JPH0797454A

JPH0797454A - 可溶性架橋コラーゲンの製造法

Info

Publication number: JPH0797454A
Application number: JP24148193A
Authority: JP
Inventors: Junko Nakagawa; 純子中川; Kazuo Watanabe; 和男渡辺
Original assignee: Nippi Inc
Current assignee: Nippi Inc
Priority date: 1993-09-28
Filing date: 1993-09-28
Publication date: 1995-04-11

Abstract

(57)【要約】【目的】コラーゲン熱変性後におけるコラーゲン三重
らせん構造の再生率が高く、水に可溶性の架橋コラーゲ
ンの製造方法を提供する。【構成】可溶性コラーゲンを、一般式：（式中、ｎは１から８を表す）で示されるメチレン鎖の
両端にイミドエステル基を有するアルキルジイミデート
二価性架橋試薬で架橋することを特徴とする可溶性架橋
コラーゲンの製造法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はコラーゲン熱変性後にお
けるコラーゲン三重らせん構造の再生率が高く、水に可
溶性の架橋コラーゲンの製造方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】コラーゲンは動物の結合組織を構成する
主要タンパク質成分で、分子量約１０万のポリペプチド
鎖３本がまとまって右巻きの三重らせん構造（コラーゲ
ンヘリックス構造）を形成している長さ約３００ｎｍ、
直径１．５ｎｍの棒状分子である。そして、骨、皮膚な
どの生体を形成する機械的支持結合機能を有し、さら
に、細胞との相互作用、水、電解質、栄養物の代謝など
の生化学的機能を持つ。コラーゲンには、動物の皮、
骨、腱等の結合組織から微細化線維とした不溶性コラー
ゲン、不溶性コラーゲンを酸溶液で抽出することにより
得られる酸可溶性コラーゲン、牛皮を酵素処理して抽出
率をあげた酵素可溶化コラーゲン、そして、牛皮をアル
カリ溶液に溶かすことにより得られるアルカリ可溶化コ
ラーゲンなどがある。これらのコラーゲンは外科手術用
縫合糸や創傷被覆材などの医用材料や機能性高分子材
料、また化粧品などを目的とした皮膚処理材として、さ
らにソーセージケーシングなどの食品用素材として広く
利用されている。

【０００３】しかし、溶液状態におけるコラーゲンの変
性温度は３８〜４１℃であるため、それ以上の高温では
熱変性によってコラーゲン分子特有のヘリックス構造か
らポリペプチド鎖３本がそれぞれランダムコイル構造を
持つ変性コラーゲンとなり、溶液状態での粘性、耐酵素
消化性、ｐＨ中性で加温により起こる線維形成等のコラ
ーゲンの特性が失われるので、その商品価値がなくな
る。

【０００４】ところが、無秩序なランダムコイル構造を
持つ変性コラーゲン溶液を変性温度以下に冷却すること
により、ポリペプチド鎖は部分的にコラーゲン構造に戻
ることが知られている。

【０００５】これはランダムコイル構造となった３本の
ポリペプチド鎖が近づき、ピロリジン豊富な位置付近で
コラーゲンホールドと呼ばれるコラーゲンヘリックスの
核が形成されて成長していくからである。しかし、ポリ
ペプチド鎖の大部分はランダムコイル構造のまま絡ま
り、無秩序な構造が残る。

【０００６】コラーゲンの熱による変性後、冷却により
コラーゲンヘリックス構造が再生したことは、円偏光二
色性、旋光度、広角Ｘ線回折、赤外分光光度計、また
は、蛋白分解酵素による消化性の変化等により確かめる
ことができる。また、円偏光二色性等を用いることによ
り、コラーゲンヘリックスの再生率を定量的に求めるこ
とができる。未変性コラーゲンのコラーゲンヘリックス
含量を１００、熱変性後のコラーゲンヘリックス含量を
０と仮定し、それらの円偏光二色性の値と、コラーゲン
を熱変性後４℃で２４時間保持して得られた再生コラー
ゲンの円偏光二色性の値とから得られた再生コラーゲン
のコラーゲンヘリックスの含量を、再生率として用い
る。

