JPH0856671A - トマトの根こぶ線虫抵抗性の鑑別法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 根こぶ線虫抵抗性形質を示さない産業上有用
な栽培種に、根こぶ線虫抵抗性を、簡便かつ効率的に付
与する。 【構成】 トマトの根こぶ線虫抵抗性の有無を、それが
保持する酸性ホスファターゼ−１遺伝子の遺伝子型によ
り識別する方法において、配列番号１に示す塩基配列を
有する根こぶ線虫感受性トマトの酸性ホスファターゼ−
１⁺遺伝子（Ａｐｓ−１⁺）領域又は配列番号２に示す塩
基配列を有する根こぶ線虫抵抗性トマトの酸性ホスファ
ターゼ−１¹遺伝子（Ａｐｓ−１¹）領域のポリメラーゼ
・チェイン・リアクションによる増幅断片またはこの増
幅断片に制限酵素を作用させて得られる断片の長さによ
り、酸性ホスファターゼ−１遺伝子の遺伝子型を識別
し、これによってトマトの根こぶ線虫抵抗性の有無を鑑
別する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、トマトの根こぶ線虫抵
抗性の鑑別法及び根こぶ線虫抵抗性栽培種トマトの作出
法に関し、詳しくは根こぶ線虫抵抗性トマト、根こぶ線
虫感受性トマト及びこれらのヘテロ型交雑体を識別する
方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】トマト（Lycopersicon）は、なす科（So
lanaceae）に属し、栽培種、リコペルシコン・エスクレ
ンタム（Lycopersicon esculentum Mill.）の他に、大
きく分けると８種の野生種、リコペルシコン・チースマ
ニー（L. cheesmanii）、リコペルシコン・チレンス
（L. chilense）、リコペルシコン・ペネルリー（L. pe
nnellii）、リコペルシコン・パルビフロールム（L. pa
rviflorum）、リコペルシコン・ヒルスタム（L. hirsut
um）、リコペルシコン・クミエルスキー（L. chmielews
kii）、リコペルシコン・ペルビアヌム（L. peruvianu
m）、リコペルシコン・ピンピネリフォリウム（L. pimp
inellifolium）が存在する。

【０００３】また、トマトの原産地は、アンデス山岳地
帯とガラパゴス諸島といわれており、その緯度と標高差
による様々な環境の違いがトマトの属内において多様な
形質を生じさせ、その結果、豊富な遺伝資源を提供して
いる。特に、野生種においては、豊富な遺伝資源が存在
し、病害虫耐性、果実の品質、生理的ストレス耐性な
ど、多種多様な育種上重要な形質をこれら野生種に見出
すことができる。

【０００４】病害虫耐性は、これらの遺伝資源の中で最
も注目されてきた資源の１つである。１９４０年以前で
は、すべての栽培種はすべての病害虫に対して感受性で
あったが、それ以降、栽培種にいくつかの病害虫耐性形
質が野生種から導入されている。付与された形質は、栽
培種の受精様式が一般に自家受粉であるので失われるこ
とはない。また、病害虫耐性形質は一般に優性形質であ
るので、圃場における表現型での選抜が可能である。し
かしながら、これらの病害虫耐性形質を野生種より栽培
種に導入し、実用品種に育種するためには何世代にもわ
たる戻し交雑を必要とし、育種家達の多大の労力と時間
がそこに費やされている。

【０００５】根こぶ線虫は、寄主範囲が広い上、高い増
殖率と加害能力を持つため、土壌病虫として甚大な被害
を及ぼしている。さらに、発生は慢性的でいったん発生
した圃場からの根絶は極めて困難である。根こぶ線虫に
対しては、ハロゲン化炭化水素系の土壌薫蒸剤の施用が
効果的であるが、環境汚染の問題からこのような薬剤に
対する使用規制の機運が高まりつつあり、天敵利用、耕
作的防除とともに、抵抗性実用品種の育種、利用に期待
が寄せられている。

【０００６】以上の理由により、根こぶ線虫抵抗性形質
を示さない産業上有用な栽培種に抵抗性を、簡便かつ効
率的に付与することは極めて重要な課題といえる。とこ
ろで、トマトにおける根こぶ線虫抵抗性形質は、１９４
０年代前半に、野生種リコペルシコン・ペルビアヌムに
おいて最初に見い出され、その後、この形質を栽培種に
導入する試みがSmithらにより試みられた（P. G. Smit
h, Proc. Am. Hort. Sci., vol.44, p413 (1944)）。

【０００７】栽培種リコペルシコン・エスクレンタムと
野生種リコペルシコン・ペルビアヌム間での交雑は、不
和合性のため、通常できないので、Smithらは交雑後の
未成熟胚を取り出し、人工的に成熟させる（embryo res
cue）ことにより、１個体を得た。現存する栽培種ＶＦ
ＮＴやＶＦＮ８などの抵抗性品種は、この１個体を母体
として交雑により育成されたものであるが、果実が小さ
いなど実用性は低い品種である。

【０００８】VFNTやVFN8などがもつ根こぶ線虫抵抗性遺
伝子（Ｍｉ）は、トマト第６染色体上に座位し、単一優
性遺伝子として存在しており、この抵抗性遺伝子は、酸
性ホスファターゼ−１¹遺伝子（Ａｐｓ−１¹）と強くリ
ンクしていることが、１９７４年Rickらによる遺伝学的
解析から明らかとなっている。Ａｐｓ−１¹とＭｉとの
遺伝学的距離は１ｃＭ以内であることが推定されている
（J. Y. Ho et al., Plant J., Vol.2, P.971 (1992)）
が、物理的距離は不明である。

