JPH08152426A

JPH08152426A - 液体クロマトグラフィ装置

Info

Publication number: JPH08152426A
Application number: JP8831995A
Authority: JP
Inventors: Osamu Shirota; 修城田
Original assignee: Shiseido Co Ltd
Current assignee: Shiseido Co Ltd
Priority date: 1994-09-30
Filing date: 1995-04-13
Publication date: 1996-06-11

Abstract

(57)【要約】【目的】本発明は被測定試料を濃縮処理する濃縮用カラ
ムを具備する液体クロマトグラフィ装置に関し、測定効
率及び測定精度の向上を図ることを目的とする。【構成】複数の濃縮用カラム30,31 と、溶媒に混在する
被測定試料を分離する分離カラム16と、被測定試料を溶
媒と共に濃縮用カラム30,31 或いは分離用カラム16に供
給する流路制御手段21,22,22a,14x と、分離用カラム16
で分離された被測定試料を分析処理する検出装置16とを
設けており、上記濃縮用カラム30,31 を複数本設けると
共に、この濃縮用カラム30,31 の内少なくともひとつが
が分離カラム16の内径寸法よりも大な夫々異なる内径寸
法を有する構成とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は液体クロマトグラフィ装
置に係り、特に被測定試料を濃縮処理する濃縮用カラム
を具備する液体クロマトグラフィ装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】液体クロマトグラフィ装置は化学物質を
分離・定量する化学分析手段として広く使われている。
特に、内径が１〜２ｍｍのセミミクロカラムを使った液
体クロマトグラフィ装置は高感度、高分解能および高精
度な分析結果を提供できる利点を有しており、活発な研
究がなされている。

【０００３】図８は、従来における液体クロマトグラフ
ィ装置の一例を示している。同図に示される液体クロマ
トグラフィ装置は、オートサンプラー１と六方弁として
構成される６バルブ−スイッチングバルブ（以下、スイ
ッチングバルブという）２との間に一次分離を行う濃縮
用カラム３が配設されている。この濃縮用カラム３は、
内部にカラム充填剤が充填されており、この濃縮用カラ
ム３においてオートサンプラー４から供給される被測定
試料は濃縮される。

【０００４】また、オートサンプラー１の内部には、被
測定試料をスイッチングバルブ２を介して分離用カラム
４に送り出すために、各種バルブ，シリンジ，及びこれ
らの構成要素と共に機能する他の構成要素が組み込まれ
た構成となっている。更に、ポンプ５Ａ及びポンプ５Ｂ
は、スイッチングバルブ２と協働して被測定試料を濃縮
用カラム３，分離用カラム４及び検出器６に供給する被
測定試料供給システムを構成する。

【０００５】図８に示される構成によれば、被測定試料
はポンプ５Ａにより供給される溶媒（移動相Ａ）と共に
オートサンプラー１から濃縮用カラム４に送られ濃縮処
理が行われる。そして、濃縮用カラム４において濃縮さ
れた被測定試料は、ポンプ５Ｂにより供給される溶媒
（移動相Ｂ）と共に分離処理を行うために分離用カラム
４に供給される。この際、移動相Ａと移動相Ｂの切り換
えは、先に述べたスイッチングバルブ２により行われ
る。

【０００６】搬送された被測定試料は分離用カラム４に
おいて分離され、検出器６において被測定試料に対して
所定の分析処理が行われる。また、上記構成とされた液
体クロマトグラフィ装置は、分析処理の制御を行うため
にコンピューターにより構成されるコントローラー７を
具備している。このコントローラー７は、オートサンプ
ラー１，スイッチングバルブ２，及びポンプ５Ａ，５Ｂ
の駆動制御を行う。

【０００７】続いて、コントローラー７の制御処理によ
り実施されるスイッチングバルブ２の切り換え動作につ
いて説明する。スイッチングバルブ２はコントローラー
７の制御処理により、液体クロマトグラフィ装置内に形
成される被測定試料の流路を第１の状態と第２の状態と
に切り換え処理を行う。

【０００８】スイッチングバルブ２が第１の状態となっ
ている時、ポンプ５Ａの発生するポンプ圧によりオート
サンプラー１から移動相Ａと共に圧送される被測定試料
は、濃縮用カラム３を通過した後にスイッチングバルブ
２に供給され、更に被測定試料は図中実線で示されるラ
インに沿って図示されない廃液貯蔵槽に向け進んでゆ
く。この際、被測定試料に含まれる分析対象となる物質
のみが濃縮用カラム３に捕獲され濃縮処理される。ま
た、同時に移動相Ｂもポンプ５Ｂの発生するポンプ圧に
よりスイッチングバルブ２に供給され、図４に実線で示
すラインに沿って分離用カラム４及に向け流れる構成と
なっている。

【０００９】一方、コントローラー７の制御処理により
スイッチングバルブ２が第２の状態となると、濃縮用カ
ラム３において濃縮された被測定試料は、分析を行うた
めに図８に破線で示すラインに沿って流れ分離用カラム
４に供給される。一方、ポンプ５Ｂから供給される移動
相Ｂは、図中破線で示されるラインに沿って図示しない
廃液貯蔵槽に流出される構成となっている。

