目
（Ａｇ再刺激の３日後）にて、９６穴平底プレート中に
ウェル当り０．５個の細胞の頻度にて免疫Ｔ細胞を、照
射同系脾臓細胞（１×１０6 個の細胞／ウェル）及び５
０Ｕ／mlのインターロイキン−２と一緒に培養した。ク
ローナル増殖を有するウェルを増殖させ、そして免疫特
異性について試験した（図２に示す）。特異的なＴ細胞
クローンを、Ｔ細胞系に関して詳細の通りに維持した。
特異性を有するＴ細胞系及びクローンの作製 前記した免疫マウスの流出するリンパ腺由来のリンパ球
を２４−ウェル培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ Ｃｏ．）
に（ウェル当り４×１０6 個の細胞）、照射同系脾臓細
胞（１０，０００ｒａｄｓ；２×１０6 個の細胞／ウェ
ル）及び免疫用ペプチド（５μｇ／ウェル）と一緒に、
最終容量２ml（培養培地）となるようにして培養した。
プレートを５日間（３７℃，５％ＣＯ2 ）で培養し、そ
してレプリケートプレート上に１：２に分けた。１０日
後、５×１０5 個の培養リンパ球を４×１０6 個の照射
同系脾臓細胞及び５μｇ／mlのペプチドと培養すること
によって再刺激せしめた。３日後、個々のウェルを１０
ユニットのインターロイキン−２（ヒト組換え体；Ｈｏ
ｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）を含む２〜４個のウェル
の培養培地の中に再分配せしめ、細胞増殖を促進せしめ
た。系を抗原、次いでＩＬ−２で前記の通りに、３〜４
週ごとに再刺激せしめた。試験管内で抗原によって２回
刺激した免疫リンパ球を、培養を開始してから１３日目
（Ａｇ再刺激の３日後）にて、９６穴平底プレート中に
ウェル当り０．５個の細胞の頻度にて免疫Ｔ細胞を、照
射同系脾臓細胞（１×１０6 個の細胞／ウェル）及び５
０Ｕ／mlのインターロイキン−２と一緒に培養した。ク
ローナル増殖を有するウェルを増殖させ、そして免疫特
異性について試験した（図２に示す）。特異的なＴ細胞
クローンを、Ｔ細胞系に関して詳細の通りに維持した。
【００４２】本発明の特定の態様を例示の目的で本明細
書に記載したが、以上からの種々の改良は本発明の範囲
を逸脱することがないことが理解されるであろう。
書に記載したが、以上からの種々の改良は本発明の範囲
を逸脱することがないことが理解されるであろう。
【図１】図１は、点変異ｒａｓペプチドに対する特異的
なＴ細胞応答が、生体内において０日目に、ネズミｒａ
ｓ−ｐ２１（アミノ酸５〜１６）と類似に作製した、１
２個のアミノ酸の長さであるが、位置１２（即ち、ｒａ
ｓ−ｐ２１にとっては位置１２であるが、該ペプチドに
とっては位置８）にて正常に見い出せるグリシンをアル
ギニンで置き換えたペプチド５０μｇを感作せしめるこ
とによって発生させることができることを示すグラフ図
である。このペプチドをｒａｓ ｐ５−１６〔Ｒ１２〕
又はｒａｓ−Ｒ１２と称する。マウスをｒａｓ−Ｒ１２
ペプチドとアジュバント、又はアジュバント単独で免疫
した。１０日後、流出するリンパ腺を集め、そしてこの
リンパ球をｒａｓ−Ｒ１２ペプチドによってインビトロ
で刺激せしめるか、又は特定のコントロールとしての、
位置１２にてアルギニンをセリン、システインもしくは
グリシンで置き換えたそれぞれｒａｓ−Ｓ１２，ｒａｓ
−Ｃ１２及びｒａｓ−Ｇ１２と称する類似のペプチドに
よってインビトロで刺激せしめた。４日後、培養物を下
記の例１に詳細の通り、〔 3Ｈ〕−チミジンで８時間パ
ルスにかけた。結果は△ＣＰＭとして表わした。
なＴ細胞応答が、生体内において０日目に、ネズミｒａ
ｓ−ｐ２１（アミノ酸５〜１６）と類似に作製した、１
２個のアミノ酸の長さであるが、位置１２（即ち、ｒａ
ｓ−ｐ２１にとっては位置１２であるが、該ペプチドに
とっては位置８）にて正常に見い出せるグリシンをアル
ギニンで置き換えたペプチド５０μｇを感作せしめるこ
とによって発生させることができることを示すグラフ図
である。このペプチドをｒａｓ ｐ５−１６〔Ｒ１２〕
又はｒａｓ−Ｒ１２と称する。マウスをｒａｓ−Ｒ１２
ペプチドとアジュバント、又はアジュバント単独で免疫
した。１０日後、流出するリンパ腺を集め、そしてこの
