JPH0771471B2 - 経口用チフス生ワクチンを調製するための培養方法 - Google Patents
経口用チフス生ワクチンを調製するための培養方法Info
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- JPH0771471B2 JPH0771471B2 JP3226192A JP22619291A JPH0771471B2 JP H0771471 B2 JPH0771471 B2 JP H0771471B2 JP 3226192 A JP3226192 A JP 3226192A JP 22619291 A JP22619291 A JP 22619291A JP H0771471 B2 JPH0771471 B2 JP H0771471B2
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、経口用チフス生ワクチ
ンの調製のための培養方法、詳しくは、培養後の細菌細
胞の収量を増加させ、凍結乾燥後に免疫活性があり、弱
毒化された、生きている菌の生存率を高めるために、新
規な生育培地、保護培地および制御された培養温度を使
用する培養方法に関する。
ンの調製のための培養方法、詳しくは、培養後の細菌細
胞の収量を増加させ、凍結乾燥後に免疫活性があり、弱
毒化された、生きている菌の生存率を高めるために、新
規な生育培地、保護培地および制御された培養温度を使
用する培養方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙ
ｐｈｉ）として知られている病原菌である腸チフスは通
常、汚染された水あるいは食物、混雑した場所での人と
の接触により感染する。腸チフスの予防のため、非経口
用の死菌ワクチンあるいは経口用の生ワクチンが通常使
用される。今日、死菌ワクチンはその高い安全性にもか
かわらず、所望の効果的な免疫活性を示さないので、生
ワクチンの使用が徐々に増加している。生ワクチンの調
製方法は死菌ワクチンの調製方法とは異なる。死菌ワク
チンは以下の工程： ｉ）液体培地あるいは固形培地中でチフス菌を培養し、 ｉｉ）アセトン、フェノールあるいはホルマリンを使用
して殺菌し、そして ｉｉｉ）製剤すること により調製されるが、生ワクチンは以下の知られている
工程： ｉ）液体培地あるいは固形培地中でチフス菌の弱毒化変
異株を培養し、 ｉｉ）遠心分離および凍結乾燥し、そして ｉｉｉ）製剤すること により調製される。
ｐｈｉ）として知られている病原菌である腸チフスは通
常、汚染された水あるいは食物、混雑した場所での人と
の接触により感染する。腸チフスの予防のため、非経口
用の死菌ワクチンあるいは経口用の生ワクチンが通常使
用される。今日、死菌ワクチンはその高い安全性にもか
かわらず、所望の効果的な免疫活性を示さないので、生
ワクチンの使用が徐々に増加している。生ワクチンの調
製方法は死菌ワクチンの調製方法とは異なる。死菌ワク
チンは以下の工程： ｉ）液体培地あるいは固形培地中でチフス菌を培養し、 ｉｉ）アセトン、フェノールあるいはホルマリンを使用
して殺菌し、そして ｉｉｉ）製剤すること により調製されるが、生ワクチンは以下の知られている
工程： ｉ）液体培地あるいは固形培地中でチフス菌の弱毒化変
異株を培養し、 ｉｉ）遠心分離および凍結乾燥し、そして ｉｉｉ）製剤すること により調製される。
【０００３】生ワクチンの生産のためには、Ｒ．Ｇｅｒ
ｍａｎｉｅｒおよびＥ．Ｆｕｒｅｒにより腸チフス菌
（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２株から２
段階の変異処理により単離された弱毒化腸チフス変異株
Ｔｙ２１ａが通常使用されている。そのような変異株の
特徴は、細菌の細胞膜内のリポポリサッカロイドの形成
において必要な中間体であるウリジン−ガラクトース２
