JPH0771482B2 - 組換え菌体の培養方法 - Google Patents
組換え菌体の培養方法Info
- Publication number
- JPH0771482B2 JPH0771482B2 JP25046091A JP25046091A JPH0771482B2 JP H0771482 B2 JPH0771482 B2 JP H0771482B2 JP 25046091 A JP25046091 A JP 25046091A JP 25046091 A JP25046091 A JP 25046091A JP H0771482 B2 JPH0771482 B2 JP H0771482B2
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- Japan
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- temperature
- culturing
- ptp64
- dhfr
- protein
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ジヒドロ葉酸還元酵素
（以下ＤＨＦＲ）遺伝子もしくはその誘導体遺伝子を有
する発現プラスミドを含有する大腸菌の培養条件を改良
することにより、ＤＨＦＲもしくはその誘導体を効率よ
く生産させることに関するものである。本発明の産業上
の利用分野としては、微生物工業、発酵工業、医薬品製
造の分野である。
（以下ＤＨＦＲ）遺伝子もしくはその誘導体遺伝子を有
する発現プラスミドを含有する大腸菌の培養条件を改良
することにより、ＤＨＦＲもしくはその誘導体を効率よ
く生産させることに関するものである。本発明の産業上
の利用分野としては、微生物工業、発酵工業、医薬品製
造の分野である。
【０００２】
【従来の技術】ＤＨＦＲは，種々の抗菌剤のターゲット
として知られており，本酵素を特異的に阻害する薬剤の
いくつかは化学療法剤として利用されている。このこと
から,ＤＨＦＲは化学療法剤の開発研究には欠かせない
ものである。また、本酵素反応を利用して葉酸化合物の
特異的還元反応を行うことができること、また、補酵素
であるＮＡＤＰＨの検出・定量にも用いることができ
る。更に、ＤＨＦＲのカルボキシ末端側に異種ポリペプ
チドもしくはタンパク質を結合した融合タンパク質（Ｄ
ＨＦＲ誘導体）がＤＨＦＲの機能を保持することを明ら
かにして、その利用方法が種々明かにされている。ＤＨ
ＦＲの高効率発現用プラスミドとしては、ｐＴＰ６４−
１が作成されている（特許第１５６７５０９号）。ま
た、ＤＨＦＲ誘導体の高効率発現プラスミドとしては、
ｐＴＰ６４−１由来のｐＴＰ７０−１（特開昭６３−２
６７２７６号公報）、また、それ由来のｐＭＥＫ２（特
開平１−２５２２８９号公報）、ｐＬＥＫ１（特開平１
−２５２２９０号公報）、ｐＢＫ１（特開平１−２５２
２８６号公報）などを代表に多くのプラスミドが本発明
者らにより作成されている。
として知られており，本酵素を特異的に阻害する薬剤の
いくつかは化学療法剤として利用されている。このこと
から,ＤＨＦＲは化学療法剤の開発研究には欠かせない
ものである。また、本酵素反応を利用して葉酸化合物の
特異的還元反応を行うことができること、また、補酵素
であるＮＡＤＰＨの検出・定量にも用いることができ
る。更に、ＤＨＦＲのカルボキシ末端側に異種ポリペプ
チドもしくはタンパク質を結合した融合タンパク質（Ｄ
ＨＦＲ誘導体）がＤＨＦＲの機能を保持することを明ら
かにして、その利用方法が種々明かにされている。ＤＨ
ＦＲの高効率発現用プラスミドとしては、ｐＴＰ６４−
１が作成されている（特許第１５６７５０９号）。ま
た、ＤＨＦＲ誘導体の高効率発現プラスミドとしては、
ｐＴＰ６４−１由来のｐＴＰ７０−１（特開昭６３−２
６７２７６号公報）、また、それ由来のｐＭＥＫ２（特
開平１−２５２２８９号公報）、ｐＬＥＫ１（特開平１
−２５２２９０号公報）、ｐＢＫ１（特開平１−２５２
２８６号公報）などを代表に多くのプラスミドが本発明
者らにより作成されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】上記の技術は、組換え
ＤＮＡ技術を利用してＤＨＦＲ及びその誘導体を大腸菌
の菌体中に大量に作らせることを目的に行われたもので
あり、プロモーターおよびＳＤ配列の改良により高効率
発現が達成されている。しかしながら、上記発明におい
ては、菌体の培養方法に関して通常に行われている方法
しか検討しておらず、培養方法を更に検討した場合に、
より生産効率のよい培養条件があるのか否かに関しては
