JP2563232B2 - 胎盤コラ−ゲンの新規製品、その抽出法およびその応用 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、変性されておらず、透明で血液適合性の胎
盤由来の天然コーラゲンからのゲルもしくは生理塩溶液
の製造に関する。

本発明は、一般に、ヒトおよび動物の胎盤からコラー
ゲンを抽出し、IV型に富むコラーゲンを単離し工業的に
使用することを可能にする方法に及ぶ。

本発明は、より正確には、著しく厚くても完全に透明
である、酸性もしくは中性のコラーゲン溶液もしくはゲ
ルの製法に関する。

コンタクトレンズの製作のための透明なコラーゲンゲ
ルを開発するために、種々の試みが長年に亘りなされて
きた。極く最近では、角膜それ自身および目の中にさ
え、これら生成物を移植しもしくは挿入するために、こ
れを利用しようとする試みがなされている。もしあらゆ
る炎症性反応もしくは免疫的反応を避けることができる
ならば、人体内での外科的使用のために、ヒトのコラー
ゲンと同じもしくはできる限りそれに近似したコラーゲ
ンを得ることがいかに重要であるか理解されるであろ
う。しかし、今日、十分な量でしかも妥当な価格で市販
品として入手できる唯一のコラーゲン製品は、ラットの
尾または腱から、もしくは若い動物（例えば小牛）の皮
膚から得ている。それらはほとんどＩ型コラーゲンのみ
からできている。他の型、即ちII、III、IV、Ｖ型およ
びその他のものは専門的な研究者によってのみ製造され
るので高価すぎて大規模に使用することができない。

動物のコラーゲン分子は、非螺旋形末端のペプチド
（テロペプチド）を除去するペプシンを用いる方法によ
って得た場合には、殆どもしくは全く抗原性をもたない
ことが多数の刊行物中で述べられている。あらゆる動物
種において類似しているコラーゲンの３本鎖ヘリックス
構造は、ペプシンの作用に対して耐性であるが、殆ど抗
原性をもたないといわれている。ペプシンの作用にかけ
られたコラーゲンのこの非抗原的特徴は上記のような理
由によるものと思われる。コラーゲンのこのような構造
は他の種においては抗原性をもつことが知られているの
で、たとえばウサギの体内において、牛もしくはヒトの
特定のもしくは他の型のコラーゲンから特殊な抗血清を
製造することが可能となる。加えて、そのような製品に
おいては、抗原となる動物タンパク質不純物の存在の可
能性が常にあることを考慮しなければならない。

数年前以来、傷痕をふさぐために、また整形外科技術
において、牛起源のコラーゲンＩの注入がヒトに対して
集中的に実行された。これらのテストにより多くの欠点
が明らかとなり、中でも以下の２つの欠点が特に重要で
ある。

−１％〜３％の対象における免疫学的反応の発生。

−このコラーゲン製品を不運にも、血管もしくは毛細血
管に注入した場合における、局所的な血液凝固反応の発
生。

それゆえに、これらの事実は人間のコラーゲンゲルを
得ることができるということがいかに重要であるかとい
うことを示している。このゲルは、望ましくない免疫学
的反応の、いかなる発生の危険も伴うことなく、ヒトの
眼科学における利用のために透明であるだけでなく、血
液適合性で生体適合性でもある。

Ｉ、IIもしくはIII型のヒトもしくは動物のコラーゲ
ンは、ペプシンの作用に付した後でさえ、電子顕微鏡下
でこれらに特徴的な小繊維構造をもっている。このよう
な構造に基づき上記型のコラーゲンは強力な血小板凝集
剤となる。しかし、これらのコラーゲンは血液適合性で
はないので、担当医が接触凝固効果を欲しない時にはい
つでもこれらを用いることを避けるほうがよい。

これらのコラーゲンは実質的に中性pHでは不溶性であ
るので、不透明な懸濁液のみしか得ることができない。
しかも、抗原決定基の出現を生ずるようなコラーゲン分
子の化学的修飾を行うことなしに、透明な生理学的ゲル
（中性pHで等張性）の製造のために、これらを用いるこ
とはできない。アメリカ合衆国特許第3,553,299号にお
てい、ジール（THIELE）はすでに、眼球の水晶体から得
た、それゆえに本質的にコラーゲンからなるゲルを用い
てコンタクトレンズを製作することについて述べてい
る。アメリカ合衆国特許第4,223,984号および同第4,26
8,131号において、ミヤヤ（MIYAYA）．は、また、中性p
Hで可溶性のものとするために化学的に修飾しなければ
ならないＩ型コラーゲンゲルからのコンタクトレンズの
製作を開示している。

