JPH0779799A - インベルターゼ遺伝子の検出法及びスクロースを含有する栽培種トマトとその作出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 果実にスクロースを含有するトマトのインベ
ルターゼ遺伝子を検出する方法、及びスクロースを含有
する栽培種トマトを提供する。 【構成】 トマト染色体ＤＮＡを鋳型とし、２種類のオ
リゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ法によるＤ
ＮＡ増幅反応で得られる増幅産物の大きさが、野生種ト
マトのインベルターゼ遺伝子に固有のものであるか否か
により、野生種トマトのインベルターゼ遺伝子を検出す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、インベルターゼ遺伝子
の検出法及びスクロースを含有する栽培種トマト及びそ
の作出法に関する。

【０００２】

【従来の技術】トマト（Lycopersicon）属には、野生種
の中の緑色果実種であるリコペルシコン・クミエルスキ
ー（L. chmielewskii）、リコペルシコン・ペルビアヌ
ム（L.peruvianum）等のように、果実にスクロースを蓄
積する種と、栽培種（リコペルシコン・エスクレンタム
(L. esculentum)）や野生種の中の赤色果実種であるリ
コペルシコン・ピンピネリフォリウム（L. pimpinellif
olium）等のようにスクロースを蓄積せずに、糖類とし
てフルクトースとグルコースのみを蓄積する種が存在す
る。

【０００３】野生種におけるスクロースの蓄積には、イ
ンベルターゼが関与していることが知られており（Plan
t Physiol., 87, 737-740, 1988）、栽培種トマトにお
いては、インベルターゼｃＤＮＡの配列（Plant Physio
l. 34(2), 263-269, 1993）、及びゲノム遺伝子の一部
の配列やイントロンの位置も報告されている（PlantMol
ecular Biology, 21, 515-524, 1993）。

【０００４】生食用トマトとして改良されてきた栽培種
である現在の市販品種では、大果種、小果種にかかわら
ず、味や栽培適性においては野生種よりも優れている
が、スクロースを蓄積する品種は存在しない。スクロー
スを含有する栽培種の性質を栽培種に導入することがで
きれば、甘さの質の向上、単糖よりも浸透圧の低いスク
ロースの蓄積による糖含量の増大、甘味度の低いグルコ
ースの減少、スクロースの蓄積などによる甘味度の向上
が期待される。

【０００５】ところで、ある遺伝子の有無あるいは遺伝
子型を調べる方法として、制限酵素断片長多型（Restri
ction fragment length polymorphisms ：ＲＦＬＰ）に
よる解析技術が知られている。これは、遺伝子の構造の
異なる部位に制限酵素部位が存在すると、制限酵素切断
断片の大きさが異なることを利用したものである。断片
の検出には、ランダムにＤＮＡ断片をプローブとして用
いる方法が用いられている（Theor. Appl. Genet, 80,
437-448, 1990）が、特定の遺伝子をターゲットとして
そのＤＮＡ断片をプローブとして用いる方法も知られて
いる。

【０００６】一方、ＤＮＡの増幅法であるＰＣＲ（Poly
merase Chain Reaction）法が、遺伝子の検出手段とし
て用いられるようになってきた。これは、二本鎖ＤＮＡ
の一本鎖ＤＮＡへの熱変性、増幅を目的とする部位の両
端の配列に相当するオリゴヌクレオチドと前記熱変性Ｄ
ＮＡとのアニーリングと、前記オリゴヌクレオチドをプ
ライマーとしたポリメラーゼ反応からなる増幅サイクル
を繰り返すことにより、前記ＤＮＡ配列を指数関数的に
増幅する方法である。増幅された遺伝子断片の長さの違
いにより、遺伝子の識別が可能となっている。

【０００７】ＰＣＲ法においても、ランダムプライマー
を用いた方法が知られている（ＲＡＰＤ：Random Ampli
fied Polymorphic DNAs、Plant Cell Reports, 12, 293
-297, 1993、Plant Physiol., 87, 737-740, 1988）
が、検出感度や効率の点では、特定の塩基配列に基づく
プライマーを用いる方法には及ばない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】上述したように、スク
ロースの蓄積にはインベルターゼが関与していることが
知られており、トマト野生種の持つインベルターゼ遺伝
子を栽培種に導入すれば、スクロースを蓄積する栽培種
が得られることが期待される。

【０００９】栽培種トマトに上記遺伝子を導入する方法
として、スクロースを蓄積する野生種トマトとの交雑が
考えられる。しかしながら、栽培種の形質を維持しなが
らスクロースを蓄積する形質を獲得した株が得られる頻
度は極めて低いことが予想され、しかも性質の確認のた
めに成体まで栽培することが必要であることから、目的
とする株を選択することは、非常に困難である。また、
スクロースを含有する形質は劣性形質であるため、戻し
交雑による育種を行う際に、より長い期間を必要とし、
トマトにおいては通常１０年程度必要である。したがっ
て、野生種のインベルターゼ遺伝子を効率的に検出する
方法が望まれる。

