JPH0778468B2 - 分光蛍光光度計 - Google Patents
分光蛍光光度計Info
- Publication number
- JPH0778468B2 JPH0778468B2 JP16489187A JP16489187A JPH0778468B2 JP H0778468 B2 JPH0778468 B2 JP H0778468B2 JP 16489187 A JP16489187 A JP 16489187A JP 16489187 A JP16489187 A JP 16489187A JP H0778468 B2 JPH0778468 B2 JP H0778468B2
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- wavelengths
- fluorescence
- wavelength
- excitation light
- measurement
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
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- Spectrometry And Color Measurement (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 イ．産業上の利用分野 本発明は分光器の波長設定およびデータ処理に改良を加
えた分光蛍光光度計に関する。
えた分光蛍光光度計に関する。
ロ．従来の技術 分光蛍光光度計は励起光分光器と蛍光分光器を備え、従
来の分光蛍光光度計では測定モードとして励起光スペク
トル法、蛍光スペクトル法、シンクロ励起法（Synchron
ous excitation）の３モードが選択可能になっていた。
励起光スペクトル法は蛍光分光器の波長を一つに固定
し、励起波長を蛍光ピークを与える中心波長とその前後
に２波長をとって、各励起波長における蛍光強度を測定
するものである。蛍光スペクトル法は励起光分光器の波
長を一つに固定し、蛍光分光器の波長を蛍光ピークの中
心波長およびその前後２波長に切換えて蛍光強度を測定
するものである。シンクロ励起法は励起光分光器および
蛍光分光器夫々に３波長を選択し、それらの波長を励起
光分光器についてλ1,λ2,λ３蛍光分光器についてλ
１′，λ２′，λ３′とし添字1,2,3の順に波長が長く
なるものとして、各分光器の波長を（λ1,λ１′），
（λ2,λ２′），（λ3,λ３′）と云うように組合せて
順次蛍光測定を行うものである。つまり励起光蛍光夫々
を共に長波長側から短波長側へ或は逆方向に同期的に変
化させて蛍光ピークのプロファイルを測定するものであ
る。
来の分光蛍光光度計では測定モードとして励起光スペク
トル法、蛍光スペクトル法、シンクロ励起法（Synchron
ous excitation）の３モードが選択可能になっていた。
励起光スペクトル法は蛍光分光器の波長を一つに固定
し、励起波長を蛍光ピークを与える中心波長とその前後
に２波長をとって、各励起波長における蛍光強度を測定
するものである。蛍光スペクトル法は励起光分光器の波
長を一つに固定し、蛍光分光器の波長を蛍光ピークの中
心波長およびその前後２波長に切換えて蛍光強度を測定
するものである。シンクロ励起法は励起光分光器および
蛍光分光器夫々に３波長を選択し、それらの波長を励起
光分光器についてλ1,λ2,λ３蛍光分光器についてλ
１′，λ２′，λ３′とし添字1,2,3の順に波長が長く
なるものとして、各分光器の波長を（λ1,λ１′），
（λ2,λ２′），（λ3,λ３′）と云うように組合せて
順次蛍光測定を行うものである。つまり励起光蛍光夫々
を共に長波長側から短波長側へ或は逆方向に同期的に変
化させて蛍光ピークのプロファイルを測定するものであ
る。
上述したような測定モードによって定量分析を行う場