これらの特許に述べられている方法では、機械的強度
の低い、薄いときいのみ比較的透明なゲルが得られるに
すぎない。これらを参照しても、後の化学的修飾（スク
シニル化もしくはメチル化）により透明性が得られるか
どうかは明らかではない。

アメリカ合衆国特許第4,388,428号において，クズマ
（KUZMA）は、化学的特性を改善するために、コラーゲ
ンを化学的重合体と混合したゲルについて述べている。
そのような生成物を使用することは、粘稠なもしくは固
体状のゲルからあらゆる痕跡量の毒性物質を除去するこ
との困難さのゆえに、好ましくない。

R.R.ブルンス（R.R.BRUNS）およびJ.グロス（J.GROS
S）（アメリカ合衆国特許第4,505,855号）は、上記従来
の技法では動物のコラーゲンから完全に透明なゲルを得
ることは困難であることを立証している。彼らは超遠心
分離法を示唆しているが、この方法は大変高価で工業的
利用に適合せることは困難である。

さらに、ペプシンによる胎盤コラーゲンの酵素的抽出
が、すでに検討されている。しかし、得られるコラーゲ
ン製品は、眼科学の分野での利用のために要求される透
明性をもっていない。

M.Z.アベディン（M.Z.ABEDIN）およびR.リームシュナ
イダー（R.RIEMSCHNEIDER）は応用高分子化学（Die Ang
ewandte Macromoleculare Chemie），11−1701,107−12
2（1983,1月）〔ヒューティーク＆ベッフ（Huthig＆Wep
f）出版、ハイデルベルグ〕においてペプシンによる胎
盤の消化のための方法について述べているが、この方法
では、Ｉ型およびIII型のコラーゲンによるIV型コラー
ゲンの汚染を生じ、従って後に分画を必要とし、更に強
力な消化特性を示す高いNaCl濃度下での沈澱および再溶
解が必要とされる。

これらと同じ著者〔応用高分子化学、（Die Angewend
te Makromoleculare Chemie），82−1276,171−186（19
79）〕は胎盤をエーテルにより長期間処理し、凍結乾燥
し、次いで、酢酸ナトリウムもしくは苛性ソーダで処理
した後ペプシンで消化し、更に得られる上澄液を透析し
てコラーゲンを沈澱させることからなる方法について述
べている。かくして得たコラーゲンは取り出した後、高
濃度のNaClの存在下で再度沈澱させなければならない。
別の理由から工業的規模での実施を不可能とするこれら
の条件は、強力な消化特性を意味しており、また得られ
た不透明な産出物が明らかに、特にＩ型＋III型コラー
ゲンであることの証拠を提供している。

Th.F.クレシナ（Th.F.KRESINA）およびEd.J.ミラー
（Ed.J.MILLER）〔人間の胎盤組織からの基底膜コラー
ゲンの単離および特徴づけ。遺伝子上異なる２種のコラ
ーゲン鎖の存在の証拠。バイオケミストリー（Biochemi
stry），18−14,3089−3097（1979），アメリカ化学
会〕はまた、胎盤組織の完全なペプシンによる消化はＩ
型およびIII型コラーゲンによる著しい汚染をもたらす
ことを述べている。分画の後、コラーゲンを酸性pHで高
NaCl濃度で処理しなければならない。得られた生成物は
眼科学的使用には適していない。

ドイツ特許出願第2,462,222号には、コラーゲンの濁
った溶液として与えられる胎盤組織の上澄液の連続的な
抽出処理からなるペプシン処理が記載されている。

ヨーロッパ特許出願第0,080,956号には、不透明な変
性されたコラーゲンを与える胎盤のアルカリ抽出物のペ
プシン消化が記載されている。

本発明の目的は、変性されていない非抗原性の完全に
透明な、生理学的適合性および血液適合性の、電子顕微
鏡で観察し得る線状の繊維を含まないコラーゲン製品を
提供することにより、上記の様々の欠点を克服すること
にある。これらの製品は、ゲルもしくは溶液として提供
することができる。

これらの製品はIV型コラーゲンに富んだものである
か、あるいは本質的にIV型コラーゲンを含んだものであ
ることが有利である。

得られたコラーゲンの溶液もしくはゲルは著しく厚く
ても透明であり、20mmに達するほどにこの厚さは、市場
（コンタクトレンズ、眼内のもしくは角膜のインプラン
ト）の要求に十分対処し得る大きさである。