【０００７】通常、コラーゲンでは、この再生率は、わ
ずか２０から３０％である。コラーゲンヘリックス構造
の再生率を高くするためには、ランダム状態においても
コラーゲン分子を構成する３本のポリペプチド鎖がお互
い常に近くに存在する必要がある。その有効な手段とし
てポリペプチド鎖間に予め架橋を導入することが挙げら
れる。ポリペプチド鎖間への架橋の導入により、熱変性
によりコラーゲンの三重らせん構造が崩壊しても冷却時
に離れたポリペプチド鎖同士の接触が容易になるため、
コラーゲンホールドの核形成速度が増加し、コラーゲン
ヘリックスの成長、促進を有効にすることが可能とな
る。そして、コラーゲンヘリックス構造の再生の割合が
高いほど、熱変性により失われた特性が回復する。すな
わち、変性コラーゲンの耐酵素消化性、ゲル化速度、融
点等である。

【０００８】３本のポリペプチド鎖間への架橋の導入
は、二価以上の架橋試薬をコラーゲン分子に作用させる
ことによって行われる。

【０００９】コラーゲンの架橋法には、アルデヒド系架
橋剤、イソシアネート系架橋剤、カルボジイミド系架橋
剤等を使用する化学薬品処理、トランスグルタミナーゼ
を用いる酵素処理、熱処理、放射線照射処理等がある。
これらのコラーゲンの架橋は、ソーセージケーシング用
のチューブ状成形品、医療用の手術糸のような糸状ある
いはひも状成形品、さらにスポンジ状、フェルト状、テ
ープ状もしくはシート状、そして、ビーズ状の成形方法
に用いられる（特公昭４５−２７３７８号公報、特開昭
５１−１４８２８９号公報、特開昭５５−６２３００号
公報、特公昭６４−１１６９号公報、特開昭５８−１９
３３１号公報）。

【００１０】しかし、これらの架橋は、コラーゲンを特
定の形態に成形するものであり、架橋反応により得られ
る架橋コラーゲンを溶液状態で維持するための架橋方法
はない。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明では可溶性コラ
ーゲンに架橋を導入し、架橋後も当該コラーゲンが不溶
化せず、溶液状態を維持することのできる可溶性の架橋
コラーゲンの製造を目的とする。また、この可溶性架橋
コラーゲンの熱変性後、冷却することにより再生される
コラーゲンヘリックスの割合を高めることにより、加熱
によって失われたコラーゲンの特性を回復させることに
ある。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、コラーゲ
ンを架橋することによってもコラーゲンが不溶化され
ず、そのため架橋反応を容易に制御でき、そしてコラー
ゲンの熱変性後、溶液中に存在する熱変性コラーゲンか
らコラーゲンへの再生率が高くなるような架橋剤の検索
に研究を重ねた。その結果、架橋剤としてメチレン鎖の
両端にイミドエステル基を有するアルキルジイミデート
類を用いることで、架橋反応を制御しやすく、水に可溶
性の架橋コラーゲンが得られることが明らかになった。

【００１３】この知見を基礎としてアルキルジイミデー
ト類のメチレン鎖の炭素数、反応条件等の検討を行い本
発明を完成させた。

【００１４】従って、本発明は、可溶性コラーゲンを、
一般式：（式中、ｎは１から８を表す）で示されるメチレン鎖の
両端にイミドエステル基を有するアルキルジイミデート
二価性架橋試薬で架橋することを特徴とする可溶性架橋
コラーゲンの製造法である。

【００１５】本発明で使用する架橋剤のアルキルジイミ
デート類は、一般式：（式中、ｎは１から８を表す）有し、ポリペプチド鎖に
含まれるアミノ基と特異的に反応するイミドエステル基
をメチレン鎖の両端に持つ二価性架橋試薬である。アル
キルジイミデート類が持つイミドエステル基とコラーゲ
ン中のアミノ基とにより生成されるアミジン基は、反応
前のアミノ基とほぼ同等の酸解離定数を有しているの
で、コラーゲンとの反応前後では電荷の変化が少なく、
架橋反応によるコラーゲンの等電点や高次構造への影響
は少ない。

【００１６】コラーゲン分子中に含まれている３本のポ
リペプチド鎖間に関与する架橋は、ポリペプチド側鎖の
アミノ基間の距離に依存するため、架橋剤であるアルキ
ルジイミデート分子中のメチレン鎖の炭素数は１ないし
８であり、好ましくは４ないし６である。