リンパ球をｒａｓ−Ｒ１２ペプチドによってインビトロ
で刺激せしめるか、又は特定のコントロールとしての、
位置１２にてアルギニンをセリン、システインもしくは
グリシンで置き換えたそれぞれｒａｓ−Ｓ１２，ｒａｓ
−Ｃ１２及びｒａｓ−Ｇ１２と称する類似のペプチドに
よってインビトロで刺激せしめた。４日後、培養物を下
記の例１に詳細の通り、〔 3Ｈ〕−チミジンで８時間パ
ルスにかけた。結果は△ＣＰＭとして表わした。
【図２】図２は、試験管内で、ｒａｓ−ペプチドによる
断続的な刺激に応答させて長期間増殖させたｒａｓ−ペ
プチド特異性Ｔ細胞が特異的な機能を保持することを示
す。ｒａｓ−Ｒ１２ペプチド（上記の図１に定義の通
り）で感作せしめたＣ５７ＢＬ／６マウスの腸間膜リン
パ腺由来のＴ細胞を、抗原提供細胞としての照射Ｂ６脾
臓細胞（３０００ｒａｄ）に基づくｒａｓ−Ｒ１２ペプ
チド（５μｇ／ml）による断続的な刺激に応答して試験
管内で長期間培養した。このＴ細胞系の特異性を８５日
目に、段階濃度の種々のｒａｓペプチド又は複数の潜在
免疫原ペプチドを含むトリプシン処理のＯＶＡ（ＴＯＶ
Ａ）によって刺激することによって試験した。データー
は１分当りに取り込まれる３ＨＴｄＲのカウント数
（ｃ．ｐ．ｍ）で表わした。
断続的な刺激に応答させて長期間増殖させたｒａｓ−ペ
プチド特異性Ｔ細胞が特異的な機能を保持することを示
す。ｒａｓ−Ｒ１２ペプチド（上記の図１に定義の通
り）で感作せしめたＣ５７ＢＬ／６マウスの腸間膜リン
パ腺由来のＴ細胞を、抗原提供細胞としての照射Ｂ６脾
臓細胞（３０００ｒａｄ）に基づくｒａｓ−Ｒ１２ペプ
チド（５μｇ／ml）による断続的な刺激に応答して試験
管内で長期間培養した。このＴ細胞系の特異性を８５日
目に、段階濃度の種々のｒａｓペプチド又は複数の潜在
免疫原ペプチドを含むトリプシン処理のＯＶＡ（ＴＯＶ
Ａ）によって刺激することによって試験した。データー
は１分当りに取り込まれる３ＨＴｄＲのカウント数
（ｃ．ｐ．ｍ）で表わした。
【図３】図３は、ｒａｓペプチドに特異的なＴ細胞が同
じ残基置換を含む完全ｒａｓｐ２１タンパク質に特異的
に応答性であることを示す。ｐ５−１７〔Ｒ１２〕と称
するこのペプチドは１３個のアミノ酸残基より成り、そ
してこれはネズミｒａｓ−ｐ２１（アミノ酸５〜１７）
と類似に作製したが、但しｒａｓ−ｐ２１の位置２１に
て通常見い出せるグリシン（ａ）がアルギニン（Ｒ）で
置換されている。Ａｒｇ−１２ｒａｓペプチドに特異的
なクローン化Ｂ６Ｔ細胞を照射Ｂ６脾臓細胞及びｐ５−
１７〔Ｒ−１２〕又は位置１２にて表示のアミノ酸を有
するｒａｓ ｐ２１タンパク質（１μｇ／ml）のいづれ
かと培養した。増殖応答を４日後に測定した（図１に詳
細の通り）。データーは組込まれた 3ＨＴｄＲのｃ．
ｐ．ｍ．の三重測定値の平均で表わした。標準偏差は
ｃ．ｐ．ｍの＜１０％であった。
じ残基置換を含む完全ｒａｓｐ２１タンパク質に特異的
に応答性であることを示す。ｐ５−１７〔Ｒ１２〕と称
するこのペプチドは１３個のアミノ酸残基より成り、そ
してこれはネズミｒａｓ−ｐ２１（アミノ酸５〜１７）
と類似に作製したが、但しｒａｓ−ｐ２１の位置２１に
て通常見い出せるグリシン（ａ）がアルギニン（Ｒ）で
置換されている。Ａｒｇ−１２ｒａｓペプチドに特異的
なクローン化Ｂ６Ｔ細胞を照射Ｂ６脾臓細胞及びｐ５−
１７〔Ｒ−１２〕又は位置１２にて表示のアミノ酸を有
するｒａｓ ｐ２１タンパク質（１μｇ／ml）のいづれ
かと培養した。増殖応答を４日後に測定した（図１に詳
細の通り）。データーは組込まれた 3ＨＴｄＲのｃ．
ｐ．ｍ．の三重測定値の平均で表わした。標準偏差は
ｃ．ｐ．ｍの＜１０％であった。
【図４】図４は、特異的なＴ細胞応答が、生体内におい
て、ネズミｒａｓｐ−２１（アミノ酸５４−６６）に類
似するがｒａｓ−ｐ２１の位置６１にて通常見い出せる
グルタミン（Ｑ）をロイシン（Ｌ）で置き換えて作製し
た１３個のアミノ酸の長さのペプチドによって感作せし
めることによって発生させることができることを示す。
このペプチドをｐ５４−６６〔Ｌ６１〕又は〔Ｌ６１〕
と称する。ＣＨ３／ＨｅＮマウスを２週間の間隔で、Ｒ
ｉｂｉアジュバント単独又はｐ５４−６６〔Ｌ６１〕ｒ