本出願人は人胎盤を出発物質とする抽出法を開発し
た。ヒト胎盤は、工業的規模でヒトコラーゲンを製造す
るために考え得る唯一の資源である。

ヒト胎盤に適した本発明の新しい方法に関する知見
は、この方法を動物の胎盤にまで拡張することを可能に
した。動物コラーゲンはたとえば獣医学において有用で
あり得、もしくはコンタクトレンズのようなヒトの非移
植性外用器具として用いることが可能である。

本発明の方法は、それゆえに、 −第１段階として、ヒトおよび動物の胎盤からコラーゲ
ンを抽出し、次いでIV型に富んだコラーゲンを単離し、 −第２段階として、このIV型に富んだコラーゲンから、
前述の特性をもった溶液もしくはゲルを製造する、 ことからなる。

本発明による胎盤コラーゲンの抽出法は以下の各工程
を含むことを特徴とする。すなわち、 −凍結した、ヒトもしくは動物の胎盤を出発物質とし、
これを粉砕し、 −粉砕した胎盤組織を、たとえば、中性pH条件下で、次
いで酸性pH条件下で行われる連続的な洗浄処理にかけ、 −該胎盤組織を酵素消化して、実質的にＩ型もしくはII
I型のコラーゲンによって汚染されていないIV型のコラ
ーゲンを抽出する。

ここで、消化は適当な酵素（コラーゲナーゼは除く）
で行う。ペプシンが好ましい。この場合において、消化
は選択的に、酸性pH好ましくは２〜3.5で、好ましくは
０〜20℃の温度で、適当な時間、特に８〜24時間行う。
ここで、凍結した胎盤1Kgあたりのペプシンの量は0.5〜
2g、好ましくは0.5〜1gもしくは1.5g、即ち胎盤1000に
対し、ペプシン0.5〜１もしくは1.5の範囲である。

この１回目の処理によって消化されなかった残留組織
を必要に応じて第１回目と同じ条件で行なう第２回目の
ペプシンによる消化にかける。この酵素消化は、後の公
知の方法で、IV型のコラーゲンを実質的に含まないＩ型
およびIII型コラーゲンを単離することを可能にする。

次いで、最初の酵素消化を受けた胎盤懸濁液を連続的
な以下の方法で処理する。すなわち、 −酵素消化によって得られた上記胎盤の懸濁液から残留
組織を分離した後、 −適度な酸性pH条件下で処理することにより不純物の沈
澱を除去し、 −得られる上澄液から、中性pH条件下で塩で処理してコ
ラーゲンを沈澱させ、 −沈澱したコラーゲンを再溶解し、得られた溶液を中和
し、 −不溶性不純物を除去し、そして −酸性pH条件下で塩を加えてコラーゲンを沈澱させる。

このように酵素消化にかけた胎盤懸濁液を次のような
処理に掛けることが有利である。すなわち、 −前述の懸濁液を、特に１容の水に溶かし、 −pHの値を７〜９もしくは10に調節し、 −この懸濁液を１〜24時間、０〜20℃の温度で静置し、 −最初の消化における上澄液から残留組織を分離し、 −該上澄液を適度のpH、たとえば4.5〜5.5のpHに調節
し、 −この上澄液を、たとえば１〜24時間、０〜20℃の温度
にて放置し、 −多くの不純物を含む不溶性の部分を除去し、 −得られる透明な上澄液を約7.5のほぼ中性のpHに調節
し、 −たとえばNaClのような塩を、最終濃度がおよそ1.2Mと
なるまで加え、 −得られた懸濁液をたとえば１〜24時間、10〜25℃の温
度で放置し、 −形成されたコラーゲン沈澱を回収し、 −この沈澱を弱酸性溶液に再溶解し、 −この溶液をpH7.5に中和し、 −得られた懸濁液を１〜24時間、０〜20℃の温度にて放
置し、 −不溶性の部分を除去し、それによって、透明性に有害
な効果を与える不純物を除去し、 −得られる上澄液を、たとえば２〜3.5もしくは４の酸
性pHに酸性化し、 −NaClのような塩を、最終濃度が0.4〜0.8Mとなるまで
加えて、コラーゲンを沈澱させ、 −得られた懸濁液を１〜24時間、０〜25℃の温度にて放
置し、 −精製した酸性コラーゲンの沈澱を回収する。