【０００９】酸性ホスファターゼ−１¹（以下、「ＡＰ
−１¹」という）は、野生種L. peruvianumと同一型であ
り、このＡＰ−１¹はＭｉと同時に栽培種に導入された
ものと考えられている。一方、根こぶ線虫抵抗性形質を
持たない栽培種は、Ａｐｓ−１ ¹の対立形質として酸性
ホスファターゼ−１⁺（以下、「ＡＰ−１⁺」という）を
もつ。これらＡＰ−１¹、ＡＰ−１⁺は、でんぷんゲル電
気泳動上異なる易動度を示し、この性質を利用して根こ
ぶ線虫抵抗性形質の選抜が行われてきた。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】上述したように、遺伝
学的解析の結果を利用して、根こぶ線虫抵抗性形質を有
する品種をでんぷんゲル電気泳動によって選抜すること
が可能となっている。しかしながら、この方法はでんぷ
んゲルの準備が煩わしく、でんぷんの品質が一定しない
ために再現性に乏しいなどの問題がある。また、選抜に
用いる材料として、トマトの葉片を使用するのが最も簡
便で実用に適しているが、トマト種子が発芽した直後の
子葉では、発現産物（ＡＰ−１¹、ＡＰ−１⁺）の量が僅
かであり、これらの検出が困難であるので、実際には播
種後、１カ月程度以上育苗したものの葉片を使用する必
要があり、選抜までに時間がかかり効率的でない。

【００１１】また、Ａｐｓ−１¹ｃＤＮＡは、本発明者
らによってすでにクローン化されており、その塩基配列
の一部について決定されている（H. Tanaka et al., Bi
osci. Biotech. Biochem., Vol.56, P.583 (1992)）。
さらにＡｐｓ−１¹染色体遺伝子の全塩基配列も報告さ
れている（J. L. Erion, et al., Plant Physiol. Vol.
98, 1535-1537 (1992)）。しかしながら、Ａｐｓ−１¹
とＡＰ−１⁺をコードする遺伝子（Ａｐｓ−１⁺）との具
体的な差異については知られておらず、これらを簡便か
つ効率的に識別する方法も当然知られていない。

【００１２】本発明は、かかる観点からなされたもので
あり、根こぶ線虫抵抗性形質を示さない産業上有用な栽
培種に、根こぶ線虫抵抗性を、簡便かつ効率的に付与す
ることを目的とし、トマトの根こぶ線虫抵抗性の有無を
鑑別する方法を提供することを課題とする。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するために鋭意研究を行い、根こぶ線虫感受性トマ
ト カゴメ７０（Kagome 70もしくはＫ７０ともいう）の
染色体からＡｐｓ−１ ⁺の第１イントロン領域の約１．
１ｋｂをクローニングすることに成功し、第一イントロ
ン領域にＡｐｓ−１¹とＡｐｓ−１⁺との間で制限酵素切
断部位の違いが存在すること、さらに、数カ所に塩基置
換、欠失、挿入が存在すること、及びこれらの相違によ
ってＡｐｓ−１¹とＡｐｓ−１⁺を効率的かつ簡便に識別
できることを見いだし、本発明に至った。

【００１４】すなわち本願発明は、トマトの根こぶ線虫
抵抗性の有無を、それが保持する酸性ホスファターゼ−
１遺伝子の遺伝子型により識別する方法において、配列
番号１に示す塩基配列を有する根こぶ線虫感受性トマト
の酸性ホスファターゼ−１⁺遺伝子（Ａｐｓ−１⁺）領域
又は配列番号２に示す塩基配列を有する根こぶ線虫抵抗
性トマトの酸性ホスファターゼ−１¹遺伝子（Ａｐｓ−
１¹）領域の少なくとも一部をポリメラーゼ・チェイン
・リアクションにより増幅させて得られたＤＮＡ断片ま
たはこの増幅断片に制限酵素を作用させて得られるＤＮ
Ａ断片の長さにより、酸性ホスファターゼ−１遺伝子の
遺伝子型を識別することを特徴とするトマトの根こぶ線
虫抵抗性の鑑別法である。

【００１５】上記方法の具体的態様として、前記ポリメ
ラーゼ・チェイン・リアクションに用いる２種のプライ
マーの一方は配列番号１において４８１〜４９４の領域
よりも５’側の部位にハイブリダイズし、他方は前記領
域よりも３’側の部位にハイブリダイズするものである
ことを特徴とする方法、さらに前記制限酵素が、Ｈａｐ
II、ＡｆａＩ、ＳｍａＩ、ＨｉｎｆＩ、ＮｌａIIIから
選ばれることを特徴とする方法を提供する。

【００１６】さらに本願発明は、下記工程からなる根こ
ぶ線虫抵抗性栽培種トマトの作出法を提供する。 （ａ）根こぶ線虫抵抗性トマトと根こぶ線虫感受性栽培
種トマトとを交雑し、（ｂ）（ａ）で得られる交雑種と
前記根こぶ線虫感受性栽培種トマトを交雑し、（ｃ）
（ｂ）で得られる交雑種の中から、酸性ホスファターゼ
−１⁺遺伝子（Ａｐｓ−１⁺）及び酸性ホスファターゼ−
１¹遺伝子（Ａｐｓ−１¹）を共に保持するヘテロ型交雑
種を、配列番号１に示す酸性ホスファターゼ−１⁺遺伝
子（Ａｐｓ−１⁺）領域又は配列番号２に示す塩基配列
を有する根こぶ線虫抵抗性トマトの酸性ホスファターゼ
−１¹遺伝子（Ａｐｓ−１¹）領域の少なくとも一部をポ
リメラーゼ・チェイン・リアクションにより増幅させて
得られるＤＮＡ断片またはこの増幅断片に制限酵素を作
用させて得られるＤＮＡ断片の長さにより選抜し、
（ｄ）前記で選抜されたヘテロ型交雑種と前記根こぶ線
虫感受性栽培種トマトとを交雑し、（ｅ）工程（ｃ）と
工程（ｄ）を繰返し、（ｆ）上記工程で得られたヘテロ
交雑種を自殖させ、酸性ホスファターゼ−１¹遺伝子
（Ａｐｓ−１¹）のみを保持する交雑種を、配列番号１
に示す酸性ホスファターゼ−１⁺遺伝子（Ａｐｓ−１⁺）
領域又は配列番号２に示す塩基配列を有する根こぶ線虫
抵抗性トマトの酸性ホスファターゼ−１ ¹遺伝子（Ａｐ
ｓ−１¹）領域の少なくとも一部をポリメラーゼ・チェ
イン・リアクションにより増幅させて得られるＤＮＡ断
片またはこの増幅断片に制限酵素を作用させて得られる
ＤＮＡ断片の長さにより選抜する。

