JPH08157499A - 新規な幹細胞マーカータンパク質をコードするヌクレオチド配列、該タンパク質のアミノ酸配列、該タンパク質の発現方法、単離したタンパク質の組成物、および該タンパク質に特異的な抗体 - Google Patents

新規な幹細胞マーカータンパク質をコードするヌクレオチド配列、該タンパク質のアミノ酸配列、該タンパク質の発現方法、単離したタンパク質の組成物、および該タンパク質に特異的な抗体

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JPH08157499A
JPH08157499A JP7015460A JP1546095A JPH08157499A JP H08157499 A JPH08157499 A JP H08157499A JP 7015460 A JP7015460 A JP 7015460A JP 1546095 A JP1546095 A JP 1546095A JP H08157499 A JPH08157499 A JP H08157499A
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 幹細胞に関連した新規なマーカータンパク質
をコードするヌクレオチド配列が提供される。このタン
パク質は、ヒト造血細胞抗原（hematopoietic cell ant
igen）より、ＨＣＡと称する。互いにスプライス変異型
であるような２つのヌクレオチド配列（ＨＣＡＳｅｑ．
１およびＨＣＡＳｅｑ．２）および該配列を含むベクタ
ーが提供される。これらのヌクレオチド配列によりコー
ドされるＨＣＡタンパク質（ＨＣＡＰｒｏ．１およびＨ
ＣＡＰｒｏ．２）のアミノ酸配列、これらのタンパク質
の発現および精製方法、純粋なタンパク質の組成物、お
よびこれらのタンパク質上の１つ以上のエピトープに高
い特異性で結合する抗体もまた提供される。 【効果】 得られた純粋なタンパク質の組成物を用い
て、タンパク質全体またはそのフラグメントの機能を標
準アッセイにより研究し得る。純粋なタンパク質の組成
物はまた、抗原として用いてタンパク質全体または特定
のフラグメントに対する抗体を生成し得る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明の分野は、新規な幹細胞マ
ーカータンパク質をコードするヌクレオチド配列の単離
である。
【０００２】
【従来の技術】本明細書に記載のすべての出版物は、本
明細書中にその全体が参考として援用される。
【０００３】哺乳類の造血（血液）細胞は、種々の範囲
の生理学的活性を提供する。血液細胞は、リンパ球系、
骨髄球系、および赤血球系に分けられる。リンパ球系
は、Ｂ細胞およびＴ細胞を含み、これらは、抗体の産
生、細胞免疫システムの調節、血液中の外来因子の検
出、宿主にとって外来である細胞の検出などを提供す
る。骨髄球系は、単球、顆粒球、および巨核球、ならび
に他の細胞を含み、外来物体の存在をモニターし、新生
物細胞に対する防御を提供し、外来物質を清掃し、血小
板を生成するなどを行う。赤血球系は、酸素キャリアと
して作用する赤血球を提供する。
【０００４】血液細胞の性質、形態、特徴、および機能
の多様性にも関わらず、現在の知識によれば、すべての
血液細胞が「幹細胞」と称される単一の前駆細胞群に由
来する。幹細胞は自己再生することができ、そして、特
定の系への分化および拡張にのみ関与する、系に傾倒し
た（lineage committed）前駆体になり得る。
【０００５】高度に精製された幹細胞群は、種々のイン
ビトロの実験およびインビボの指標に必要である。例え
ば、幹細胞には以下の用途が見出される：（１）幹細胞
の不足した宿主の造血システムの再生；（２）骨髄の除
去、幹細胞の単離、薬物または照射での宿主の処置、お
よび幹細胞の再移植による、宿主の疾病の処置；（３）
種々の造血細胞系の発達；（４）幹細胞の自己再生に関
連する成長因子の検出および評価；（５）幹細胞の特定
の系への傾倒の初期段階に関連する成長因子の検出およ
び評価；（６）血液細胞に有用な特性を付与するための
遺伝子治療の標的として；（７）癌患者の造血移植およ
び造血移植に関連した他の器官の移植を包含するがこれ
に限定されない、造血移植を包含する外科手術；および
（８）リンパ腫および白血病、ならびに他の新生物状態
の処置。従って、実質的に純粋な形態、または純粋な形
態でのヒト造血幹細胞を単離することを目指して世界的
な努力が払われている。
【０００６】造血細胞は、種々の細胞表面の「マーカ
ー」の存在により同定し得る。このようなマーカーは、
特定の系または前駆細胞に特異的であり得、または１つ
以上の細胞タイプで存在し得る。典型的には、幹細胞の
富化は、幹細胞に存在する表面マーカーを有する細胞の
ポジティブ選択および／または幹細胞に存在しない表面
マーカーを有する細胞を除去するネガティブ選択によ
る。例えば、幹細胞は、表現型のＬＩＮ-であり、これ
は、一般的に、幹細胞が、Ｔ細胞（ＣＤ２、３、４、お
よび８など）、Ｂ細胞（ＣＤ１０、１９、および２０な
ど）、骨髄細胞（ＣＤ１４、１５、および１６など）、
ナチュラルキラー（「ＮＫ」）細胞（ＣＤ２、１６、お
よび５６など）、および赤血球（グリコホリンＡなど）
に関連するマーカーを欠くことを意味する。タンパク質
マーカーの存在または非存在は、マーカーに特異的な抗
体の結合の有無により同定される。
【０００７】残念ながら、今日まで、幹細胞に特異的な
マーカーは同定されてなく、分化した細胞に関連するマ
ーカーの内のどの程度が幹細胞上に存在するかも明らか
ではない。例えば、当初は幹細胞特異的として同定され
たＣＤ３４もまた、非常に多くの、系に傾倒した細胞に
見出される：一方、ＣＤ３４+群の８０〜９０％は他の