これらの操作を完了することによって得た、精製され
たコラーゲン沈澱をアセトンもしくは同等の揮発性有機
溶媒で溶解し、その、結果酸性コラーゲン繊維を形成
し、これを濾過器による濾過によって回収する。これら
の繊維を、なまぬるい無菌の空気流で乾燥する。

ここで繊維とは乾燥の後、固体コラーゲン粉末の有す
る外観を意味するものと理解すべきである。即ち、この
繊維は、溶液中の既知のコラーゲンを電子顕微鏡で観察
したときにみられるような線状の繊維構造に対応するも
のでは決してない。

本発明の実施態様の１変形においては、精製したコラ
ーゲン沈澱を水に再溶解する。次いで、この溶液のpHを
7.5に調節し、NaClのような塩を、最終的な濃度が約1.2
Mとなるまで溶解する。得られた懸濁液を１〜24時間放
置し、中性コラーゲン沈澱物を回収する。

得られた中性コラーゲン繊維の沈澱物をアセトンもし
くは同等の揮発性有機溶媒に溶解する。この結果、中性
コラーゲン繊維が形成され、これを濾過器による濾過器
によって回収する。これらの繊維をなまぬるい無菌の空
気中流で乾燥する。

本発明の溶液もしくはゲルの製造のためのコラーゲン
材料として用いるのは、これら乾燥段階（＜10％）の酸
性もしくは中性コラーゲン繊維である。

アセトンで処理した後に得られる酸性もしくは中性コ
ラーゲン繊維から、次のようにしてゲルを作製すること
ができる。すなわち、 −２〜30％の濃度のコラーゲン溶液が得られるように決
めた体積の水にこれらの繊維を加え、 −これらの繊維を水中でたとえば１時間膨潤させ、 −全体を適度に加熱し、 −得られる粘稠かつ透明な溶液を孔径0.2〜８μの膜で
濾過し、 −得られる溶液を冷却する。

IV型コラーゲンに富むコラーゲン繊維からコラーゲン
溶液を次の方法でつくる。すなわち、 −コラーゲン繊維を所定の体積の水と接触させ、 −コラーゲン繊維をたとえば約１時間、水中で膨潤さ
せ、 −0.1M以下の濃度の、たとえば酢酸ナトリウムのような
塩の溶液を中和を開始させるために加える。

ここで、多くても２％の濃度のコラーゲンが得られる
ように水の体積を決定する。

−該溶液のpHを約7.5に調節し、必要であればNaClを加
えて等張液にし、 −該溶液を、10〜60分間、30〜80℃にて適度に加熱す
る。変法として、コラーゲン溶液を、酸性状態で0.2〜
８μの孔径の膜で濾過してもよい。中和をこの後にの
み、もし必要であれば、減菌条件下で行い、その結果生
成物の無菌を保証し、一方、コラーゲン溶液は酸性pHで
粘性が低いことから、濾過操作の促進を保証する。もう
一つの変法は、一時的に粘性を低下させるために超音波
を印加しつつ濾過を行うことからなる。

−上記溶液を0.2〜８μの孔径の膜で濾過し、 −次いで溶液を冷却する。

以上の操作を完了することにより、 −著しく粘稠であり、 −多くとも２％の未変性コラーゲンを含有し、 −完全に透明であり、 −等張性であり、生理的適合性であり、かつ血液適合性
であり、 −電子顕微鏡で観察可能な直線状の繊維を全く含んでい
ない、 という各種特徴をもつ溶液が得られる。

このような溶液はヒトもしくは動物医学におけるイン
プラント材として用いることができ、更に眼科学、骨の
接合、やけどの治療および皮膚病学の分野で用いること
もできる。

酸性コラーゲン繊維をもはやコラーゲンの材料として
用いず、本発明の実施態様の変法により得られる中性の
IV型コラーゲンに富む中性コラーゲンを用いた場合に
は、前述の方法と同じ連続的操作を行って、コラーゲン
繊維から溶液が得られる。この場合中和はもはや必要で
はない。

IV型コラーゲンに富む中性コラーゲン繊維からコラー
ゲン溶液をつくるためには、以下の手順を行う。

−多くとも２％の濃度のコラーゲン溶液が得られるよう
に決定した量の水に、中性コラーゲン繊維を溶かし、 −この溶液に、濃度が約0.15MとなるまでNaClのような
塩を加え、 −この溶液を10〜60分間、30〜80℃の温度、好ましくは
数十分間、約60℃の温度にて適度に加熱し、 −この溶液を0.2〜８μの孔径の膜で濾過し、 −得られる溶液を冷却する。