ａｓペプチド（１００μｇ）に乳化せしめたアジュバン
トによって２回皮下的に免疫した。最後の免疫の２週間
後、アジュバンド単独（白棒）又はアジュバントとｐ５
４−６６〔Ｌ６１〕ｒａｓペプチド（黒棒）を注射した
マウス由来の脾臓を回収し、そして表示のｐ５４−６６
ｒａｓペプチド（１００μｇ／ml）に対する増殖応答に
ついて試験管内で試験した。位置６１にてグルタミンが
リジン（Ｋ）に置換されたペプチドを〔Ｋ６１〕と称す
る。データーは組込まれた 3ＨＴｄＲのｃ．ｐ．ｍの三
重測定値の平均と±Ｓ．Ｄ．で表わした。
て、ネズミｒａｓｐ−２１（アミノ酸５４−６６）に類
似するがｒａｓ−ｐ２１の位置６１にて通常見い出せる
グルタミン（Ｑ）をロイシン（Ｌ）で置き換えて作製し
た１３個のアミノ酸の長さのペプチドによって感作せし
めることによって発生させることができることを示す。
このペプチドをｐ５４−６６〔Ｌ６１〕又は〔Ｌ６１〕
と称する。ＣＨ３／ＨｅＮマウスを２週間の間隔で、Ｒ
ｉｂｉアジュバント単独又はｐ５４−６６〔Ｌ６１〕ｒ
ａｓペプチド（１００μｇ）に乳化せしめたアジュバン
トによって２回皮下的に免疫した。最後の免疫の２週間
後、アジュバンド単独（白棒）又はアジュバントとｐ５
４−６６〔Ｌ６１〕ｒａｓペプチド（黒棒）を注射した
マウス由来の脾臓を回収し、そして表示のｐ５４−６６
ｒａｓペプチド（１００μｇ／ml）に対する増殖応答に
ついて試験管内で試験した。位置６１にてグルタミンが
リジン（Ｋ）に置換されたペプチドを〔Ｋ６１〕と称す
る。データーは組込まれた 3ＨＴｄＲのｃ．ｐ．ｍの三
重測定値の平均と±Ｓ．Ｄ．で表わした。
【図５】図５は、完全ｒａｓ ｐ２１〔Ｌ６１〕タンパ
ク質がｒａｓペプチド誘発Ｔ細胞系によって特異的に認
識されることを示す図である。特異的なＴ細胞系及びク
ローンを以降の例２に詳細の通りに作りそして維持し
た。ｒａｓペプチドｐ５４−６６〔Ｌ６１〕に特異的な
反応性を示すＴ細胞系（パネルＡ）及びｒａｓペプチド
ｐ５−１７〔Ｒ１２〕に特異的な反応性を示すＴ細胞ク
ローン（パネルＢ）を、（ａ）抗原なしで、（ｂ）感作
用ｒａｓペプチドで、又は（ｃ）完全ｒａｓｐ２１〔Ｌ
６１〕タンパク質で刺激せしめた。このｒａｓ ｐ−５
４−６６〔Ｌ６１〕特異的Ｔ細胞系はＣ３Ｈ由来であ
り、そしてｒａｓ ｐ５−１７〔Ｒ１２〕特異的Ｔ細胞
クローンはＢ６由来であった。増殖アッセイは抗原提供
細胞としての同系照射脾臓細胞によって行った（図１に
示す通り）。刺激用ペプチド及びタンパク質は５μｇ／
mlの濃度で利用した。このｒａｓ ｐ２１〔Ｌ６１〕タ
ンパク質はＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１におい
て、原核発現性プラスミドｐＨＲ−Ｌ９を用いて生産
し、そしてＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｃｅｌとＳｅｐｈａｄ
ｅｘの連続カラムクロマトグラフィーによって精製し
た。データーは組込まれた 3ＨＴｄＲのｃ．ｐ．ｍ．の
平均値と±Ｓ．Ｄで表わした。
ク質がｒａｓペプチド誘発Ｔ細胞系によって特異的に認
識されることを示す図である。特異的なＴ細胞系及びク
ローンを以降の例２に詳細の通りに作りそして維持し
た。ｒａｓペプチドｐ５４−６６〔Ｌ６１〕に特異的な
反応性を示すＴ細胞系（パネルＡ）及びｒａｓペプチド
ｐ５−１７〔Ｒ１２〕に特異的な反応性を示すＴ細胞ク
ローン（パネルＢ）を、（ａ）抗原なしで、（ｂ）感作
用ｒａｓペプチドで、又は（ｃ）完全ｒａｓｐ２１〔Ｌ
６１〕タンパク質で刺激せしめた。このｒａｓ ｐ−５
４−６６〔Ｌ６１〕特異的Ｔ細胞系はＣ３Ｈ由来であ
り、そしてｒａｓ ｐ５−１７〔Ｒ１２〕特異的Ｔ細胞
クローンはＢ６由来であった。増殖アッセイは抗原提供
細胞としての同系照射脾臓細胞によって行った（図１に
示す通り）。刺激用ペプチド及びタンパク質は５μｇ／
mlの濃度で利用した。このｒａｓ ｐ２１〔Ｌ６１〕タ
ンパク質はＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１におい
て、原核発現性プラスミドｐＨＲ−Ｌ９を用いて生産