系特異的および非特異的マーカーを有する。米国特許第
4,714,680号は、ＣＤ３４+細胞を含む組成物を記載して
いる。上記の不確定性の結果として、ヒト幹細胞の純粋
な組成物の単離が捕らえどころのないまま残されてい
る。幹細胞に関連する新しいマーカーの同定は、この目
的を達成する努力を大いに助ける。ヒト造血幹細胞の特
徴および単離は、Baumら、(1991) Proc. Natl. Acad. S
ci. USA；およびTsukamotoら、米国特許第5,061,620号
に報告されている。
【０００８】最近、マウス幹細胞が、精製された形態で
ないとしても、少なくとも高度に濃縮された形態で得ら
れ、骨髄から得られた約３０よりも少ない細胞が、致死
的に照射されたマウスの造血システムの全ての系を再構
成し得た。アッセイした各細胞は、全ての血液系につい
て多能性（multipotent）であるが、自己再生はこれら
の細胞間で可変性である。Spangrudeら、(1988) Scienc
e 241:58-62；Smithら、(1991) Proc. Natl. Acad. Sc
i. 88:2788-2792；Uchida、博士論文、スタンフォード
大学（1992）；および、マウス幹細胞の単離を記載して
いる欧州特許出願第89.304651.6号およびその中で引用
された参考文献も参照のこと。
【０００９】
【発明の要旨】幹細胞に関連した新規なマーカータンパ
ク質をコードするヌクレオチド配列が提供される。この
タンパク質は、ヒト造血細胞抗原（hematopoietic cell
antigen）より、ＨＣＡと称する。互いにスプライス変
異型であるような２つのヌクレオチド配列（ＨＣＡＳｅ
ｑ．１およびＨＣＡＳｅｑ．２）および該配列を含むベ
クターが提供される。これらのヌクレオチド配列により
コードされるＨＣＡタンパク質（ＨＣＡＰｒｏ．１およ
びＨＣＡＰｒｏ．２）のアミノ酸配列、これらのタンパ
ク質の発現および精製方法、純粋なタンパク質の組成
物、およびこれらのタンパク質上の１つ以上のエピトー
プに高い特異性で結合する抗体もまた提供される。1994
年７月29日に出願されたPCT/US94/08574は、ＨＣＡを認
識するモノクローナル抗体（F84.1 mAb）を用いるヒト
幹細胞の精製方法を提供する。
【００１０】従って、本発明によれば、図３に示すヌク
レオチドまたはそれに相補的なヌクレオチドの少なくと
も一部を含む組成物、ならびに、図４に示すヌクレオチ
ドまたはそれに相補的なヌクレオチドの少なくとも一部
を含む組成物が提供される。これらのヌクレオチドは、
少なくとも約２００塩基の長さであり得、または少なく
とも約１００塩基の長さであり得、または少なくとも約
５０塩基の長さであり得る。また、これらのヌクレオチ
ドは、少なくともヒトＨＣＡタンパク質のフラグメント
をコードするヌクレオチドであり得る。
【００１１】さらに、本発明によれば、単離した図５に
示すタンパク質またはそのフラグメントを含む組成物、
ならびに、単離した図６に示すタンパク質またはそのフ
ラグメントを含む組成物が提供される。これらのタンパ
ク質またはそのフラグメントに応答して生成される抗体
を含む組成物もまた提供される。
【００１２】さらに、本発明によれば、図３に示すヌク
レオチドまたはそれに相補的なヌクレオチドの少なくと
も一部を含む組換えベクター、ならびに、図４に示すヌ
クレオチドまたはそれに相補的なヌクレオチドの少なく
とも一部を含む組換えベクターが提供される。
【００１３】
【発明の構成】本明細書中で、ＨＣＡとは、F84.1 mAb
と称するモノクローナル抗体により認識されるエピトー
プを有するヒトタンパク質、およびこのタンパク質の全
ての変異型をいう。変異型は、図５〜図６に示すような
このタンパク質および融合タンパク質をコードするヌク
レオチド配列の代わりのプロセシングにより得られる変
異型を含むが、これに限定されない。本明細書中で、α
ＨＣＡとは、F84.1 mAb、およびＨＣＡに結合する全て
のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を意味
する。これはまた、F84.1 mAbと同様の抗原特異性を有
する全ての抗体を含む。
【００１４】ＨＣＡは、F84.1と称するラットタンパク
質を認識する、F84.1 mAbと称するモノクローナル抗体
により認識された。F84.1は、免疫グロブリンスーパー
ファミリーのメンバーであるBEN/DM-GRASP/SC1と呼ばれ
るニワトリタンパク質と同様の分布で、ラット神経系に
発現される。Pourquieら、(1992) Dev. Bio. 89:5261-5
265。BEN/DM-GRASP/SC1への抗体もまたヒト胚運動ニュ
ーロンを認識した。Pourquieら、「Expression des pro
teines d'adherence BEN/SC1/DM-GRASP et Tag-1pendan
t l'axogenese des motoneurones humans」(1994)。BEN
/DM-GRASP/SC1を認識するモノクローナル抗体もまた、
分化しているＴ細胞、ＣＤ４+ＣＤ８+Ｔ細胞ならびに骨
髄球および赤血球前駆体を含むがＢ細胞を含まない、ト
リ造血細胞を染色した。Corbelら、(1992) Exp. Cell R
es. 203:91-99。F84.1およびBEN/DM-GRASP/SC1の同様の
神経系分布は、F84.1がBEN/DM-GRASP/SC1のラット相同
体であるという仮説を導き出した。F84.1のＮ−末端の
配列決定は、この仮説を支持した。Princeら、(1992) D
evel. Br. Res. 68:193-201。同様に、KG-CAMと呼ばれ