かくして、酸性コラーゲンからつくったコラーゲン溶
液と同じ特徴をもつ溶液が得られる。

本発明の他の利点および特徴は、以下に与えられる本
発明の実施例を参照することによって明らかになるであ
ろう。もとより本発明は、これら実施例に限られるもの
ではない。

実施例１では、ヒトの胎盤からのIV型コラーゲンに富
んだコラーゲンの抽出法および酸性コラーゲン繊維の製
造法を例示する。

実施例２は、本発明による中性コラーゲン繊維の製造
に関する。

実施例３は、IV型コラーゲンに富んだコラーゲンを動
物の胎盤から抽出する方法を例示するものである。

実施例４および５では15％コラーゲンゲルの製造につ
いて述べる。

実施例６、７、８および９ではコラーゲン溶液の製造
について述べる。

実施例１ 凍結した300Kgの胎盤を粉砕して、数cm³の塊状物とし
た。次いで粉砕材料を、８％のエタノール、6g/のNaC
l、10Kgのセルロースを含む300の水性溶液と混合し
た。10℃で撹拌した後、マビール（MBILLE）圧搾機で液
全体を圧搾して、胎盤組織から血液を分離した。65％の
水を含む102Kgの胎盤組織を得た。

圧搾機で分離した組織を、pH7.2の0.05Mクエン酸ナト
リウム500中で10℃で30分間撹拌した。次いで圧搾し
て洗浄液を除去し、組織を回収した。30g/のNaClを加
えたpH7.2の0.05Mクエン酸ナトリウム500で２回目の
洗浄操作を行った。３回目の洗浄操作をpH7.2の0.05Mク
エン酸ナトリウム500で行った。更に、このように中
性pHで洗浄した組織を、10℃にて酸性pHにおける以下の
３回の連続洗浄操作にかけた。すなわち、 −2N HClを加えることによって最終的にpHを2.8に調節
した0.05Mクエン酸500を用い、30分間撹拌した後、圧
搾し、 −0.5M蟻酸500で15時間洗浄し、 −20g/のNaClを加えた0.05Mクエン酸500で30分間洗
浄する。

このように酸性pH条件下で洗浄した胎盤組織は白い外
観をもち、このことは、最初の胎盤血液からの赤色色素
を十分に除去したことを立証している。得られた製品の
重量は82Kgであった。

次いで300gのペプシンを含むpH2.8の0.05Mクエン酸50
0中で、10℃で15時間、ペプシンによる酵素消化を行
った。次に、10℃の水500で懸濁液を希釈した。ペプ
シンを変性させ、そのプロテアーゼとしての作用を抑制
するため、4NNaOHを加えてpHを7.5に調節した。10℃で1
5時間静置した後、主として不溶性のコラーゲンＩおよ
びIIIを含む組織残留物を遠心分離機（ウウストファリ
ア（Westfalia）KG10006）で連続的に分離した。この残
留物の重さは103Kgであった。これを１回目と同じであ
る２回目の酵素消化処理にかけ、文献に記載されている
方法により、コラーゲンＩおよびIIIのそれぞれの抽出
および分離を行った。

最初の酵素消化処理の際の上澄液には、ペプシン処理
の後には、本質的に中性のpHで可溶性のコラーゲンおよ
び他の巨大分子が含まれている。これは特にIV型のコラ
ーゲンを含んでいる。

上澄液のpHを2N HClで５に調節し、10℃で15時間静置
した後、形成された沈澱物をアルファラバル「バクトフ
ュージ」（Alfa Laval“Bactofuge"）遠心分離機で連続
的に遠心分離することにより除去した。

得られた上澄液は極めて透明であったが、そのpHを4N
NaOHを加えて7.5に調節し、NaClの最終濃度を1.2Mにし
た。16℃で15時間放置後、形成されたコラーゲン沈澱物
を「バクトフュージ」（“Bactofuge"）遠心分離機で連
続的に遠心分離することによって回収した。

次いで、13Kgの沈澱物を0.01N HCl600に溶かし、4N
NaOHを加えることによってpHを7.5に調節した。４℃で1
5時間静置後、形成された沈澱物を「バクトフュージ」
（“Bactofuge"）遠心分離機で分離した（得られた重量
10Kg）。

