JPH08176194A - プロトロンビン活性化因子 - Google Patents
プロトロンビン活性化因子Info
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- JPH08176194A JPH08176194A JP6318082A JP31808294A JPH08176194A JP H08176194 A JPH08176194 A JP H08176194A JP 6318082 A JP6318082 A JP 6318082A JP 31808294 A JP31808294 A JP 31808294A JP H08176194 A JPH08176194 A JP H08176194A
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- thrombin
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 新規なプロトロンビン活性化因子およびその
阻害物質を提供することにある。 【構成】 ネコ腎臓由来繊維芽細胞株8Cの膜画分にプロ
トロンビン活性化因子が存在することを確認した。本因
子はXa因子や V因子とは異なり、Ca++を要求、EDTAによ
り阻害を受ける金属プロテアーゼと予測されるものであ
る。またヒト、イヌ、ウサギなどの細胞においても本因
子は発現しており、ヒトグリア芽腫細胞株での発現は、
本因子の脳組織での重要性が示唆された。さらにプロト
ロンビンフラグメント−１が本因子に対し阻害作用を有
することが判明し、トロンビンが関与する疾患への応用
が期待される。
阻害物質を提供することにある。 【構成】 ネコ腎臓由来繊維芽細胞株8Cの膜画分にプロ
トロンビン活性化因子が存在することを確認した。本因
子はXa因子や V因子とは異なり、Ca++を要求、EDTAによ
り阻害を受ける金属プロテアーゼと予測されるものであ
る。またヒト、イヌ、ウサギなどの細胞においても本因
子は発現しており、ヒトグリア芽腫細胞株での発現は、
本因子の脳組織での重要性が示唆された。さらにプロト
ロンビンフラグメント−１が本因子に対し阻害作用を有
することが判明し、トロンビンが関与する疾患への応用
が期待される。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はプロトロンビンの新規な
活性化因子に関し、医薬の分野で利用される。
活性化因子に関し、医薬の分野で利用される。
【０００２】
【従来の技術】トロンビンは血管壁の損傷によって開始
される血栓形成反応における最も重要な最終プロテアー
ゼである。この酵素は凝固カスケードの最終段階におい
て、前駆体プロトロンビンがプロトロンビナーゼ複合体
（Xa因子、Va因子、Ca++、酸性リン脂質）により限定分
解され血液中に生じるが、生理的にはこれ以外の活性化
経路は存在しないと考えられてきた。近年、トロンビン
は血液凝固以外の作用、特に各種細胞の活性化への関与
が注目されている。すなわち、血小板の凝固促進作用、
血管内皮細胞のもつ抗凝固活性の調節作用、平滑筋細胞
への増殖作用、マクロファージへの走化・増殖作用など
が知られている（Carney DH et al., J. Clin. Inves
t., 89, 1469-1477, 1992 ; Bar-Shavit R. et al., Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA., 83, 976-980, 1986; Diha
rich M. et al., Neuron, 6, 575-581, 1991 ）。最
近、Coughlinらはプロトロンビンレセプターのクローニ
ングに成功し、トロンビンの細胞への作用はこのレセプ
ターを介して起こることが解明されつつある（Coughlin
SR et al.,J. Clin. Invest., 89, 351-355, 1992
）。さらにプロトロンビンが肝臓以外の組織、例えば
脳にも存在することが報告された（Dihanich M. et a
l., Neuron,6, 575-581, 1991）。このように血栓形成
以外のトロンビンの広範な生理作用を考えると、血液と
全く接触していない組織内のプロトロンビンがなぜトロ
ンビンに活性化しうるのか、その機構と生理的役割な
ど、現在非常に注目されている分野である。
される血栓形成反応における最も重要な最終プロテアー
ゼである。この酵素は凝固カスケードの最終段階におい
て、前駆体プロトロンビンがプロトロンビナーゼ複合体