全く不明であった。そこで、本発明者らは、組換え菌体
の培養条件に関して種々検討した。
ＤＮＡ技術を利用してＤＨＦＲ及びその誘導体を大腸菌
の菌体中に大量に作らせることを目的に行われたもので
あり、プロモーターおよびＳＤ配列の改良により高効率
発現が達成されている。しかしながら、上記発明におい
ては、菌体の培養方法に関して通常に行われている方法
しか検討しておらず、培養方法を更に検討した場合に、
より生産効率のよい培養条件があるのか否かに関しては
全く不明であった。そこで、本発明者らは、組換え菌体
の培養条件に関して種々検討した。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、培養条件
を検討している間に、通常行われている同一温度を用い
る方法ではなくて、温度をシフトさせることにより生産
効率が向上することを見いだし本発明の培養方法を考案
するに至った。本発明者らが用いているプラスミドに関
しては、温度に依存して制御を受けるような機構は全く
知られておらず通常の思考方法ではとうてい試行しえな
い培養方法である。
を検討している間に、通常行われている同一温度を用い
る方法ではなくて、温度をシフトさせることにより生産
効率が向上することを見いだし本発明の培養方法を考案
するに至った。本発明者らが用いているプラスミドに関
しては、温度に依存して制御を受けるような機構は全く
知られておらず通常の思考方法ではとうてい試行しえな
い培養方法である。
【０００５】
【発明の構成】本発明におけるＤＨＦＲ誘導体とは、ジ
ヒドロ葉酸還元酵素遺伝子のカルボキシ末端側に異種ポ
リペプチドもしくはタンパク質が結合した融合タンパク
質をいう。また、ｐＴＰ６４−１誘導体とは、ｐＴＰ６
４−１中のｐＨＦＲ遺伝子が、ＤＨＦＲ誘導体遺伝子に
置き換えられた組換えプラスミドをいう。本発明に係わ
る組換え菌体の培養方法は、組換えプラスミドＤＴＰ６
４−１もしくはその誘導体を有する大腸菌を用いて、Ｄ
ＨＦＲもしくはその誘導体を大腸菌の菌体内に発現蓄積
する場合に限定される。ｐＴＰ６４−１の誘導体として
は、ｐＴＰ７０−１、ｐＭＥＫ２、ｐＬＥＫ１、ｐＢＫ
１などを例示することができるが、ｐＴＰ６４−１由来
のプラスミドであれば、本発明が適用できると考えられ
る。
ヒドロ葉酸還元酵素遺伝子のカルボキシ末端側に異種ポ
リペプチドもしくはタンパク質が結合した融合タンパク
質をいう。また、ｐＴＰ６４−１誘導体とは、ｐＴＰ６
４−１中のｐＨＦＲ遺伝子が、ＤＨＦＲ誘導体遺伝子に
置き換えられた組換えプラスミドをいう。本発明に係わ
る組換え菌体の培養方法は、組換えプラスミドＤＴＰ６
４−１もしくはその誘導体を有する大腸菌を用いて、Ｄ
ＨＦＲもしくはその誘導体を大腸菌の菌体内に発現蓄積
する場合に限定される。ｐＴＰ６４−１の誘導体として
は、ｐＴＰ７０−１、ｐＭＥＫ２、ｐＬＥＫ１、ｐＢＫ
１などを例示することができるが、ｐＴＰ６４−１由来
のプラスミドであれば、本発明が適用できると考えられ
る。
【０００６】次に、本発明の菌体の培養方法は、培養す
る温度を３０℃もしくはそれ以下の温度を用いて一度培
養した後、温度を３７℃もしくはその以上で４２℃以下
の温度に高めて更に１から３時間培養することに特徴を
有する。用いられる培地として、実施例では、ＹＴ培地
を利用した例を示すが、他の培地でも同様な結果が示さ
れており、本発明は用いられる培地の組成には制限され
ない。
る温度を３０℃もしくはそれ以下の温度を用いて一度培
養した後、温度を３７℃もしくはその以上で４２℃以下
の温度に高めて更に１から３時間培養することに特徴を
有する。用いられる培地として、実施例では、ＹＴ培地
を利用した例を示すが、他の培地でも同様な結果が示さ
れており、本発明は用いられる培地の組成には制限され
ない。
【０００７】本発明の培養方法を用いることにより、菌
体中のＤＨＦＲもしくはＤＨＦＲ誘導体の含量は、３０
℃の一定温度で培養した場合の約３倍、３７℃の一定温
度で培養した場合の約２倍増大する。
体中のＤＨＦＲもしくはＤＨＦＲ誘導体の含量は、３０
℃の一定温度で培養した場合の約３倍、３７℃の一定温
度で培養した場合の約２倍増大する。
【０００８】本発明の実施例で述べられるように、大腸
菌の培養は好気的な振とう培養法が用いられるが、通気
培養との有為な差を認めることはできない。従って、本
発明の培養方法は、振とうもしくは通気などの好気的条
件の作成方法には制限されない。
菌の培養は好気的な振とう培養法が用いられるが、通気
培養との有為な差を認めることはできない。従って、本
発明の培養方法は、振とうもしくは通気などの好気的条
件の作成方法には制限されない。