【００１７】以下、本発明を詳細に説明する。

【００１８】＜１＞トマト根こぶ線虫抵抗性の鑑別法 本発明のトマト根こぶ線虫抵抗性の鑑別法は、トマトの
根こぶ線虫抵抗性の有無を、それが保持する酸性ホスフ
ァターゼ−１遺伝子の遺伝子型により識別する方法にお
いて、配列番号１に示す塩基配列を有する根こぶ線虫感
受性トマトの酸性ホスファターゼ−１⁺遺伝子（Ａｐｓ
−１⁺）領域又は配列番号２に示す塩基配列を有する根
こぶ線虫抵抗性トマトの酸性ホスファターゼ−１¹遺伝
子（Ａｐｓ−１¹）領域の少なくとも一部をポリメラー
ゼ・チェイン・リアクションにより増幅させて得られた
ＤＮＡ断片またはこの増幅断片に制限酵素を作用させて
得られるＤＮＡ断片の長さにより、酸性ホスファターゼ
−１遺伝子の遺伝子型を識別することを特徴とするトマ
トの根こぶ線虫抵抗性の鑑別法である。

【００１９】上記方法の具体的態様として、前記ポリメ
ラーゼ・チェイン・リアクションに用いる２種のプライ
マーの一方は配列番号１において４８１〜４９４の領域
よりも５’側の部位にハイブリダイズし、他方は前記領
域よりも３’側の部位にハイブリダイズするものである
ことが好ましい。また、前記制限酵素としては、Ｈａｐ
II、ＡｆａＩ、ＳｍａＩ、ＨｉｎｆＩ、ＮｌａIIIが挙
げられる。

【００２０】本発明者らは、トマトＶＦＮＴからＡＰ−
１¹タンパクを精製し、部分アミノ酸配列を決定し（H.
Tanaka, et al., Agric. Biol. Chem., Vol.54, P.1947
(1990)）、その情報よりオリゴヌクレオチドプライマ
ーを作製し、ＰＣＲ反応により５２２ｂｐのｃＤＮＡ断
片を増幅することに成功している（H. Tanaka et al.,
Biosci. Biotech. Biochem., Vol.56, P.583 (199
2)）。尚、ＰＣＲ法（Polymerase chain reaction）
は、二本鎖ＤＮＡの一本鎖ＤＮＡへの熱変性、増幅を目
的とする部位の両端の配列に相当する２種類のオリゴヌ
クレオチドと、前記熱変性ＤＮＡとのアニーリング、前
記オリゴヌクレオチドをプライマーとしたポリメラーゼ
反応からなる増幅サイクルを繰り返すことにより、前記
ＤＮＡ配列を指数関数的に増幅する方法である。

【００２１】上記のようにして得られたｃＤＮＡ配列を
もとに、トマトＶＦＮＴ染色体ＤＮＡを用いてＰＣＲ反
応によるＡＰ−１¹遺伝子断片の増幅を行い、その塩基
配列を決定したところ、この領域中に２個のイントロン
が存在することがわかった。さらに、Erionらによって
ＡＰ−１¹染色体遺伝子の全塩基配列も報告され（J. L.
Erion, et al., Plant Physiol. Vol.98, 1535-1537
(1992)）、上記知見を裏付けている。

【００２２】一方、上記で得られたｃＤＮＡをプローブ
として、根こぶ線虫抵抗性株（ＶＦＮＴ及びＶＦＮ８な
ど）および感受性株（Ｋ７０など）の染色体ＤＮＡのサ
ザンハイブリダイゼーション分析を行ったところ、抵抗
性株と感受性株との間に明かな多型が認められ、Ａｐｓ
−１¹保持株とＡｐｓ−１⁺とをＲＦＬＰ（restriction
fragment length polymorphism：制限酵素断片多型）に
よって識別することができることが示唆された。

【００２３】そこで、Ａｐｓ−１¹とＡｐｓ−１⁺との差
異を明らかにすることを目的とし、根こぶ線虫感受性ト
マト（カゴメ７０）から染色体ＤＮＡを調製し、これを
鋳型としてＡｐｓ−１⁺遺伝子断片を増幅するために、
２種類のオリゴヌクレオチドプラマイーを合成した。
５’末端側のプライマーとしては第１エクソン中に存在
する２８塩基からなる配列（配列番号３）を有するオリ
ゴヌクレオチドを、３’末端側のプライマーとしては第
２エクソン中に存在する２８塩基からなる配列（配列番
号４）を有するオリゴヌクレオチドを用いた。これらの
プライマーを用いて根こぶ線虫抵抗性株および感受性株
の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応を行った。ＰＣ
Ｒ反応産物をアガロースゲル電気泳動により分析した結
果、各々の株において長さがわずかに異なる約１．１ｋ
ｂのバンドが観察された。しかし、その長さの違いはわ
ずかであり、より明確に相違を検出する方法をさらに検
討した。

【００２４】上記の約１．１ｋｂのＰＣＲ増幅断片をＨ
ａｐII、ＡｆａＩ、ＳｍａＩ、ＨｉｎｆＩ、ＮｌａIII
等の制限酵素を作用させ、反応後のＤＮＡ断片を解析し
たところ、根こぶ線虫抵抗性株染色体ＤＮＡ由来の増幅
産物は約１．１ｋｂの長さを維持したのに対し、感受性
株由来の増幅産物はこれらの制限酵素により切断され、
５６０ｂｐ前後の断片が生じ、多型が明確に区別された
（以下、本方法を「ＰＣＲ−ＲＦＬＰ」と呼ぶ）。さら
に、根こぶ線虫抵抗性株及び感受性株のヘテロ交雑種で
は、制限酵素に対し、上記の根こぶ線虫抵抗性株に特徴
的なパターンと感受性株に特徴的なパターンの両方を示
した。これらのことから、根こぶ線虫抵抗性株及び感受
性株の識別はもとより、育種の過程で最も重要なヘテロ
型を識別することが可能であることがわかった。