【００１０】本発明は、上記観点からなされたものであ
り、スクロースを蓄積するトマトのインベルターゼ遺伝
子を検出する方法、及びスクロースを蓄積する栽培種ト
マトを提供することを課題とする。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者は、前記課題を
解決するために鋭意研究を行った結果、栽培種トマトの
インベルターゼ遺伝子の塩基配列のうち、特定の部位の
配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーに用い、
トマトの染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法によるＤＮ
Ａ増幅反応を行うと、果実にスクロースを含有する野生
種トマトのインベルターゼ遺伝子を検出することができ
ることを見出し、本発明に至った。

【００１２】すなわち本発明は、トマト染色体ＤＮＡを
鋳型とし、２種類のオリゴヌクレオチドをプライマーと
するＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅反応で得られる増幅産物
の大きさが、野生種トマトのインベルターゼ遺伝子に固
有のものであるか否かにより、野生種トマトのインベル
ターゼ遺伝子を検出する方法である。

【００１３】本発明はさらに、下記工程からなるスクロ
ースを含有する栽培種トマトの作出法、及び果実にスク
ロースを含有する野生種トマトのインベルターゼ遺伝子
を有し、果実にスクロースを含有する栽培種トマトを提
供する。 （ａ）果実にスクロースを含有する野生種トマトと栽培
種トマトとを交雑し、（ｂ）（ａ）で得られる交雑種と
栽培種トマトを交雑し、（ｃ）（ｂ）で得られる交雑種
の中から、前記野生種のインベルターゼ遺伝子を保持す
るものを、この交雑種の染色体ＤＮＡを鋳型とし、２種
類のオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ法に
よるＤＮＡ増幅反応を行い、この反応により得られる増
幅産物が野生種トマトのインベルターゼ遺伝子に固有の
大きさを有するものを選抜し、（ｄ）前記で選抜された
交雑種と栽培種トマトとを交雑し、（ｅ）工程（ｃ）と
工程（ｄ）を繰返す。

【００１４】以下、本発明を詳細に説明する。

【００１５】＜１＞果実にスクロースを含有する栽培種
トマトとその作出法 スクロースを含有する栽培種トマトは上記工程により作
出することができる。スクロースを含有する野生種トマ
トとしては、リコペルシコン・クミエルスキー、リコペ
ルシコン・ペルビアヌム等が挙げられ、これらと栽培種
トマト（リコペルシコン・エスクレンタム）を交雑し、
栽培種トマトのもつ味や栽培適性に関する形質を維持し
つつ、スクロースを蓄積する形質を有するものを選抜す
る。尚、スクロースを蓄積する形質の選抜は、次項で述
べる野生種インベルターゼ遺伝子の検出法により行う。

【００１６】トマトはイネ等と同様に自殖性植物であ
り、通常同じ花の中で花粉が柱頭について受精（自殖）
し、果実や種子の形成がなされる。したがって、交雑の
際には、あらかじめ花粉を除去して自殖を避け、他の個
体の花粉を授粉することが好ましい。具体的には、例え
ば、雌親に用いる個体の、開花３〜５日前の花の葯をピ
ンセットなどで除去（除雄）し、１〜３日後、開花前後
の除雄した花の柱頭に雄親の花粉を授粉し、形成した果
実内の種子を採り、これを播種して個体を育成する。

【００１７】上記のようにして得られる雑種第１代（Ｆ
１）の後代では、野生型の遺伝子の多くが入ってくるの
で、食用には適さない。したがって、Ｆ１雑種を栽培種
の親と戻し交雑を繰返し、スクロースを含有する形質以
外は栽培種の形質を保持するものを作出することが好ま
しい。

【００１８】従来の作出法では交雑種を成体まで栽培
し、特定の形質を有するか否かを表現形質により判定し
ているが、このような方法では新品種を得るのに非常に
長い期間を要する。本発明においては、目的とする交雑
種を得るために、後述するように、トマト野生種のイン
ベルターゼ遺伝子を検出することとした。その結果、幼
苗の段階で同遺伝子を保持するか否かを判定することが
でき、スクロースを含有する栽培種トマトを得ることが
できた。

【００１９】上記のようにして得られた交雑種は、カゴ
メ株式会社総合研究所（栃木県那須郡西那須野町西富山
１７番地）内にて保管栽培されており、本出願人は、本
発明の確認のために提供することを宣言する。 ＜２＞インベルターゼ遺伝子の検出法及スクロースを含
有する栽培種トマトの選抜 本発明のインベルターゼ遺伝子の検出法は、トマト染色
体ＤＮＡを鋳型とし、２種類のオリゴヌクレオチドをプ
ライマーとするＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅反応で得られ
る増幅産物の大きさが、野生種トマトのインベルターゼ
遺伝子に固有のものであるか否かにより、野生種トマト
のインベルターゼ遺伝子を検出する方法である。

【００２０】本発明者は、栽培種トマトについては、イ
ンベルターゼｃＤＮＡを単離し、その塩基配列を開示し
ている（Plant Physiol. 34(2), 263-269, 1993）。そ
の配列を、配列表配列番号１に示す。また、ゲノム遺伝
子の一部の配列やイントロンの位置も報告されている
（Plant Molecular Biology, 21, 515-524, 1993）。一
方、野生種トマトについては、インベルターゼ遺伝子の
構造は知られていない。