合、蛍光スペクトルは目的物質の濃度が同じでも試料調
整の仕方でベースラインレベルが大幅に異るため、単純
に蛍光強度を用いて検量線を作っても再現性のある定量
結果は得られない。従って通常ベースライン法と呼ばれ
るデータ処理が適用されている。即ち上記何れのモード
においても、蛍光強度のデータとして、中心波長に対す
るものと、その前後に二つのデータが得られているか
ら、中心波長における蛍光強度をI2,その前後二つの波
長における蛍光強度をI1,I3とするとき、 Ｉ＝I2−（I1＋I3）/2 なるＩを用いて検量線を作用し、被測定試料について
も、上記Ｉを算出して検量線上に当嵌め目的物質の濃度
を求める。このデータ処理の意味を図解すれば第３図の
ようになる。三つの測定位置における蛍光強度は蛍光ピ
ークのプロファイル上の頂点および左右２点の蛍光強度
で、図示のＩが上式のＩに相当し、このＩの値はベース
ラインレベルの如何にかゝわりなく目的物質の濃度に比
例したものだから、蛍光強度そのものでなく、このＩを
最終的な測定値とすることで、定量の精度向上が得られ
ることになる。
合、蛍光スペクトルは目的物質の濃度が同じでも試料調
整の仕方でベースラインレベルが大幅に異るため、単純
に蛍光強度を用いて検量線を作っても再現性のある定量
結果は得られない。従って通常ベースライン法と呼ばれ
るデータ処理が適用されている。即ち上記何れのモード
においても、蛍光強度のデータとして、中心波長に対す
るものと、その前後に二つのデータが得られているか
ら、中心波長における蛍光強度をI2,その前後二つの波
長における蛍光強度をI1,I3とするとき、 Ｉ＝I2−（I1＋I3）/2 なるＩを用いて検量線を作用し、被測定試料について
も、上記Ｉを算出して検量線上に当嵌め目的物質の濃度
を求める。このデータ処理の意味を図解すれば第３図の
ようになる。三つの測定位置における蛍光強度は蛍光ピ
ークのプロファイル上の頂点および左右２点の蛍光強度
で、図示のＩが上式のＩに相当し、このＩの値はベース
ラインレベルの如何にかゝわりなく目的物質の濃度に比
例したものだから、蛍光強度そのものでなく、このＩを
最終的な測定値とすることで、定量の精度向上が得られ
ることになる。
ハ．発明が解決しようとする問題点 蛍光測定による定量を行うに当って、測定波長位置を決
めて前記したＩを算出する場合、蛍光ピークの形がブロ
ードであるとＩの値は小さく、ピークのプロファイルが
鋭いとＩの値が大きくなる。所で同じ試料の蛍光であっ
ても、励起スペクトル法、蛍光スペクトル法、シンクロ
励起法等の測定モードによって蛍光ピークのプロファイ
ルは異るから、試料によって最も適した測定モードを選
択する必要がある。従来はこのような選択に当って前述
した三種の測定モードからしか選択できなかった。しか
るに試料によっては上述した三種の測定モードを採って
も蛍光ピークのプロファイルがブロードであったり著し
く非対称で最適の測定モードとし難い場合がある。
めて前記したＩを算出する場合、蛍光ピークの形がブロ
ードであるとＩの値は小さく、ピークのプロファイルが
鋭いとＩの値が大きくなる。所で同じ試料の蛍光であっ
ても、励起スペクトル法、蛍光スペクトル法、シンクロ
励起法等の測定モードによって蛍光ピークのプロファイ
ルは異るから、試料によって最も適した測定モードを選
択する必要がある。従来はこのような選択に当って前述
した三種の測定モードからしか選択できなかった。しか
るに試料によっては上述した三種の測定モードを採って
も蛍光ピークのプロファイルがブロードであったり著し
く非対称で最適の測定モードとし難い場合がある。
本発明は選択できる測定モードの種類を増し、何れの試
料に対しても高感度が得られる分光蛍光光度計を提供し
ようとするものである。
料に対しても高感度が得られる分光蛍光光度計を提供し
ようとするものである。
ニ．問題点解決のための手段 励起分光器および蛍光分光器の波長の組合せについて、
任意の組合せを可能とし、かつそのような波長の組合せ
