JPH0774239B2

JPH0774239B2 - 細胞培養用高ゲル強度酸可溶性コラーゲンの製法

Info

Publication number: JPH0774239B2
Application number: JP61208436A
Authority: JP
Inventors: 正博肥塚; 淳平榎並; 正隆羽多; 銀男鈴木
Original assignee: Nitta Gelatin Inc
Current assignee: Nitta Gelatin Inc
Priority date: 1986-09-04
Filing date: 1986-09-04
Publication date: 1995-08-09
Anticipated expiration: 2010-08-09
Also published as: JPS6363700A

Description

【発明の詳細な説明】〔技術分野〕この発明は、高ゲル強度の酸可溶性コラーゲンを得る方
法に関する。

〔背景技術〕

生体内において、コラーゲンは細胞内で合成され、種々
の修飾反応をうけて３本鎖のプロコラーゲンができて細
胞外に分泌される。このプロコラーゲン分子は、コラー
ゲン分子より大きく、両末端に非コラーゲン性のかなり
大きなプロペプチドをもっている。生体内では、これら
のプロペプチドは、特異的なプロテアーゼにより僅かに
ペプチドを残して通常のコラーゲン分子となる。このよ
うにして生じたコラーゲン分子（トロポコラーゲン）
は、分子量約10万のポリペプチド鎖が３本集まってコラ
ーゲン特有のらせん構造を形成しており、長さ約3000
Å、直径15Å、分子量約30万の棒状の分子である。分子
の両末端にはらせん構造をとらないペプチド鎖（テロペ
プチド）が付いている。

プロコラーゲンがコラーゲン分子となると、初めて規則
性のある集合体を形成してコラーゲン線維となる。コラ
ーゲン線維内のコラーゲン分子は、加令により、分子内
架橋および分子間架橋が形成される。架橋の進行によ
り、コラーゲン組織は硬く丈夫なものに変化していくと
ともに、可溶性区分が減少し、不溶性区分が増大してい
く。

これらのコラーゲン線維を含む組織から、コラーゲン分
子の形状を全く変化させることなく、コラーゲンの可溶
性区分を得ることには、大別して、食塩等の中性塩溶液で抽出する方法、希酸溶液で抽出する方法がある。の方法で得られたコラーゲンは中性塩可溶性
コラーゲン、の方法で得られたコラーゲンは酸可溶性
コラーゲンとそれぞれ呼ばれる。中性塩で抽出されるコ
ラーゲンは、分子間架橋が形成されていないコラーゲン
（モノメリックコラーゲン）がほとんどである。しかし
ながら、通常利用されうる動物組織を抽出原料として用
いた場合、中性塩で抽出されるコラーゲンの量が極めて
微量であるから、これを工業的に利用することは実質的
にほとんど不可能である。これに対し、酸で抽出を行う
と、モノメリックコラーゲンとともに分子間架橋により
生じるコラーゲン分子のオリゴマー（ポリメリックコラ
ーゲン）も抽出される。しかし、酸可溶性コラーゲンに
おいても、幼若な動物組織を用いた場合には、その収率
（モノメリックコラーゲンおよびポリメリックコラーゲ
ンの収率）が高々数％以下であることが知られている。

このほかに、不溶性コラーゲンを可溶性するには、ペプ
シン等のプロテアーゼ（蛋白質分解酵素）で処理する方
法、あるいは、飽和硫酸ソーダの存在下で苛性ソーダで
処理する方法が公知である。これらの方法によって、コ
ラーゲンのらせん構造を保ったまま、ほとんど100％の
収率で可溶性コラーゲンが得られる。しかし、前者の方
法では、テロペプチド部分が消化されており、後者の方
法では、さらにコラーゲン分子中のアスパラギン、グル
タミンのアマイドが加水分解され得られたコラーゲンの
等電点が低下しており、厳密な意味では元のコラーゲン
分子の構造をすべて保持しているものではない。

近年、コラーゲンゲルマトリックスを利用した細胞培養
法が注目されている。コラーゲンゲルを支持基質として
細胞培養を行う方法には、ゲル上に細胞を単層培養する
方法と、ゲル内に細胞を包理培養する方法とがある。さ
らに、単層培養法はゲルが培養器に付着したままの状態
の付着コラーゲンゲル培養法と、ゲルが培養液中に浮か
んでいる状態の浮遊コラーゲンゲル培養法とに分けられ
る。

浮遊コラーゲンゲル培養法は、これまで困難とされてい
た培養細胞における分化機能の維持を可能にした。すな
わち、この方法を応用すれば細胞培養により生体物質、
生理活性物質を大量に採取することも可能になってき
た。