リン酸−４−エピメラーゼの酵素活性を欠いている。従
って、不完全な細胞膜しか形成されないのでそのような
変異株は事実上毒性がない。
ｍａｎｉｅｒおよびＥ．Ｆｕｒｅｒにより腸チフス菌
（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２株から２
段階の変異処理により単離された弱毒化腸チフス変異株
Ｔｙ２１ａが通常使用されている。そのような変異株の
特徴は、細菌の細胞膜内のリポポリサッカロイドの形成
において必要な中間体であるウリジン−ガラクトース２
リン酸−４−エピメラーゼの酵素活性を欠いている。従
って、不完全な細胞膜しか形成されないのでそのような
変異株は事実上毒性がない。
【０００４】しかし、そのような変異株はガラクトース
の存在下においてリポポリサッカロイドを合成すること
により顕著な免疫効果を表す。そしてガラクトースが過
剰に供給されるとガラクトース−１−リン酸およびＵＤ
Ｐ−ガラクトースの形で蓄積され、細菌の溶菌を引き起
こす。Ｒ．Ｇｅｒｍａｎｉｅｒらは、Ｔｙ２１ａ株の変
異、培養および製剤に関して、１９７２年１２月２４日
発行の米国特許第３，８５６，９３５号を取得した。以
下は、この特許明細書において開示されたチフスワクチ
ンの調製法である。
の存在下においてリポポリサッカロイドを合成すること
により顕著な免疫効果を表す。そしてガラクトースが過
剰に供給されるとガラクトース−１−リン酸およびＵＤ
Ｐ−ガラクトースの形で蓄積され、細菌の溶菌を引き起
こす。Ｒ．Ｇｅｒｍａｎｉｅｒらは、Ｔｙ２１ａ株の変
異、培養および製剤に関して、１９７２年１２月２４日
発行の米国特許第３，８５６，９３５号を取得した。以
下は、この特許明細書において開示されたチフスワクチ
ンの調製法である。
【０００５】選択された変異株Ｔｙ２１ａが振盪機上で
３７℃において６時間、脳−心臓浸出物中で培養され
た。細菌は６，０００ｇの遠心分離により回収され、８
％蔗糖、１．５％ゼラチンおよび５％ スキムミルク粉
末を含む液体保護培地中に懸濁された。懸濁液はバイア
ル中で凍結乾燥された後、バイアルのうちの一つを開け
ることにより細菌が調製され、栄養寒天の傾斜培養基へ
の接種により３７℃において培養された。細菌は生理食
塩水中に懸濁され、懸濁液は６００ｍｌの栄養培地への
接種材料として使用された。この栄養培地は、２８ｇの
カゼイン加水分解物、１０ｇの酵母抽出物および２ｇの
グルコースを１リットルの蒸留水に溶解してｐＨ７．２
に調整することにより調製された。
３７℃において６時間、脳−心臓浸出物中で培養され
た。細菌は６，０００ｇの遠心分離により回収され、８
％蔗糖、１．５％ゼラチンおよび５％ スキムミルク粉
末を含む液体保護培地中に懸濁された。懸濁液はバイア
ル中で凍結乾燥された後、バイアルのうちの一つを開け
ることにより細菌が調製され、栄養寒天の傾斜培養基へ
の接種により３７℃において培養された。細菌は生理食
塩水中に懸濁され、懸濁液は６００ｍｌの栄養培地への
接種材料として使用された。この栄養培地は、２８ｇの
カゼイン加水分解物、１０ｇの酵母抽出物および２ｇの
グルコースを１リットルの蒸留水に溶解してｐＨ７．２
に調整することにより調製された。
【０００６】そして次に培養物は、同じ栄養培地２５リ
ットル中に移され、接種後１分あたり５リットルの率で
通気しながら１２時間３７℃に置かれた。培養後、細菌
細胞は６，０００ｇの遠心分離により回収され、そして
前記の液体保護培地に懸濁され、そしてバイアル中で凍
結乾燥された。しかし、環境の変化に対する抵抗性が弱
いためＴｙ２１ａ株は凍結乾燥中に容易に死滅するの
で、前記の方法に従って培養された細菌は凍結乾燥後に
わずかしか生きていなかった。
ットル中に移され、接種後１分あたり５リットルの率で
通気しながら１２時間３７℃に置かれた。培養後、細菌
細胞は６，０００ｇの遠心分離により回収され、そして
前記の液体保護培地に懸濁され、そしてバイアル中で凍