【００１０】ここで濃縮用カラム３に注目する。濃縮用
カラム３の内部にはカラム充填剤が充填されており、試
料溶液はこのカラム充填剤により濃縮処理が行われる。
従来、この濃縮用カラム３は液体クロマトグラフィ装置
に１個配設されたものが一般的であり、またその内径寸
法は上記のように１〜２ｍｍのセミミクロカラムを使っ
たものが殆どであった。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】しかるに、濃縮用カラ
ムの内径寸法は、一般に用いられているセミミクロカラ
ム（内径寸法１〜２ｍｍ）よりも小さい方がより良好な
特性を示すことが知られている。ここで、内径が１ｍｍ
未満の小口径カラムをマイクロカラムと定義すると、こ
のマイクロカラムに関する文献は種々報告されている。

【００１２】この文献としては、例えば(1)R.P.Scott,a
nd P.J.Kucera, "J.Chromatogr.,125(1978)271" 、(2)
T.Tsuda, and M.Novotny,"Anal.Chem.50(1978)632" 、
(3)D.Ishii,K.Asai,K.Hibi,T.Janokuchi,and M.J.Nagay
a,"J.Chromatogr.,124(1977)157"、(4)M.Novotny,"Ana
l.Chem.60(1988)500A等が挙げられる。

【００１３】これら一連の報告では、マイクロカラムを
用いることの一般的な利点として、(1) 高理論段数、
(2) 濃度感応形検出器を用いた場合の濃縮効果による応
答の増大、(3) 質量分析計等の溶媒除去を要する機器へ
の接続の容易さ、(4) 溶媒消費量の節減等が挙げられて
いる。

【００１４】しかるに、上記のように優れた利点を有す
るマイクロカラムを用いた液体クロマトグラフィ装置が
現在でも一般に用いられていない理由は、本発明者の考
察では、マイクロカラムを用いた液体クロマトグラフィ
装置では、保持時間の管理に不可欠な流量モードの流量
安定性が劣る点、またカラム安定性が汎用サイズのカラ
ム（セミミクロカラム）を用いた場合に比べて劣る点に
あると思われる。

【００１５】また、いまひとつのマイクロカラムを用い
た液体クロマトグラフィ装置の根本的な問題として、分
析を行おうとする分析試料調製のディメンジョン（数十
から数百マイクロリッター）とマイクロカラムを用いた
液体クロマトグラフィ装置の試料注入量（数マイクロリ
ッター）とでディメンジョンの不一致がある。マイクロ
カラムを用いた液体クロマトグラフィ装置は微小の試料
注入量にて分析を行うが、試料溶液中の分析対象物の濃
度が極端に低い場合、調製された溶液の殆どを分析に供
したいという願望が測定者には生じる。しかるに、従来
構成のマイクロカラムを用いた液体クロマトグラフィ装
置では、この要望に答えることができなかった。

【００１６】更に、前記した図８に示す液体クロマトグ
ラフィ装置において、分離用カラム４としてセミミクロ
カラム（内径が１〜２ｍｍ）を用いた場合と、マイクロ
カラム（内径が１ｍｍ未満）を用いた場合とにおける試
料溶液の流速について考察すると、分離用カラム４とし
てセミミクロカラムを用いた場合の流速は 1.0ｍｌ／ｍ
ｉｎ程度であるのに対し、マイクロカラムを用いた場合
には内径寸法が小さくなるため流速は最大で 0.2ｍｌ／
ｍｉｎ程度と遅くする必要が生じる。

【００１７】試料溶液の流速は、上記のように分離用カ
ラム４の径寸法が小さくなるほど遅くなる傾向を有す
る。従って、単に大径を有する濃縮用カラム３と小径を
有する分離用カラム４とを連通させた構成では測定に要
する時間が長くなり、効率的な測定処理を行うことがで
きなくなってしまう。

【００１８】本発明は上記の点に鑑みてなされたもので
あり、測定感度及び測定効率の向上を図った液体クロマ
トグラフィ装置を提供することを目的とする。

【００１９】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に、本発明になる液体クロマトグラフィ装置では、溶媒
と共に供給される該被測定試料を濃縮処理する複数の濃
縮用カラムと、上記溶媒に混在する被測定試料を分離す
る分離用カラムと、ポンプから上記溶媒を供給されると
共に試料注入手段より被測定試料を供給され、この被測
定試料を溶媒と共に上記濃縮用カラム或いは分離用カラ
ムに供給する流路制御手段と、上記分離用カラムで分離
された被測定試料が供給されると共に、供給された該被
測定試料を分析処理する検出手段とを設けており、上記
濃縮用カラムを複数配設し、この複数の濃縮用カラムの
内少なくともひとつは分離用カラムの内径寸法よりも大
なる内径寸法を有する構成としたことを特徴とするもの
である。