（Xa因子、Va因子、Ca++、酸性リン脂質）により限定分
解され血液中に生じるが、生理的にはこれ以外の活性化
経路は存在しないと考えられてきた。近年、トロンビン
は血液凝固以外の作用、特に各種細胞の活性化への関与
が注目されている。すなわち、血小板の凝固促進作用、
血管内皮細胞のもつ抗凝固活性の調節作用、平滑筋細胞
への増殖作用、マクロファージへの走化・増殖作用など
が知られている（Carney DH et al., J. Clin. Inves
t., 89, 1469-1477, 1992 ; Bar-Shavit R. et al., Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA., 83, 976-980, 1986; Diha
rich M. et al., Neuron, 6, 575-581, 1991 ）。最
近、Coughlinらはプロトロンビンレセプターのクローニ
ングに成功し、トロンビンの細胞への作用はこのレセプ
ターを介して起こることが解明されつつある（Coughlin
SR et al.,J. Clin. Invest., 89, 351-355, 1992
）。さらにプロトロンビンが肝臓以外の組織、例えば
脳にも存在することが報告された（Dihanich M. et a
l., Neuron,6, 575-581, 1991）。このように血栓形成
以外のトロンビンの広範な生理作用を考えると、血液と
全く接触していない組織内のプロトロンビンがなぜトロ
ンビンに活性化しうるのか、その機構と生理的役割な
ど、現在非常に注目されている分野である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】プロトロンビンの新規
な活性化因子の提供にある。
な活性化因子の提供にある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らはネコ繊維芽
細胞株8Cの細胞膜画分をマウスに静注すると死に到らし
めることから、何か毒性物質が含まれていると予想し
た。8C細胞株の膜画分（100 μg protein ）をマウスに
静注 5分後剖検したところ、主に肺臓や肝臓の血管に血
栓の異常発生が観察されフィブリンの沈着が確認され
た。このことからこの毒性物資は血栓産生促進物質であ
ろうと予想した。事実、正常ヒト血漿のフィブリン産生
をこの8C細胞膜画分が促進することを見い出した。そこ
でこの毒性物質の性質を知るために、まずフィブリノー
ゲンに対する作用を検定したが作用は認められず、いわ
ゆるトロンビン様物質でないことを確認した。次いで種
々の精製された血液凝固因子に対する作用を検定した結
果、プロトロンビンからトロンビンへの変換作用（プロ
トロンビン活性化作用）を有することが判明し、他の因
子には何ら作用せず、ティッシュー・ファクター活性も
有せず、Xa因子とも異なることを確認した。さらに、驚
くべきことに、プロトロンビンフラグメント−１が本因
子の活性を阻害することを見いだした。このようにして
本発明者らは、新規なプロトロンビン活性化因子および
その阻害物質の存在を初めて確認し本発明を完成するに
到った。すなわち本発明は、哺乳動物細胞由来のプロト
ロンビン活性化因子であって、下記の性質を有するもの
である。1)プロトロンビンをトロンビンに変換する、2)
活性発現にCa++を要求する、3)EDTAにより失活する、4)
血液凝固因子Xaとは異なる、5)膜蛋白質である。および
本因子阻害物質であるプロトロンビンフラグメント−１
またはその誘導体を有効成分として含有することからな
る医薬組成物、である。プロトロンビンフラグメント−
１（以下、フラグメント−１と記す。）は、ヒトプロト
ロンビンの場合、Ｎ末端から分子量約 17000の 155アミ
ノ酸残基よりなるペプチドで、プロトロンビン活性化の
最初の段階でプレトロンビン−１に変換される際に切断
遊離されるものである。フラグメント−１の誘導体と
は、フラグメント−１のアミノ酸配列の全部またはその
一部を含むものであって、本因子阻害活性を有するもの
を意味する。また、それらペプチドのアミノ酸を欠失、
付加、置換したもの、及び化学的に修飾したものも含ま
れる。前述の如く、トロンビンは血液凝固とは別個の生
理作用が判明し、臨床的にも非常に注目されている。あ
る種の腫瘍患者において、血液凝固系の障害により癌細
胞へのフィブリンの沈着がみられるとの報告があること
から（Dvorak, H.F.,Hum. Pathol., 18, 275-284, 1987
）、この因子が癌の進展に関与している可能性があ
る。またプロトロンビンは肝臓のみならず、脳において