また、コラーゲン包理培養法は、試験管内においても形
態形成、組織構築を観察することが可能になった。

これらのように、細胞培養に極めて有効なコラーゲンゲ
ルは、上記のようにして得られた可溶性コラーゲンの溶
液のpHを中性とし、さらに塩類を加えて生体内の塩濃度
（NaClで0.14M）にした後、25℃〜37℃に加温すること
によって得られる。これは、溶液中に分散しているコラ
ーゲン分子が生理的条件下で再び会合を始め、コラーゲ
ン線維が再構成され、網目状の線維の間に液が閉じ込め
られるからである。

このようにして得られるコラーゲンゲルを細胞培養に用
いる場合、ゲルを調製する際に要求される特性として
は、線維再構成のスピード、すなわち、ゲル化速度が早
いこと、得られるゲルの強度が高いこと、および、ゲル
の透明度が高いことである。これらいずれの特性も得ら
れる可溶性コラーゲンの中で熱可溶性コラーゲンが最も
優れており、他の方法によって得られるコラーゲンで
は、上記特性のすべてまたはいずれかを満足するものが
得られない。すなわち、酵素可溶化コラーゲンおよびア
ルカリ可溶化コラーゲンに比べ、酸可溶性コラーゲン
は、元のコラーゲン構造をほとんど損なうことなく保持
しているために、線維再構成能が高く、したがって、そ
の溶液は、生理的条件下においた時、素早く、かつ、硬
いゲルを構成し、細胞の支持体として極めて優れたマト
リックスとなる。

しかし、これまでのところ、高いゲル強度をもつコラー
ゲンを高い収率、すなわち、工業的に利用できる程度の
収率でつくる方法は見出されていない。

〔発明の目的〕

この発明は、以上のことに鑑みて、ゲル強度の高いコラ
ーゲンを与えるコラーゲンを高い収率で得ることができ
る細胞培養用高ゲル強度酸可溶性コラーゲンの製法を提
供することを目的とする。

〔発明の開示〕

この発明は、上記の目的を達成するために、動物組織か
ら酸溶液により抽出して可溶性コラーゲンを得る方法に
おいて、前記動物組織として豚由来のものを用いるよう
にするとともに、抽出により得られた溶液を、前記動物
組織の乾燥固形分量１重量％以下、pH3以下、遠心加速
度30000g以下の条件で遠心分離にかけて不溶性コラーゲ
ンを除くことを特徴とする細胞培養用高ゲル強度酸可溶
性コラーゲンの製法を要旨とする。

以下に、この発明を詳しく説明する。

この発明では、抽出原料として、豚由来の動物組織を用
いることにしている。これは、豚由来の動物組織を抽出
原料として用いると、高ゲル強度のコラーゲンが高い収
率で得られるからである。豚由来の動物組織としては、
たとえば、豚皮、豚腱などが用いられるが、これらに限
定されない。

豚由来の動物組織は、通常の方法に従って精製されたの
ち酸溶液に分散し、抽出を行う。この抽出を行った後、
その抽出液は、遠心分離にかけ、可溶性コラーゲン画分
と不溶性コラーゲン画分に分離する。前記酸溶液として
は、酢酸、クエン酸などの有機酸、および、塩酸などの
無機酸の溶液が用いられるが、これらに限定されない。
抽出時間は、特に限定されないが、通常どおり一夜ない
し二日間行うのがよい。

全操作は、コラーゲンの変性を避けるために、１〜10℃
の低温で行うことが好ましい。

遠心分離は、以下のような条件で行われる必要がある。
まず、動物組織の乾燥固形分の量を、酸溶液に対し１重
量％以下とすることである。前記乾燥固形分の量が酸溶
液に対し１重量％を上回ると、遠心分離の際、コラーゲ
ン溶液の粘性によって可溶性コラーゲン画分の分離が困
難となる。前記乾燥固形分の量としては、0.7重量％以
下が好ましく、0.5重量％以下がより好ましい。分離に
必要な乾燥固形分量は、遠心加速度によって異なるが、
たとえば、約20000gの場合0.3重量％以下が好ましい。
つぎに、pHを３以下とすることである。抽出pHは、通常
用いられるpH（２〜４）でよいが、遠心分離時のpHが高
すぎると、可溶性コラーゲン画分の分離が困難となる。
遠心分離時のpHは、2.7以下が好ましく、2.5以下がより
好ましい。遠心分離の遠心加速度は、30000g以下とす
る。30000gを上回ると、そのような遠心装置は、処理量
が小さく、工業的に利用することは実質的にほとんど不
可能である。