【００２０】

【作用】液体クロマトグラフィ装置を上記構成とするこ
とにより、被測定試料を種々の内径寸法を有する濃縮用
カラムにより濃縮処理を行うことが可能となる。このよ
うに、分離用カラムに被測定試料を導入する前におい
て、複数の濃縮用カラムへ被測定試料を導入て濃縮処理
を行うことにより、被測定試料の流速低下を最小限に留
めることが可能となり、測定時間の短縮を図ることが可
能となる。

【００２１】また、複数の濃縮用カラムにより濃縮処理
が行われることにより、被測定試料の濃縮効率は向上す
る。このため、検出手段により行われる測定処理は最終
段の濃縮用カラムで濃縮された濃縮密度の高い被測定試
料にて行われるため、測定感度を向上させることができ
る。

【００２２】更に、上記のように濃縮密度が向上するこ
とにより被測定試料の安定化を図ることができ、かつ上
記のように測定時間の短縮が図られるため、分離用カラ
ムとして内径寸法が１〜２ｍｍのいわゆるセミミクロカ
ラムを用いることが可能となり、(1) 高理論段数、(2)
濃度感応形検出器を用いた場合の濃縮効果による応答の
増大、(3) 質量分析計等の溶媒除去を要する機器への接
続の容易さ、(4) 溶媒消費量の節減等のセミミクロカラ
ムを用いることによる効果を享受することができる。

【００２３】

【実施例】次に本発明の実施例について図面と共に説明
する。図１乃至図３は、本発明の第１実施例である液体
クロマトグラフィ装置の全体構成図である。

【００２４】液体クロマトグラフィ装置は複数の試料容
器２１ａを形成された試料保持部２１を有し、各試料容
器２１ａには被測定試料が保持される。この各々の試料
容器２１ａは典型的には約２００μｌの容量を有してい
る。また、試料注入管２２はロボット２２ａにより移動
自在に保持されており、ロボット２２ａの動作により試
料注入管２２が位置Ｐ₁に移動され、続いて下降動作す
ることにより試料注入管２２は複数ある試料容器２１ａ
の内、選択された一つの試料容器２１ａに挿入される。

【００２５】この試料注入管２２は細管形状を有し、ま
たその材質は例えば腐食に強いステンレスが選定されて
いる。この試料注入管２２は、ダイフロン，テフロン等
よりなる樹脂パイプ３２及び継手１５ａを介してシリン
ジ１５が接続されている。このシリンジ１５は図示しな
いシリンジ駆動装置により駆動される構成とされてお
り、このシリンジ１５が駆動されることにより選択され
た試料容器２１ａから試料注入管２２に試料溶液３０が
吸入される。

【００２６】また、図中１４で示すのは六方弁として構
成される第１の切り換えバルブであり、この第１の切り
換えバルブ１４には第１の濃縮用カラム３０（以下、Ｍ
Ｆカラムという），第２の濃縮用カラム３１（以下、中
間カラム），試料注入管２２の先端を受け入れる端部１
４ｘ，試料溶液から被測定試料を分離する分離用カラム
１６，第２の溶媒（移動相）を圧送するＢポンプ１１，
廃液を収集する廃液溜め１８等が接続されている。

【００２７】ＭＦカラム３０は、被測定試料と第１溶媒
（移動相）とが混在する試料溶液から被測定試料を分離
し濃縮する第１次分離処理を行うものである。このＭＦ
カラム３０は、その内径寸法が４ｍｍと比較的大なる内
径寸法を有し、その長さは比較的短い１０ｍｍとされ、
更に内容積は２００マイクロリットル程度とされてい
る。また、ＭＦカラム３０の内部には被測定試料を濃縮
するためのカラム充填剤が充填されている。

【００２８】上記のように、第１次分離処理を行うカラ
ムとして上記のように短い寸法であるＭＦカラム３０を
用いることにより、物質の定量を行うのに必要な論理段
数（分離効率の指標）は得られないものの、例えば繰り
返し供雑物の多い生体試料液を注入した際の圧力増加を
緩和する点で大きな効果を奏する。尚、ＭＦカラム３０
における溶媒（移動相溶媒）の流速は例えば0.5 〜1.0m
l/nin に設定されている。

【００２９】また、中間カラム３１は、ＭＦカラム３０
により第１次分離処理が行われた試料溶液から被測定試
料を更に分離し濃縮する第２次分離処理を行うものであ
る。この中間カラム３０は、その内径寸法が２．０ｍ
ｍ，長さが３５ｍｍとされている。また、中間カラム３
０の内部にも被測定試料を濃縮するためのカラム充填剤
が充填されている。尚、中間カラム３１における溶媒
（移動相）の流速は例えば0.25ml/ninに設定されてい
る。

【００３０】また、後に詳述するように、ＭＦカラム３
０と中間カラム３１は、各カラム３０，３１が連通され
た状態において、試料溶液の流れ（Ａポンプ２５に付勢
された流れ）に対して上流側にＭＦカラム３０が、下流
側に中間カラム３１が配設されるよう構成されている。
また、上記説明から明らかなように、試料溶液の流れに
対して上流側に配設されたＭＦカラム３０の内径寸法
は、試料溶液の流れに対して下流側に配設された中間カ
ラム３１の内径寸法よりも大きくなるよう設定されてい
る。