も発現していることから、トロンビンは脳組織において
も重要な役割を演ずると予想されている。事実、トロン
ビンを培養神経細胞に与えると速やかな形態変化（神経
突起が引っ込み細胞が丸くなる）が観察されており( Ja
link K. et al., J. Cell Biol., 118, 411-419, 1992
)、特にアルツハイマー病患者の脳にトロンビンの蓄積
が見られることからも脳疾患との関係に注目が集まって
いる（Wagner S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA., 86, 8284-8288, 1989 ; Akiyama H. et al., Neur
oscience Letters, 146, 152-154, 1992 )。実施例に記
載の如く、本発明因子はヒトグリア芽腫細胞株にも存在
していることから、本因子およびその阻害物質であるフ
ラグメント−１は、トロンビンの関与する疾患の治療用
医薬品開発のツールとして、特にアルツハイマー病など
の脳疾患への応用が期待されるものである。以下に本発
明を詳細に説明する。
細胞株8Cの細胞膜画分をマウスに静注すると死に到らし
めることから、何か毒性物質が含まれていると予想し
た。8C細胞株の膜画分（100 μg protein ）をマウスに
静注 5分後剖検したところ、主に肺臓や肝臓の血管に血
栓の異常発生が観察されフィブリンの沈着が確認され
た。このことからこの毒性物資は血栓産生促進物質であ
ろうと予想した。事実、正常ヒト血漿のフィブリン産生
をこの8C細胞膜画分が促進することを見い出した。そこ
でこの毒性物質の性質を知るために、まずフィブリノー
ゲンに対する作用を検定したが作用は認められず、いわ
ゆるトロンビン様物質でないことを確認した。次いで種
々の精製された血液凝固因子に対する作用を検定した結
果、プロトロンビンからトロンビンへの変換作用（プロ
トロンビン活性化作用）を有することが判明し、他の因
子には何ら作用せず、ティッシュー・ファクター活性も
有せず、Xa因子とも異なることを確認した。さらに、驚
くべきことに、プロトロンビンフラグメント−１が本因
子の活性を阻害することを見いだした。このようにして
本発明者らは、新規なプロトロンビン活性化因子および
その阻害物質の存在を初めて確認し本発明を完成するに
到った。すなわち本発明は、哺乳動物細胞由来のプロト
ロンビン活性化因子であって、下記の性質を有するもの
である。1)プロトロンビンをトロンビンに変換する、2)
活性発現にCa++を要求する、3)EDTAにより失活する、4)
血液凝固因子Xaとは異なる、5)膜蛋白質である。および
本因子阻害物質であるプロトロンビンフラグメント−１
またはその誘導体を有効成分として含有することからな
る医薬組成物、である。プロトロンビンフラグメント−
１（以下、フラグメント−１と記す。）は、ヒトプロト
ロンビンの場合、Ｎ末端から分子量約 17000の 155アミ
ノ酸残基よりなるペプチドで、プロトロンビン活性化の
最初の段階でプレトロンビン−１に変換される際に切断
遊離されるものである。フラグメント−１の誘導体と
は、フラグメント−１のアミノ酸配列の全部またはその
一部を含むものであって、本因子阻害活性を有するもの
を意味する。また、それらペプチドのアミノ酸を欠失、
付加、置換したもの、及び化学的に修飾したものも含ま
れる。前述の如く、トロンビンは血液凝固とは別個の生
理作用が判明し、臨床的にも非常に注目されている。あ
る種の腫瘍患者において、血液凝固系の障害により癌細
胞へのフィブリンの沈着がみられるとの報告があること
から（Dvorak, H.F.,Hum. Pathol., 18, 275-284, 1987
）、この因子が癌の進展に関与している可能性があ
る。またプロトロンビンは肝臓のみならず、脳において
も発現していることから、トロンビンは脳組織において
も重要な役割を演ずると予想されている。事実、トロン
ビンを培養神経細胞に与えると速やかな形態変化（神経
突起が引っ込み細胞が丸くなる）が観察されており( Ja
link K. et al., J. Cell Biol., 118, 411-419, 1992
)、特にアルツハイマー病患者の脳にトロンビンの蓄積
が見られることからも脳疾患との関係に注目が集まって
いる（Wagner S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA., 86, 8284-8288, 1989 ; Akiyama H. et al., Neur