【００２５】次に、根こぶ線虫感受性株のＡｐｓ−１⁺
遺伝子ＰＣＲ増幅断片をクローニングし、その塩基配列
を決定し、Ａｐｓ−１¹遺伝子の配列と比較した。前記
と同様に、根こぶ線虫感受性株（Kagome70）から調製し
た染色体ＤＮＡを鋳型とし、前記の配列番号３及び４に
示す配列を有するプライマーを用いてＰＣＲ反応を行
い、第１イントロン周辺部の断片を増幅した。約１．１
ｋｂの増幅産物を精製し、プラスミドベクターｐＵＣ１
１９のＳｍａＩ部位にクローニングした。続いて、増幅
断片内部及びベクターのマルチクローニング部位に存在
するＢａｍＨＩ部位を切断し、生成する２つの小断片を
各々ｐＵＣ１１９のＢａｍＨＩ部位にサブクローニング
した。これらのサブクローン断片について、市販のＤＮ
Ａ塩基配列決定機（Pharmacia社製）を用いて塩基配列
を決定した。その結果を、配列番号１に示す。また、す
でに本発明者らにより決定されているＡｐｓ−１¹遺伝
子の同部位の塩基配列を配列番号２に示す。この塩基配
列は、前記５２２ｂｐのｃＤＮＡと同様にしてＰＣＲ法
により増幅された染色体ＤＮＡ断片について決定された
ものである。さらに、Ａｐｓ−１⁺遺伝子とＡｐｓ−１¹
との配列の比較を図１に、制限酵素切断部位の相違を図
２に示す。図１中、エクソン部分（第１エクソンの３’
末端部及び第２エクソンの５’末端部）を点線枠で示し
た。

【００２６】これらの図に示したように、Ａｐｓ−１⁺
遺伝子とＡｐｓ−１¹遺伝子との間には、いくつかの点
変異及び欠失（又は挿入）、及び１個所の大きな欠失
（又は挿入）が存在し、これらが原因となって制限酵素
切断パターンに違いが生じることがわかった。

【００２７】上記知見をもとに、ＰＣＲ増幅断片長の違
いによるＡｐｓ−１⁺遺伝子とＡｐｓ−１¹遺伝子との識
別を試みた。ＰＣＲに用いるプライマーとしては、上記
の大きな差異及び多くの点変異あるいは欠失を有する領
域を挟む位置の配列を有するオリゴヌクレオチドプライ
マーを用いた。各々のプライマーの配列を配列番号５及
び６に示す。また、各々のプライマーに相当する位置を
図１に矢印で示した。尚、矢印の向きは、ポリメラーゼ
反応が進行する向きを表す。

【００２８】後記実施例に示すように、ＰＣＲによっ
て、Ａｐｓ−１⁺遺伝子あるいはＡｐｓ−１¹遺伝子を有
するホモ型、及びこれらの遺伝子を併せ持つヘテロ型と
を明確に識別することができた。したがって、本発明に
よって、根こぶ線虫抵抗性株、感受性株及びこれらのヘ
テロ型を識別できることが判明した。

【００２９】配列番号５及び６に示したプライマーは、
一例であり、Ａｐｓ−１⁺遺伝子とＡｐｓ−１¹遺伝子と
をＰＣＲ増幅断片長の違いによって識別できるものであ
れば、本発明に使用し得るプライマーは特に制限されな
い。また、プライマーとして、配列番号１及び２に示し
た配列の外側の配列を有するプライマーを用いた場合で
も、識別の正確性は減少するが、Ａｐｓ−１⁺遺伝子と
Ａｐｓ−１¹遺伝子とを識別することは可能である。

【００３０】さらに、配列番号１及び２に示した配列は
Ａｐｓ−１⁺遺伝子とＡｐｓ−１¹遺伝子の第１イントロ
ンの周辺部領域の１例であり、ＰＣＲによる増幅断片ま
たはこの増幅断片に制限酵素を作用させて得られる断片
の長さにより、酸性ホスファターゼ−１遺伝子の遺伝子
型を識別することができる限り、塩基の置換、欠失、挿
入を有する配列であっても、その配列にハイブリダイズ
するプライマーを用いたＰＣＲによって酸性ホスファタ
ーゼ−１遺伝子の遺伝子型を識別することは、本発明の
範囲に含まれる。

【００３１】＜２＞根こぶ線虫抵抗性栽培種トマトの作
出法 根こぶ線虫抵抗性栽培種トマトは、下記工程により作出
することができる。 （ａ）根こぶ線虫抵抗性トマトと根こぶ線虫感受性栽培
種トマトとを交雑し、（ｂ）（ａ）で得られる交雑種と
前記根こぶ線虫感受性栽培種トマトを交雑し、（ｃ）
（ｂ）で得られる交雑種の中から、酸性ホスファターゼ
−１⁺遺伝子（Ａｐｓ−１⁺）及び酸性ホスファターゼ−
１¹遺伝子（Ａｐｓ−１¹）を共に保持するヘテロ型交雑
種を、配列番号１に示す酸性ホスファターゼ−１⁺遺伝
子（Ａｐｓ−１⁺）領域又は配列番号２に示す塩基配列
を有する根こぶ線虫抵抗性トマトの酸性ホスファターゼ
−１¹遺伝子（Ａｐｓ−１¹）領域の少なくとも一部をポ
リメラーゼ・チェイン・リアクションにより増幅させて
得られるＤＮＡ断片またはこの増幅断片に制限酵素を作
用させて得られるＤＮＡ断片の長さにより選抜し、
（ｄ）前記で選抜されたヘテロ型交雑種と前記根こぶ線
虫感受性栽培種トマトとを交雑し、（ｅ）工程（ｃ）と
工程（ｄ）を繰返し、（ｆ）上記工程で得られたヘテロ
交雑種を自殖させ、酸性ホスファターゼ−１¹遺伝子
（Ａｐｓ−１¹）のみを保持する交雑種を、配列番号１
に示す酸性ホスファターゼ−１⁺遺伝子（Ａｐｓ−１⁺）
領域又は配列番号２に示す塩基配列を有する根こぶ線虫
抵抗性トマトの酸性ホスファターゼ−１ ¹遺伝子（Ａｐ
ｓ−１¹）領域の少なくとも一部をポリメラーゼ・チェ
イン・リアクションにより増幅させて得られるＤＮＡ断
片またはこの増幅断片に制限酵素を作用させて得られる
ＤＮＡ断片の長さにより選抜する。