し、そしてＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｃｅｌとＳｅｐｈａｄ
ｅｘの連続カラムクロマトグラフィーによって精製し
た。データーは組込まれた 3ＨＴｄＲのｃ．ｐ．ｍ．の
平均値と±Ｓ．Ｄで表わした。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成８年４月２３日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/574 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 (72)発明者 ピース，デビッド ジェイ. アメリカ合衆国，ワシントン 98103，シ アトル，アパートメント 201 ノース ナインティセカンド ストリート 1124
Claims (8)
- 【請求項１】 温血動物における悪性腫瘍を処置するた
めの医薬品の製造において利用するための、温血動物か
ら単離せしめたＴ細胞（このＴ細胞は悪性腫瘍に関連す
る活性化癌遺伝子又は癌関連遺伝子の少なくとも１種の
タンパク質発現生成物の存在下において増殖せしめたも
のである）。 - 【請求項２】 前記の活性化癌遺伝子のタンパク質発現
生成物が、ｒａｓ，ｓｒｃ，ａｂｌ，ｆｇｒ，ｒｅｌ，
ｙｅｓ，ｆｅｓ，ｎｅｔ，ｍｏｓ，ｒａｆ，ｅｒｂＢ，
ｅｒｂＡ，ｆｍｓ．ｎｅｕ，ｒｏｓ，ｋｉｔ，ｓｅａ，
ｓｉｓ，ｍｙｃ，ｍｙｂ，ｆｏｓ，ｓｋｉ，ｊｕｎ及び
ｅｔｓより成る群から選ばれる癌遺伝子によってコード
されるタンパク質である、請求項１に記載のＴ細胞。 - 【請求項３】 悪性腫瘍に対する温血動物の免疫のため
のタンパク質発現生成物であって、前記悪性腫瘍に関連
する活性化癌遺伝子又は癌関連遺伝子の改変一次配列を
有する前記タンパク質発現生成物。 - 【請求項４】 前記のタンパク質発現生成物が、ｒａ
ｓ，ｓｒｃ，ａｂｌ，ｆｇｒ，ｒｅｌ，ｙｅｓ，ｆｅ
ｓ，ｎｅｔ，ｍｏｓ，ｒａｆ，ｅｒｂＢ，ｅｒｂＡ，ｆ
ｍｓ．ｎｅｕ，ｒｏｓ，ｋｉｔ，ｓｅａ，ｓｉｓ，ｍｙ
ｃ，ｍｙｂ，ｆｏｓ，ｓｋｉ，ｊｕｎ及びｅｔｓより成
る群から選ばれる癌遺伝子によってコードされるタンパ
ク質である、請求項３記載のタンパク質発現生成物。 - 【請求項５】 悪性腫瘍に対する温血動物の免疫のため
の医薬品の製造のための、前記悪性腫瘍に関連する活性
化癌遺伝子又は癌関連遺伝子の改変一次配列を有する前
記タンパク質発現生成物の利用。 - 【請求項６】 前記のタンパク質発現生成物が、ｒａ
ｓ，ｓｒｃ，ａｂｌ，ｆｇｒ，ｒｅｌ，ｙｅｓ，ｆｅ
ｓ，ｎｅｔ，ｍｏｓ，ｒａｆ，ｅｒｂＢ，ｅｒｂＡ，ｆ
ｍｓ．ｎｅｕ，ｒｏｓ，ｋｉｔ，ｓｅａ，ｓｉｓ，ｍｙ
ｃ，ｍｙｂ，ｆｏｓ，ｓｋｉ，ｊｕｎ及びｅｔｓより成
る群から選ばれる癌遺伝子によってコードされるタンパ
ク質である、請求項５記載の利用。 - 【請求項７】 悪性腫瘍に対する温血動物の免疫のため
の組成物であって、前記悪性腫瘍に関連する活性化癌遺
伝子又は癌関連遺伝子の改変一次配列を有する少なくと
も一種のタンパク質発現生成物を含んで成る組成物。 - 【請求項８】 前記のタンパク質発現生成物が、ｒａ
ｓ，ｓｒｃ，ａｂｌ，ｆｇｒ，ｒｅｌ，ｙｅｓ，ｆｅ
ｓ，ｎｅｔ，ｍｏｓ，ｒａｆ，ｅｒｂＢ，ｅｒｂＡ，ｆ
ｍｓ．ｎｅｕ，ｒｏｓ，ｋｉｔ，ｓｅａ，ｓｉｓ，ｍｙ
ｃ，ｍｙｂ，ｆｏｓ，ｓｋｉ，ｊｕｎ及びｅｔｓより成
る群から選ばれる癌遺伝子によってコードされるタンパ
ク質である、請求項７記載の組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US47064590A | 1990-01-26 | 1990-01-26 | |
| US470645 | 1990-01-26 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3504130A Division JP2552047B2 (ja) | 1990-01-26 | 1991-01-24 | 悪性腫瘍の検査方法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10168736A Division JPH1169976A (ja) | 1990-01-26 | 1998-06-16 | 悪性腫瘍の処置のための組成物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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Family