具体的操作としては、あらかじめ動物組織の乾燥固形分
の量が酸溶液に対して１重量％以下となるようにしてpH
3以下の酸溶液で抽出を行い、引き続き遠心分離を行う
か、もしくは、抽出は適当な条件で行い、遠心分離の直
前に遠心分離にかける溶液（抽出により得られる溶液）
を、動物組織の乾燥固形分量が酸溶液に対し１重量％以
下、pHが３以下となるように調整して遠心分離を行なう
ことがあげられる。

遠心分離にかけられる溶液が上記の乾燥固形分量および
pHであれば、30000gで少なくとも30分間以上遠心分離を
行うことにより、上澄みの可溶性コラーゲン画分と下層
の不溶性コラーゲン画分に分離する。なお、このとき、
遠心分離の遠心加速度を高くする程、可溶性コラーゲン
画分中のモノメリックコラーゲンの割合が増すが、特に
細胞培養に適した高ゲル強度のコラーゲンゲルを調製す
るのに用いるコラーゲンには、ポリメリックコラーゲン
が含まれていても差支えない。また、両画分を分離する
には、高い遠心加速度を用いる程、分離が容易に行える
ことはいうまでもないが、実際に数万ｇ以上の遠心加速
度が得られる、いわゆる超遠心装置は、その処理量が小
さく、これを工業的に利用することが実質的にほとんど
不可能である。このようなことから、この発明は、実際
に工業的に利用可能な低遠心加速度の遠心分離機（通常
30000g以下）を用いて、酸可溶性コラーゲンを効率良く
得る方法を研究した結果、豚由来の動物組織を用い、上
記の条件で処理することにより達成できることを見出
し、完成するに至ったものである。

豚由来の動物組織を用い、上記のようにして遠心分離を
行うことにより、他の動物組織を原料にした場合に比
べ、大量の酸可溶性コラーゲンが得られる。

上記のようにして、遠心分離を行ったあと、上澄みの可
溶性コラーゲン画分を回収し、通常の方法にしたがって
精製を行えば、精製酸可溶性コラーゲンが得られる。

このコラーゲン溶液（たとえば、3mg/ml濃度）８部を氷
中で冷却しながら、この溶液にNaClを1.4M含む0.1Mリン
酸緩衝液１部およびNaOH溶液１部を加えて、pH7.4に調
整し、よく混合して37℃に加温すると、数分で高ゲル強
度のコラーゲンゲルが形成される。

この発明の高ゲル強度酸可溶性コラーゲンの製法は、酸
可溶性コラーゲンを高い収率で容易に得ることができ
る。得られたコラーゲンから調製したコラーゲンゲルは
高いゲル強度を有しており、ゲル化速度および透明度な
どの特性にも優れている。このため、このコラーゲン
は、上記のコラーゲンゲルマトリックスを利用した細胞
培養法において、マトリックスとして用いるのに適した
ものである。

（実施例Ｉ）新鮮な豚皮の毛および付着物を取り除いて得た真皮層を
細断し、５％NaCl溶液および水でよく洗浄し、さらにメ
タノール−クロロホルム混合物液で脱脂し、ついでよく
洗浄して精製豚皮原料を得た。この原料15g（乾燥重量
3.8g）をpH2.4のHCl溶液1700mlに一夜膨潤させ、ついで
ホモジナイザー（ポリトロンPT10-35型:KINEMATICA社
製）を用い、よく分散し、約0.22重量％の原料濃度（乾
燥重量基準。以下同様）の分散液を得た。得られた分散
液を時々攪拌しながら24時間放置した後、遠心分離機
（日立高速冷却遠心機HIMACSCR20B型：日立工機社製:RP
R12−２型ローター使用）を用い、12000rpm（最大遠心
加速度22220×ｇ）で１時間遠心分離した。なお、１回
の処理量は約１であった。遠心分離した溶液は、透明
な上層と不透明な下層に分離されており、上層の透明な
部分を下層部が混入しないように注意深く吸引回収し、
酸可溶性コラーゲン画分660mlを得た。

次に、この溶液に10％濃度になるように、NaClを加えて
一夜放置し、生じた沈澱を遠心分離して回収し、水洗
後、pH3.0のHCl溶液に再溶解した。さらに、この溶液に
NaOH溶液を加えてpH7.0に調整し、一夜放置して、生じ
た沈澱を回収し、よく水洗した後、pH3.0のHCl溶液のコ
ラーゲン濃度が3.0mg/mlになるように溶解した。なお、
上記の全操作はすべて10℃以下で行った。得られた精製
酸可溶性コラーゲン溶液は203mlであり、収率は乾燥重
量基準で16.0％であった。