結乾燥された。しかし、環境の変化に対する抵抗性が弱
いためＴｙ２１ａ株は凍結乾燥中に容易に死滅するの
で、前記の方法に従って培養された細菌は凍結乾燥後に
わずかしか生きていなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、培養
後の細菌細胞の収量を増加させ、凍結乾燥後に免疫学的
に活性な、弱毒化された生きている菌の生存率を高める
ために、新規な生育培地、保護培地および制御された培
養温度を使用する、改良された培養方法を提供すること
である。本発明において調製された生育培地は培養温度
を制御することにより細菌が効果的に生育し、そして環
境の変化に容易に適応するように意図されている。そし
て、本発明において調製された保護培地は細菌が凍結乾
燥の間の急速な凍結に耐え得るように、そして凍結乾燥
細菌が特性を変えることなく長期間保存されうるように
意図されている。そして、新しい生育培地および保護培
地を使用した培養方法によって得られた経口用チフスワ
クチンは、弱毒化した細菌の生存率が高く、腸チフスに
対する免疫活性が高い。
後の細菌細胞の収量を増加させ、凍結乾燥後に免疫学的
に活性な、弱毒化された生きている菌の生存率を高める
ために、新規な生育培地、保護培地および制御された培
養温度を使用する、改良された培養方法を提供すること
である。本発明において調製された生育培地は培養温度
を制御することにより細菌が効果的に生育し、そして環
境の変化に容易に適応するように意図されている。そし
て、本発明において調製された保護培地は細菌が凍結乾
燥の間の急速な凍結に耐え得るように、そして凍結乾燥
細菌が特性を変えることなく長期間保存されうるように
意図されている。そして、新しい生育培地および保護培
地を使用した培養方法によって得られた経口用チフスワ
クチンは、弱毒化した細菌の生存率が高く、腸チフスに
対する免疫活性が高い。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明による詳細な培養
法を以下に説明する。経口用のチフスワクチンの調製の
ためのチフス株は、寄託番号ＡＴＣＣ−３３４５９とし
てＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌ
ｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託され、そして寄託番
号ＫＣＴＣ−２４２５としてＫｏｒｅａ Ｉｎｓｔｉｔ
ｕｔｅ ｏｆＳｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ（ＫＩＳＴ）に寄託されている、腸チフスの弱毒
化変異株Ｔｙ２１ａである。上記寄託されたチフス株
は、脳−心臓浸出物寒天により構成されている蘇生培地
を用い、市販品である”Ｖｉｖｏｔｉｆ Ｂｅｒｎａ”
［Ｓｗｉｓｓ Ｓｅｒｕｍ ＆ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｎ
ｓｔｉｔｕｔｅ Ｂｅｒｎｅから販売されている］をシ
ングルコロニーとして蘇生させることによっても得るこ
とができる。上記チフス株のシングルコロニーから単離
された接種用細菌を１００ｍｌの脳−心臓浸出物（ＢＨ
Ｉ）培地中に接種し、そして接種した株を振盪機上で１
８時間３０℃において培養した。培養液を６，０００ｇ
で１０分間遠心分離することにより、細菌を回収し、保
護培地に懸濁した。保護培地は８％ 乳糖、１％ カル
ボキシメチルセルロース、５％ スキムミルク、０．２
％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、および１％ グルタミン酸１
ナトリウムを含む。上記懸濁液をアンプル中で凍結乾燥
した。生きているワクチンを生産する前に、凍結乾燥し
たアンプルを４−８℃において貯蔵した。