【００３１】また、端部１４ｘは被測定試料の注入口と
なる部位であり、試料注入管２２内に採取された被測定
試料は、試料注入管２２を端部１４ｘ内に挿入し再びシ
リンジ１５を操作することにより端部１４ｘ内に注入さ
れる。この際、試料注入管２２はロボット２２ａにより
端部１４ｘに対応した位置Ｐ ₂に水平移動され、続いて
鉛直方向に移動することにより端部１４ｘ内に挿入され
る。また、試料注入管２２から注入された試料溶液は、
第１の切り換えバルブ１４が図２及び図３に示される状
態の時にＭＦカラム３０から中間カラム３１内に順次供
給され、濃縮処理が行われる構成となっている。

【００３２】分離用カラム１６は試料溶液から被測定試
料を分離するものであり、この分離用カラム１６で分離
された被測定試料は検出器１７に搬送されて所定の測定
が行われる。分離用カラム１６は、例えばその内径寸法
が１．０ｍｍ，長さが２５０ｍｍとされたマイクロカラ
ムを用いている。また、分離用カラム１６の内部には被
測定試料を溶媒から分離するためのカラム充填剤が充填
されている。

【００３３】このように、分離用カラム１６として内径
寸法が小さなマイクロカラムを用いることにより、本実
施例に係る液体クロマトグラフィ装置では、(1) 高理論
段数、(2) 濃度感応形検出器を用いた場合の濃縮効果に
よる応答の増大、(3) 質量分析計等の溶媒除去を要する
機器への接続の容易さ、(4) 溶媒消費量の節減等のマイ
クロカラム特有の効果を享受することができる。

【００３４】上記構成とされた分離用カラム１６は、第
１の切り換えバルブ１４が図１に示される状態の時に中
間カラム３１と接続される。中間カラム３１と分離用カ
ラム３１が連通された状態において、試料溶液の流れ
（Ｂポンプ１１に付勢された流れ）に対して上流側に中
間カラム３１が、下流側に分離用カラム１６が配設され
るよう構成されている。

【００３５】また、上記説明から明らかなように、試料
溶液の流れに対して上流側に配設された中間カラム３１
の内径寸法は、試料溶液の流れに対して下流側に配設さ
れた分離用カラム１６の内径寸法よりも大きくなるよう
設定されている。一方、本実施例に係る液体クロマトグ
ラフィ装置では、検出器１７の試料出口に六方弁として
構成される第２の切り換えバルブ２３が接続されてい
る。この第２の切り換えバルブ２３は、分離用カラム１
６で分離され検出器１７で検出された後排出される被分
離試料を、廃液溜め１８と試料注入管２２のいずれか一
方に選択的に供給する機能を奏する。図１及び図２に示
す状態では、検出器１７から排出される被分離試料は矢
印で示すように廃液溜め１８に送られる。

【００３６】一方、被分離試料を試料注入管２２に給送
する場合には、図３に示されるように、試料はシリンジ
１５に設けられた継手１５ａ中に形成された流路１５ｂ
を通って試料注入管２２に供給される。流路１５ｂは、
シリンジ１５から供給された試料であろうとも、また第
２の切換バルブ２３から供給された試料であろうとも、
いずれも前記試料注入管２２に送られるようにＴ字型に
形成されている。

【００３７】また、図中２４で示すのは内部に第１の溶
媒（移動相溶媒）が装填された容器であり、この容器２
４に装填された第１の溶媒はＡポンプ２５により第２の
切換バルブ２３を会して流路１５ｂ，試料注入管２２に
供給させるよう構成されている。また、容器２４に装填
された第１の溶媒は、分離用カラム１６およびこれに協
働する配管系を洗浄する洗浄液としても機能する。

【００３８】図１及び図２に示す状態では、第１の溶媒
は洗浄液として機能しており、この第１の溶媒は継手１
５ａを経て試料注入管２２に送られこれを洗浄する。試
料注入管２２を洗浄する場合には、ロボット２２ａは針
２２を位置Ｐ₁やＰ₂とは異なった廃液回収位置（図示
せず）に移動させる。

【００３９】図３は、図１の装置において第２の切り換
えバルブ２３が回動した状態を示している。図示の状態
では、検出器１７から排出される被分離試料は矢印に沿
って第２の切換バルブ２３を通過し、継手１５ａ中の流
路１５ｂを経て針２２に送られる。一方、容器２４から
の第１の溶媒は第２の切り換えバルブ２３において阻止
される。

【００４０】その結果、ロボット２２ａにより、試料注
入管２２を試料保持部２１上の適当な試料容器２１ａに
対応する位置に移動させることにより、検出器１７から
排出された被分離試料を試料容器２１ａ中に回収するこ
とが可能になる。続いて、上記構成とされた液体クロマ
トグラフィ装置の測定時における動作について説明す
る。