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Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3504130A Expired - Fee Related JP2552047B2 (ja) | 1990-01-26 | 1991-01-24 | 悪性腫瘍の検査方法 |
| JP8043483A Pending JPH08275774A (ja) | 1990-01-26 | 1996-02-29 | 悪性腫瘍の処置のための組成物 |
| JP10168736A Pending JPH1169976A (ja) | 1990-01-26 | 1998-06-16 | 悪性腫瘍の処置のための組成物 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3504130A Expired - Fee Related JP2552047B2 (ja) | 1990-01-26 | 1991-01-24 | 悪性腫瘍の検査方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10168736A Pending JPH1169976A (ja) | 1990-01-26 | 1998-06-16 | 悪性腫瘍の処置のための組成物 |
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| JP (3) | JP2552047B2 (ja) |
| AT (2) | ATE180276T1 (ja) |
| AU (1) | AU639311B2 (ja) |
| CA (1) | CA2074720C (ja) |
| DE (2) | DE69108716T2 (ja) |
| DK (1) | DK0617124T3 (ja) |
| ES (2) | ES2134294T3 (ja) |
| WO (1) | WO1991011719A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US10889818B2 (en) | 2006-01-20 | 2021-01-12 | Cell Signaling Technology, Inc. | Translocation and mutant ROS kinase in human non-small cell lung carcinoma |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| DK0617124T3 (da) * | 1990-01-26 | 1999-12-06 | Washington Res Found | Immunreaktivitet overfor udtrykte aktiverede onkogener til diagnose og behandling af maligne svulster |
| GB9103974D0 (en) * | 1991-02-26 | 1991-04-10 | Norsk Hydro As | Therapeutically useful peptides or peptide fragments |
| EP0612353B1 (en) * | 1991-09-16 | 1999-03-31 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES | Detection method for c-raf-1 genes |
| US5512473A (en) * | 1993-01-29 | 1996-04-30 | Brent; Roger | Max-interacting proteins and related molecules and methods |