oscience Letters, 146, 152-154, 1992 )。実施例に記
載の如く、本発明因子はヒトグリア芽腫細胞株にも存在
していることから、本因子およびその阻害物質であるフ
ラグメント−１は、トロンビンの関与する疾患の治療用
医薬品開発のツールとして、特にアルツハイマー病など
の脳疾患への応用が期待されるものである。以下に本発
明を詳細に説明する。
【０００５】細胞の培養は、各々の細胞に応じて適切な
培養液を用い、通常の方法によって培養する。細胞成分
の分画は、適当な中性緩衝液にて細胞をホモジナイズ
し、常法に従い遠心分離により細胞膜画分、ミクロゾー
ム画分、細胞質画分を調製することができる。活性化因
子の精製は、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換
クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー
など常法に従い精製することができる。プロトロンビン
活性化作用の検定はヒトプロトロンビンを基質として検
体試料と反応させ、生成したトロンビン量をトロンビン
の基質、例えばVPR-pNA （Boc-Val-Pro-Arg-p-nitroani
lide）と反応させることにより定量することにより活性
化力価を測定することができる。なお本因子の性質を知
るために使用する、各種プロテアーゼ阻害剤、各種血液
凝固因子、各種細胞株は試薬として入手することができ
る。
培養液を用い、通常の方法によって培養する。細胞成分
の分画は、適当な中性緩衝液にて細胞をホモジナイズ
し、常法に従い遠心分離により細胞膜画分、ミクロゾー
ム画分、細胞質画分を調製することができる。活性化因
子の精製は、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換
クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー
など常法に従い精製することができる。プロトロンビン
活性化作用の検定はヒトプロトロンビンを基質として検
体試料と反応させ、生成したトロンビン量をトロンビン
の基質、例えばVPR-pNA （Boc-Val-Pro-Arg-p-nitroani
lide）と反応させることにより定量することにより活性
化力価を測定することができる。なお本因子の性質を知
るために使用する、各種プロテアーゼ阻害剤、各種血液
凝固因子、各種細胞株は試薬として入手することができ
る。
【０００６】
【実施例】本発明を以下の実施例をもって具体的に説明
するが、本発明はこれに限定されるものではない。 実施例１．細胞培養と細胞分画 ネコの腎臓由来繊維芽細胞株8Cをイーグル最小必須培養
液（Eagle's minimumessential medium, 10％熱不活化
胎児牛血清および60μg/mlカナマイシン含有）にて培養
増殖させた。コンフルエント培養後、等張トリス緩衝液
（TBS : 50mM Tris-HCl, 100mM NaCl, pH8.0）にてリン
スした後、細胞をかき取り50mM Tris-HCl (pH8.0) に懸
濁させ、テフロンホモジナイザーを用いてホモジナイズ
した。まず 600×g 5 分間遠心分離を行い細胞破片を除
去した後、 5,000×g 10分間次いで100,000 ×g 60分間
遠心分離を行い、細胞分画を行った。それぞれ順次、細
胞膜画分、ミクロゾーム画分、細胞質画分に相当し、活
性測定時にはそれぞれ TBSに懸濁し検定用試料とした。
8C細胞株がプロトロンビン活性化因子を放出しているか
どうかを確認するため、コンフルエントに培養した細胞
をEagle's MEM （血清を含まない）にて洗浄後、同栄養
液にて一晩培養し、その培養を採取した（conditioned
medium）。
するが、本発明はこれに限定されるものではない。 実施例１．細胞培養と細胞分画 ネコの腎臓由来繊維芽細胞株8Cをイーグル最小必須培養
液（Eagle's minimumessential medium, 10％熱不活化
胎児牛血清および60μg/mlカナマイシン含有）にて培養
増殖させた。コンフルエント培養後、等張トリス緩衝液
（TBS : 50mM Tris-HCl, 100mM NaCl, pH8.0）にてリン
スした後、細胞をかき取り50mM Tris-HCl (pH8.0) に懸
濁させ、テフロンホモジナイザーを用いてホモジナイズ
した。まず 600×g 5 分間遠心分離を行い細胞破片を除
去した後、 5,000×g 10分間次いで100,000 ×g 60分間
遠心分離を行い、細胞分画を行った。それぞれ順次、細