を複数組設定すると、両分光器を駆動して上記波長の組
合せを順次実現すると共に、夫々の組合せ状態で蛍光の
検出強度のデータを取込み記憶すると共に、その記憶デ
ータに指定された係数を掛算して一次変換演算を施し、
演算結果を測定値として出力する制御演算装置を分光蛍
光光度計に設けた。
任意の組合せを可能とし、かつそのような波長の組合せ
を複数組設定すると、両分光器を駆動して上記波長の組
合せを順次実現すると共に、夫々の組合せ状態で蛍光の
検出強度のデータを取込み記憶すると共に、その記憶デ
ータに指定された係数を掛算して一次変換演算を施し、
演算結果を測定値として出力する制御演算装置を分光蛍
光光度計に設けた。
ホ．作用 上述構成によるときは励起光分光器，蛍光分光器の波長
の組合せが任意に設定できるから、従来の励起光スペク
トル法，蛍光スペクトル法、シンクロ励起法等の測定モ
ードが実行できることは勿論、ヘテロな波長の組合せも
可能となる。こゝでヘテロと云うのは第４図に示すよう
に励起光分光器，蛍光分光器夫々に複数の波長を選択
し、励起波長を短波長側から順にとるとき、それに組合
せる蛍光波長を長波長側から順にとるように両分光器の
波長を組合せるものである。このようなヘテロな波長の
組合せを用いると、他の測定モードによるよりも、蛍光
ピークのプロファイルがシャープな形になる場合があ
る。本発明によれば従来の測定モードに加えて従来行わ
れていないヘテロな測定モードも選択できるので、所与
の試料に対して最適の測定モードを選んで測定を行うこ
とができる。
の組合せが任意に設定できるから、従来の励起光スペク
トル法，蛍光スペクトル法、シンクロ励起法等の測定モ
ードが実行できることは勿論、ヘテロな波長の組合せも
可能となる。こゝでヘテロと云うのは第４図に示すよう
に励起光分光器，蛍光分光器夫々に複数の波長を選択
し、励起波長を短波長側から順にとるとき、それに組合
せる蛍光波長を長波長側から順にとるように両分光器の
波長を組合せるものである。このようなヘテロな波長の
組合せを用いると、他の測定モードによるよりも、蛍光
ピークのプロファイルがシャープな形になる場合があ
る。本発明によれば従来の測定モードに加えて従来行わ
れていないヘテロな測定モードも選択できるので、所与
の試料に対して最適の測定モードを選んで測定を行うこ
とができる。
なお一次変換演算は取込んだ蛍光強度のデータにベース
ライン補正を行うもので、実施しようと思う測定モード
において不要のデータに対する係数は０とすればよく、
中心波長に対して前後等間隔に二つの波長をとるときは
使用される係数は１および−1/2であるが、波長間隔は
等間隔とは限らないので、そのときは一般に前後２つの
波長における測定値を結ぶ直線を求め、その直線の中心
波長位置における高さを比例配分で求め、その値を中心
波長における測定値から引算すると云う演算になって、
しかもこれらの諸演算は結局３つの測定値に色々な係数
を掛けて足し算をすると云う一次変換形式に帰着される
が、そのときの係数は１とか1/2等とは異なるので、係
数はオペレータが場合によって適当に設定できるように
してあるのである。
ライン補正を行うもので、実施しようと思う測定モード
において不要のデータに対する係数は０とすればよく、
中心波長に対して前後等間隔に二つの波長をとるときは
使用される係数は１および−1/2であるが、波長間隔は
等間隔とは限らないので、そのときは一般に前後２つの
波長における測定値を結ぶ直線を求め、その直線の中心
波長位置における高さを比例配分で求め、その値を中心
波長における測定値から引算すると云う演算になって、
しかもこれらの諸演算は結局３つの測定値に色々な係数
を掛けて足し算をすると云う一次変換形式に帰着される
が、そのときの係数は１とか1/2等とは異なるので、係
数はオペレータが場合によって適当に設定できるように
してあるのである。
ヘ．実施例 第１図に本発明の一実施例を示す。第１図においてＰは
励起光源、１は励起光分光器、Ｓは試料、２は蛍光分光