るタンパク質は、BEN/DM-GRASP/SC1の他のラット相同体
であると提案された。Peduzziら、(1994) Brain Res. 6
40:296-307。ヒト造血幹細胞上で発現されるＨＣＡのF8
4.1 mAbによる認識は、ＨＣＡが、ラットタンパク質で
あるF84.1およびKG-CAMならびにニワトリタンパク質で
あるBEN/DM-GRASP/SC1のヒト相同体であるという仮説を
導き出した。
【００１５】１つの実施態様では、本発明はＨＣＡをコ
ードするヌクレオチド配列を提供する。互いにスプライ
ス変異型であるような２つの異なるヌクレオチド配列
（ＨＣＡＳｅｑ．１およびＨＣＡＳｅｑ．２）が提供さ
れる。ＨＣＡをコードするヌクレオチド配列は、実施例
１に示す縮重プライマーを用いるＲＴ−ＰＣＴクローニ
ング（図１）により、骨髄ＣＤ３４+ｃＤＮＡライブラ
リーから単離された。
【００１６】他の実施態様では、ＨＣＡ変異型をコード
するヌクレオチド配列（例えば、他の代わりにプロセス
された配列またはＨＣＡ融合および欠失タンパク質をコ
ードする配列）が提供される。代わりにプロセスされた
ヌクレオチド配列とは、配列は互いに異なるが同じゲノ
ム領域由来であるｍＲＮＡに対応するヌクレオチド配列
として定義される。例えば、１）代わりのプロモーター
の使用；２）代わりのポリアデニル化部位の使用；また
は３）代わりのスプライス部位の使用により得られるｍ
ＲＮＡに対応するものである。
【００１７】本明細書中で、ヌクレオチドは、ＲＮＡ、
ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成型、混合ポリマー、セン
スおよびアンチセンス鎖、および全長ｃＤＮＡ配列より
短いヌクレオチドを包含する。好ましくは、ヌクレオチ
ドは、少なくとも２００塩基の長さである。より好まし
くは、ヌクレオチドは１００塩基の長さである。最も好
ましくは、ヌクレオチドは５０塩基の長さである。ポリ
ヌクレオチドは、通常、少なくとも約１２〜１５ヌクレ
オチド（または塩基対）に対応する配列を含み、さらに
通常には約２１ヌクレオチドであり、そして最も好まし
くは少なくとも約３５ヌクレオチドであり、その長さ
は、所望の用途に依存する。１つ以上のイントロンもま
た存在し得る。全ての場合に、ヌクレオチドはヒト配列
に特異的であり、そして他の供給源由来の配列と同じま
たは相同ではない。
【００１８】ポリヌクレオチドは、化学的または生化学
的に改変され得るか、あるいは非天然または誘導化され
たヌクレオチド塩基を含み得る。ヌクレオチドは、少な
くともＨＣＡタンパク質のフラグメントをコードするｍ
ＲＮＡ、およびＨＣＡタンパク質をコードするＤＮＡま
たはｍＲＮＡのいずれかに結合し得る他のヌクレオチド
に相補的であり得る。これらの相補的ヌクレオチドに
は、三重らせんを形成し得るヌクレオチドおよびアンチ
センスヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。
相補的ヌクレオチドは、ベクターにより内因的に発現さ
れ得るか、またはオリゴヌクレオチド療法の分野で公知
の方法により外因的に付加され得る。Reedら、(1990) C
ancer Res. 50:6565-6570。天然に生じる以外の配列を
含む組換えポリヌクレオチドもまた、本発明により提供
される。野生型ヌクレオチド配列の代わりの型もまた提
供され、これには、欠失、挿入、１つ以上のヌクレオチ
ドの置換によるもの、または他のポリヌクレオチド配列
への融合によるものを含むがこれらに限定されない。
【００１９】適当なｃＤＮＡおよびゲノムライブラリー
を構築する方法、目的の配列のためのライブラリーをス
クリーニングする方法、適切なプローブまたはプライマ
ー（例えばＰＣＲプライマー）を調製する方法、ポリヌ
クレオチドの精製、増幅、およびサブクローニングの方
法、および宿主細胞の形質転換方法、および本発明の実
施に適当な組換えＤＮＡ法の他の技法を提供する文献と
して、特に、Sambrookら編、Molecular Cloning: A Lab
oratory Manual,第2版,Vol.1-3,Cold Spring Harbor La
boratory Press(1989)；Ausubelら編、Current Protoco
ls in Molecular Biology,Greene Publishing and Wile
y-Interscience, New York(1987および定期的最新版)；
およびPCR Protocols: A Guide to Methods and Applic
ations,Innisら編、Academic Press: San Diego (1990)
がある。このような技法に適用するのに有用な試薬（例
えば、制限酵素、発現ベクター、標識など）は、当該分
野で公知であり、そしてNew England BioLabs、Boehrin
ger Mannheim、Amersham、Promega Biotec、U. S. Bioch
emicals、New England Nuclearなどの業者、および他の
多くの商業的供給源から入手可能である。
【００２０】他の実施態様では、ＨＣＡをコードする配
列に相同なヌクレオチドが提供される。ヌクレオチドま
たはそのフラグメントは、以下の条件を満たす場合に、
他方に「実質的に相同」（または「実質的に同様」）で
ある：他方のヌクレオチド（またはその相補鎖）ととも
に（適当なヌクレオチドの挿入または欠失で）最適に整
列させた場合に、少なくとも約６０％のヌクレオチド塩
基、通常は少なくとも約７０％、さらに通常は少なくと
も約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、そしてよ