胞膜画分、ミクロゾーム画分、細胞質画分に相当し、活
性測定時にはそれぞれ TBSに懸濁し検定用試料とした。
8C細胞株がプロトロンビン活性化因子を放出しているか
どうかを確認するため、コンフルエントに培養した細胞
をEagle's MEM （血清を含まない）にて洗浄後、同栄養
液にて一晩培養し、その培養を採取した（conditioned
medium）。
【０００７】実施例２．プロトロンビン活性化測定法お
よび結果 ヒトプロトロンビン（10μM/TBS 5mM CaCl2 含有）と検
体試料とを37℃で30分間反応させた後、反応液の1/10量
の100mM EDTAを添加し反応を停止する。生成したトロン
ビン量は、VPR-pNA （Boc-Val-Pro-Arg-p-nitroanilid
e）を基質としてトロンビン活性を測定した。すなわち
反応を停止した反応液90μl （必要に応じて希釈）に5m
M VPR-pNA, 10 μl 添加、37℃にて反応させp-ニトロア
ニリン遊離初速度をカイネティク・プレートリーダー
（生化学工業社製）にて 405nmをモニターし測定した。
細胞分画物ではなく、インタクト細胞にプロトロンビン
活性化作用があるかどうか検定する場合は、96穴プレー
トに細胞を培養後リンスして、ウエルにヒトプロトロン
ビンEDTA, VPR-pNA を順次添加し、上記の方法をウエル
中にて実施し、測定した。測定結果を以下に記す。8C細
胞株の分画物については図１に示されるごとく、細胞膜
画分とミクロゾーム画分（いわゆる膜画分）に85％の活
性が回収された。またプロトロンビン活性化作用は8C細
胞株そのもの（インタクト細胞）にもみられ、0.7nM/mi
n トロンビンの生成がみられた。しかしコンディション
メディウム中には、20倍濃縮液においても活性は検出さ
れなかった。また8C細胞膜の高張もしくは低張緩衝液で
の洗浄液中には活性は検出されず、0.3 ％CHAPS (3-[(3
-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfoni
c acid])による洗浄液に活性が検出されたことから、本
活性因子は膜結合性蛋白質であろうと予想された。ヒト
プロトロンビン（10μM ）に8C細胞株の細胞膜画分（1m
g protein/ml）を添加した際の活性化曲線は図２に示す
如く、30分以内に80％以上がトロンビンに変換された。
またこの反応液をSDS-PAGEにて解析した結果（非還元条
件下）、ヒトプロトロンビン活性化による生成物は、Xa
因子による活性化の場合と同じく、α−トロンビンおよ
びF1フラグメントの生成が確認された。さらに、この8C
細胞株細胞膜画分により生成したα−トロンビンの N端
部アミノ酸配列を解析した結果、ヒトプロトロンビンの
285位スレオニン、および 321位イソロイシンから始ま
っていることが確認されたことから、本活性化因子はヒ
トプロトロンビンを選択的に、特異的部位を開裂させて
いることを意味している。このことから本因子は一種の
蛋白分解酵素である。またウシプロトロンビンに対して
も活性化作用を有した。なお、血液凝固因子 VII、 IX、
X に対する活性化作用は有していなかった。
よび結果 ヒトプロトロンビン（10μM/TBS 5mM CaCl2 含有）と検
体試料とを37℃で30分間反応させた後、反応液の1/10量
の100mM EDTAを添加し反応を停止する。生成したトロン
ビン量は、VPR-pNA （Boc-Val-Pro-Arg-p-nitroanilid
e）を基質としてトロンビン活性を測定した。すなわち
反応を停止した反応液90μl （必要に応じて希釈）に5m
M VPR-pNA, 10 μl 添加、37℃にて反応させp-ニトロア
ニリン遊離初速度をカイネティク・プレートリーダー
（生化学工業社製）にて 405nmをモニターし測定した。
細胞分画物ではなく、インタクト細胞にプロトロンビン
活性化作用があるかどうか検定する場合は、96穴プレー
トに細胞を培養後リンスして、ウエルにヒトプロトロン
ビンEDTA, VPR-pNA を順次添加し、上記の方法をウエル
中にて実施し、測定した。測定結果を以下に記す。8C細
胞株の分画物については図１に示されるごとく、細胞膜
画分とミクロゾーム画分（いわゆる膜画分）に85％の活
性が回収された。またプロトロンビン活性化作用は8C細
胞株そのもの（インタクト細胞）にもみられ、0.7nM/mi
n トロンビンの生成がみられた。しかしコンディション
メディウム中には、20倍濃縮液においても活性は検出さ
れなかった。また8C細胞膜の高張もしくは低張緩衝液で
の洗浄液中には活性は検出されず、0.3 ％CHAPS (3-[(3