【００２１】そこで、栽培種及び野生種のインベルター
ゼ遺伝子あるいはそれに隣接するゲノムのＰＣＲ増幅断
片に差異が認められるようなプライマーを得るために、
種々のプライマーを作製し、多型検出が可能な配列の検
索を行った。その結果、後記実施例に示すように、配列
表配列番号１中、塩基番号１〜１９０５の配列の一部を
有するプライマー、及び１９０６〜２３７２の配列に相
補的な配列（向きは、配列番号１に示した配列の３’側
から５’側に向かう）の一部を有するプライマーを用い
てＰＣＲ反応を行うことによって、野生種のインベルタ
ーゼ遺伝子の検出を効率よく行うことができることがわ
かった。

【００２２】また、上記配列を有するＤＮＡ断片をプロ
ーブに用いたサザンハイブリダイゼーション等によって
も検出が可能であるが、効率や一度に処理可能な検体数
の点から、ＰＣＲ法を用いることが好ましい。

【００２３】

【実施例】以下に、本発明の実施例を説明する。

【００２４】

【実施例１】栽培種トマトと野生種トマトのインベルタ
ーゼ遺伝子間での多型検出

【００２５】栽培種トマト（大果種）と、野生種トマト
（リコペルシコン・クミエルスキーＬＡ１０２８）が有
するインベルターゼ遺伝子の多型検出を行った。まず、
配列番号１に示した栽培種トマトインベルターゼｃＤＮ
Ａの塩基配列を基に、５’末端寄りの断片、３’末端寄
りの断片を増幅できるよう２組のＰＣＲ用プライマーを
作製した。５’寄りの断片の増幅には、プライマー５’
−１（配列番号２：配列番号１中塩基番号１９９〜２１
８に相当）とプライマー３’−２（配列番号３：配列番
号１中塩基番号６７４〜６８３に相当）を、３’寄りの
断片の増幅には、プライマー５’−２（配列番号４：配
列番号１中塩基番号１５９０〜１６０８に相当）とプラ
イマー３’−１（配列番号５：配列番号１中塩基番号２
０８５〜２１０４に相当）を作製した。インベルターゼ
遺伝子のそれぞれの部位について、２つのイントロンが
含まれることがわかっている（Plant Molecular Biolog
y, 21, 515-524, 1993）。

【００２６】上記プライマーは、ＤＮＡ合成装置サイク
ロンプラス（Milligen社製）を用い、合成したオリゴヌ
クレオチドは、アンモニア原液（約２８％）を用いてカ
ラムから切り出し、乾固した後、ＴＥ緩衝液に溶解し、
フェノール−クロロホルム抽出を行った。

【００２７】一方、ＰＣＲ反応の鋳型ＤＮＡは、次のよ
うにして調製した。トマト栽培種（リコペルシコン・エ
スクレンタム）の大果種（固定種）、小果種（固定
種）、野生種（リコペルシコン・クミエルスキー）の２
系統ＬＡ１０２８、ＬＡ１３１４、および、栽培種の大
果種を雌親、ＬＡ１０２８を雄親として育成した雑種Ｆ
₁およびＦ₂集団、栽培種の小果種を雌親、ＬＡ１３１４
を雄親として育成した雑種Ｆ₁およびＦ₂集団を主な材料
とした。

【００２８】さらに、栽培種の小果種として２品種を、
その他の野生種としてリコペルシコン・ヒルスタム（L.
hirsutum）（ＷＩＲ９２４）、リコペルシコン・ピン
ピネリフォリウム ＰＩ３４４１０２、リコペルシコン
・ペルビアナム ＰＩ１２８６５０を用いた。

【００２９】ハウス内にて、ポリポットを用い、生食用
トマト栽培要領に準じて、上記各種のトマトの栽培を行
った。本葉が２枚以上出葉したトマトの成葉１００ｍｇ
あるいはそれ以上を材料に、以下に示すＣＴＡＢ（Cety
ltrimethyl ammonium bromide）法を用いて核酸を抽出
した。

【００３０】液体窒素を用い乳鉢内で材料を粉状にホモ
ジナイズし、約３００μｌ／１００ｍｇの割合でＣＴＡ
Ｂ−Ｂバッファー（100mM Tris-HCl pH8.0、1.4M NaCl、
20mMEDTA、２％ＣＴＡＢ）を加え、１分間吸引して脱気
した。これを６５℃で１５〜２０分間インキュベートし
た後、クロロホルム／イソアミルアルコール（２４／
１）で２度抽出を行った。得られた水層に等量のＣＴＡ
Ｂ−Ｃバッファー（50mM Tris-HCl pH8.0、10mM EDTA、1
% CTAB）を加え、室温にて３０分間インキュベートし
た。次に、これを１２０００ｒｐｍ、１０分間、室温に
て遠心し、沈殿を４００μｌの１Ｍ ＣｓＣｌに溶解し
た後、エタノールを加えて核酸を沈殿させた。