り好ましくは少なくとも約９５〜９８％のヌクレオチド
塩基においてヌクレオチド配列の同一性があること。Ｈ
ＣＡをコードするが、遺伝子コードの縮重に適合するヌ
クレオチドの置換を有するヌクレオチドもまた含まれ
る。
【００２１】あるいは、ヌクレオチドまたはそのフラグ
メントが選択的ハイブリダイゼーション条件下で他方の
ヌクレオチド（またはその相補鎖）にハイブリダイズす
るとき、実質的相同性（または類似性）が存在する。目
的の標的ヌクレオチドを他のポリヌクレオチドから識別
させるハイブリダイゼーション条件下で、ハイブリダイ
ゼーションの選択性が存在する。典型的には、選択的ハ
イブリダイゼーションは、少なくとも約１４ヌクレオチ
ドの範囲にわたって少なくとも約５５％の類似性、好ま
しくは少なくとも約６５％、より好ましくは少なくとも
約７５％、そして最も好ましくは少なくとも約９０％で
あるとき生じる。Kanehisa (1984) Nuc.Acids Res. 12:
203-213を参照のこと。上記のような相同性の比較の長
さは、より長い範囲にわたり得、そしてある実施態様で
は、しばしば少なくとも約１７〜２０ヌクレオチド、そ
して好ましくは少なくとも約３６以上のヌクレオチドの
範囲にわたる。
【００２２】ヌクレオチドのハイブリダイゼーション
は、塩基組成、相補鎖長、およびハイブリダイズするポ
リヌクレオチド間のヌクレオチド塩基ミスマッチ数に加
えて、塩濃度、温度、または有機溶媒などの条件により
影響され、これらは当業者に容易に理解される。ストリ
ンジェント温度条件は、一般に、３０℃を超える温度、
典型的には３７℃を超える温度、そして好ましくは４５
℃を超える温度を含む。ストリンジェント塩条件は、通
常は１Ｍ未満、典型的には５００ｍＭ未満、そして好ま
しくは２００ｍＭ未満である。しかし、パラメーターの
組み合わせは、任意の単一のパラメーターの範囲よりも
さらに重要である。WetmurおよびDavidson(1968) J. Mo
l. Biol. 31:349-370。
【００２３】「単離した」または「実質的に純粋な」ヌ
クレオチドは、天然で本来のヌクレオチド配列に付随す
る他のヌクレオチドから実質的に分離されたヌクレオチ
ドである。この用語は、その天然に存在する環境から取
り出されたヌクレオチド配列を包含し、そして組換えま
たはクローン化ＤＮＡ単離体、および、化学合成アナロ
グまたは異種システムにより生物学的に合成されたアナ
ログを含む。
【００２４】ヌクレオチドは、その本来の状態でまたは
当業者に周知の方法により操作されたときに、転写およ
び／または翻訳されてポリペプチドまたはそのフラグメ
ントを生成し得る場合、ポリペプチドを「コードする」
といわれる。このようなポリヌクレオチドのアンチセン
ス鎖もまた、その配列をコードするといわれる。
【００２５】ポリヌクレオチド配列は、他のポリヌクレ
オチド配列との機能的関係に置かれるとき、作動可能に
連結される。例えば、プロモーターが転写または発現に
影響を与えるとき、プロモーターはコーディング配列に
作動可能に連結される。一般に、作動可能に連結される
とは、連結される配列が隣接していることを意味し、２
つのタンパク質コーディング領域を接続することが必要
な場合は、隣接しそしてリーディングフレーム中にある
ことを意味する。しかし、特定の遺伝要素（例えばエン
ハンサー）が離れていてさえも、すなわち隣接していな
くても、作動可能に連結され得ることは周知である。
【００２６】「組換え」ポリヌクレオチドという用語
は、遺伝子工学技法によりまたは化学合成により単離し
たポリヌクレオチドのセグメントの人為的操作により得
られる、２つの（当該操作がなければ分離している）配
列のセグメントの組み合わせにより作製されるポリヌク
レオチドをいう。そのようにして、所望の機能のポリヌ
クレオチドセグメントを接合して、所望の機能の組み合
わせを生成し得る。
【００２７】ポリヌクレオチドプローブは、標識または
リポーター分子に付着した、単離したポリヌクレオチド
を含み、そして他の配列を同定しそして単離するのに用
いられ得る。合成オリゴヌクレオチドまたは他のポリヌ
クレオチドを包含するプローブは、天然に存在するまた
は組換えの一本鎖または二本鎖核酸由来であり得、ある
いは化学的に合成され得る。ポリヌクレオチドプローブ
は、当業者に公知の任意の方法（例えば、ランダムヘキ
サマー標識化、ニックトランスレーション、またはクレ
ノウ充填(fill-in)反応）により標識され得る。
【００２８】大量のポリヌクレオチドが、適切な宿主細
胞中で複製により生成され得る。タンパク質またはその
フラグメントをコードする天然または合成ＤＮＡフラグ
メントは、原核細胞または真核細胞に導入しおよびその
中で複製し得る組換えポリヌクレオチド構築物、典型的
にはＤＮＡ構築物中に導入される。通常は、構築物は、
酵母または細菌などの単一細胞宿主中での複製に適切で
あるが、多細胞真核宿主もまた、その宿主細胞のゲノム
内への組み込みを伴う場合にまたは伴わない場合に、適
切であり得る。通常用いられる原核宿主には、Escheric
hia coliの株が含まれるが、Bacillus subtilisまたはP
seudomonasなどのほかの原核生物もまた用いられ得る。
哺乳動物または他の真核宿主細胞には、酵母、糸状菌、
植物、昆虫、両生類、または鳥種が含まれる。操作の容
易さ、発現したタンパク質を適切にグリコシル化する能
力、タンパク質発現の程度および制御、細胞内夾雑物か
らの発現したタンパク質の精製の容易さなどの要素また
は他の要素が、宿主細胞の選択を決定し得る。
【００２９】ポリヌクレオチドはまた、化学合成によ
り、例えば、BeaucageおよびCarruthers (1981) Tetra.