器、３は蛍光分光器２の出射光を検出する光検出器、４
は装置全体を制御するCPUである。分光器1,2は夫々独立
にCPU4によって駆動制御が行われる。５は測定結果その
他のデータを格納する記憶装置、６はCPU4に種々のデー
タを入力する入力装置で、７は測定結果を表示するプリ
ンタ等の表示装置である。
励起光源、１は励起光分光器、Ｓは試料、２は蛍光分光
器、３は蛍光分光器２の出射光を検出する光検出器、４
は装置全体を制御するCPUである。分光器1,2は夫々独立
にCPU4によって駆動制御が行われる。５は測定結果その
他のデータを格納する記憶装置、６はCPU4に種々のデー
タを入力する入力装置で、７は測定結果を表示するプリ
ンタ等の表示装置である。
第２図はCPU7の測定動作のフローチャートである。まず
励起光分光器1,蛍光分光器の波長の組合せを（Ｎ個）設
定する（イ）。次に実施しようとする測定モードに応じ
て蛍光強度データに掛算する係数α，β…を設定（ロ）
する。その後設定された波長の組合せを一番目から読出
し設定波長に各分光器を駆動し、光検出器出力Ii（ｉ＝
1,2…ｎ）を取込み記憶装置５に格納（ハ）する。この
動作を設定された波長の組合せ全部について行い、全測
定が終了したら、記憶装置５に格納されたデータI1,I2
…Inについて、 Ｉ＝αI1＋βI2＋…υIn の演算を行う（ニ）。以下の動作は検量線作成時と試料
測定時で異る。検量線作成の場合、予め４種の測定モー
ド夫々に対応した係数が設定してあり、上記Ｉについて
４通りの演算を行い、その結果を表示（ホ）する。幾つ
かの既知試料を用いて上の動作を行はせ、オペレータが
表示結果から検量線を作成する。作成された検量線を比
較して最も良い（直線性，感度）検量線を与える測定モ
ードを決定する。決定された検量線のデータ或は表示式
を記憶装置に格納（ヘ）する。試料測定の場合、（ニ）
のステップ迄の動作は同じである。但し、波長の組合せ
は測定モードによって不必要なものは省き、係数の設定
も選択した測定モードに対するものだけにする。従って
（ニ）のステップの演算は一試料につき一回である。
（ニ）のステップの次に（ト）のステップでは算出され
たＩの値に対応する濃度値を記憶装置５に格納された検
量線のデータから索出或は算出し、これを表示装置７に
出力（チ）して一試料の測定動作を終わる。
励起光分光器1,蛍光分光器の波長の組合せを（Ｎ個）設
定する（イ）。次に実施しようとする測定モードに応じ
て蛍光強度データに掛算する係数α，β…を設定（ロ）
する。その後設定された波長の組合せを一番目から読出
し設定波長に各分光器を駆動し、光検出器出力Ii（ｉ＝
1,2…ｎ）を取込み記憶装置５に格納（ハ）する。この
動作を設定された波長の組合せ全部について行い、全測
定が終了したら、記憶装置５に格納されたデータI1,I2
…Inについて、 Ｉ＝αI1＋βI2＋…υIn の演算を行う（ニ）。以下の動作は検量線作成時と試料
測定時で異る。検量線作成の場合、予め４種の測定モー
ド夫々に対応した係数が設定してあり、上記Ｉについて
４通りの演算を行い、その結果を表示（ホ）する。幾つ
かの既知試料を用いて上の動作を行はせ、オペレータが
表示結果から検量線を作成する。作成された検量線を比
較して最も良い（直線性，感度）検量線を与える測定モ
ードを決定する。決定された検量線のデータ或は表示式
を記憶装置に格納（ヘ）する。試料測定の場合、（ニ）
のステップ迄の動作は同じである。但し、波長の組合せ
は測定モードによって不必要なものは省き、係数の設定
も選択した測定モードに対するものだけにする。従って
（ニ）のステップの演算は一試料につき一回である。
（ニ）のステップの次に（ト）のステップでは算出され
たＩの値に対応する濃度値を記憶装置５に格納された検
量線のデータから索出或は算出し、これを表示装置７に
出力（チ）して一試料の測定動作を終わる。
波長の組合せの設定は例えば励起光分光器の波長をλ１
＜λ２＜λ３とし、蛍光分光器の波長をλ１′＜λ２′
＞λ３′とするとき、検量線作成時には Ａ（λ1,λ２′）（λ2,λ２′）（λ3,λ２′） Ｂ（λ2,λ１′） （λ2,λ３′） Ｃ（λ1,λ１′） （λ3,λ３′） Ｄ（λ1,λ３′） （λ3,λ１′） の９通りとする（実際の測定順序は上表の通りではな
い）。上の組合せでＡの段は励起光スペクトル法、Ｂの
段は蛍光スペクトル法、Ｃの段はシンクロ励起法、Ｄの
段はヘテロの組合せに相当する。検量線作成の結果ヘテ
ロのモードが最も良いと云うことになれば、試料測定時
には上記Ｄ段の組合せに（λ2,λ２′）の組合せを加え
て他のＡ〜Ｃ段の組合せを検量線作成時の設定から削除
すればよい。検量線作成時上記９個の組合せの各々に対
して蛍光強度のデータが得られるから、これらのデータ
を（λ1,λ２′）に対してIA1,（λ2,λ２′）に対して
IA2,（λ3,λ２′）に対してIA3,（λ2,λ１′）に対し
てIB1,（λ2,λ３′）に対してIB3,（λ3,λ１′）に対
してID3等とすると例えば励起光スペクトル法に対して Ｉ＝IA2−（1/2）IA1−（1/2）IA3 であるが、これは９個の測定データと夫々に掛ける係数
をa,b,c…ｉとよりなる一次式 Ｉ＝aIAI＋bIA2＋cIA3＋dIBI＋…＋iID3 において、ａ＝−1/2,b＝1,c＝−1/2,d以下ｉまで全部
を０としたものである。
＜λ２＜λ３とし、蛍光分光器の波長をλ１′＜λ２′
＞λ３′とするとき、検量線作成時には Ａ（λ1,λ２′）（λ2,λ２′）（λ3,λ２′） Ｂ（λ2,λ１′） （λ2,λ３′） Ｃ（λ1,λ１′） （λ3,λ３′） Ｄ（λ1,λ３′） （λ3,λ１′） の９通りとする（実際の測定順序は上表の通りではな
い）。上の組合せでＡの段は励起光スペクトル法、Ｂの
段は蛍光スペクトル法、Ｃの段はシンクロ励起法、Ｄの
段はヘテロの組合せに相当する。検量線作成の結果ヘテ
ロのモードが最も良いと云うことになれば、試料測定時
には上記Ｄ段の組合せに（λ2,λ２′）の組合せを加え
て他のＡ〜Ｃ段の組合せを検量線作成時の設定から削除
すればよい。検量線作成時上記９個の組合せの各々に対
して蛍光強度のデータが得られるから、これらのデータ
を（λ1,λ２′）に対してIA1,（λ2,λ２′）に対して
IA2,（λ3,λ２′）に対してIA3,（λ2,λ１′）に対し
てIB1,（λ2,λ３′）に対してIB3,（λ3,λ１′）に対
してID3等とすると例えば励起光スペクトル法に対して Ｉ＝IA2−（1/2）IA1−（1/2）IA3 であるが、これは９個の測定データと夫々に掛ける係数
をa,b,c…ｉとよりなる一次式 Ｉ＝aIAI＋bIA2＋cIA3＋dIBI＋…＋iID3 において、ａ＝−1/2,b＝1,c＝−1/2,d以下ｉまで全部
を０としたものである。
ト．効果 本発明によれば励起光，蛍光の波長の組合せが単一モー
ドに限定されず、従来行われていた測定モード以外の測
定モードも可能となったので、試料に対する最適測定モ
ードの選択の幅が拡大され、測定の感度，精度，波長選
択の容易さが共に向上した。
ドに限定されず、従来行われていた測定モード以外の測
定モードも可能となったので、試料に対する最適測定モ
ードの選択の幅が拡大され、測定の感度，精度，波長選
択の容易さが共に向上した。
第１図は本発明の一実施例装置の構成を示すブロック
図、第２図は同実施例の動作のフローチャート、第３図
は励起光波長，蛍光波長座標面上における各測定モード
の波長組合せの軌跡図、第４図はベースライン補正演算
の説明図である。 Ｐ……光源、Ｓ……試料、１……励起光分光器、２……
蛍光分光器、３……光検出器、４……CPU、５……記憶
装置、６……入力装置、７……表示装置。
図、第２図は同実施例の動作のフローチャート、第３図
は励起光波長，蛍光波長座標面上における各測定モード
の波長組合せの軌跡図、第４図はベースライン補正演算
の説明図である。 Ｐ……光源、Ｓ……試料、１……励起光分光器、２……