【００３１】上記のようにして得られた鋳型ＤＮＡ及び
プライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応
は、10mM Tris-HCl(pH8.9)、1.5mM MgCl2、80mM KCl、50
0μg/ml BSA、0.1% コール酸ナトリウム、0.1% TritonX
-100、240μM dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP）、各３０
ｎｇプライマー、約２００ｎｇの鋳型ＤＮＡ、１．０ユ
ニット Ｔｔｈ ＤＮＡ ポリメラーゼ（東洋紡
（株））を含む２５μｌの反応組成で、ＰＣＲ反応装置
（Perkin Elmer Cetus DNA thermal cycler）を用いて
行った。

【００３２】増幅反応の条件は、変性９４℃５分間、ア
ニーリング５５℃５分間の後、伸長７２℃３分間、変性
９４℃１分間、アニーリング５５℃２分間からなるサイ
クルを３０サイクル繰り返して行い、最後に伸長７２℃
１０分間を加えた。

【００３３】ＰＣＲ産物は、NuSieve 3:1 agarose（FMC
BioProducts）３〜４％のゲルを用いて、電気泳動によ
り分離し、その断片の長さを識別した。その結果、栽培
種（大果種）と、リコペルシコン・クミエルスキー Ｌ
Ａ１０２８では、５’末端よりの断片の増幅では、少な
くとも電気泳動により両者の断片の長さに差は認められ
なかった。一方、３’末端よりの断片の増幅では、僅か
に両者の断片の長さが異なるのが観察された。しかし、
違いを判定するのが多少困難であったため、得られた増
幅断片長（７００〜８００ｂｐ）をより小さくし、バン
ドの分離を明確にすることが望まれた。

【００３４】そこで、さらにこの断片を２つに分けるた
めに、新たに２つのプライマー３’−３（配列番号６：
配列番号１中塩基番号１８２４〜１８４３に相当）、
５’−３（配列番号７：配列番号１中塩基番号１８４４
〜１８６３に相当）を合成し、５’−２と３’−３、
５’−３と３’−１の組み合わせでＰＣＲ反応を行い、
増幅断片を２つに分離した。

【００３５】その結果、２つの断片のうち３’末端より
の断片において長さの差が認められ、ＮｕＳｉｅｖｅ
３：１ アガロース（FMC BioProducts）を３〜４％用い
たアガロースゲル電気泳動により、はっきりと区別する
ことができた（図１）。なお、この２つのプライマーを
用いた場合、栽培種のｃＤＮＡを鋳型にすると２６１ｂ
ｐの断片が増幅されるが、栽培種ゲノムＤＮＡではこの
領域にイントロンが１カ所含まれることがわかってお
り、４００ｂｐ弱の断片が増幅されたことから、栽培
種、リコペルシコン・クミエルスキー共に、１００〜１
５０ｂｐのイントロンが含まれることが予想される。お
そらく、このイントロンの長さが両者で異なるのではな
いかと考えられ、詳細に検討したところ、予想通りであ
ることが確認された。

【００３６】このＰＣＲを用いた解析により、栽培種と
リコペルシコン・クミエルスキーとでインベルターゼ遺
伝子の違いを識別することが可能となった。また、栽培
種に小果種、リコペルシコン・クミエルスキーにＬＡ１
３１４を用いた場合もまったく同様の結果が得られた。

【００３７】次に、鋳型として栽培種（大果種）とリコ
ペルシコン・クミエルスキー（ＬＡ１０２８）のＦ₁お
よびＦ₂集団のゲノムＤＮＡを用い、前記で断片の差が
認められたプライマー（５’−３、３’−１）を使って
ＰＣＲを行った。その結果Ｆ₁では、栽培種とリコペル
シコン・クミエルスキー由来の２本のバンドが検出され
（ヘテロ型）、Ｆ₂集団では、栽培種型を示す個体、リ
コペルシコン・クミエルスキー型を示す個体、ヘテロ型
を示す個体が現れた（図１）。そして、それらＦ ₂集団
の糖組成分析の結果を照らし合わせると、スクロース含
有個体はリコペルシコン・クミエルスキー型を、スクロ
ース非含有個体では栽培種型もしくはヘテロ型を示すこ
とが明らかとなった。

【００３８】すなわちリコペルシコン・クミエルスキー
のインベルターゼ遺伝子をホモで持つのか、へテロで持
つのか、あるいは持たないのかを、すべて明らかにする
ことが可能となり、それによりスクロース含有の有無に
ついても識別可能となった。なお、ヘテロ型を示す場合
には、例外なく、より長い断片がもう１本認められた
が、この断片の増幅された原因については定かではない
が、遺伝子マーカーとしてはまったく支障はない。ま
た、栽培種に小果種、リコペルシコン・クミエルスキー
にＬＡ１３１４を用いた場合についても、まったく同様
の結果が得られた。

【００３９】リコペルシコン・クミエルスキー以外の野
生種を含むその他の種、および品種について、同様のプ
ライマーを用いてＰＣＲによるインベルターゼ遺伝子の
増幅を行い、電気泳動による分離を行った（図２）。栽
培種では、他品種の大果種、小果種の２品種においてま
ったく同じサイズのＤＮＡ断片の増幅が認められた。ま
た、小果種の起源であるといわれるリコペルシコン・ピ
ンピネリフォリウムでも、栽培種と同じサイズの断片が
得られた。よって、スクロースを含有しない種では、野
生種のリコペルシコン・ピンピネリフォリウムを含め
て、栽培種では大果種、小果種にかかわらず、少なくと
も電気泳動上では同じサイズの断片が得られることがほ
ぼ明らかとなった。