Letts. 22:1859-1862により記載されているホスホルア
ミダイト法、または、Matteucciら、(1981) J. Am. Che
m. Soc. 103:3185に従ったトリエステル法により生成さ
れ得、そして市販の自動化オリゴヌクレオチド合成機で
行われ得る。二本鎖フラグメントは、相補鎖を合成して
適当な条件下で鎖を共にアニールすることによって、あ
るいは適当なプライマー配列と共にＤＮＡポリメラーゼ
を用いて相補鎖を付加することによって、化学合成の一
本鎖生成物から得られ得る。
【００３０】他の実施態様では、発現システムが、組換
えＨＣＡタンパク質の生成のために提供される。発現シ
ステムは、適当な宿主細胞中に形質転換されたとき、タ
ンパク質を発現し得るポリヌクレオチドとして定義され
る。このポリヌクレオチドは、天然のタンパク質をコー
ドするポリヌクレオチドまたはそのフラグメントに実質
的に類似のヌクレオチド配列を有する。
【００３１】原核または真核宿主中への導入のために調
製される発現システムは、典型的には、宿主により認識
される複製システムを含み、所望のポリペプチドをコー
ドする意図されたＤＮＡフラグメントを含む。そして、
好ましくは、ポリペプチドをコードするセグメントに作
動可能に連結した転写および翻訳開始調節配列もまた含
む。発現システム（発現ベクター）は、例えば、複製起
点または自律複製配列（ＡＲＳ）および発現制御配列、
プロモーター、エンハンサー、および必要なプロセシン
グ情報部位（例えば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプ
ライス部位、ポリアデニル化部位）、転写終結配列、お
よびｍＲＮＡ安定化配列を含み得る。シグナルペプチド
をコードしているＤＮＡもまた、同一または関連種の分
泌されたポリペプチドから、適切な場合は含まれ得、タ
ンパク質を細胞膜に交差させおよび／または留まらせ、
または細胞から分泌させる。
【００３２】適当なプロモーターおよび他の必要なベク
ター配列の選択は、宿主中で機能的であるように選択さ
れる。細胞株および発現ベクターの作動し得る組み合わ
せの例は、Sambrookら、1989；Ausubelら、1987；およ
びMetzgerら、(1988) Nature334:31-36に記載されてい
る。細菌、酵母、哺乳動物、昆虫、植物、または他の細
胞での発現に有用な多くのベクターが当該分野で周知で
あり、そしてStratagene、New England Biolabs、Prome
ga Biotechなどの業者から入手し得る。さらに、構築物
は増幅可能な遺伝子（例えばＤＨＦＲ）に接合され得、
そのため遺伝子の多くのコピーが作製され得る。適当な
エンハンサーおよび他の発現制御配列については、Enha
ncers and Eukaryotic Gene Expression、Cold Spring
Harbor Press、N.Y. (1983)も参照のこと。このような
発現ベクターは自律的に複製し得る一方、宿主細胞のゲ
ノム中に挿入されることにより（あまり好ましくはない
が）複製し得る。
【００３３】発現およびクローニングベクターは、好ま
しくは選択可能なマーカーを含む。選択可能なマーカー
は、ベクターで形質転換された宿主細胞の生存または増
殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子により生成さ
れる。このような選択可能な遺伝子はまた、宿主細胞中
に発現ベクターと共に同時導入される他のポリヌクレオ
チド配列上に存在し得る。選択可能な遺伝子が導入され
た宿主細胞のみが選択的条件下で生存および／または増
殖する。典型的な選択遺伝子は、(a)抗生物質または他
の毒性物質（例えばアンピシリン、ネオマイシン、メト
トレキセートなど）への耐性を与え；(b)独立栄養欠失
を補い；または(c)複合培地から得られない重要な栄養
を供給するタンパク質をコードする。適切な選択可能な
マーカーの選択は、宿主に依存し、そして種々の宿主に
適切なマーカーが当該分野で公知である。
【００３４】目的のポリヌクレオチドを含むベクター
は、多くの適当な手段のうち任意のものにより宿主細胞
に導入され得る。適当な手段には、エレクトロポレーシ
ョン；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシ
ウム、DEAE-デキストラン、または他の物質を用いるト
ランスフェクション；ミクロ射出体衝撃；リポフェクシ
ョン；感染（ベクターがレトロウイルスゲノムなどの感
染因子である場合）が含まれる。このような手段の選択
は、しばしば宿主細胞に依存する。
【００３５】大量の本発明のポリヌクレオチドおよびポ
リペプチドが、適切な原核のまたは真核の宿主細胞を、
適合可能なベクターまたは他の発現ベヒクル中でのタン
パク質をコードする本発明のポリヌクレオチドを用いて
形質転換して、このように形質転換した宿主細胞を、タ
ンパク質をコードする遺伝子の発現を達成するのに適切
な条件下で培養することにより、調製され得る。タンパ