【００１７】一方、本発明の原料として使用できるコラ
ーゲンとしては、希酸溶液でトロポコラーゲン分子を溶
解抽出した酸可溶性コラーゲン、酸性プロテアーゼによ
って可溶化した酵素可溶化コラーゲン（特公昭４４−１
１０３７号公報）、アルカリ溶液によって可溶化したア
ルカリ可溶化コラーゲン（特公昭４６−１５０３３号公
報）である。

【００１８】架橋反応時のコラーゲン溶液中のコラーゲ
ン物質の濃度は、０．００１重量％〜０．４重量％であ
り、架橋剤として用いるアルキルジイミデート類の濃度
は、コラーゲン一分子に対し５０〜３０００倍量の濃度
である。また、反応を行うとき、架橋剤であるアルキル
ジイミデート類の反応基であるイミドエステルが、ポリ
ペプチド側鎖のアミノ基と反応してアミジンを生成する
反応は、ｐＨ依存性がきわめて強く、アミノ基の求核性
が高くなる塩基性においてのみ反応が進むため、反応中
のｐＨはｐＨ７〜１１であり好ましくは８〜１０であ
る。コラーゲン分子中に含まれるアミノ基のうち、架橋
に関与するアミノ基の割合は、コラーゲン分子に対する
アルキルジイミデート類の濃度、コラーゲンの種類、反
応温度、反応時間等により変動するが、好ましくは、１
０％〜５０％、より好ましくは、３０％〜４０％の範囲
である。

【００１９】アルキルジイミデート類二価性架橋試薬の
添加方法は固体のまま、あるいは、少量の水と混和する
有機溶媒に溶解し、数回にわけて添加し、穏やかに撹拌
しながらコラーゲンが変性しない温度である３０℃以
下、好ましくは４℃以下で、５〜２４時間架橋反応を行
う。そして、反応溶液のｐＨを酸性にするとアミノ基が
正に荷電して反応性がなくなり、さらに、アルキルジイ
ミデート類二価性架橋試薬が分解されるので架橋反応を
停止することが容易となる。

【００２０】反応液からアルキルジイミデート類未反応
物及びその分解物の除去は透析，塩析，等電点沈殿によ
り容易に反応生成物である架橋コラーゲンと分離するこ
とが出来る。本発明により得られる架橋コラーゲンの１
重量％濃度の水溶液は、無色透明であり、５３０ｎｍの
光の透過率は９２％以上であった。また、０．２重量％
の水溶液では０．４５μｍメンブランフィルターに対す
る通過率も９９％以上であることから、本発明では、コ
ラーゲンを可溶性の状態で維持したまま架橋させること
ができる。そして再生率が４０から８５％という、未架
橋コラーゲンの２から３倍の再生率をもつ架橋コラーゲ
ンが得られた。

【００２１】

【実施例】以下、実施例により更に詳細に説明するが、
これらは本発明を限定するものではない。

【００２２】（実施例１）アルカリ可溶化コラーゲン水
溶液（ｐＨ１０．０、濃度０．１５重量％）を４℃で穏
やかに撹拌しながら、炭素数４のメチレン鎖を持つジメ
チルアジポイミデートを終濃度が０．０３６重量％（コ
ラーゲンに対し３００倍量）となるように粉末で少量ず
つ数回にわけて添加し、１８時間反応を行った。反応
後、反応液のｐＨを４にし、０．０３重量％酢酸水溶液
で透析し、濾過、凍結乾燥して架橋コラーゲンを得た。
得られた架橋コラーゲンは、白色のスポンジ状で、未架
橋のコラーゲンと同様の外観を示した。

【００２３】０．０１重量％となるように上記で得られ
た架橋コラーゲンを、０．１２重量％酢酸に溶解し、６
０℃で１５分間加熱して変性させ、冷却後、４℃で２４
時間放置した。これを用いて円偏光二色性より熱変性後
のコラーゲンヘリックスの再生率の測定を行なった結
果、その再生率は５５％であった。

【００２４】（実施例２）アルカリ可溶化コラーゲン水
溶液（ｐＨ１０．０、濃度０．００６重量％）を４℃で
穏やかに撹拌しながら、炭素数５のメチレン鎖を持つジ
メチルピメロイミデートを終濃度が０．００６１６重量
％（コラーゲンに対し１５００倍量）となるように粉末
で少量ずつ数回にわけて添加し、１８時間反応を行っ
た。反応後、反応液のｐＨを３にし、塩化ナトリウム飽
和水溶液によって塩析後遠心分離して沈澱物を集めて
０．１２重量％酢酸溶液に溶解した。この溶液を０．０
３重量％酢酸水溶液で透析し、濾過、凍結乾燥して架橋
コラーゲンを得た。