【００４０】スクロースを含有するその他の野生種につ
いては、リコペルシコン・ヒルスタム（L. hirsutum）
では、リコペルシコン・クミエルスキーと同じくらいの
長さの断片が得られ、リコペルシコン・ペルビアナムで
は、栽培種よりやや長めの３本の断片が得られた（図
２）。すなわち、ここで用いたスクロースを含有する野
生種３種では、いずれの種においても栽培種の断片との
識別が可能であり、スクロース含有に関するマーカーと
なり得ること、また、スクロースを含有する種は、必ず
しも同じインベルターゼ遺伝子を持つわけではないこと
が示唆された。

【００４１】

【実施例２】 スクロース含有トマトの作出 トマト栽培種と野生種を交配し、実施例１の方法により
野生種のインベルターゼ遺伝子を保持する雑種の選択を
行い、スクロースを含有する栽培種トマトを作出した。

【００４２】＜１＞トマトの栽培種と野生種の交雑 トマト栽培種（リコペルシコン・エスクレンタム）を育
成し、形成された花房の中の開花３〜５日目の花の葯
（花粉はまだ受精能力なし）をピンセットなどで除去
（除雄）した。１〜３日後、開花前後の除雄した栽培種
の花の柱頭に、同時に育成した野生種（リコペルシコン
・クミエルスキー）の花粉を授粉した。その後、形成さ
れた果実内の種子を採り、播種して個体（Ｆ₁個体）を
育成した。得られたＦ₁個体は、ＰＣＲ法を用いたイン
ベルターゼ遺伝子の解析により、栽培種と野生種の雑種
であることを確認した。

【００４３】＜２＞トマト栽培種への戻し交雑（Ｂａｃ
ｋ Ｃｒｏｓｓ） （１）栽培種とＦ₁個体の交雑 上記と同様にトマト栽培種の除雄を行い、Ｆ₁個体の花
粉を授粉した。その後、形成された果実内の種子を採
り、播種して個体（ＢＣ₁Ｆ₁個体）を育成した。

【００４４】（２）遺伝子解析による選抜（ＢＣ₁Ｆ₁） このＢＣ₁Ｆ₁個体の中には、野生種由来のインベルター
ゼ遺伝子を持たない個体とヘテロに持つ個体が含まれる
が、いずれもスクロースを含有しないため、形質では識
別することができない。よって通常の戻し交雑法では、
上記で作製したＦ₁個体を自殖（自家受粉）し、次世代
の中からスクロース含有個体を選抜して、その個体の花
粉をトマト栽培種に戻し交雑するという方法をとった。
これにより得られたＢＣ₁Ｆ₁個体は、野生種由来のイン
ベルターゼ遺伝子を必ずヘテロに持つことになる。

【００４５】しかし、本発明の方法によるＰＣＲ法を用
いたインベルターゼ遺伝子の解析を行うことにより、野
生種由来のインベルターゼ遺伝子をヘテロに持つ個体を
選抜することが可能になったため、期間短縮が可能とな
った。

【００４６】（３）栽培種とＢＣ₁Ｆ₁個体の交雑 前記と同様にトマト栽培種の除雄を行い、（２）で選抜
した野生種由来のインベルターゼ遺伝子をヘテロに持つ
ＢＣ₁Ｆ₁個体の花粉を授粉した。その後、形成された果
実内の種子を採り、播種して個体（ＢＣ₂Ｆ₁個体）を育
成した。

【００４７】（４）遺伝子解析による選抜（ＢＣ₂Ｆ₁） 上記ＢＣ₂Ｆ₁個体のなかには、野生種由来のインベルタ
ーゼ遺伝子をまったく持たない個体とヘテロに持つ個体
が含まれるため、ＰＣＲ法を用いたインベルターゼ遺伝
子の解析により、ヘテロに持つ個体を選抜した。

【００４８】（５）戻し交雑の繰り返し 以上のような栽培種への戻し交雑を、野生種の食味、
色、外観、栽培適性における不良形質がなくなり、戻し
親の栽培種に近い形質になるまで繰り返した（最低３回
以上）。

【００４９】＜３＞スクロース含有トマト品種の育成 ３〜６回戻し交雑を行って得たＢＣ_nＦ₁個体を自殖（自
家受粉）した。次世代では、野生種由来のインベルター
ゼ遺伝子を持たない個体とヘテロに持つ個体、ホモに持
つ個体の３種類が現れ、ホモに持つ個体のみがスクロー
スを含有し得る。そこで幼苗の段階でのＰＣＲ法を用い
たインベルターゼ遺伝子の解析により、ホモに持つ個体
のみを選抜し、育成した。尚、幼苗での選抜が可能とな
り、より多くの個体を扱えるようになったため、スクロ
ース含有個体の比率が非常に低い場合でも、効率的に選
抜ができる。