ク質は、次いで、宿主細胞から回収されて、標準的技法
を用いて精製され得る。内因性遺伝子もまたタンパク質
の生成に用いられ得る。本来の発現は、少量のタンパク
質に適切であり得、そして発現レベルは発現の上流の活
性化により上昇され得る。上流活性化の方法は公知であ
り、相同的組換えによる、内因性ＨＣＡ遺伝子の上流へ
の活性化配列の挿入を包含する。
【００３６】他の実施態様では、非造血幹細胞、特に神
経系の幹細胞を同定する方法が提供される。ＨＣＡは、
現在、Thy-1、c-kit、およびLIF-レセプターを含む、神
経および造血システムの両方で発現される一群のマーカ
ーの一つであることが見出されている。神経発達の間に
おいて、ＨＣＡは、多数の原始細胞（primitive cell
s）を有する領域で高度に発現される。従って、本発明
の１つの実施態様では、非造血幹細胞の同定は、ＨＣＡ
の発現をモニターすることにより提供される。細胞を同
定する方法は、ｍＲＮＡおよびタンパク質の検出の分野
で公知の全てを含む。神経幹細胞を単離し操作する適切
な方法は当該分野で公知であり、例えば、以下に記載さ
れている：ReynoldsおよびWeiss (1992) Science 255:1
707；Hallら(1989) Development 106:619；Pottenら(19
90) Crypt. Development 110:100；Dupinら(1990) Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 87:1119；およびＰＣＴ公開
第WO94/16718号。
【００３７】本発明の他の実施態様では、精製されたＨ
ＣＡタンパク質が提供される。ＨＣＡタンパク質の推定
されたアミノ酸配列が提供される。タンパク質は組換え
発現システム、本来の供給源から単離され得、または合
成的に製造され得る。好ましくは、タンパク質は、他の
細胞内成分から、少なくとも部分的に精製される。好ま
しくは、タンパク質は少なくとも５０％純粋である。さ
らに好ましくは、タンパク質は、５０〜７５％純粋であ
る。さらに高度に精製されたタンパク質もまた入手され
得、そして本発明に包含される。
【００３８】ＨＣＡタンパク質またはＨＣＡ融合タンパ
ク質を発現し、発現したタンパク質を精製する方法が提
供される。組換えＤＮＡによりまたは内因性の遺伝子か
らのいずれかで発現されたＨＣＡタンパク質の精製また
は単離は、当該分野で公知の任意の方法により達成され
得る。抗体産生のためには、タンパク質は好ましくは高
度に精製されており、通常は約９９％純粋であり、そし
てパイロジェンおよび他の夾雑物を含まない。
【００３９】タンパク質精製の適切な方法は当該分野で
公知であり、アフィニティークロマトグラフィー、免疫
アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマ
トグラフィー、ＨＰＬＣ、およびＦＰＬＣを含むがこれ
らに限定されない。タンパク質の実質的な分解を生じな
い全ての精製スキームが本発明での使用に適切である。
【００４０】本発明は、特性に著しい影響を与えないＨ
ＣＡタンパク質の機能的等価の変異型、および、全体と
して同一のアミノ酸配列を保持するが、活性が増強また
は低減された変異型を包含する。例えば、アミノ酸残基
の保存的置換、１つまたは数個のアミノ酸の欠失または
付加、およびアミノ酸アナログによるアミノ酸残基の置
換は、本発明の範囲内である。ＨＣＡタンパク質の特性
に著しい影響を与えないいかなる保存的アミノ酸置換
も、本発明に包含される。互いに保存的に置換され得る
アミノ酸残基は、以下のものを包含するが、これらに限
定されない：グリシン／アラニン；バリン／イソロイシ
ン／ロイシン；アスパラギン／グルタミン；アスパラギ
ン酸／グルタミン酸；セリン／トレオニン；リジン／ア
ルギニン；およびフェニルアラニン／チロシン。
【００４１】他の実施態様では、ＨＣＡおよび全ての変
異型またはそのフラグメントに特異的に結合し得る、ポ
リクローナル抗体および／またはモノクローナル抗体、
またはそれらの機能的部分が提供される。抗体という用
語は、均一な分子体、または複数の種々の分子体からな
る血清産物などの混合物、の両方をいうのに用いられ
る。ＨＣＡタンパク質と反応するモノクローナルまたは
ポリクローナル抗体は、当該分野で公知の方法により作
成され得る。例えば、HarlowおよびLane、(1988)Antibo
dies: A Laboratory Manual, CSH Laboratories；Godin
g (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Pra
ctice、第2版、Academic Press、New York；およびAusu
belら、(1987)を参照のこと。また、組換え免疫グロブ
リンも、当該分野で公知の方法により生成され得、公知
の方法には米国特許第4,816,567号に記載されている方
法を含むがこれに限定されない。１０8Ｍ-1の親和性、