-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfoni
c acid])による洗浄液に活性が検出されたことから、本
活性因子は膜結合性蛋白質であろうと予想された。ヒト
プロトロンビン（10μM ）に8C細胞株の細胞膜画分（1m
g protein/ml）を添加した際の活性化曲線は図２に示す
如く、30分以内に80％以上がトロンビンに変換された。
またこの反応液をSDS-PAGEにて解析した結果（非還元条
件下）、ヒトプロトロンビン活性化による生成物は、Xa
因子による活性化の場合と同じく、α−トロンビンおよ
びF1フラグメントの生成が確認された。さらに、この8C
細胞株細胞膜画分により生成したα−トロンビンの N端
部アミノ酸配列を解析した結果、ヒトプロトロンビンの
285位スレオニン、および 321位イソロイシンから始ま
っていることが確認されたことから、本活性化因子はヒ
トプロトロンビンを選択的に、特異的部位を開裂させて
いることを意味している。このことから本因子は一種の
蛋白分解酵素である。またウシプロトロンビンに対して
も活性化作用を有した。なお、血液凝固因子 VII、 IX、
X に対する活性化作用は有していなかった。
【０００８】実施例３．プロトロンビン活性化因子の性
質 １）分子量 CHAPS 抽出液をゲル濾過クロマトグラフィーにかけた結
果、活性は図３に示す溶出パタ−ンで約65〜70KDの位置
に溶出された。 ２）Ca++要求性 本因子活性発現にはCa++が必須であり、その結果は図４
に示した通り、生理的濃度が必要である。 ３）プロテアーゼ阻害剤の影響 本因子の性質を明確にするため、各種プロテアーゼ阻害
剤の影響を実験した。p-amidinophenylmethanesulfonyl
fluoride(1mM), Dns-EGRcK(1 μM, 1,5-dansyl-Glu-Gl
y-Arg-chloromethyl ketone), antithrombin III(0.1m
g/mlヘパリン5 units/ml 共存下）, diisopropyl fluor
ophosphate (10mM), phenylmethanesulfonyl fluoride
(1mM), benzamidine(10mM), leupeptin(1mM), pepstati
n(1mM), iodoacetamide(10mM) によって活性阻害はみら
れなかった。しかし大豆トリプシンインヒビタ− 0.1μ
M で約 50 ％の阻害を受けた。これらのことから本プロ
トロンビン活性化因子はセリンプロテアーゼ、カルボキ
シプロテアーゼ、チオールプロテアーゼではないと予測
された。 ４）血液凝固因子との関係 前項に記載した最初の二つの酵素阻害剤はXa因子の強力
な阻害剤であることから、本因子はXa因子とは異なるも
のであることが確認された。また本因子は 4℃保存で少
なくとも 1週間安定であるが、第V 因子は非常に不安定
であることから第V 因子とも異なる。本因子の活性化反
応系にXa因子を添加した場合、わずかな活性の上昇がみ
られるのみであり、活性化protein C 処理によっても本
因子活性の抑制はみられなかった。 ５）EDTAの効果 本因子はEDTAによる活性阻害がみられ、その結果は図５
に示す通りである。CHAPS 溶解本因子（1.5mg protein/
ml）を各種濃度のEDTAにて室温30分処理した後、プロト
ロンビン活性化作用を検定したものである。一方不溶化
状態の本因子の場合は、EDTAに対し抵抗性を示し、活性
抑制のためにはさらに長い時間EDTA処理が必要であっ
た。このことから本因子は金属プロテアーゼの可能性が
ある。
質 １）分子量 CHAPS 抽出液をゲル濾過クロマトグラフィーにかけた結
果、活性は図３に示す溶出パタ−ンで約65〜70KDの位置
に溶出された。 ２）Ca++要求性 本因子活性発現にはCa++が必須であり、その結果は図４
に示した通り、生理的濃度が必要である。 ３）プロテアーゼ阻害剤の影響 本因子の性質を明確にするため、各種プロテアーゼ阻害
剤の影響を実験した。p-amidinophenylmethanesulfonyl
fluoride(1mM), Dns-EGRcK(1 μM, 1,5-dansyl-Glu-Gl
y-Arg-chloromethyl ketone), antithrombin III(0.1m
g/mlヘパリン5 units/ml 共存下）, diisopropyl fluor
ophosphate (10mM), phenylmethanesulfonyl fluoride