【００５０】形成された果実の糖分析を行い、スクロー
ス含量、糖含量の高い個体を選抜した。その後、形質の
ばらつきがほとんどなく、遺伝的にほぼ固定されたと判
断されるまで、自殖、糖分析による選抜を数回繰り返
し、目標とするスクロース含有トマト品種を得た。この
トマト品種は、果実はリコペルシコン・クミエルスキー
やリコペルシコン・ペルビアナムなどの野生種のような
青臭みは少なく、栽培種と同程度の食味を有し、大部分
の野生種のように果実は緑色ではなく着色し、花の柱頭
が大部分の野生種のように突出していないため、栽培種
と同様に容易に自家受粉し、葉は野生種のように小さく
なく、草勢も栽培種と同等で強く、側枝も野生種のよう
に多くないため、栽培適性もよい。

【００５１】こうして得られたスクロース含有栽培種ト
マトは、カゴメ株式会社総合研究所（栃木県那須郡西那
須野町西富山１７番地）内にて保管栽培されており、本
出願人は、本発明の確認のために提供することを宣言す
る。

【００５２】

【発明の効果】本発明により、スクロースを含有するト
マトのインベルターゼ遺伝子を検出することが可能とな
り、スクロースを含有する栽培種トマトを提供すること
ができる。

【００５３】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ： 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名： 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：.. 特徴を決定した方法：Ｐ 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：361..414 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：５５９．．１６４１ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GGACAAAGTC GCGCTTCAGG GAATAATTGA AGCAGATCAT GTAGGTTTCT ATATCCAACT 60 CTGCAGCTGA GTCAACACGG AGTAGCTCAA TTGAGCCTGG TTGAAGATCG ACTTGCTTAA 120 CAGTAGGATC ACCCACTCTT AAGCTTTCAA TTTCTTCCAC TGGCCACTGA AGTAGATGTG 180 TCCCTATCTT CTATT ATG GCC ACT CAG TGT TAT GAC CCC GAA AAC TCC 228 Met Ala Thr Gln Cys Tyr Asp Pro Glu Asn Ser 5 10 GCC TCT CGT TAC ACA TTA CTC CCG GAT CAA CCC GAT TCC GGC CAC CGG 276 Ala Ser Arg Tyr Thr Leu Leu Pro Asp Gln Pro Asp Ser Gly His Arg 15 20 25 AAG TCC CTT AAA ATC ATC TCC GGC ATT TTC CTC TCC GTT TTC CTT TTG 324 Lys Ser Leu Lys Ile Ile Ser Gly Ile Phe Leu Ser Val Phe Leu Leu 30 35 40 CTT TCT GTA GCC TTC TTT CCT ATC CTC AAC AAC CAG TCA CCG GAC TTG 372 Leu Ser Val Ala Phe Phe Pro Ile Leu Asn Asn Gln Ser Pro Asp Leu 45 50 55 CAA ATC GAC TCC CGT TCG CCG GCG CCG CCG TCA AGA GGT GTT TCT CAG 420 Gln Ile Asp Ser Arg Ser Pro Ala Pro Pro Ser Arg Gly Val Ser Gln 60 65 70 75 GGA GTC TCC GAT AAA ACT TTT CGA GAT GTA GCC GGT GCT AGT CAC GTT 468 Gly Val Ser Asp Lys Thr Phe Arg Asp Val Ala Gly Ala Ser His Val 80 85 90 TCT TAT GCG TGG TCC AAT GCT ATG CTT AGC TGG CAA AGA ACG GCT TAC 516 Ser Tyr Ala Trp Ser Asn Ala Met Leu Ser Trp Gln Arg Thr Ala Tyr 95 100 105 CAT TTT CAA CCT CAA AAA AAT TGG ATG AAC GAT CCT AAT GGA CCA TTG 564 His Phe Gln Pro Gln Lys Asn Trp Met Asn Asp Pro Asn Gly Pro Leu 110 115 120 TAT CAC AAG GGA TGG TAC CAC CTT TTT TAT CAA TAC AAT CCA GAT TCA 612 Tyr His Lys Gly Trp Tyr His Leu Phe Tyr Gln Tyr Asn Pro Asp Ser 125 130 135 GCT ATT TGG GGA AAT ATC ACA TGG GGC CAT GCT GTA TCC AAG GAC TTG 660 Ala Ile Trp Gly Asn Ile Thr Trp Gly His Ala Val Ser Lys Asp Leu 140 145 150 155 ATC CAC TGG CTC TAC TTG CCT TTT GCC ATG GTT CCT GAT CAA TGG TAT 708 Ile His Trp Leu Tyr Leu Pro Phe Ala Met Val Pro Asp Gln Trp Tyr 160 165 170 GAT ATT AAC GGT GTC TGG ACA GGG TCC GCT ACC ATC CTA CCC GAT GGT 756 Asp Ile Asn Gly Val Trp Thr Gly Ser Ala Thr Ile Leu Pro Asp Gly 175 180 185 CAG ATC ATG ATG CTT TAT ACC GGT GAC ACT GAT GAT TAT GTG CAA GTG 804 Gln Ile Met Met Leu Tyr Thr Gly Asp Thr Asp Asp Tyr Val Gln Val 190 195 200 CAA AAT CTT GCG TAC CCC GCC AAC TTA TCT GAT CCT CTC CTT CTA GAC 852 Gln Asn Leu Ala Tyr Pro Ala Asn Leu Ser Asp Pro Leu Leu Leu Asp 205 210 215 TGG GTC AAG TTG AAA GGC AAC CCG GTT CTG GTT CCT CCA CCC GGC ATT 900 Trp Val Lys Leu Lys Gly Asn Pro Val Leu Val Pro Pro Pro Gly Ile 220 225 230 235 GGT GTC AAG GAC TTT AGA GAC CCG ACT ACT CGT TGG ACC GGA CCA CAA 948 Gly Val Lys Asp Phe Arg Asp Pro Thr Thr Arg Trp Thr Gly Pro Gln 240 245 250 AAT GGG CAA TGG CTG TTA ACA ATC GGG TCT AAG ATT GGT AAA ACG GGT 996 Asn Gly Gln Trp Leu Leu Thr Ile Gly Ser Lys Ile Gly Lys Thr Gly 255 260 265 GTT GCA CTT GTT TAT GAA ACT TCC AAC TTC ACA AGC TTT AAG CTA TTG 1044 Val Ala Leu Val Tyr Glu Thr Ser Asn Phe Thr Ser Phe Lys Leu Leu 270 275 280 GAT GGA GTG CTG CAT GCG GTT CCG GGT ACG GGT ATG TGG GAG TGT GTG 1092 Asp Gly Val Leu His Ala Val Pro Gly Thr Gly Met Trp Glu Cys Val 285 290 295 GAC TTT TAC CCG GTA TCT ACT AAA AAA ACA AAC GGG TTG GAG ACA TCG 1140 Asp Phe Tyr Pro Val Ser Thr Lys Lys Thr Asn Gly Leu Glu Thr Ser 300 305 310 315 TAT AAC GGG CCG GGT GTA AAG CAT GTG TTA AAA GCA AGT TTA GAT GAC 1188 Tyr Asn Gly Pro Gly Val Lys His Val Leu Lys Ala Ser Leu Asp Asp 320 325 330 AAT AAG CAA GAT CAT TAT GCT ATT GGT ACG TAT GAC TTG GGA AAG AAC 1236 Asn Lys Gln Asp His Tyr Ala Ile Gly Thr Tyr Asp Leu Gly Lys Asn 335 340 345 AAA TGG ACA CCC GAT AAC CCG GAA TTG GAT TGT GGA ATT GGG TTG AGA 1284 Lys Trp Thr Pro Asp Asn Pro Glu Leu Asp Cys Gly Ile Gly Leu Arg 350 355 360 CTA GAC TAT GGG AAA TAT TAT GCA TCA AAG ACT TTT TAT GAC CCG AAG 1332 Leu Asp Tyr Gly Lys Tyr Tyr Ala Ser Lys Thr Phe Tyr Asp Pro Lys 365 370 375 AAA GAA CGA AGA GTA CTG TGG GGA TGG ATT GGG GAA ACT GAC AGT GAA 1380 Lys Glu Arg Arg Val Leu Trp Gly Trp Ile Gly Glu Thr Asp Ser Glu 380 385 390 395 TCT GCT GAC CTG CAG AAG GGA TGG GCA TCT GTA CAG AGT ATT CCA AGG 1428 Ser Ala Asp Leu Gln Lys Gly Trp Ala Ser Val Gln Ser Ile Pro Arg 400 405 410 ACA GTG CTT TAC GAC AAG AAG ACA GGG ACA CAT CTA CTT CAG TGG CCA 1476 Thr Val Leu Tyr Asp Lys Lys Thr Gly Thr His Leu Leu Gln Trp Pro 415 420 425 GTG GAA GAA ATT GAA AGC TTA AGA GTG GGT GAT CCT ACT GTT AAG CAA 1524 Val Glu Glu Ile Glu Ser Leu Arg Val Gly Asp Pro Thr Val Lys Gln 430 435 440 GTC GAT CTT CAA CCA GGC TCA ATT GAG CTA CTC CGT GTT GAC TCA GCT 1572 Val Asp Leu Gln Pro Gly Ser Ile Glu Leu Leu Arg Val Asp Ser Ala 445 450 455 GCA GAG TTG GAT ATA GAA GCC TCA TTT GAA GTG GAC AAA GTC GCG CTT 1620 Ala Glu Leu Asp Ile Glu Ala Ser Phe Glu Val Asp Lys Val Ala Leu 460 465 470 475 CAG GGA ATA ATT GAA GCA GAT CAT GTA GGT TTC AGT TGC TCT ACT AGT 1668 Gln Gly Ile Ile Glu Ala Asp His Val Gly Phe Ser Cys Ser Thr Ser 480 485 490 GGA GGT GCT GCT AGC AGA GGC ATT TTG GGA CCA TTT GGT GTC ATC GTA 1716 Gly Gly Ala Ala Ser Arg Gly Ile Leu Gly Pro Phe Gly Val Ile Val 495 500 505 ATT GCT GAT CAA ACG CTA TCT GAC GTA ACG CCA GTT TAC TTT TAC ATT 1764 Ile Ala Asp Gln Thr Leu Ser Asp Val Thr Pro Val Tyr Phe Tyr Ile 510 515 520 TCT AAA GGA GCT GAT GGT CGT GCA GAG ACT CAC TTC TGT GCT GAT CAA 1812 Ser Lys Gly Ala Asp Gly Arg Ala Glu Thr His Phe Cys Ala Asp Gln 525 530 535 ACT CGA TCC TCT GAG GCT CCG GGA GTT GGT AAA CAA GTT TAT GGT AGT 1860 Thr Arg Ser Ser Glu Ala Pro Gly Val Gly Lys Gln Val Tyr Gly Ser 540 545 550 555 TCA GTA CCT GTG TTG GAC GGT GAA AAA CAT TCA ATG AGA TTA TTG GTG 1908 Ser Val Pro Val Leu Asp Gly Glu Lys His Ser Met Arg Leu Leu Val 560 565 570 GAT CAC TCA ATT GTG GAG AGC TTT GCT CAA GGA GGA AGA ACA GTC ATA 1956 Asp His Ser Ile Val Glu Ser Phe Ala Gln Gly Gly Arg Thr Val Ile 575 580 585 ACA TCG CGA ATT TAC CCA ACA AAG GCA GTA AAT GGA GCA GCA CGA CTC 2004 Thr Ser Arg Ile Tyr Pro Thr Lys Ala Val Asn Gly Ala Ala Arg Leu 590 595 600 TTT GTT TTC AAC AAT GCC ACA GGG GCT AGC GTT ACT GCC TCC GTC AAG 2052 Phe Val Phe Asn Asn Ala Thr Gly Ala Ser Val Thr Ala Ser Val Lys 605 610 615 ATT TGG TCA CTT GAG TCA GTC AAT ATT CAA TCC TTC CCT TTG CAA GAC 2100 Ile Trp Ser Leu Glu Ser Val Asn Ile Gln Ser Phe Pro Leu Gln Asp 620 625 630 635 TTG TAATCTTACT TTATTTCGTT TTTTTTTTCT TTTTCATTTG AAGGTTATTT 2153 Leu CAACACCGAC GTCCCATCAA GAAAGGGAAG AGGGAGATCA ATATATGTAG TGTTATTCGC 2213 CCTACCTTAG GATTAGATGT CATCTAGCAA TGTCAAATCT AGTAGAGTAT ACAATGTATG 2273 GGTTCCTGGA AACCGAGTAG AGCTTACCTG GATTCTATGA AACTAAGAAA CTAAGAAAGC 2333 TCAGCAAATA TATGCACAAA TAATTTACAG AAAAAAAAA 2372

【００５４】配列番号：２ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GCCACTCAGT GTTATGACCC 20

【００５５】配列番号：３ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AACCATGGCA AAAGGCAAGT 20

【００５６】配列番号：４ 配列の長さ：19 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AGCCTCATTT GAAGTGGAC 19

【００５７】配列番号：５ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ACAAGTCTTG CAAAGGGAAG 20

【００５８】配列番号：６ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TACCAACTCC CGGAGCCTCA 20

【００５９】配列番号：７ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AACAAGTTTA TGGTAGTTCA 20

【００６０】

【図面の簡単な説明】

【図１】 スクロース含有の有無とインベルターゼ遺伝
子との関係を示す電気泳動図。

【図２】 各種トマトのインベルターゼ遺伝子断片の増
幅を示す電気泳動図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 石黒 幸雄 栃木県那須郡西那須野町東三島５丁目96番 地19 (72)発明者 佐藤 隆英 東京都中野区江原町３−31−11 (72)発明者 森 仁志 愛知県名古屋市緑区篠の風３丁目252番地 ９−103

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 トマト染色体ＤＮＡを鋳型とし、２種類
   のオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ法によ
   るＤＮＡ増幅反応で得られる増幅産物の大きさが、野生
   種トマトのインベルターゼ遺伝子に固有のものであるか
   否かにより、野生種トマトのインベルターゼ遺伝子を検
   出する方法。
2. 【請求項２】 前記プライマーの一方が、配列表配列番
   号１中、塩基番号１〜１９０５の配列の一部を有し、他
   方が１９０６〜２３７２の配列に相補的な配列の一部を
   有することを特徴とする請求項１記載の野生種トマトの
   インベルターゼ遺伝子を検出する方法。
3. 【請求項３】 下記工程からなるスクロースを含有する
   栽培種トマトの作出法。 （ａ）果実にスクロースを含有する野生種トマトと栽培
   種トマトとを交雑し、（ｂ）（ａ）で得られる交雑種と
   栽培種トマトを交雑し、（ｃ）（ｂ）で得られる交雑種
   の中から、前記野生種のインベルターゼ遺伝子を保持す
   るものを、この交雑種の染色体ＤＮＡを鋳型とし、２種
   類のオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ法に
   よるＤＮＡ増幅反応を行い、この反応により得られる増
   幅産物が野生種トマトのインベルターゼ遺伝子に固有の
   大きさを有するものを選抜し、（ｄ）前記で選抜された
   交雑種と栽培種トマトとを交雑し、（ｅ）工程（ｃ）と
   工程（ｄ）を繰返す。
4. 【請求項４】 果実にスクロースを含有する野生種トマ
   トのインベルターゼ遺伝子を有し、果実にスクロースを
   含有する栽培種トマト。