得られた透明な上澄液を、４℃で0.6Mの最終濃度とな
るまで2N HClでpH2.8に酸性化し、15時間後、コラーゲ
ン沈澱物を「バクトフュージ」（“Bactofuge"）遠心分
離機によって集めた。沈澱物は6.5Kgの重さであった
が、流動性の様相をもっていた。７のアセトンを徐々
に加えると、コラーゲン繊維が形成され、濾過器で濾過
することにより、これを回収した。アセトンにより複数
回処理することにより、これらの繊維を洗浄し、なまぬ
るい殺菌した空気流中で乾燥した後、最終製品として18
0gの乾燥繊維を得た。これらの繊維のアミノ酸成分を分
析したところ、IV型コラーゲンと同じ構造およびコラー
ゲン族の特徴をもつことが示された（≧30％グリシン、
約10％のグルタミン酸、プロリンおよびヒドロキシプロ
リン）。

以下の表は、この実施例にされた方法を適用して得
た、４つの異なるヒト胎盤コラーゲン製品の構成アミノ
酸成分分析の結果を示している（結果は1000残基あたり
の各アミノ酸の分子数で示してある）。

実施例２ ヒト胎盤300Kgの第２のロットに対して、実施例１に
述べた方法と全く同じ方法を適用した。

この操作の終了時点で、４℃、0.6M NaClの存在下、p
H2.8で得ることのできた沈澱物の重さは6.5Kgであっ
た。沈澱物を200の水に再溶解した。得られた溶液のp
Hを16℃にして4NNaOHを加えることによって7.5に調整し
た。次いで、最終的に1.2Mの濃度になるようにNaClを加
えた。

15時間後に形成された沈澱物を「バクトフュージ」
（“Bactofuge"）で遠心分離することによって回収し
た。回収した製品の重さは3450gであった。実施例１の
ように、沈澱物をアセトンで乾燥させた後、本質的にIV
型のコラーゲンに富んだ200gの乾燥中性コラーゲン繊維
を得た。

実施例３ 実施例１に述べた方法と全く同じ方法を180Kgの牛胎
盤に対して適用した。連続的な洗浄を300の洗液で行
った。最初のペプシンによる消化処理をpH2.8に調節し
た0.05Mクエン酸300中で、180gのペプシンを加えるこ
とによって行った。他の選択的コラーゲン沈澱工程は、
実施例１と同じであった。

アセトン処理によって最終的に乾燥した後130gの乾燥
牛コラーゲン繊維を回収した。ドデシル硫酸ナトリウム
（SDS）の存在の下にかつ還元剤（ジチオトレイトー
ル）を用い、もしくは用いることなしに行ったポリアク
リルアミドゲル電気泳動による分析によって、この製品
がIV型のコラーゲンに富んでいることが立証された。

これらの牛コラーゲン繊維を水に溶かすと、最終沈澱
物が酸性pH条件下でつくられているため、酸性溶液とな
った。

実施例４ 実施例１によりつくった1.5gの乾燥ヒトコラーゲン繊
維を10mlの蒸溜水と接触させた。繊維を１時間膨潤させ
た後、全体を70℃の水浴中で30分間維持した。著しく粘
稠な透明の溶液を得た。これは同じ温度で0.8μ〜８μ
の孔径の膜によって、容易に濾過することができた。冷
却の後、得られたゲルは濾過された水のように無色で酸
性で、完全に透明であった。ドデシル硫酸ナトリウムの
存在下で、ジチオトレイトールを用いて、もしくは用い
ることなく行なったポリアクリルアミドゲル電気泳動に
よる検査によって、加熱工程の間、コラーゲンIV分子が
完全に保存されることが立証される。

このゲルを、コンタクトレンズやあらゆる他の光学的
特性をもつ物品を形成するための既知の操作に掛けるこ
とができた。化学試薬（アルデヒド）もしくは物理的手
段（γ、β、Ｘ線もしくは紫外線放射）による成形およ
び架橋結合法が完全に利用できた。

実施例５ 実施例３によってつくった牛コラーゲン繊維を実施例
４の仕様にしたがって溶解した。実施例４のゲルに匹敵
する物性をもつゲルを得た。

実施例６ 実施例２で得た中性コラーゲン繊維1gを90mlの蒸溜水
に溶かした。容量100mlに調節したpH7.5の最終的溶液
に、最初の沈澱物にすでに存在している塩化ナトリウム
を考慮して、0.15Mの最終濃度となるように塩化ナトリ
ウムを加えた。得られた溶液には、主にIV型のヒトコラ
ーゲンからなる、およそ１％のタンパク質が含まれてい
た。