法を以下に説明する。経口用のチフスワクチンの調製の
ためのチフス株は、寄託番号ＡＴＣＣ−３３４５９とし
てＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌ
ｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託され、そして寄託番
号ＫＣＴＣ−２４２５としてＫｏｒｅａ Ｉｎｓｔｉｔ
ｕｔｅ ｏｆＳｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ（ＫＩＳＴ）に寄託されている、腸チフスの弱毒
化変異株Ｔｙ２１ａである。上記寄託されたチフス株
は、脳−心臓浸出物寒天により構成されている蘇生培地
を用い、市販品である”Ｖｉｖｏｔｉｆ Ｂｅｒｎａ”
［Ｓｗｉｓｓ Ｓｅｒｕｍ ＆ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｎ
ｓｔｉｔｕｔｅ Ｂｅｒｎｅから販売されている］をシ
ングルコロニーとして蘇生させることによっても得るこ
とができる。上記チフス株のシングルコロニーから単離
された接種用細菌を１００ｍｌの脳−心臓浸出物（ＢＨ
Ｉ）培地中に接種し、そして接種した株を振盪機上で１
８時間３０℃において培養した。培養液を６，０００ｇ
で１０分間遠心分離することにより、細菌を回収し、保
護培地に懸濁した。保護培地は８％ 乳糖、１％ カル
ボキシメチルセルロース、５％ スキムミルク、０．２
％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、および１％ グルタミン酸１
ナトリウムを含む。上記懸濁液をアンプル中で凍結乾燥
した。生きているワクチンを生産する前に、凍結乾燥し
たアンプルを４−８℃において貯蔵した。
【０００９】アンプルを開けることにより細菌を調製
し、そしてＢＨＩ培地に接種した。接種培養のために、
接種した細菌を振盪機上で３０℃において１８時間培養
した。こうして得られた接種細菌を３７ｇのＢＨＩ、５
ｇのＬ−リジン、３０ｇのソルビトール、１．５ｇのＫ
2ＨＰＯ4、０．５ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、および１リ
ットルの蒸留水からなるｐＨ７．０に調整した本培養の
ための生産生育培地に接種した。大量生産の場合、生産
培地から得られた培養液を２５０リットルの発酵装置に
接種することができる。本培養の間、本発明の主要な特
徴の一つとして凍結乾燥の間の急激な温度の変化に完全
に耐えるように、培養温度を変える必要がある。本培養
の間の培養温度はｉ）最初の６時間が３０℃、ｉｉ）次
の２時間が２５℃、そしてｉｉｉ）最後の１４時間が２
０℃であった。発酵装置内の通気は０．５ＶＶｍ（体積
／体積／分）に保持した。培養終了後、細菌細胞を６，
０００ｇで冷却遠心により回収し、前記保護培地に０−
４℃において２時間懸濁した。そして懸濁液を冷却乾燥
機において凍結乾燥した。最後に、１グラムあたりの生
菌数を２．５×１０10にするために、凍結乾燥した細菌
を乳糖と混合し、そして調製されたワクチンを各カプセ
ルあたり０．２ｇの量になるようにしてカプセルに充填
し、そして経口投与のために腸溶性のコーティングを施
すことによりカプセルを作った。
し、そしてＢＨＩ培地に接種した。接種培養のために、
接種した細菌を振盪機上で３０℃において１８時間培養
した。こうして得られた接種細菌を３７ｇのＢＨＩ、５
ｇのＬ−リジン、３０ｇのソルビトール、１．５ｇのＫ
2ＨＰＯ4、０．５ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、および１リ
ットルの蒸留水からなるｐＨ７．０に調整した本培養の
ための生産生育培地に接種した。大量生産の場合、生産
培地から得られた培養液を２５０リットルの発酵装置に