好ましくは１０9〜１０10またはそれ以上の親和性を有
するモノクローナル抗体が好ましいが、ただし多くの適
用に関して、より低い親和性が競合的放出システムに好
ましくあり得る。
【００４２】タンパク質に特異的な抗体は、造血源およ
び他の供給源の両方から幹細胞を精製するのに有用であ
り得る。このような抗体は、モノクローナルまたはポリ
クローナルのいずれであっても、免疫源として精製ＨＣ
Ａを利用する当該分野で公知の方法により作成され得
る。しばしば、ポリペプチドおよび抗体は、検出可能な
シグナルを与える物質に共有結合または非共有結合のい
ずれかで結合することにより標識される。適切な標識に
は、放射性核種、酵素、基質、補因子、インヒビター、
蛍光剤、化学発光剤、磁気粒子などが含まれるが、これ
らに限定されない。このような標識の使用を記載する米
国特許としては、第3,817,837号；第3,850,752号；第3,
939,350号；第3,996,345号；第4,277,437号；第4,275,1
49号；および第4,366,241号が挙げられる。
【００４３】以下の実施例は例示であって、本発明を限
定するものではない。
【００４４】
【実施例】
［実施例１］ＨＣＡをコードするヌクレオチド配列の単
離 ＨＣＡをコードするヌクレオチド配列を、逆転写酵素Ｐ
ＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）クローニングにより単離した（図
１）。縮重した５’および３’オリゴヌクレオチドプラ
イマーを作成した。これらのプライマー（ＨＣＡ５１お
よびＨＣＡ３１）は以下の配列を有する：
【００４５】
【化９】
【００４６】ＨＣＡ５１およびＨＣＡ３１を用いて、Ｃ
Ｄ３４選択したヒト骨髄（ＨＢＭ）細胞から、ＲＴ−Ｐ
ＣＲにより、ＨＣＡの細胞外ドメインをコードするヌク
レオチド配列を単離した。1.4 kbフラグメントが優先的
に増幅された（ＨＣＡ１．４）。このフラグメントを精
製し、ｐＣＲＩＩベクターにクローン化し、そして配列
決定して、これがKG-CAMおよびBEN/DM-GRASP/SC1の細胞
外ドメインの配列に類似のペプチドをコードすることを
確認した。２つの全長ＨＣＡ配列を同定した。第１の配
列は、３つの重複するクローンから得た（図２）。ＨＣ
Ａｇｔ１１は、λｇｔ１１ヒト脳ｃＤＮＡライブラリー
から、放射標識したＨＣＡ１．４のライブラリー中の配
列へのハイブリダイゼーションにより単離した。ＨＣＡ
５ｅｘｔは、５’ＲＡＣＥを用いてＨＢＭ ｃＤＮＡか
ら単離した。第２のヌクレオチド配列は、ＲＴ−ＰＣＲ
を用いてヒトＣＤ３４+細胞ｃＤＮＡから得た。全長の
ヌクレオチド配列（図３および図４）および対応するタ
ンパク質の推定アミノ酸配列（図５および図６）の両方
が提供される。２つのヌクレオチド配列は、配列の３’
末端付近のスプライス部位の選択的な使用の結果とし
て、互いに異なると思われ、各配列が特異的なヌクレオ
チドを有するという結果を得る。これらのヌクレオチド
を太字で示す。これらの２つのヌクレオチド配列により
コードされるタンパク質もまた、それらのカルボキシ末
端付近で互いに異なり、各タンパク質配列は特異的なア
ミノ酸を含んでいる。これらのアミノ酸もまた太字で示
す。上記の差異に加えて、タンパク質全体にわたり、ア
ミノ酸交換を生じる単一のヌクレオチドの差異がある。
これらの差異もまた太字で示す。単一のヌクレオチド交
換の起源は不明である。ＨＣＡは、ノーザンブロット分
析により、発育の初期および成人の両方における多くの
ヒト組織で発現することが示された（図７）。
【００４７】［実施例２］ＨＣＡ／Ｆｃ融合タンパク質
の発現およびF84.1 mAbがこの融合タンパク質を認識す
ることの証明 ＨＣＡの細胞外ドメインとＦｃとの間の融合タンパク質
を生成し、そしてこれがF84.1 mAbにより認識されるこ
とを示した。融合タンパク質を生成するために、タンパ
ク質の細胞外ドメインをコードするＨＣＡヌクレオチド
配列の部分を、以下のようにｐＣＤ５ｎｅｇ−１発現ベ
クターにクローン化した。ＰＣＲ反応を、テンプレート
としてｐＣＲＩＩ中のＨＣＡ１．４を用いて、そしてＳ
ｐｅＩ部位を含む５’プライマーおよびＢａｍＨＩ部位
を含む３’プライマーを用いて行った。増幅したＤＮＡ
フラグメントをＳｐｅＩおよびＢａｍＨＩで切断し、ｐ
ＣＤ５ｎｅｇ−１ベクターにクローン化した。得られた
構築物（pCD5neg-1/HCA1.4）を図８に示す。この構築物
をＣＯＳ７細胞にトランスフェクトしてＨＣＡ−Ｆｃ融
合タンパク質（ＨＣＡＦｃ）を生成した。融合タンパク
質をプロテインＡ上でＣＯＳ７上清から精製した。
【００４８】F84.1 mAbがＨＣＡＦｃを認識すること
を、ＥＬＩＳＡおよびバイオセンサーアッセイを用いて
証明した。ＥＬＩＳＡアッセイについては、ＨＣＡＦｃ
を、Immulon 4 ELISAプレート上に、５０mMの炭酸塩／
重炭酸塩緩衝液（pH 9.6）中で１０μg/mlで一晩コート
した。プレートを、0.05％のTween-20、ＰＢＳ（pH 7.