【００３２】トマトはイネ等と同様に自殖性植物であ
り、通常同じ花の中で花粉が柱頭について受精（自殖）
し、果実や種子の形成がなされる。したがって、交雑の
際には、あらかじめ花粉を除去して自殖を避け、他の個
体の花粉を授粉する必要がある。具体的には、例えば、
雌親に用いる個体の、開花３〜５日前の花の葯をピンセ
ットなどで除去（除雄）し、３〜５日後、開花前後の除
雄した花の柱頭に雄親の花粉を授粉し、形成した果実内
の種子を採り、これを播種して個体を育成する。

【００３３】上記のようにして得られる雑種第１代（Ｆ
１）の後代では、野生型の遺伝子の多くが入ってくるの
で、食用には適さない。したがって、Ｆ１雑種を栽培種
の親と戻し交雑を繰返し、根こぶ線虫抵抗性形質以外は
栽培種の形質を保持するものを作出することが好まし
い。

【００３４】しかる後、得られたヘテロ交雑種を自殖さ
せ、Ａｐｓ−１¹のみを保持するものを選択する。根こ
ぶ線虫抵抗性トマトとしては、根こぶ線虫抵抗性を有
し、かつＡｐｓ−１ ¹を有するものである必要がある。
なぜなら、極めて低い頻度ではあるが（１％以下）、根
こぶ線虫抵抗性遺伝子（Mi）とＡｐｓ−１¹の間で組換
えが起こり、両方の遺伝子の連鎖がなくなった株が存在
するからである。具体的には、野生種としては、リコペ
ルシコン・ペルビアヌム（L. peruvianum）が挙げられ
るが、栽培種との交雑は、前述した通り極めて困難であ
る。栽培種としては、ＶＦＮＴ、ＶＦＮ８などが挙げら
れる。これらの根こぶ線虫抵抗性株と栽培種株（リコペ
ルシコン・エスクレンタム）を交雑し、栽培種トマトの
もつ味や栽培適性に関する形質など実用的な食用品種と
して必要な形質を維持しつつ、根こぶ線虫抵抗性形質を
有するものを選抜する。各世代の交雑種と根こぶ線虫感
受性栽培種との交雑工程におけるヘテロ交雑種の選抜、
及び最終工程でのホモ型根こぶ線虫抵抗性株の選抜は、
上記のトマト根こぶ線虫抵抗性の鑑別法により行う。

【００３５】従来の作出法では交雑種を成体まで栽培
し、根こぶ線虫抵抗性を有するか否かを表現形質により
判定しているが、このような方法では新品種を得るのに
多大な労力及び非常に長い期間を要する。また、ＡＰ−
１^-、ＡＰ−１⁺の発現量をでんぷんゲル電気泳動により
調べることによって根こぶ線虫抵抗性形質を判定する方
法では、でんぷんゲルの調製が煩わしく、再現性に乏し
く、また、判定に用いる試料を得るために播種後１カ月
程度以上育苗することが必要となる。本発明において
は、目的とする交雑種を得るために、前記鑑別法を利用
することとした。その結果、幼苗の段階でＡｐｓ−１¹
遺伝子の有無、すなわち根こぶ線虫抵抗性の有無を判定
することができ、根こぶ線虫抵抗性トマトの育種が容易
となった。

【００３６】

【実施例】以下に、本発明の実施例を説明する。

【００３７】

【実施例１】根こぶ線虫抵抗性の鑑別１ 根こぶ線虫抵抗性トマト（ＶＦＮＴ及びＶＦＮ８）及び
感受性トマト（Moneymaker、ＶＦ３６及びカゴメ７０）
から染色体ＤＮＡを調製し、ＰＣＲによる酸性ホスファ
ターゼ遺伝子型の識別を行った。

【００３８】染色体ＤＮＡは、主にVictorらの方法（Th
e Plant Journal (1993) 3(3), 493-494）に従って調製
した。すなわち、発芽後３日後の各トマトの子葉から、
約２ｍｍ²の断片を切り取り、プラスチック製１．５ｍ
ｌ容チューブ（エッペンドルフチューブ：エッペンドル
フ社製）に入れた。各チューブに０．２５Ｍ ＮａＯＨ
を４０μｌ加え、３０秒間、沸騰水中にチューブを入れ
て加熱した。その後、チューブに０．２５Ｍ ＨＣｌを
４０μｌ加えて中和し、さらに0.5M Tris-HCl(pH8.0),
0.5%(v/v) Nonidet P-40(シグマ社)を２０μｌ加え、さ
らに沸騰水中に２分間入れて加熱した。こうして得られ
た試料を鋳型ＤＮＡとして用いた。一方、プライマーに
は配列番号５、６に示す配列を有する合成オリゴヌクレ
オチドを使用した。

【００３９】ＰＣＲ反応は、10mM Tris-HCl(pH8.9)、1.
5mM MgCl₂、80mM KCl、500μg/ml BSA、0.1% コール酸ナ
トリウム、0.1% TritonX-100、240μM dNTP(dATP、dCT
P、dGTP、dTTP）、各３０ｎｇのプライマー、０．５μ
ｇの鋳型ＤＮＡ、１．０ユニットのＴｔｈ ＤＮＡ ポ
リメラーゼ（東洋紡（株））を含む２５μｌの反応組成
で、ＰＣＲ反応装置（Perkin Elmer Cetus DNA thermal
cycler）を用いて行った。

【００４０】増幅反応の条件は、変性９４℃５分間、ア
ニーリング５５℃５分間の後、伸長反応７２℃２分間、
変性９４℃１分、アニーリング５５℃１分からなるサイ
クルを３０サイクル繰り返し、最後に伸長反応７２℃１
０分反応させた。

【００４１】ＰＣＲ産物を、１．５％アガロースゲル電
気泳動により分離し、その断片の長さを調べた。結果を
図３に示す。その結果、根こぶ線虫抵抗性株（レーン
１、２）及び感受性株（レーン３〜５）ともに約３００
ｂｐの増幅産物が認められたが、抵抗性株由来の増幅産
物の方が鎖長がわずかに短いことが確認された。これ
は、本発明により明らかにされたように、Ａｐｓ−１¹
型遺伝子には欠失部分が存在するためである。