この溶液は、10分間60℃の水浴中に維持した後、0.2
μ〜８μの孔径の膜で濾過できた。この溶液に超音波を
印加することによって、濾過を促進することができた。
冷却した後、極めて粘稠な、完全に透明かつ無菌のヒト
コラーゲンの溶液を得ることができた。

この溶液は血液適合性であった。余分のクエン酸を除
いた９容のヒト血液で希釈したとき、血液凝固、血小板
凝集、もしくはプロトロンビンのトロンビンへの活性化
はおこらなかった。

実施例７ 実施例１でつくったヒトコラーゲン繊維1gを50mlの水
中に維持して１時間膨潤させ、次いで50mlの0.1M酢酸ナ
トリウムを加えた。得られた最終溶液には、主にIV型の
ヒトコラーゲンからなるおよそ１％のタンパク質が含ま
れていた。そのpHを7.5に調節した。この際必要であれ
ば、塩化ナトリウムを加えて等張液とすることができ
る。

60℃の水浴中に10分間保持した後、この溶液は0.2μ
〜８μの孔径の膜によって濾過できた。著しく粘稠な、
生理的に適合性で完全に透明な、無菌のヒトコラーゲン
溶液を得た。

この溶液は、前述のものと同様に、血液適合性であっ
た。

実施例８ 実施例７に述べられた方法を全く同じように繰返し
た。ただし、50mlの0.1M酢酸ナトリウムを、50mlの0.05
Mリン酸水素ナトリウムの代りに添加した。

得られた溶液は血液適合性であった。

実施例９ 実施例１で製造したコラーゲン繊維1gを50mlの水中に
保持して、１時間膨潤させた。この得られた溶液を30℃
で10分間加熱し、孔径0.2μの膜で濾過した。

また37℃に加熱しながら超音波を使用することによ
り、このような濾過を促進することができる。次いで、
得られた無菌溶液に50mlの0.1M酢酸ナトリウムを加え
た。生理学的水性溶液を得るために、必要に応じて塩化
ナトリウムを加えるとともに、pHを7.5に調節した。濾
過した後のあらゆる操作は細菌による汚染を防止しつつ
実施するのがよい。