(1mM), benzamidine(10mM), leupeptin(1mM), pepstati
n(1mM), iodoacetamide(10mM) によって活性阻害はみら
れなかった。しかし大豆トリプシンインヒビタ− 0.1μ
M で約 50 ％の阻害を受けた。これらのことから本プロ
トロンビン活性化因子はセリンプロテアーゼ、カルボキ
シプロテアーゼ、チオールプロテアーゼではないと予測
された。 ４）血液凝固因子との関係 前項に記載した最初の二つの酵素阻害剤はXa因子の強力
な阻害剤であることから、本因子はXa因子とは異なるも
のであることが確認された。また本因子は 4℃保存で少
なくとも 1週間安定であるが、第V 因子は非常に不安定
であることから第V 因子とも異なる。本因子の活性化反
応系にXa因子を添加した場合、わずかな活性の上昇がみ
られるのみであり、活性化protein C 処理によっても本
因子活性の抑制はみられなかった。 ５）EDTAの効果 本因子はEDTAによる活性阻害がみられ、その結果は図５
に示す通りである。CHAPS 溶解本因子（1.5mg protein/
ml）を各種濃度のEDTAにて室温30分処理した後、プロト
ロンビン活性化作用を検定したものである。一方不溶化
状態の本因子の場合は、EDTAに対し抵抗性を示し、活性
抑制のためにはさらに長い時間EDTA処理が必要であっ
た。このことから本因子は金属プロテアーゼの可能性が
ある。
【０００９】実施例４．本因子発現細胞および発現組織 8C細胞株のみならず他の細胞株も本因子を発現している
か否かを検定した結果を表１に示した。
か否かを検定した結果を表１に示した。
【００１０】
【表１】
【００１１】各細胞の破粋液（1mg protein/ml）の活性
測定データであるが、ヒト、イヌ、サル、マウス、ウサ
ギの細胞株においても活性が確認されたことから、本因
子は哺乳動物に共通して存在することを確認した。また
ヒト白血球細胞株（Jurkat）ではほとんど検出されず、
ヒトグリア芽腫細胞株（T98G）にかなり検出されたこと
から、本因子は組織特異性を有すると予想され、T98G細
胞での発現は脳組織における本因子の重要性が示唆され
た。またラットの各組織ホモジネイトについて本因子の
分布を検討した結果、脳、卵巣、腎臓、心臓、肝臓、
肺、脾臓すべてに本因子の活性が確認されたことから、
かなり広く分布しているものと考えられる。ヒトT98G細
胞株が発現する本因子の性質は、Ca++要求性、EDTA効果
など前記の8C細胞株の発現する因子と同じ性質を示し、
ゲルクロマトグラフィーにおいても同様の位置に溶出さ
れることが確認された。このことはヒトにおいてもプロ
トロンビン活性化因子が存在することを意味するもので
あり、このヒト因子は抗 X因子抗体処理によっても何ら
影響を受けなかったことから、Xa因子とは異なることを
確認した。
測定データであるが、ヒト、イヌ、サル、マウス、ウサ
ギの細胞株においても活性が確認されたことから、本因
子は哺乳動物に共通して存在することを確認した。また
ヒト白血球細胞株（Jurkat）ではほとんど検出されず、
ヒトグリア芽腫細胞株（T98G）にかなり検出されたこと
から、本因子は組織特異性を有すると予想され、T98G細
胞での発現は脳組織における本因子の重要性が示唆され
た。またラットの各組織ホモジネイトについて本因子の
分布を検討した結果、脳、卵巣、腎臓、心臓、肝臓、
肺、脾臓すべてに本因子の活性が確認されたことから、
かなり広く分布しているものと考えられる。ヒトT98G細
胞株が発現する本因子の性質は、Ca++要求性、EDTA効果
など前記の8C細胞株の発現する因子と同じ性質を示し、
ゲルクロマトグラフィーにおいても同様の位置に溶出さ
れることが確認された。このことはヒトにおいてもプロ
トロンビン活性化因子が存在することを意味するもので
あり、このヒト因子は抗 X因子抗体処理によっても何ら
影響を受けなかったことから、Xa因子とは異なることを
確認した。
【００１２】実施例 ５．本因子の阻害物質 本因子活性測定系において、基質であるヒトプロトロン
ビンの変わりにヒトプレトロンビン−１を用いて、実施
例２記載の方法で測定し、ヒトプレトロンビン−１も基
質となり得るかどうかを検討したところ、ヒトプレトロ
ンビン−１を活性化しないことが判明した。このことよ
り本因子のプロトロンビン活性化にフラグメント−１が
関与する可能性があると考え、本因子の活性化作用にお
けるフラグメント−１の影響を検討した。フラグメント
−１は常法により調製した（Methods in Enzymology ，