【００４２】

【実施例２】根こぶ線虫抵抗性の鑑別２ 上記と同様にして根こぶ線虫抵抗性トマト（ＶＦＮＴ及
びＶＦＮ８）及び感受性トマト（Moneymaker、ＶＦ３６
及びカゴメ７０）から染色体ＤＮＡを調製し、ＰＣＲ−
ＲＦＬＰによる酸性ホスファターゼ遺伝子型の識別を行
った。

【００４３】染色体ＤＮＡの調製及びＰＣＲ反応は、実
施例１と同様にして行った。ただし、プライマーには配
列番号３、４に示す配列を有する合成オリゴヌクレオチ
ドを使用した。

【００４４】得られた増幅産物を、ＳｍａＩ、ＨａｐI
I、ＡｆａＩ（宝酒造（株））で消化した。反応は、制
限酵素に添付されている解説書に従って行った。各反応
物を、１．５％アガロースゲル電気泳動により分離し、
その断片の長さを調べた。結果を図４〜６に示す。その
結果、根こぶ線虫感受性株では約０．５６ｋｂ付近に２
本のバンドが認められたのに対し、抵抗性株では約１．
１ｋｂ付近に単一のバンドが認められ、感受性株と抵抗
性株を明確に識別することができた。

【００４５】

【実施例３】根こぶ線虫抵抗性栽培種トマトの作出 ＜１＞根こぶ線虫感受性栽培種トマトと抵抗性トマトと
の交雑 根こぶ線虫感受性栽培種トマト（カゴメ７０）を育成
し、形成された花房の中の開花前３〜５日目の花の葯
（花粉はまだ受精能力なし）をピンセットなどで除去
（除雄）した。３〜５日後、開花前後の除雄した栽培種
の花の柱頭に、同時に育成した根こぶ線虫抵抗性栽培種
トマト（ＶＦＮＴ）の花粉を授粉した。その後、形成さ
れた果実内の種子を採り、播種して個体（Ｆ₁個体）を
育成した。得られたＦ₁個体は、ＰＣＲを用いた識別法
によりＡｐｓ−１^-遺伝子及びＡｐｓ−１ ⁺遺伝子を共に
保持しており、根こぶ線虫感受性トマトと抵抗性トマト
との雑種であることを確認した。

【００４６】＜２＞トマト栽培種への戻し交雑（Ｂａｃ
ｋ Ｃｒｏｓｓ） （１）栽培種とＦ₁個体の交雑 上記と同様にトマト栽培種の除雄を行い、Ｆ₁個体の花
粉を授粉した。その後、形成された果実内の種子を採
り、播種して個体（ＢＣ₁Ｆ₁個体）を育成した。 （２）遺伝子解析による選抜（ＢＣ₁Ｆ₁） このＢＣ₁Ｆ₁個体の中には、根こぶ線虫抵抗性トマト由
来のＡｐｓ−１¹遺伝子を持たない個体とＡｐｓ−１¹遺
伝子及びＡｐｓ−１⁺遺伝子をヘテロに持つ個体が含ま
れるが、ヘテロ型の交雑種をＰＣＲを用いた識別法によ
り選抜した。

【００４７】ＢＣ₁Ｆ₁種子を播種用培土１００粒播き、
発芽させた。発芽３日後のそれぞれの子葉から、約２ｍ
ｍ²の断片を切り取り、実施例１と同様にして鋳型ＤＮ
Ａを調製した。ＰＣＲ反応は、配列番号３、４に示す配
列を有する合成ヌクレオチドをプライマーとして使用
し、実施例１と同様に反応を行った。

【００４８】ＰＣＲ産物を、制限酵素ＳｍａＩ（宝酒造
（株）製）で消化した。反応は、制限酵素に添付されて
いる解説書に従って行った。各反応物を、１．５％アガ
ロースゲル電気泳動により分離し、その断片の長さを調
べた。結果を図７に示す。その結果、Ａｐｓ−１¹遺伝
子のみを保持する株、Ａｐｓ−１⁺遺伝子のみを保持す
る株、及びこれらをヘテロに持つ株を識別することがで
きた。

【００４９】（３）栽培種とＢＣ₁Ｆ₁個体の交雑 前記と同様にトマト栽培種の除雄を行い、（２）で選抜
したヘテロ型ＢＣ₁Ｆ₁個体の花粉を授粉した。その後、
形成された果実内の種子を採り、播種して個体（ＢＣ₂
Ｆ₁個体）を育成した。続いて、ＢＣ₂Ｆ₁個体からＡｐ
ｓ−１¹遺伝子及びＡｐｓ−１⁺遺伝子をヘテロに持つ個
体を選抜した。

【００５０】（４）戻し交雑の繰り返し 以上のような栽培種への戻し交雑を、ＶＦＮＴの食味、
色、外観、栽培適性における不良形質がなくなり、戻し
親の根こぶ線虫感受性トマトに近い形質になるまで繰り
返した（最低３回以上）。

【００５１】＜３＞根こぶ線虫抵抗性トマト品種の育成 ３〜６回戻し交雑を行って得たＢＣ_nＦ₁個体を自殖（自
家受粉）した。次世代では、Ａｐｓ−１¹遺伝子のみを
有する個体、Ａｐｓ−１⁺遺伝子のみを有する個体、及
びＡｐｓ−１¹遺伝子とＡｐｓ−１⁺遺伝子とを共に有す
る個体の３種類が現れ、Ａｐｓ−１¹遺伝子のみをホモ
に持つ個体が根こぶ線虫抵抗性に優れている。

【００５２】このようにして得られたトマト品種は、根
こぶ線虫に対して抵抗性であり、さらに栽培種と同程度
の食味を有していた。

【００５３】

【発明の効果】本発明により、トマトの根こぶ線虫抵抗
性の有無を簡便に鑑別することができ、その結果、根こ
ぶ線虫抵抗性形質を示さない産業上有用な栽培種に、根
こぶ線虫抵抗性を、簡便かつ効率的に付与することがで
きる。