【００４１】液体クロマトグラフィ装置を用いて試料分
析測定を行うには、先ず第１の切り換えバルブ１４を図
１に示される状態に切り換えると共に、Ａポンプ２５を
起動する。また、試料注入管２２を移動させて被測定試
料を採取すると共に、試料注入管２２を端部１４ｘ内に
挿入する。これにより、被測定試料は容器２４内に装填
されている第１の溶媒（移動相溶媒）と共にＭＦカラム
３０に導入される。この際、Ａポンプ２５を制御するこ
とにより第１の溶媒の流量は0.5ml/min となるよう構成
されている。

【００４２】前記したように、ＭＦカラム３０には被測
定試料を濃縮するためのカラム充填剤が充填されてい
る。このため、導入された被測定試料は、ＭＦカラム３
０において被測定試料と第１溶媒とが混在する試料溶液
から被測定試料を分離し濃縮する。また、分離された第
１の溶媒は逐次廃液溜め１８に排出される。これによ
り、ＭＦカラム３０には濃縮された被測定試料が蓄積さ
れた状態となる。以上が第１次分離の処理である。

【００４３】上記のＭＦカラム３０による第１次分離の
処理が終了すると、第１の切り換えバルブ１４は図２に
示される状態に切り換えられる。この状態においても、
試料注入管２２は端部１４ｘ内に挿入された状態を維持
しており、従って第１の溶媒はＡポンプ２５に付勢され
て端部１４ｘを会してＭＦカラム３０に流入する。この
際、Ａポンプ２５を制御することにより第１の溶媒の流
量は0.25ml/minとなるよう構成されている。

【００４４】この図２に示される状態では、ＭＦカラム
３０は中間カラム３１と直列状態に接続された構成とな
っているため、ＭＦカラム３０内に蓄積された被測定試
料は中間カラム３１に流入し、この中間カラム３１で再
び濃縮処理が行われる。即ち、中間カラム３1 では、Ｍ
Ｆカラム３０から流入する被測定試料と第１溶媒とが混
在する試料溶液から被測定試料を分離し濃縮する。ま
た、分離された第１の溶媒は逐次廃液溜め１８に排出さ
れる。これにより、中間カラム３１には濃縮された被測
定試料が蓄積された状態となる。以上が中間カラム３１
による分離処理（中間分離処理という）である。

【００４５】上記のように中間分離処理が終了すると、
第１の切り換えバルブ１４を再び図１に示される状態に
切り換えると共に、Ｂポンプ２６を起動する。これによ
り、Ｂポンプ２６に接続された容器２６内に装填されて
いる第２の溶媒（移動相溶媒）は中間カラム３１に導入
される。この際、Ａポンプ２５を制御することにより第
２の溶媒の流量は0.1ml/min となるよう構成されてい
る。

【００４６】この図１に示される状態では、中間カラム
３１は分離用カラム１６と直列状態に接続された構成と
なっているため、中間カラム３１内に蓄積された被測定
試料は分離用カラム１６に流入し、この分離用カラム１
６で試料溶液から被測定試料が分離される（本分離処理
という）。分離用カラム１６で分離された被測定試料は
検出器１７に送られ分析処理が行われる。

【００４７】図４は、本発明の第２実施例である液体ク
ロマトグラフィ装置を示す全体構成図である。本実施例
に係る液体クロマトグラフィ装置は、図８を用いて説明
した従来構成の液体クロマトグラフィ装置と同様に、オ
ートサンプラー４１、六方弁として構成される６バルブ
−スイッチングバルブ（以下、スイッチングバルブとい
う）４２、第１の濃縮用カラム（以下、ＭＦカラムとい
う）４３、分離用カラム４５、及び検出器４６，ポンプ
４７，４８等を有した構成とされている。

【００４８】また、本実施例に係る液体クロマトグラフ
ィ装置は、図８に示される従来構成の液体クロマトグラ
フィ装置に対し、第２の濃縮用カラム（以下、中間カラ
ムという）４４が配設されていることを特徴とする。こ
の中間カラム４４はスイッチングバルブ４２の切り換え
動作により、後述するようにＭＦカラム４３或いは分離
用カラム４５と選択的に連通するよう構成されている。

【００４９】また、ＭＦカラム４３は、例えばその内径
が１〜４ｍｍであり、またその長さは１０〜５０ｍｍで
あり比較的短い寸法とされている。この構成とすること
によ、ＭＦカラム４３は約２００マイクロリットルの容
積を有することとなる。この容積を有するＭＦカラム４
３の内部には、被測定試料を濃縮するための充填物質が
詰められている。

【００５０】上記のようにＭＦカラム４３として短い寸
法のカラムを用いることにより、物質の定量を行うのに
必要な論理段数（分離効率の指数）は得られないもの
の、例えば繰り返し供雑物の多い生体試料液を注入した
際の圧力増加を緩和する点で大きな効果を奏する。尚、
ＭＦカラム４３における溶媒（移動相溶媒）の流量は例
えば0.5 〜1.0ml/min に設定されている。