2）中の２％ウシ血清アルブミンを用いて、室温で１時
間ブロックし、次いでF84.1 mAbまたは適切なコントロ
ール（ＩｇＧ１）を含むサンプルを加えた。コントロー
ルは１０μg/mlで行ったが、ハイブリドーマ上清は未希
釈または１／５希釈物をテストした。
【００４９】室温で１時間のモノクローナル抗体のイン
キュベーションの後、プレートをＰＢＳ／0.05％ Tween
-20を用いて洗浄し、続いてアルカリホスファターゼで
標識したヤギ抗マウスＩｇとともに（１／１０００希
釈）、室温で１時間プレートをインキュベーションし
た。プレートを洗浄し、基質としてＰＮＰＰを用いて展
開した。反応を１０mMのＥＤＴＡを用いて停止し、４０
５ｎｍで読みとった。結果は、Ｆ８４．１抗体がＨＣＡ
Ｆｃを認識することを示した。
【００５０】バイオセンサーアッセイについては、ウサ
ギ抗マウスＦｃをＮＨＳ／ＥＤＣ中５０μg/mlでＣＭ５
バイオセンサーチップに共有結合させ、続いて製造者の
指示（Pharmacia）に従ってエタノールアミンでブロッ
クした。Ｆ８４．１ハイブリドーマ上清を５μl/分でセ
ルに注入した。これに続いて、精製したＨＣＡ−Ｆｃを
５μl/分で注入した。共鳴ユニット（ＲＵ）の差を測定
した。この差は、F84.1 mAbのＨＣＡＦｃへの結合を示
す（図９）。これらのアッセイの結果は、F84.1mAbがＨ
ＣＡＦｃを認識することを証明する。
【００５１】得られた純粋なタンパク質の組成物を用い
て、タンパク質全体またはそのフラグメントの機能を標
準アッセイにより研究し得る。純粋なタンパク質の組成
物はまた、抗原として用いてタンパク質全体または特定
のフラグメントに対する抗体を生成し得る。
【００５２】上記の発明は、明瞭さおよび理解の目的で
の例示および実施例により詳細に記載しているが、一定
の変更および改変を実施し得ることは当業者には明らか
である。従って、これらの記載および実施例は、請求の
範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではな
い。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＨＣＡをコードするヌクレオチド配列の単離に
用いられたＲＴ−ＰＣＲクローニングアプローチの概略
を示す図である。
【図２】２つの同定された全長ＨＣＡヌクレオチド配列
の１つを推定するのに用いられた３つのゲノムクローン
の構造を示す図である。
【図３】同定されたＨＣＡの全長のヌクレオチド配列で
あるＨＣＡＳｅｑ．１を示す図である。
【図４】同定されたＨＣＡの全長のヌクレオチド配列で
あるＨＣＡＳｅｑ．２を示す図である。
【図５】図３のヌクレオチド配列によりコードされるタ
ンパク質の推定アミノ酸配列（ＨＣＡＰｒｏ．１）を示
す図である。
【図６】図４のヌクレオチド配列によりコードされるタ
ンパク質の推定アミノ酸配列（ＨＣＡＰｒｏ．２）を示
す図である。
【図７】プローブとして放射標識したＨＣＡ１．４を用
いた種々のヒト組織のノーザン分析を示す図である。
【図８】発現構成物pcD5neg-1/HCA1.4を示す図である。
【図９】F84.1 mAbがＨＣＡおよびＦｃの融合タンパク
質を認識することを証明する、バイオセンサーアッセイ
の結果を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9452−4Ｂ 21/08 9358−4Ｂ // Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 9453−4Ｂ (72)発明者 ジ ヤン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94025, メンロ パーク，コールマン アベニュー 600 (72)発明者 ノブコ ウチダ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94301, パロ アルト，ハイ ストリート 223 (72)発明者 デイビッド ギアリング アメリカ合衆国 カリフォルニア 94040, マウンテン ビュー，クリーデン ウェイ 2103 (54)【発明の名称】 新規な幹細胞マーカータンパク質をコードするヌクレオチド配列、該タンパク質のアミノ酸配 列、該タンパク質の発現方法、単離したタンパク質の組成物、および該タンパク質に特異的な抗 体

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下のヌクレオチドまたはそれに相補的
    なヌクレオチドの少なくとも一部を含む組成物： 【化１】
  2. 【請求項２】 以下のヌクレオチドまたはそれに相補的
    なヌクレオチドの少なくとも一部を含む組成物： 【化２】
  3. 【請求項３】 前記ヌクレオチドが約２００塩基の長さ
    である、請求項１または２に記載の組成物。
  4. 【請求項４】 前記ヌクレオチドが約１００塩基の長さ
    である、請求項１または２に記載の組成物。
  5. 【請求項５】 前記ヌクレオチドが約５０塩基の長さで
    ある、請求項１または２に記載の組成物。
  6. 【請求項６】 前記ヌクレオチドが、少なくともヒトＨ
    ＣＡタンパク質のフラグメントをコードする、請求項１
    または２に記載の組成物。
  7. 【請求項７】 単離した以下のタンパク質またはそのフ
    ラグメントを含む組成物： 【化３】
  8. 【請求項８】 単離した以下のタンパク質またはそのフ
    ラグメントを含む組成物： 【化４】
  9. 【請求項９】 単離した以下のタンパク質またはそのフ
    ラグメントに応答して生成される抗体を含む組成物： 【化５】
  10. 【請求項１０】 単離した以下のタンパク質またはその
    フラグメントに応答して生成される抗体を含む組成物： 【化６】
  11. 【請求項１１】 以下のヌクレオチドまたはそれに相補
    的なヌクレオチドの少なくとも一部を含む組換えベクタ
    ー： 【化７】
  12. 【請求項１２】 以下のヌクレオチドまたはそれに相補
    的なヌクレオチドの少なくとも一部を含む組換えベクタ
    ー： 【化８】
JP7015460A 1994-12-06 1995-02-01 新規な幹細胞マーカータンパク質をコードするヌクレオチド配列、該タンパク質のアミノ酸配列、該タンパク質の発現方法、単離したタンパク質の組成物、および該タンパク質に特異的な抗体 Withdrawn JPH08157499A (ja)

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JP7015460A Withdrawn JPH08157499A (ja) 1994-12-06 1995-02-01 新規な幹細胞マーカータンパク質をコードするヌクレオチド配列、該タンパク質のアミノ酸配列、該タンパク質の発現方法、単離したタンパク質の組成物、および該タンパク質に特異的な抗体

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