【００５４】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：1087 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：トマト(Licopersicon esculentum) 株名：ＶＦＮＴ 配列の特徴 特徴を表す記号：exon 存在位置：1..184 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：intron 存在位置：185..1007 特徴を決定した方法：Ｓ 配列の特徴 特徴を表す記号：exon 存在位置：1008..1087 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 CTGATTATGT CAAGGAATAT ATGGTGGGTC CAGGTTATAA GATGGAGATT GATAGGGTTT 60 CGGATGAGGC AGGAGAATAT GCCAAAAGTG TTGATTTGGG AGATGATGGA AGAGATGTGT 120 GGATTTTTGA TGTTGACGAA ACTTTGCTTT CTAATCTTCC TTATTATTCT GATCATCGTT 180 ATGGGTATGA TTGATTCTTC ACTAAGTTTC TTTGTATTTT TTGTTAAATT TACTTCATTC 240 TTGCACTCCT AAACTGTCTT GTTGGGTAAC GCCAATATTG GGGTTAGAGT CATAATTGAA 300 CATGACCCTA GTTTGTTGGA TTTAGTTAAA GAAATTAAAG GCTATAGCTT TTCACATAAG 360 CTCAACATGT CTACTAATGA AAATGTCCCC GTTGAGTCTG TCGAATAAGG GCTTTGGCCT 420 AATTCATACG CCCAAAAGCT GAGCTCAAAG GGAGGACGGA GGAAGATTGC CCAAATTCTC 480 AAGTCCAGAT TGGGACATTC TTTACCTGGG GTTTCACTGT TTGATTTGAT GTGTAACTGT 540 CTAGGATCCT GAGGACCCAC ATTGGATCGG CTGTGGATTT GATACCACTG ATAGGAAAAA 600 CAGATTAGAG AAGAAAAGTG AAAATAGAGT AGACAAAGAA GTGGTGAATG TGAAAAGAAA 660 TTGCTTGACT AATTTCAACT ATGCTGCAAC TGCAGTTGCT TTTTATAAGC AAAAACATCG 720 CAAACTAAAG CTAAAAATTT AGCAATTATC CCATAACGTT TTCTCCTATA GACTAGATAA 780 TGAACCACAT CAAACTACAT TTTCTAAAGA CTAGAACAAA CCTAATCACA GTCTTAATCC 840 ATCATGTAAA AGGAGATAGA TTGAGCATCA TTTTTGTTAA TATCCATTTT GAAGGGGATT 900 TTCTCTGTTT TACTTGGAAT TATAGTTCTG CTTCATATTT CTTTTTAGGC ATTATACTAT 960 GTGTAATAGT AAGCTAATGG TGATTTGTAT TGATCTCAAT ATTGTAGATT GGAGGTATTT 1020 GATGATGTGG AATTTGATAA ATGGGTTGAG AATGGAACGG CGCCAGCCTT GGGGTCCAGC 1080 TTGAAGC 1087

【００５５】配列番号：２ 配列の長さ：1103 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：トマト(Licopersicon esculentum) 株名：カゴメ７０ 配列の特徴 特徴を表す記号：exon 存在位置：1..184 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：intron 存在位置：185..1023 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：exon 存在位置：1024..1103 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 CTGATTATGT CAAGGAATAT ATGGTGGGTC CAGGTTATGA GATGGAGATT GATAGGGTTT 60 CGGATGAGGC GGGAGAATAT GCCAAAAGTG TTGATTTGGG AGATGATGGA AGAGATGTGT 120 GGATTTTTGA TGTTGACGAA ACTTTGCTTT CGAATCTTCC TTATTATTCT GATCATCGTT 180 ATGGGTATGA TTGATTCTTC ACTAAGTTTC TTTGTATTTT TTGTTAAATT TACTTCATTC 240 TTGCACTCCT AAACTGTCTT GTTGGGTAAC GCCAATATTG GGGTCAGAGT CATAATTGAA 300 CATGACCCTA GTTTGTTGGA TTCAGTTAAA GAAATTAAAG GGCTATACCT TTTCGCATAA 360 GCTCAACATG TCTACTAATG AAAATGTCCC CGTTGAGTCT GTCGAATATG GGCTTTGGCC 420 TAATTCATAC CCCAAAAAGC TGAGCTCCAA AGGGAGGACG GTGGAAGATT GCCCAAATCA 480 TGTAAGGAGC CCTCAAGTCC AGATTGGGAC ATTCTTTACC CGGGGTTTCA CTGTTTGATT 540 TGATGTGCAA CTGTCTAGGA TCCTGAGTAC CCACACATTG GATCGGGTGT GGATTTGATA 600 CCACTGATAG GAAAAACAGA TTAGAGAAGA AAAGTGAAAA TAGAGTAGAC AAAGAAGTGG 660 TGAATGTGAA AAGAAATTGC TTGACTAATT TCAACTATGC TGCAACTGCA GTTGCTTTTT 720 ATAAGCAAAA ACATAGCAAA CTAAAGCTAA AAATTTAGCA ATTACCCCAT AACGTTTTCT 780 TCTATAGACT AGATAATGAA CCACATCAAA CTACTTTTTC TAAAGACTAG AACAAACCTA 840 ATCACAGTCT TAATCCATCA TGTAAAAGGA GATAGATTGA GCATCATTTT TGTTAATATC 900 CATTTTGAAG GGGATTTTCT CTGTTTTACT TGGAATTGTA GTTCTGCTTC ATATTTCTTC 960 TTAGGCATTA TACTATGTGT AATAGTAAGC TAATGGTGAT TTATATTGAT CTCAATATTG 1020 TAGATTGGAG GTATTTGATG ATGTGGAATT TGATAAATGG GTTGAGAAGG GAACGGCGCC 1080 AGCCTTGGGG TCCAGCTTGA AGC 1103

【００５６】配列番号：３ 配列の長さ：28 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTGATTATGT CAAGGAATAT ATGGTGGG 28

【００５７】配列番号：４ 配列の長さ：28 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AGAACTTCTT GATAAAGCTT CAAGCTGG 28

【００５８】配列番号：５ 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TCATAATTGA ACATGACCCT AG 22

【００５９】配列番号：６ 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTATCAGTG GTATCAAATCC AC 22