| US6953573B1 (en) * | 1993-03-17 | 2005-10-11 | University Of Washington | Compounds for eliciting or enhancing immune reactivity to HER-2/neu protein for prevention or treatment of malignancies in which the HER-2/neu oncogene is associated |
| US5869445A (en) * | 1993-03-17 | 1999-02-09 | University Of Washington | Methods for eliciting or enhancing reactivity to HER-2/neu protein |
| US5801005A (en) * | 1993-03-17 | 1998-09-01 | University Of Washington | Immune reactivity to HER-2/neu protein for diagnosis of malignancies in which the HER-2/neu oncogene is associated |
| US5419900A (en) | 1993-05-19 | 1995-05-30 | The United States Of America As Represented By The Department Of Of Health And Human Services | Immunologic enhancement with intermittent interleukin-2 therapy |
| US6156316A (en) * | 1995-05-08 | 2000-12-05 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Oncogene fusion protein peptide vaccines |
| US6942862B2 (en) * | 1996-04-01 | 2005-09-13 | University Of Washington | Methods and compositions to generate immunity in humans against self tumor antigens by immunization with homologous foreign proteins |
| WO1998021585A1 (en) | 1996-11-15 | 1998-05-22 | Cornell Research Foundation, Inc. | Activated ras interaction assay |
| DE19736691A1 (de) * | 1997-08-22 | 1999-02-25 | Michael Prof Dr Med Giesing | Verfahren zur Charakterisierung und Identifizierung disseminierter und metastasierter Krebszellen |
| US6551780B1 (en) * | 2000-03-31 | 2003-04-22 | The Regents Of University Of California | Detection of gene mutations or amplifications in melanocytic neoplasms |
| WO2001008636A2 (en) * | 1999-08-03 | 2001-02-08 | The Ohio State University | Polypeptides and polynucleotides for enhancing immune reactivity to her-2 protein |
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