前述の溶液と同じ溶液を得ることができた。

Claims (17)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】電子顕微鏡で観察した時に筋状繊維を含ま
   ず、濾過した水のように完全に透明で、未変性かつ化学
   的に未修飾で、生理学的に許容される、IV型コラーゲン
   を主成分とするか、基本的にIV型コラーゲンで構成され
   ることを特徴とする眼科で使用可能な胎盤コラーゲン調
   製物。
2. 【請求項２】30〜80℃に10〜60分間加熱しても変性せ
   ず、ドデシル硫酸ナトリウムを用いたポリアクリルアミ
   ドゲル電気泳動法で分子量変化が無い溶液状の特許請求
   の範囲第１項に記載のコラーゲン調製物。
3. 【請求項３】0.1〜20mmの厚さで同じ厚さの濾過水と同
   じ透明性を有し、未変性かつ未修飾の天然コラーゲンを
   ２〜30％含む酸性または中性pHの透明なゲル状の特許請
   求の範囲第１項に記載のコラーゲン調製物。
4. 【請求項４】中性pHで等張性があり且つ生理学的に許容
   可能で、未変性かつ未修飾の天然コラーゲンを２％以下
   含む、酸性または中性pHの溶液状の特許請求の範囲第１
   項に記載のコラーゲン調製物。
5. 【請求項５】胎盤の酵素消化操作を含む、胎盤コラーゲ
   ンの抽出方法において、 凍結状態にあるヒトまたは動物の胎盤を粉砕・洗浄し、
   洗浄した胎盤組織を酵素消化させ、この際、酵素消化を
   ペプシンを用いてpHを２〜3.5にして０〜20℃の温度で
   ８〜24時間行い、ペプシンの量は凍結胎盤1,000に対し
   て0.5〜1.5とすることによってＩ型またはIII型のコラ
   ーゲンで汚染されていないIV型コラーゲンを得、 酵素消化で消化されなかった残りの組織を懸濁液から分
   離した後、酸性pHで懸濁液から不純物を沈澱除去し、、
   上澄相を回収し、上澄相中のコラーゲンを中性pH条件で
   塩を用いて沈澱させ、沈澱したコラーゲンを弱酸性溶液
   に再溶解して中和し、不溶性の不純物を除去し、塩を用
   いてコラーゲンを酸性沈澱させることを特徴とする方
   法。
6. 【請求項６】酵素消化で消化されなかった残りの組織を
   ペプシンで再度第２回目の酵素消化にかけ、この第２回
   目の消化を第１回目の酵素消化と同じ条件下で行う特許
   請求の範囲第５項に記載の方法。
7. 【請求項７】上記の酸性pHでの沈澱除去を下記操作で行
   う特許請求の範囲第５項に記載の方法： 懸濁液を水で希釈し、 懸濁液のpHを７〜10に調節し、 懸濁液を０〜20℃の温度に１〜24時間放置し、 第１回目の酵素消化で得られた上澄相から残りの組織
   を分離し、 この上澄相のpHを4.5〜5.5に調節し、 上澄相を０〜20℃の温度に１〜24時間放置し、 不溶物を除去する。
8. 【請求項８】中和pH条件での塩を用いた沈澱を下記操作
   で行う特許請求の範囲第５項に記載の方法： 上澄相のpHを7.5に調節し、 塩を加えて濃度を1.2Mにし、 上澄相を10〜25℃の温度に１〜24時間維持し、 沈澱したコラーゲンを回収する。
9. 【請求項９】弱酸性溶液に再溶解・中和後の不溶性不純
   物の除去を下記操作で行う特許請求の範囲第５項に記載
   の方法： 沈澱物を弱酸溶液に溶かし、 得られた溶液のpHを7.5に中和し、 溶液を０〜20℃の温度に１〜24時間放置し、 不溶物を除去する。
10. 【請求項１０】弱酸性溶液で中和し、不溶性不純物を除
    去した後のコラーゲンの沈澱を下記操作で行う特許請求
    の範囲第５項に記載の方法： 上澄相を２〜４のpHに酸性化し、 塩を最終濃度が0.5〜0.8Mとなるまで加えてコラーゲ
    ンを沈澱させ、 溶液を０〜25℃の温度に１〜24時間放置し、 得られた精製済みのコラーゲン沈澱物を回収する。
11. 【請求項１１】精製済みのコラーゲンの沈澱物を再溶解
    した後に中性pHで塩を加えてコラーゲンを沈澱させる特
    許請求の範囲第５項に記載の方法。
12. 【請求項１２】下記操作で行う特許請求の範囲第11項に
    記載の方法： 精製済みの酸性コラーゲンの最終沈澱物を水に再溶解
    し、 得られた溶液のpHを中性にし、 塩を1.2Mの濃度になるまで溶液に加え、 溶液を１〜24時間放置し、 得られたコラーゲン沈澱物を回収し、この沈澱物を溶
    液またはゲルの調整のための精製コラーゲン源として用
    いる。
13. 【請求項１３】酸性または中性の精製コラーゲン沈澱物
    を揮発性有機溶媒に溶解し、コラーゲン繊維を形成さ
    せ、得られた繊維を回収・乾燥して溶液またはゲルの調
    整用精製コラーゲン源として用いる特許請求の範囲第５
    に記載の方法。
14. 【請求項１４】コラーゲン濃度が２〜30％となるような
    容積の水とコラーゲン繊維とを接触させ、そのまま約１
    時間膨湿させ、その後、10〜60分間、30〜80℃の温度に
    加熱し、得られた透明かつ粘稠な溶液を0.8〜８μの孔
    径の膜で濾過し、得られた溶液を冷却する特許請求の範
    囲第13項に記載の方法。
15. 【請求項１５】コラーゲン繊維を所定量の水と接触さ
    せ、そのまま約１時間、水中で膨潤させた後、溶液中に
    0.1Mの濃度の酢酸ナトリウムのような塩の溶液を加え、
    この際水の量はコラーゲン濃度を２％以下とするような
    値とし、次いで、pHを約7.5に調節し、溶液を10〜60分
    間、30〜80℃の温度に加熱し、孔径0.2〜８μの膜で濾
    過し、次いで冷却する特許請求の範囲第13項に記載の方
    法。
16. 【請求項１６】コラーゲン濃度が２％以下となるような
    容量の水にコラーゲン沈澱物を溶解し、得られた溶液に
    0.15Mの濃度となるまで塩を加えた後、10〜60分間、30
    〜80℃の温度で加熱し、0.2〜８μの孔径の膜で濾過
    し、得られた溶液を冷却する特許請求の範囲第13項に記
    載の方法。
17. 【請求項１７】溶液の濾過中に超音波を加える特許請求
    の範囲第14項に記載の方法。