蛍光分光器、３……光検出器、４……CPU、５……記憶
装置、６……入力装置、７……表示装置。
Claims (1)
- 【請求項１】励起光分光器と蛍光分光器とよりなり、励
起光分光器および蛍光分光器の波長の組合せについて、
一つの励起光波長に対して互いに異なる複数の蛍光波長
を組合せる蛍光スペクトル測定モードと、一つの蛍光波
長に対して互いに異なる励起光波長を組合わせる励起光
スペクトル測定モードと、励起光，蛍光ともに短波長同
士，中波長同士，長波長同士と云うように組合せるシン
クロ励起法測定モードと、短波長から長波長に変わる励
起光に対して長波長から短波長に変わる蛍光波長を組合
せるヘテロな波長の組合せによる測定モードの選択が可
能なように、設定された複数の励起光波長毎に設定され
た複数の蛍光波長で順次蛍光測定を実行する制御手段
と、測定された蛍光の検出強度のデータを取込み記憶す
る記憶装置と、取込んだデータに係数を掛けて足し算し
てベースライン補正された蛍光強度を算出する演算手段
と、この演算手段に対して上記係数を入力する入力手段
とを備え、上記係数として、指定した測定モードに該当
しない波長組合せに対応する測定データに掛ける係数を
全て０とし、指定した測定モードに該当するデータにつ
いて、励起光或は蛍光何れでも固定波長でない側の波長
について中心波長の両側にある波長が組合せられている
場合の測定データによって一つの直線を決め、その直線
の上記中心波長位置における高さをその中心波長が組合
された測定データから引算したものとなるように夫々の
係数を決めるようにしたことを特徴とする分光蛍光光度
計。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16489187A JPH0778468B2 (ja) | 1987-06-30 | 1987-06-30 | 分光蛍光光度計 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16489187A JPH0778468B2 (ja) | 1987-06-30 | 1987-06-30 | 分光蛍光光度計 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS649343A JPS649343A (en) | 1989-01-12 |
| JPH0778468B2 true JPH0778468B2 (ja) | 1995-08-23 |
Family
ID=15801839
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16489187A Expired - Lifetime JPH0778468B2 (ja) | 1987-06-30 | 1987-06-30 | 分光蛍光光度計 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0778468B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3237692B2 (ja) * | 1996-04-24 | 2001-12-10 | 横河電機株式会社 | 近赤外分光分析計用変換器 |
| JP2011153945A (ja) * | 2010-01-28 | 2011-08-11 | Hitachi High-Technologies Corp | 分光蛍光光度計、および液体クロマトグラフ用蛍光検出器 |
-
1987
- 1987-06-30 JP JP16489187A patent/JPH0778468B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS649343A (en) | 1989-01-12 |
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