次に、前記精製酸可溶性コラーゲン溶液40mlを100mlビ
ーカーにとり、氷冷しながらNaClを1.4M含む0.1Mリン酸
緩衝液5mlを加えてよく混合し、さらにNaOH溶液5mlを加
えてpH7.4に調整し、直ちに37℃の恒温槽に入れ、１時
間保持した。得られたコラーゲンゲルをレオメーター
（不動工業社製、NRM-2002D型：径１″/2粘弾性用アダ
プター，浸入深度10mm,浸入速度6cm/分で測定）を用い
てゲル強度を測定した結果、235gの高いゲル強度であっ
た。

（実施例２）新鮮な豚足部から採取した腱を実施例１と同様に細断
し、精製して得た精製豚腱原料15g（乾燥重量3.3g）をp
H2.2のHCl溶液1650ml（乾燥重量で約0.2％濃度）に膨潤
し、引き続き実施例１と同様に処理して精製酸可溶性コ
ラーゲン溶液（濃度3.0mg/ml）198mlを得た。収率は18.
0％であった。また、実施例１と同様にしてゲル強度を
測定したところ、246gであった。

（実施例３）実施例２において、分散液の原料濃度0.2重量％およびp
H2.2を、原料濃度1.5重量％およびpH3.5に変えて分散を
行い、24時間後HCl溶液を加えて、原料濃度0.2重量％、
pH2.2に調整し直ちに実施例１と同様にして遠心分離お
よび精製を行い、精製酸可溶性コラーゲン溶液181mlを
得た。収率は16.5％であった。また、実施例１と同様に
してゲル強度を測定したところ、220gであった。

（比較例１）実施例２において、分散液の原料濃度0.2重量％を1.2重
量％に変えた以外は、すべて実施例２と同じ条件で処理
したところ、遠心分離によって透明な酸可溶性画分が得
られなかった。

（比較例２）実施例２において、分散液のpH2.2を3.5に変えた以外
は、すべて実施例２と同じ条件で処理したところ、遠心
分離によって透明な酸可溶性画分が得れなかった。

（比較例３）新鮮な牛皮を実施例１と同様に精製した後、実施例１と
同様の条件で処理したところ、精製酸可溶性コラーゲン
溶液が得られたが、収率は3.4％であった。

（比較例４）新鮮な牛足部から採取した腱を、実施例１と同様に精製
した後、実施例２と同様の条件で処理したところ、精製
酸可溶性コラーゲン溶液が得られたが、収率は4.9％で
あった。

（比較例５）実施例１と同様にして得られたコラーゲン分散液にペプ
シン（乾燥重量に対し、４％）を加え、攪拌しながら20
℃で48時間処理し、原料コラーゲンを溶解してアテロコ
ラーゲン溶液を得た。この溶液を精製水を加えて２倍に
希釈した後、グラスフィルターで濾過し、残渣を除き、
引き続き実施例１と同様に精製処理を行って、精製アテ
ロコラーゲン溶液を得た。収率は87.5％であった。この
精製アテロコラーゲン溶液を実施例１と同様にしてゲル
強度を測定したところ、65gと低いゲル強度であった。

第１表に、実施例および比較例でそれぞれ得た可溶性コ
ラーゲンの原料、収率およびゲル強度を示した。

第１表にみるように、同じ酸処理であっても、豚由来の
原料からは高い収率で可溶性コラーゲンが得られている
のに対して、牛由来の原料からは低い収率でしか可溶性
コラーゲンが得られていない。同じ豚由来の原料からで
も、酵素処理コラーゲンは、酸可溶性コラーゲンに比べ
て非常に高い収率で得られている。しかし、酵素処理コ
ラーゲンは、ゲル化した場合、酸可溶性コラーゲンに比
べてゲル強度が非常に小さい。

〔発明の効果〕

この発明にかかる細胞培養用高ゲル強度酸可溶性コラー
ゲンの製法は、以上にみるように、豚由来の動物組織を
用いるようにするとともに、抽出により得られた溶液
を、前記動物組織の乾燥固形分量１重量％以下、pH3以
下、遠心加速度30000g以下の条件で遠心分離にかけて不
溶性コラーゲンを除くことを特徴とするので、ゲル強度
の高いコラーゲンゲルを与えるコラーゲンを高い収率で
得ることができる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】動物組織から酸溶液により抽出して可溶性
コラーゲンを得る方法において、前記動物組織として豚
由来のものを用いるようにするとともに、抽出により得
られた溶液を、前記動物組織の乾燥固形分量１重量％以
下、pH3以下、遠心加速度30000g以下の条件で遠心分離
にかけて不溶性コラーゲンを除くことを特徴とする細胞
培養用高ゲル強度酸可溶性コラーゲンの製法。