【００５１】また、中間カラム４４は、ＭＦカラム４３
により第１次濃縮（分離）処理が行われた試料溶液を更
に分離し濃縮する第２次濃縮（分離）処理を行うもので
ある。この中間カラム４４は、その内径寸法が２．０ｍ
ｍ，長さが３５ｍｍとされている。また、中間カラム４
４の内部にも被測定試料を濃縮するためのカラム充填剤
が充填されている。

【００５２】また、ＭＦカラム４３と中間カラム４４
は、各カラム４３，４４が連通された状態において、試
料溶液の流れに対して上流側にＭＦカラム４３が、下流
側に中間カラム４４が配設されるよう構成されている。
また、図４に示されるように、試料溶液の流れに対して
上流側に配設されたＭＦカラム４３の内径寸法は、試料
溶液の流れに対して下流側に配設された中間カラム４４
の内径寸法よりも大きくなるよう設定されている。

【００５３】上記構成とすることにより、オートサンプ
ラー４１から圧送された試料溶液は各コラム４３，４４
を順次通り、夫々において濃縮処理が行われる。各カラ
ム４３，４４において濃縮処理が終了すると、試料溶液
は抽出処理を行うため分離用カラム４５に供給される。
この分離用カラム４５は試料溶液から被測定試料を分離
するものであり、この分離カラム４５で分離された被測
定試料は検出器４６に搬送されて所定の測定が行われ
る。分離カラム４５は、例えばその内径寸法が１．０ｍ
ｍ，長さが２５０ｍｍとされたマイクロカラムを用いて
いる。

【００５４】このように、分離コラム４５としてマイク
ロカラム或いはセミマイクロカラムを用いた液体クロマ
トグフィ装置に複数（本実施例では２個）の濃縮用コラ
ム４３，４４を設け、また複数の濃縮用コラム４３，４
４の内の少なくとも一つが分離コラム４５に対して大き
な径寸法を有する構成とすることにより、優れた分析特
性を得ることができる。

【００５５】続いて、上記構成とさたれ液体クロマトグ
フィ装置の動作について説明する。まず、スイッチング
バルブ４２が図５（Ａ）に示される状態にセットされて
いる場合の動作について説明する。この状態では、中間
カラム４４は分離カラム４５と連通した状態となってい
る。従って、オートサンプララー４１により被測定試料
溶液は、ＭＦカラム４３に向け供給される。この際、ポ
ンプ４７は移動相Ａを流量0.5 〜1.0ml/min で圧送す
る。ＭＦカラム４３では、測定を行おうとする目標物質
のみが捕集され、測定に不要な他の混入物は補集される
ことなく通過する。

【００５６】また図５（Ａ）に示される状態では、移動
相Ｂは中間カラム４４及びその先に接続された分離コラ
ム４５に供給される。しかるに、この状態において目標
となる被測定物質が分析処理されることはない。一方、
図５（Ａ）に示される状態において、目標となる被測定
物質がＭＦカラム４３から溶け出し始めると、図示しな
いコントローラーの制御動作によりスイッチングバルブ
４２は図５（Ｂ）に示される状態に切り替わる。

【００５７】この状態において、ＭＦカラム４３におい
て一次的に濃縮処理された被測定物質は溶け出し、そし
て移動相Ａにより中間カラム４４に供給される。この中
間カラム４４においても測定に不要な混入物質は通り抜
け、目標となる被測定物質のみの濃縮処理が行われる。
また、図５（Ｂ）に示される状態では、移動相Ｂは単に
分離コラム４５を通過するのみであり、濃縮処理が行わ
れることはない。

【００５８】上記処理が終わると、スイッチングバルブ
４２は再び図５（Ａ）に示される状態に戻る。この状態
において、中間カラム４４で濃縮された被測定物質は、
中間カラム４４から分離カラム４５に向け移動してゆ
く。図５（Ａ）から図５（Ｂ）へのスイッチングバルブ
４２の切換操作において、中間カラム４４に過剰な圧力
上昇が発生するのを避けるためにはポンプ２５の流量を
変更することが必要である。そこで、本実施例において
は、中間カラム４４として内径が1.0 〜4.0mm で長さが
50mm以下のものを用いることにより、0.1 〜0.5ml/min
という比較的高い流量を保持する構成とした。これによ
り、ポンプ４７の流量減少に起因して生じる望ましくな
い分析時間の増大を有効に無くすことができ、よってク
ロマトグラフィ処理における処理時間の短縮を図ること
ができる。

【００５９】図５（Ａ）及び図５（Ｂ）に示される各状
態に切り換え処理を行う液体クロマトグラフィ装置にお
いて、上記流量はミクロ或いはセミミクロカラムの内径
により決めることができる。尚、図７は上記流量と分離
カラム４５のカラム径との関係の一例を示している。

【００６０】上記した図４に示す液体クロマトグラフィ
装置を使用することにより、各カラム４３，４４を用い
た被測定試料の濃縮処理が短縮され、よって大量の被測
定試料に対するマイクロカラム或いはセミマイクロカラ
ムを用いた分析処理を短時間で行うことが可能となり、
よって測定に要する時間を大幅に短縮することができ
る。

【００６１】上記した第１実施例及び第２実施例に係る
液体クロマトグラフィ装置の構成説明において述べた一
連の動作を行うことにより、被測定試料に対する分析処
理が行われる。ここで、上記した各実施例に係る液体ク
ロマトグラフィ装置（以下、３カラムシステムという）
において分析処理を行うのに要する処理時間について、
従来の二つのカラムを用いて分析処理を行う構成の液体
クロマトグラフィ装置（以下、２カラムシステムとい
う。尚、図８参照）と対比して説明する。

【００６２】３カラムシステムにおけるＭＦカラム３
０，４３の溶媒（移動相Ａ）の流量は前記のように約0.
5ml/min である。従って、ＭＦカラム３０，４３で１分
間被測定試料の採取を行うと、続く中間カラム３１，４
４には0.5ml の試料溶液が送られることとなる。中間カ
ラム３１，４４として、例えば内径寸法２．０ｍｍ，長
さ３５ｍｍ，溶媒の流量0.25ml/minのものを用いると、
ＭＦカラム３０，４３からの0.5ml の試料溶液の濃縮は
約２分で終了する。中間カラム３１，４４の死体積はこ
の場合0.06ml程度であるため、分離カラム１６，４５と
して内径１ｍｍのものを用いた場合には、約１分強にて
分離カラム１６，４５への試料溶液の移動は完了する。

【００６３】これに対し、２カラムシステムにおいて
は、濃縮用カラム３の構成は各実施例に係るＭＦカラム
３０，４３と略同様で溶媒（移動相Ａ）の流量は前記の
ように0.5ml/min であるが、この濃縮用カラム３を直接
内径１ｍｍ程度の分離用カラム４に接続すると、分離用
カラム４の溶媒の流量が急激に低減する。このため、本
発明者の実験では濃縮用カラム３で濃縮された試料溶液
を全て分離するのに内径１ｍｍのもので約１０分，内径
が０．８ｍｍのもので約２５分の時間が必要となる。

【００６４】よって、上記した第１及び第２実施例に係
る液体クロマトグラフィ装置（３カラムシステム）を用
いることにより、２カラムシステムに比べて７分から２
０分の測定時間の短縮を図ることができる。また、各実
施例に係る液体クロマトグラフィ装置（３カラムシステ
ム）では、分離用カラム１６，４５に流入する試料溶液
の容量は、中間カラム３１，４４の死体積に相当し、そ
の量は極小量となる。このことは、分離用カラム１６，
４５で行われる被測定試料の分離処理において分離用カ
ラム１６，４５の安定化に寄与することになる。

【００６５】尚、本実施例に係る液体クロマトグラフィ
装置（３カラムシステム）では、溶媒（移動相）を２種
類用い、これに伴い溶媒を搬送付勢するために２台のポ
ンプ１１，２５，４７，４８を用いた構成としている。
このため、上記したＭＦカラム３０，４３により第１分
離処理を実行している時に、分離カラム１６，４５及び
中間カラム３１，４４に第２の溶媒（移動相Ｂ）を供給
することができるため、よって中間分離処理が終了後、
第１の切り換えバルブ１４或いはスイッチングバルブ４
２が切り替わり本分離処理時に移行しても、分離カラム
１６，４５を早期に安定化させることができる。このよ
うに、分離カラム１６，４５を早期に安定化させること
ができることにより、ピーク波形の乱れがなくなり、感
度のよい分析結果を得ることができる。

【００６６】更に、本実施例に係る液体クロマトグラフ
ィ装置（３カラムシステム）では、ＭＦカラム３０，４
３と分離カラム１６，４５とが直接接続されることがな
いため、ＭＦカラム３０，４３は１０ＭＰａを越えるよ
うな圧力を測定の全工程において受けるようなことはな
い。

【００６７】ＭＦカラム３０，４３による一次分離処理
（濃縮処理）が適正に行われない場合、その後に実施さ
れる中間分離処理及び本分離処理が適正に行われても測
定感度は大きく低下する。また、ＭＦカラム３０，４３
による一次分離処理は、ＭＦカラム３０，４３に印加さ
れる圧力に影響され、印加圧力が大きい程分離精度が低
下することが知られている。従って、測定の全工程にお
いてＭＦカラム３０，４３に高圧力が印加されない構成
とすることにより、測定感度を向上させることができ
る。

【００６８】図６は、上記した本実施例に係る液体クロ
マトグラフィ装置を用い、抗てんかん薬、カルマパゼピ
ンの分析を行った結果を示している。尚、測定条件は下
記の通りである。（１）ＭＦカラム３０，４３による第１次分離カラム：カプセルパックＭＦカートリッジカラム（内径
４．０ｍｍ，長さ１０ｍｍ）移動相：０．１Ｍリン酸緩衝液（２）中間カラム３１，４４による中間分離カラム：カプセルパック Phenyl（内径２．０ｍｍ，長
さ３５ｍｍ）移動相：０．１Ｍリン酸緩衝液／アセトニトリル＝８
５／１５（３）分離カラム１６，４５による本分離カラム：カプセルパック Phenyl（内径１．５ｍｍ，長
さ２５０ｍｍ）移動相：０．１Ｍリン酸緩衝液／アセトニトリル＝８
５／１５（４）操作プログラム・０分→１．８分バルブ状態：図１に示す状態Ａポンプ流量：０．５ｍｌ／ｍｉｎＢポンプ流量：０．１ｍｌ／ｍｉｎ・１．８分→１２．０分バルブ状態：図２に示す状態Ａポンプ流量：０．２５ｍｌ／ｍｉｎＢポンプ流量：０．１ｍｌ／ｍｉｎ・１２．０分移行バルブ状態：図１に示す状態Ａポンプ流量：０．５ｍｌ／ｍｉｎＢポンプ流量：０．１ｍｌ／ｍｉｎ（５）その他・検出：ＵＶ吸収２５４ｎｍ・温度：４０℃ ・試料注入量：１００μｌ図６に示される結果より、血清中に添加した１３ｐｐｂ
の目的物（カルマパゼピン）が良好なＳ／Ｎ比をもって
観測されており、よって本実施例に係る液体クロマトグ
ラフィ装置の効果を実証することができた。

【００６９】尚、上記した実施例においては、使用する
カラムとしてＭＦカラム３０，４３、中間カラム３１，
４４、分離カラム１６，４５の３個のカラムを使用する
実施例を示したが、カラムの数は３本に限定されるもの
ではなく、測定する被測定試料に応じて適宜カラム数を
設定してもよい。

【００７０】また、複数の濃縮カラムの配列は必ずしも
大径のカラムから順に小径のカラムとなるよう配設する
必要はなく、濃縮効率に応じて適宜配列を選定すること
が可能である。更に、複数の濃縮カラムの径寸法は全て
異ならせる必要はなく、同一径の濃縮カラムを用いるこ
とも可能である。

【００７１】

【発明の効果】上述の如く本発明によれば、被測定試料
を種々の内径寸法を有する濃縮用カラムにより濃縮処理
を行うことが可能となる。このように、分離用カラムに
被測定試料を導入する前において、複数の濃縮用カラム
へ被測定試料を導入て濃縮処理を行うことにより、被測
定試料の流速低下を最小限に留めることが可能となり、
測定時間の短縮を図ることが可能となる。

【００７２】また、複数の濃縮用カラムにより濃縮処理
が行われることにより、被測定試料の濃縮効率は向上す
る。このため、検出手段により行われる測定処理は最終
段の濃縮用カラムで濃縮された濃縮密度の高い被測定試
料にて行われるため、測定感度を向上させることができ
る。

【００７３】更に、上記のように濃縮密度が向上するこ
とにより被測定試料の安定化を図ることができ、かつ上
記のように測定時間の短縮が図られるため、分離用カラ
ムとして内径寸法が１〜２ｍｍのいわゆるセミミクロカ
ラムを用いることが可能となり、(1) 高理論段数、(2)
濃度感応形検出器を用いた場合の濃縮効果による応答の
増大、(3) 質量分析計等の溶媒除去を要する機器への接
続の容易さ、(4) 溶媒消費量の節減等のセミミクロカラ
ムを用いることによる効果を享受することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の第１実施例である液体クロマトグラフ
ィ装置の概略構成図である。

【図２】本発明の第１実施例である液体クロマトグラフ
ィ装置の動作を説明するための概略構成図である。

【図３】本発明の第１実施例である液体クロマトグラフ
ィ装置の動作を説明するための概略構成図である。

【図４】本発明の第２実施例である液体クロマトグラフ
ィ装置の概略構成図である。

【図５】本発明の第２実施例である液体クロマトグラフ
ィ装置の動作を説明するための図である。

【図６】本発明に係る液体クロマトグラフィ装置を用い
て行った測定結果の一例を示す図である。

【図７】カラム径と流量との関係を示す図である。

【図８】従来の液体クロマトグラフィ装置の概要を示す
図である。

【符号の説明】

１１，２５，４７，４８ポンプ１４第１の切り換えバルブ１４ｘ試料注入口１５シリンジ１５ａ継手１５ｂ流路１６，４５分離用カラム１７，４６検出器１８廃液溜め２１試料保持機構２１ａ試料容器２２試料注入管２３第２の切り換えバルブ３０，４３ＭＦカラム３１，４４中間カラム４１オートサンプララー４２スイッチングバルブ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】溶媒と共に供給される該被測定試料を濃
縮処理する複数の濃縮用カラムと、該溶媒に混在する被測定試料を分離する分離用カラム
と、ポンプから該溶媒を供給されると共に試料注入手段より
該被測定試料を供給され、該被測定試料を該溶媒と共に
該濃縮用カラム或いは分離用カラムに供給する流路制御
手段と、該分離用カラムで分離された該被測定試料が供給される
と共に、供給された該被測定試料を分析処理する検出手
段とを設けており、該濃縮用カラムを複数配設し、該複数の濃縮用カラムの
内少なくともひとつは該分離用カラムの内径寸法よりも
大なる内径寸法を有する構成としたことを特徴とする液
体クロマトグラフィ装置。