接種することができる。本培養の間、本発明の主要な特
徴の一つとして凍結乾燥の間の急激な温度の変化に完全
に耐えるように、培養温度を変える必要がある。本培養
の間の培養温度はｉ）最初の６時間が３０℃、ｉｉ）次
の２時間が２５℃、そしてｉｉｉ）最後の１４時間が２
０℃であった。発酵装置内の通気は０．５ＶＶｍ（体積
／体積／分）に保持した。培養終了後、細菌細胞を６，
０００ｇで冷却遠心により回収し、前記保護培地に０−
４℃において２時間懸濁した。そして懸濁液を冷却乾燥
機において凍結乾燥した。最後に、１グラムあたりの生
菌数を２．５×１０10にするために、凍結乾燥した細菌
を乳糖と混合し、そして調製されたワクチンを各カプセ
ルあたり０．２ｇの量になるようにしてカプセルに充填
し、そして経口投与のために腸溶性のコーティングを施
すことによりカプセルを作った。
【００１０】本発明を、以下の実施例においてより詳細
に説明する。しかし、これらの実施例はあくまで例示で
あり、本発明の範囲を限定するものでない。
に説明する。しかし、これらの実施例はあくまで例示で
あり、本発明の範囲を限定するものでない。
【００１１】
実施例 １ ＡＴＣＣ−３３４５９，ＫＣＴＣ−２４２５あるいはＶ
ｉｖｏｔｉｆ Ｂｅｒｎａからの腸チフス弱毒化変異株
Ｔｙ２１ａを１００ｍｌのＢＨＩ培地に接種し、そして
振盪機上で３０℃において１８時間培養し、そして遠心
分離により回収された細菌をアンプル中で凍結乾燥し
た。接種用の凍結乾燥細菌を３７ｇのＢＨＩ、５ｇのＬ
−リジン、３０ｇのソルビトール、１．５ｇのＫ2ＨＰ
Ｏ4、０．５ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、および１リット
ルの蒸留水からなるｐＨ７．０に調整した、本培養用の
生育培地に接種した。
ｉｖｏｔｉｆ Ｂｅｒｎａからの腸チフス弱毒化変異株
Ｔｙ２１ａを１００ｍｌのＢＨＩ培地に接種し、そして
振盪機上で３０℃において１８時間培養し、そして遠心
分離により回収された細菌をアンプル中で凍結乾燥し
た。接種用の凍結乾燥細菌を３７ｇのＢＨＩ、５ｇのＬ
−リジン、３０ｇのソルビトール、１．５ｇのＫ2ＨＰ
Ｏ4、０．５ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、および１リット
ルの蒸留水からなるｐＨ７．０に調整した、本培養用の
生育培地に接種した。
【００１２】本培養を実施するために、５リットルの本
生産培地を１０リットルの発酵装置に添加した。発酵装
置の通気は３００ｒｐｍで撹拌しながら０．５ＶＶｍの
速度で行った。本培養の間の温度はｉ）最初の６時間が
３０℃、ｉｉ）次の２時間が２５℃、そしてｉｉｉ）最
後の１４時間が２０℃であった。全培養時間は２２時間
を要した。最終的に得られた培養液の特性は、ＯＤ６６
０における培養液の濁度が０．５１６×２０であり、生
菌数が１ｍｌあたり４．６×１０10であった。
生産培地を１０リットルの発酵装置に添加した。発酵装
置の通気は３００ｒｐｍで撹拌しながら０．５ＶＶｍの
速度で行った。本培養の間の温度はｉ）最初の６時間が
３０℃、ｉｉ）次の２時間が２５℃、そしてｉｉｉ）最
後の１４時間が２０℃であった。全培養時間は２２時間
を要した。最終的に得られた培養液の特性は、ＯＤ６６
０における培養液の濁度が０．５１６×２０であり、生
菌数が１ｍｌあたり４．６×１０10であった。
【００１３】実施例 ２ 本培養の間の温度をｉ）最初の６−８時間を３０℃、ｉ
ｉ）次の２−４時間を２５℃、そしてｉｉｉ）最後の１
２−１４時間を２０℃−２５℃にする以外は、実施例１
と同じ方法で培養を行った。最終的に得られた培養液の
特性は、ＯＤ６６０における培養液の濁度が０．４５２
×２０−０．５１６×２０であり、生菌数が１ｍｌあた
り３．２×１０10であった。
ｉ）次の２−４時間を２５℃、そしてｉｉｉ）最後の１
２−１４時間を２０℃−２５℃にする以外は、実施例１
と同じ方法で培養を行った。最終的に得られた培養液の
特性は、ＯＤ６６０における培養液の濁度が０．４５２
×２０−０．５１６×２０であり、生菌数が１ｍｌあた
り３．２×１０10であった。
【００１４】実施例 ３ 実施例１で得られた培養液を６，０００ｇで遠心分離
し、そして８％ 乳糖、１％ カルボキシメチルセルロ
ース、５％ スキムミルク、０．２％ ＭｇＳＯ4・７
Ｈ2Ｏ、および１％ グルタミン酸１ナトリウムからな
る２．５リットルの保護培地に懸濁した。低温に対する
抵抗性を高めるために、保護培地中の懸濁液を０−４℃
において２時間静置した。冷却乾燥機中において、抵抗
性が上昇した懸濁液を−７０℃において２時間冷凍し、
そして真空状態において１２時間乾燥した。凍結乾燥後
の生菌数は１グラムあたり６．８×１０10であった。
し、そして８％ 乳糖、１％ カルボキシメチルセルロ
ース、５％ スキムミルク、０．２％ ＭｇＳＯ4・７
Ｈ2Ｏ、および１％ グルタミン酸１ナトリウムからな
る２．５リットルの保護培地に懸濁した。低温に対する
抵抗性を高めるために、保護培地中の懸濁液を０−４℃
において２時間静置した。冷却乾燥機中において、抵抗
性が上昇した懸濁液を−７０℃において２時間冷凍し、
そして真空状態において１２時間乾燥した。凍結乾燥後
の生菌数は１グラムあたり６．８×１０10であった。
【００１５】実施例 ４ 凍結乾燥は、１％のカルボキシメチルセルロースの代わ
りに１％のゼラチンを使用して実施例３と同じ方法によ
り実行した。凍結乾燥後に得られた生菌数は１グラムあ
たり４．１×１０10であった。
りに１％のゼラチンを使用して実施例３と同じ方法によ
り実行した。凍結乾燥後に得られた生菌数は１グラムあ
たり４．１×１０10であった。
Claims (4)
- 【請求項１】 （ｉ）ＢＨＩ培地中においてチフス菌Ｔ
ｙ２１ａ株から得られた種培養菌を培養し； （ｉｉ）８％乳糖、１％カルボキシメチルセルロース、
５％スキムミルク、０．２％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏおよ
び１％グルタミン酸１ナトリウムからなる保護培地に上
記の培養された細菌を懸濁し、そして懸濁した細胞をア
ンプル中で凍結乾燥し； （ｉｉｉ）凍結乾燥した細菌を蘇生し、そして蘇生した
細菌を、３７ｇ ＢＨＩ、５ｇ Ｌ−リジン、３０ｇ
ソルビトール、１．５ｇ Ｋ2ＨＰＯ4、０．５ｇＭｇＳ
Ｏ4およびｐＨ７．０に調整した１リットルの蒸留水か
らなる生育培地に接種し； （ｉｖ）上記の蘇生した細菌を発酵装置中で培養する
が、その際、発酵装置中の培養温度を、最初の６時間を
３０℃にし、続く２時間を２５℃にし、そして最後の１
４時間を２０℃にし； （ｖ）細菌細胞を回収し； （ｖｉ）８％乳糖、１％カルボキシメチルセルロース、
５％スキムミルク、０．２％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏおよ
び１％グルタミン酸１ナトリウムからなる保護培地に上
記の細菌細胞を懸濁し；そして （ｖｉｉ）上記工程（ｖｉ）において調製された細菌を
凍結乾燥して該細菌を経口投与のために製剤化する； 工程からなる、経口用チフス生ワクチンを得るための方
法。 - 【請求項２】 保護培地中の１％カルボキシメチルセル
ロースを１％ゼラチンに置き換えることからなる、請求
項１記載の方法。 - 【請求項３】 懸濁液を０−４℃に２時間置いた後に、
−７０℃において２時間凍結し、そして真空状態におい
て１２時間乾燥しながら細菌を凍結乾燥することからな
る、請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 請求項１ないし３のいずれか１項に記載
された方法により得られた、チフス生ワクチン。
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