【０００９】本発明に関する菌体中のＤＨＦＲの含有量
の測定は、破砕菌体から得られる無細胞抽出液中のＤＨ
ＦＲが示す酵素活性を測定することにより行う。ＤＨＦ
Ｒ酵素活性は，反応液 （０．０５ｍＭのジヒドロ葉
酸、０．０６ｍＭのＮＡＤＰＨ、１２ｍＭの２−メルカ
プトエタノ−ル、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０））を、１ｍｌのキュベットとり、これに酵素液を加
え、分光光度計をもちいて、３４０ｎｍの吸光度の時間
変化を３０℃で測定することにより行う。酵素１ユニッ
トは、上記反応条件において、１分間に１マイクロモル
のジヒドロ葉酸を還元するのに必要な酵素量として定義
する。この測定は、分光光度計を用いて容易に行うこと
ができる。
の測定は、破砕菌体から得られる無細胞抽出液中のＤＨ
ＦＲが示す酵素活性を測定することにより行う。ＤＨＦ
Ｒ酵素活性は，反応液 （０．０５ｍＭのジヒドロ葉
酸、０．０６ｍＭのＮＡＤＰＨ、１２ｍＭの２−メルカ
プトエタノ−ル、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０））を、１ｍｌのキュベットとり、これに酵素液を加
え、分光光度計をもちいて、３４０ｎｍの吸光度の時間
変化を３０℃で測定することにより行う。酵素１ユニッ
トは、上記反応条件において、１分間に１マイクロモル
のジヒドロ葉酸を還元するのに必要な酵素量として定義
する。この測定は、分光光度計を用いて容易に行うこと
ができる。
【００１０】本発明に用いられる試薬、装置等は、特に
限定して記載した以外、通常の市販品を利用することが
できる。また、ここに記載した種々の操作は、この分野
の当業者であれば、なんの問題もなく再現よく行うこと
ができる。なお、用いられる市販の試薬品は、特級以上
の品質が要求される。
限定して記載した以外、通常の市販品を利用することが
できる。また、ここに記載した種々の操作は、この分野
の当業者であれば、なんの問題もなく再現よく行うこと
ができる。なお、用いられる市販の試薬品は、特級以上
の品質が要求される。
【００１１】
【実施例】次に本発明の実施例をしめす。 実施例１ ｐＴＰ６４−１を含有する大腸菌（特許第１５６７５０
９号、微工研寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−５４５１）を、
５０ｍｌのＹＴ＋Ａｐ培地（培地１ｌ中に，５ｇのＮａ
Ｃｌ、５ｇの酵母エキス、８ｇのトリプトン、及び５０
ｍｇのアンピシリンナトリウムを含む液体培地）を用い
て、２６℃、３０℃、及び３７℃でクレットユニットが
約１００になるまで培養する（対数成長期の後期）。そ
の後、一時間おきにクレットユニットを測定し、同時に
培養液を１ｍｌ分取し、エッペンドルフの遠心チューブ
にいれ、遠心分離することにより菌体を沈澱として集め
る。菌体を０．２ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）に懸濁し、音波破砕法で菌体を破砕する。これ
を遠心分離し、無細胞抽出液を調製する。無細胞抽出液
中のＤＨＦＲ活性を測定する。得られたＤＨＦＲ活性の
値を用いた菌体のクレットユニット（この値は菌体培養
液中の菌体数に比例する。）の値で割った値を求める。
この値は、培養菌体中のＤＨＦＲ量を表す。また、同様
にして、３０℃で培養したクレットユニットが約１００
になるまで培養した後、３７もしくは４２℃に温度を上
げた菌体に関しても同様に測定する。その結果を以下の
表に示す。３０℃から３７もしくは４２℃に温度を上
げ、３時間培養することにより約２もしくは３倍ＤＨＦ
Ｒ生産量が増大した。３０℃から３７℃に温度を上げた
場合、３７℃で培養を続けた場合より約５０％生産量が
増大した。また、４２℃に上げた場合は、更に増大し
た。 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 培養温度 クレットユニット 菌体の成長度 ＤＨＦＲ活性 が１００以降の （クレットユニット）（活性ユニット／クレット 培養時間（時間） ユニット） −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− ２６℃ ０ ９５ ０．７ １ １３０ ０．８ ２ １５０ ０．７ ３ １５５ ０．９ ３０℃ ０ １０５ １．１ １ １４０ １．３ ２ １５５ １．１ ３ １５５ １．２ ３７℃ ０ １００ １．６ １ １５０ １．４ ２ １６０ １．６ ３ １６５ １．５ ３０−＞３７℃ ０ １０５ １．１ １ １４０ １．４ ２ １６０ １．８ ３ １６０ ２．２ ３０−＞４２℃ ０ １０５ １．１ １ １５０ ２．６ ２ １５５ ３．０ ３ １５５ ３．２ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