【００６０】

【図面の簡単な説明】

【図１】 Ａｐｓ−１¹遺伝子及びＡｐｓ−１⁺遺伝子の
第１イントロン周辺領域の塩基配列を比較した図。

【図２】 Ａｐｓ−１¹遺伝子及びＡｐｓ−１⁺遺伝子の
第１イントロン周辺領域の制限酵素切断部位の相違を示
す図。

【図３】 根こぶ線虫抵抗性及び感受性トマトのＡｐｓ
−１遺伝子のＰＣＲによる識別を示す電気泳動写真。 Ｍ：分子量マーカー（１００ｂｐラダー）、レーン１：
ＶＦＮＴ、レーン２：ＶＦＮ８、レーン３：Moneymake
r、レーン４：ＶＦ３６、レーン５：カゴメ７０

【図４】 根こぶ線虫抵抗性及び感受性トマトのＡｐｓ
−１遺伝子のＰＣＲ−ＲＦＬＰ（ＳｍａＩ切断）を示す
電気泳動写真。レーンは図３と同様。 レーン１：分子量マーカー（λ／HindIII）、レーン
２：ＶＦＮＴ、レーン３：ＶＦＮ８、レーン４：Moneym
aker、レーン５：ＶＦ３６、レーン６：カゴメ７０

【図５】 根こぶ線虫抵抗性及び感受性トマトのＡｐｓ
−１遺伝子のＰＣＲ−ＲＦＬＰ（ＨａｐII切断）を示す
電気泳動写真。レーンは図３と同様。

【図６】 根こぶ線虫抵抗性及び感受性トマトのＡｐｓ
−１遺伝子のＰＣＲ−ＲＦＬＰ（ＡｆａＩ切断）を示す
電気泳動写真。レーンは図３と同様。

【図７】 ＢＣ₁Ｆ₁個体のＡｐｓ−１遺伝子のＰＣＲ−
ＲＦＬＰを示す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ０１Ｈ 1/00 Ｚ (72)発明者 石黒 幸雄 栃木県那須郡西那須野町東三島５丁目96− 19 (72)発明者 伊藤 徹 静岡県磐田市国府台16−８ＪＴ桜ヶ丘アパ ート402号 (72)発明者 高木 正道 東京都府中市栄町１丁目31−10

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 トマトの根こぶ線虫抵抗性の有無を、そ
   れが保持する酸性ホスファターゼ−１遺伝子の遺伝子型
   により識別する方法において、 配列番号１に示す塩基配列を有する根こぶ線虫感受性ト
   マトの酸性ホスファターゼ−１⁺遺伝子（Ａｐｓ−１⁺）
   領域又は配列番号２に示す塩基配列を有する根こぶ線虫
   抵抗性トマトの酸性ホスファターゼ−１¹遺伝子（Ａｐ
   ｓ−１¹）領域の少なくとも一部をポリメラーゼ・チェ
   イン・リアクションにより増幅させて得られたＤＮＡ断
   片またはこの増幅断片に制限酵素を作用させて得られる
   ＤＮＡ断片の長さにより、酸性ホスファターゼ−１遺伝
   子の遺伝子型を識別することを特徴とするトマトの根こ
   ぶ線虫抵抗性の鑑別法。
2. 【請求項２】 前記ポリメラーゼ・チェイン・リアクシ
   ョンに用いる２種のプライマーの一方は配列番号１にお
   いて塩基番号４８１〜４９４の領域よりも５’側の部位
   にハイブリダイズし、他方は前記領域よりも３’側の部
   位にハイブリダイズすることを特徴とする請求項１記載
   のトマトの根こぶ線虫抵抗性の鑑別法。
3. 【請求項３】 前記制限酵素が、ＨａｐＩＩ、Ａｆａ
   Ｉ、ＳｍａＩ、ＨｉｎｆＩ、ＮｌａIIIから選ばれるこ
   とを特徴とする請求項１又は２記載のトマトの根こぶ線
   虫抵抗性の鑑別法。
4. 【請求項４】 下記工程からなる根こぶ線虫抵抗性栽培
   種トマトの作出法。 （ａ）根こぶ線虫抵抗性トマトと根こぶ線虫感受性栽培
   種トマトとを交雑し、（ｂ）（ａ）で得られる交雑種と
   前記根こぶ線虫感受性栽培種トマトを交雑し、（ｃ）
   （ｂ）で得られる交雑種の中から、酸性ホスファターゼ
   −１⁺遺伝子（Ａｐｓ−１⁺）及び酸性ホスファターゼ−
   １¹遺伝子（Ａｐｓ−１¹）を共に保持するヘテロ型交雑
   種を、配列番号１に示す酸性ホスファターゼ−１⁺遺伝
   子（Ａｐｓ−１⁺）領域又は配列番号２に示す塩基配列
   を有する根こぶ線虫抵抗性トマトの酸性ホスファターゼ
   −１¹遺伝子（Ａｐｓ−１¹）領域の少なくとも一部をポ
   リメラーゼ・チェイン・リアクションにより増幅させて
   得られるＤＮＡ断片またはこの増幅断片に制限酵素を作
   用させて得られるＤＮＡ断片の長さにより選抜し、
   （ｄ）前記で選抜されたヘテロ型交雑種と前記根こぶ線
   虫感受性栽培種トマトとを交雑し、（ｅ）工程（ｃ）と
   工程（ｄ）を繰返し、（ｆ）上記工程で得られたヘテロ
   交雑種を自殖させ、 酸性ホスファターゼ−１¹遺伝子（Ａｐｓ−１¹）のみを
   保持する交雑種を、配列番号１に示す酸性ホスファター
   ゼ−１⁺遺伝子（Ａｐｓ−１⁺）領域又は配列番号２に示
   す塩基配列を有する根こぶ線虫抵抗性トマトの酸性ホス
   ファターゼ−１ ¹遺伝子（Ａｐｓ−１¹）領域の少なくと
   も一部をポリメラーゼ・チェイン・リアクションにより
   増幅させて得られるＤＮＡ断片またはこの増幅断片に制
   限酵素を作用させて得られるＤＮＡ断片の長さにより選
   抜する。