45，123-，1976；Academic Press）。その結果図６に示
すごとく、５μＭフラグメント−１は本因子の活性を約
75％抑制した。なお、この阻害は競合的阻害であり、そ
の Ki 値は 10-6 Ｍであった。
ビンの変わりにヒトプレトロンビン−１を用いて、実施
例２記載の方法で測定し、ヒトプレトロンビン−１も基
質となり得るかどうかを検討したところ、ヒトプレトロ
ンビン−１を活性化しないことが判明した。このことよ
り本因子のプロトロンビン活性化にフラグメント−１が
関与する可能性があると考え、本因子の活性化作用にお
けるフラグメント−１の影響を検討した。フラグメント
−１は常法により調製した（Methods in Enzymology ，
45，123-，1976；Academic Press）。その結果図６に示
すごとく、５μＭフラグメント−１は本因子の活性を約
75％抑制した。なお、この阻害は競合的阻害であり、そ
の Ki 値は 10-6 Ｍであった。
【００１３】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ネコ腎臓由来繊維芽細胞株8Cの細胞分画物の
プロトロンビン活性化活性の分布。
プロトロンビン活性化活性の分布。
【図２】 8C細胞株の細胞膜画分のヒトプロトロンビン
活性化作用。Xa因子による活性化量を 100％とした。
活性化作用。Xa因子による活性化量を 100％とした。
【図３】 プロトロンビン活性化因子のゲル濾過クロマ
トグラフィ−における溶出パタ−ン。
トグラフィ−における溶出パタ−ン。
【図４】 プロトロンビン活性化におけるCa++の効果。
【図５】 EDTAによるプロトロンビン活性化因子阻害効
果。
果。
【図６】 フラグメント−１によるプロトロンビン活性
化因子阻害効果。
化因子阻害効果。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成７年５月２２日
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
Claims (4)
- 【請求項１】哺乳動物細胞由来の下記の性質を有するプ
ロトロンビン活性化因子。 １）プロトロンビンをトロンビンに変換する活性を有す
る。 ２）活性発現にカルシウムイオンを要求する。 ３）EDTAにより失活する。 ４）血液凝固因子Xaとは異なる。 ５）膜蛋白質である。 - 【請求項２】哺乳動物細胞がヒト細胞である請求項１記
載のプロトロンビン活性化因子。 - 【請求項３】請求項１記載のプロトロンビン活性化因子
の阻害物質であるプロトロンビンフラグメント−１、ま
たはその誘導体を有効成分として含有することからなる
医薬組成物。 - 【請求項４】プロトロンビンフラグメント−１がヒトプ
ロトロンビンフラグメント−１である請求項３記載の医
薬組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6318082A JPH08176194A (ja) | 1994-12-21 | 1994-12-21 | プロトロンビン活性化因子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6318082A JPH08176194A (ja) | 1994-12-21 | 1994-12-21 | プロトロンビン活性化因子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08176194A true JPH08176194A (ja) | 1996-07-09 |
Family
ID=18095283
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6318082A Pending JPH08176194A (ja) | 1994-12-21 | 1994-12-21 | プロトロンビン活性化因子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08176194A (ja) |
-
1994
- 1994-12-21 JP JP6318082A patent/JPH08176194A/ja active Pending
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040908 |
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| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20050127 |