９号、微工研寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−５４５１）を、
５０ｍｌのＹＴ＋Ａｐ培地（培地１ｌ中に，５ｇのＮａ
Ｃｌ、５ｇの酵母エキス、８ｇのトリプトン、及び５０
ｍｇのアンピシリンナトリウムを含む液体培地）を用い
て、２６℃、３０℃、及び３７℃でクレットユニットが
約１００になるまで培養する（対数成長期の後期）。そ
の後、一時間おきにクレットユニットを測定し、同時に
培養液を１ｍｌ分取し、エッペンドルフの遠心チューブ
にいれ、遠心分離することにより菌体を沈澱として集め
る。菌体を０．２ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）に懸濁し、音波破砕法で菌体を破砕する。これ
を遠心分離し、無細胞抽出液を調製する。無細胞抽出液
中のＤＨＦＲ活性を測定する。得られたＤＨＦＲ活性の
値を用いた菌体のクレットユニット（この値は菌体培養
液中の菌体数に比例する。）の値で割った値を求める。
この値は、培養菌体中のＤＨＦＲ量を表す。また、同様
にして、３０℃で培養したクレットユニットが約１００
になるまで培養した後、３７もしくは４２℃に温度を上
げた菌体に関しても同様に測定する。その結果を以下の
表に示す。３０℃から３７もしくは４２℃に温度を上
げ、３時間培養することにより約２もしくは３倍ＤＨＦ
Ｒ生産量が増大した。３０℃から３７℃に温度を上げた
場合、３７℃で培養を続けた場合より約５０％生産量が
増大した。また、４２℃に上げた場合は、更に増大し
た。 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 培養温度 クレットユニット 菌体の成長度 ＤＨＦＲ活性 が１００以降の （クレットユニット）（活性ユニット／クレット 培養時間（時間） ユニット） −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− ２６℃ ０ ９５ ０．７ １ １３０ ０．８ ２ １５０ ０．７ ３ １５５ ０．９ ３０℃ ０ １０５ １．１ １ １４０ １．３ ２ １５５ １．１ ３ １５５ １．２ ３７℃ ０ １００ １．６ １ １５０ １．４ ２ １６０ １．６ ３ １６５ １．５ ３０−＞３７℃ ０ １０５ １．１ １ １４０ １．４ ２ １６０ １．８ ３ １６０ ２．２ ３０−＞４２℃ ０ １０５ １．１ １ １５０ ２．６ ２ １５５ ３．０ ３ １５５ ３．２ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
【００１２】実施例２ 同様の実験を、ｐＴＰ７０−１、ｐＭＥＫ２、ｐＬＥＫ
１及びｐＢＫ１を含有する大腸菌について行った。結果
を以下の表に示す。この表においては、温度を上げて
（３０−＞４２℃及び３０−＞３７℃）３時間後にどの
くらいＤＨＦＲ活性が増大するかを示している。いずれ
の場合も、温度が上昇することにより、ＤＨＦＲ生産の
顕著な増大が認められた。 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− プラスミド ＤＨＦＲ活性の増大（倍） −−−−−−−−−−−−−−−−− ３０−＞３７℃ ３０−＞４２℃ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− ｐＴＰ７０−１ １．７ ２．８ ｐＭＥＫ２ １．５ ２．５ ｐＬＥＫ１ １．５ ３．０ ｐＢＫ１ １．８ ３．１ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
１及びｐＢＫ１を含有する大腸菌について行った。結果
を以下の表に示す。この表においては、温度を上げて
（３０−＞４２℃及び３０−＞３７℃）３時間後にどの
くらいＤＨＦＲ活性が増大するかを示している。いずれ
の場合も、温度が上昇することにより、ＤＨＦＲ生産の
顕著な増大が認められた。 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− プラスミド ＤＨＦＲ活性の増大（倍） −−−−−−−−−−−−−−−−− ３０−＞３７℃ ３０−＞４２℃ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− ｐＴＰ７０−１ １．７ ２．８ ｐＭＥＫ２ １．５ ２．５ ｐＬＥＫ１ １．５ ３．０ ｐＢＫ１ １．８ ３．１ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