【００２５】得られた架橋コラーゲンを、０．１２重量
％酢酸溶液に１．０重量％となるように溶解した溶液
の、５３０ｎｍの光の透過率は９６％であった。また、
この溶液を架橋コラーゲンの濃度が０．２重量％となる
ように希釈したものを、０．４５μｍのポアサイズを持
つ、メンブランフィルターに透過させたところ、その透
過率は９９．５％であった。

【００２６】（実施例３）酸可溶性コラーゲン水溶液
（ｐＨ１０．０、濃度０．００８重量％）を４℃で穏や
かに撹拌しながら、炭素数５のメチレン鎖を持つジメチ
ルピメロイミデートを終濃度が０．００３４６重量％
（コラーゲンに対し５００倍量）となるように粉末で少
量ずつ数回にわけて添加し、１８時間反応を行った。反
応後、反応液のｐＨを４にし、０．０３重量％酢酸水溶
液で透析し、濾過、凍結乾燥して架橋コラーゲンを得
た。

【００２７】得られた架橋コラーゲンを０．６重量％の
塩化ナトリウムを含む０．６０６重量％Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ緩衝液（ｐＨ７．６）に０．１重量％となるように溶
解した溶液と、同様に調製した架橋コラーゲン溶液を６
０℃で１５分保持して熱変性させた後、４℃で２４時間
保持してコラーゲンの三重らせん構造を再生させた溶液
とに、０．０２重量％のトリプシン溶液を加えて、２０
℃で１０分間反応させた。別に、比較として、未架橋の
コラーゲンについても同様に未変性と変性との溶液を調
製し、同様に酵素反応をさせた。

【００２８】反応させたそれぞれの反応液を７．５％の
アクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−アクリルアミドゲ
ル電気泳動（Ｎａｔｕｒｅ，２２７：６８０−６８５，
１９７０）を行なったところ、未架橋のコラーゲンで
は、熱変性前には、コラーゲン由来のバンドが見い出さ
れたが熱変性後のものには、コラーゲン由来のバンドが
消失していた。一方、本発明の架橋コラーゲンについて
は、熱変性前後において、コラーゲン由来のバンドの消
失が見られなかったことから、本発明による架橋によ
り、架橋コラーゲンは熱変性後、コラーゲンの三重らせ
ん構造を十分再生させることができ、トリプシン消化に
対する抵抗性を維持することができた。

【００２９】（実施例４）酵素可溶化コラーゲン水溶液
（ｐＨ１０．０、濃度０．０１重量％）を４℃で穏やか
に撹拌しながら、少量のメタノールに溶解した炭素数６
のメチレン鎖を持つジメチルスベロイミデートを終濃度
が０．００２７３重量％（コラーゲンに対し３００倍
量）となるように少量ずつ数回にわけて添加し、２０時
間反応を行った。反応後、反応液のｐＨを４にし、０．
０３重量％酢酸水溶液で透析し、濾過、凍結乾燥して架
橋コラーゲンを得た。

【００３０】０．０１重量％となるように架橋コラーゲ
ンを０．１２重量％酢酸に溶解し、６０℃で１５分間加
熱して変性させ、冷却後、４℃で２４時間放置した。こ
れを用いて円偏光二色性よる熱変性後のコラーゲンヘリ
ックスの再生率の測定を行なった結果、その再生率は８
０％であった。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】可溶性コラーゲンを、一般式：（式中、ｎは１から８を表す）で示されるメチレン鎖の
両端にイミドエステル基を有するアルキルジイミデート
二価性架橋試薬で架橋することを特徴とする可溶性架橋
コラーゲンの製造法。
【請求項２】前記可溶性コラーゲンが、酸可溶性コラ
ーゲン、アルカリ可溶化コラーゲン又は酵素可溶化コラ
ーゲンであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】前記アルキルジイミデート二価性架橋試
薬を前記可溶性コラーゲン一分子に対し５０〜３０００
倍量の濃度で使用することを特徴とする請求項１記載の
方法。
【請求項４】前記可溶性コラーゲンの濃度を０．００
１重量％〜０．４重量％で反応させることを特徴とする
請求項１記載の方法。