【００１３】
【発明の効果】本発明に従えば、ＤＨＦＲもしくはＤＨ
ＦＲ誘導体の大腸菌での生産効率を２ないし３倍向上さ
せることができる。また、ｐＴＰ６４−１の誘導体のプ
ラスミドを含有する大腸菌においては、培養温度が３７
℃程度であっても成長できないものがある。そのような
場合でも成長できる温度で対数成長期の後期にまで培養
してから、３７℃もしくは４２℃などの温度にすること
によって組換えタンパク質の生産効率を高めることが可
能となる。
ＦＲ誘導体の大腸菌での生産効率を２ないし３倍向上さ
せることができる。また、ｐＴＰ６４−１の誘導体のプ
ラスミドを含有する大腸菌においては、培養温度が３７
℃程度であっても成長できないものがある。そのような
場合でも成長できる温度で対数成長期の後期にまで培養
してから、３７℃もしくは４２℃などの温度にすること
によって組換えタンパク質の生産効率を高めることが可
能となる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (1)
- 【請求項１】 組換えプラスミドｐＴＰ６４−１または
ｐＴＰ６４−１中のジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子が、ジ
ヒドロ葉酸還元酵素のカルボキシ末端側に異種ポリペプ
チドもしくはタンパク質が結合した融合タンパク質を暗
号化するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子融合体に置き換え
られたｐＴＰ６４−１誘導体を有する大腸菌の培養を行
う際に、培養する温度を３０℃もしくはそれ以下の温度
を用いて対数成長期の後期にまで培養した後、温度を３
７℃もしくはそれ以上で４２℃以下の温度に高め、更に
１から３時間培養することにより、ジヒドロ葉酸還元酵
素またはジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子のカルボキシ末端
側に異種ポリペプチドもしくはタンパク質が結合した融
合タンパク質を効率よく菌体内に発現蓄積させることを
特徴とする組換え菌体の培養方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25046091A JPH0771482B2 (ja) | 1991-09-03 | 1991-09-03 | 組換え菌体の培養方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25046091A JPH0771482B2 (ja) | 1991-09-03 | 1991-09-03 | 組換え菌体の培養方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05199866A JPH05199866A (ja) | 1993-08-10 |
| JPH0771482B2 true JPH0771482B2 (ja) | 1995-08-02 |
Family
ID=17208208
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25046091A Expired - Lifetime JPH0771482B2 (ja) | 1991-09-03 | 1991-09-03 | 組換え菌体の培養方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0771482B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE602004029868D1 (de) * | 2003-03-05 | 2010-12-16 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | Verfahren zur herstellung eines heterologen proteins in e. coli |
-
1991
- 1991-09-03 JP JP25046091A patent/JPH0771482B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05199866A (ja) | 1993-08-10 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |