JPH0767641A - 酵素を安定化する方法 - Google Patents
酵素を安定化する方法Info
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- JPH0767641A JPH0767641A JP24036993A JP24036993A JPH0767641A JP H0767641 A JPH0767641 A JP H0767641A JP 24036993 A JP24036993 A JP 24036993A JP 24036993 A JP24036993 A JP 24036993A JP H0767641 A JPH0767641 A JP H0767641A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】溶液中での酵素を安定化する為の効果的且つ汎
用的方法を提供する。 【構成】溶液中の酵素にヌクレオチド及びシャペロニン
蛋白質を添加し、酵素、ヌクレオチド及びシャペロニン
蛋白質の間の特異的相互作用を利用することを特徴とす
る酵素の安定化方法。
用的方法を提供する。 【構成】溶液中の酵素にヌクレオチド及びシャペロニン
蛋白質を添加し、酵素、ヌクレオチド及びシャペロニン
蛋白質の間の特異的相互作用を利用することを特徴とす
る酵素の安定化方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、酵素が水溶液状態で活
性を維持することができる酵素の安定化方法に関する。
性を維持することができる酵素の安定化方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】酵素は、温和な条件で触媒作用を示す
為、従来より、臨床検査、食品工業等の分野で広く用い
られ、又、近年、有機合成の分野においても広く用いら
れるようになってきている。しかし、一般に酵素は不安
定であり、特に溶液中での安定性が悪く、上記利用分野
で改善が望まれていた。これまでにも酵素を安定化する
ために、グリシン、グルタミン酸ソーダ等のアミノ酸、
アルブミン、ゼラチン等の蛋白質、ラクトース、デキス
トラン等の糖類、グリセロール、ソルビトール等の多価
アルコールを添加する方法が種々に試みられてきた。
為、従来より、臨床検査、食品工業等の分野で広く用い
られ、又、近年、有機合成の分野においても広く用いら
れるようになってきている。しかし、一般に酵素は不安
定であり、特に溶液中での安定性が悪く、上記利用分野
で改善が望まれていた。これまでにも酵素を安定化する
ために、グリシン、グルタミン酸ソーダ等のアミノ酸、
アルブミン、ゼラチン等の蛋白質、ラクトース、デキス
トラン等の糖類、グリセロール、ソルビトール等の多価
アルコールを添加する方法が種々に試みられてきた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】酵素溶液に安定化剤を
添加する方法は、酵素の種類により、添加する安定化剤
が異なるのが一般的であり、酵素の種類により添加する
安定化剤を選択する必要があった。又、安定化剤の安定
化作用は、酵素との非特異的な相互作用によるため高濃
度に添加する必要があった。このように、溶液中の酵素
を安定化する効率的且つ汎用的な方法はなかった。
添加する方法は、酵素の種類により、添加する安定化剤
が異なるのが一般的であり、酵素の種類により添加する
安定化剤を選択する必要があった。又、安定化剤の安定
化作用は、酵素との非特異的な相互作用によるため高濃
度に添加する必要があった。このように、溶液中の酵素
を安定化する効率的且つ汎用的な方法はなかった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、溶液中で
酵素を安定化する効率的且つ汎用的方法を求め鋭意検討
した。そして、酵素溶液中にシャペロニン蛋白質及びヌ
クレオチドを添加することにより、効率的且つ汎用的に
酵素を安定化できることを知り、本発明を完成した。
酵素を安定化する効率的且つ汎用的方法を求め鋭意検討
した。そして、酵素溶液中にシャペロニン蛋白質及びヌ
クレオチドを添加することにより、効率的且つ汎用的に
酵素を安定化できることを知り、本発明を完成した。
【０００５】即ち、本発明は、酵素溶液にシャペロニン
蛋白質及びヌクレオチドを添加し、酵素とシャペロニン
蛋白質との特異的な相互作用により酵素を安定化する方
法に関する。
蛋白質及びヌクレオチドを添加し、酵素とシャペロニン
蛋白質との特異的な相互作用により酵素を安定化する方
法に関する。
【０００６】一般に、溶液中の酵素の構造は非常に柔軟
性に富んでおり、通常は大きな構造変化が起こっている
とされている〔バイオケミストリイ（Biochemistry），
27巻，346〜350頁（1988）、バイオポリマーズ（Biopol
ymers），30巻，389〜394頁（1990）〕。即ち、微視的
には溶液中の酵素の立体構造は、生理活性を持つネイテ
ィブな分子種（Ｎ）と完全に生理活性を失った変性酵素
の分子種（Ｕ）とこの２つの分子種の間に位置する変性
中間体（Ｉ）とが平衡的に存在すると考えられている。 Ｎ←−−→Ｉ←−−→Ｕ
性に富んでおり、通常は大きな構造変化が起こっている
とされている〔バイオケミストリイ（Biochemistry），
27巻，346〜350頁（1988）、バイオポリマーズ（Biopol
ymers），30巻，389〜394頁（1990）〕。即ち、微視的
には溶液中の酵素の立体構造は、生理活性を持つネイテ
ィブな分子種（Ｎ）と完全に生理活性を失った変性酵素
の分子種（Ｕ）とこの２つの分子種の間に位置する変性
中間体（Ｉ）とが平衡的に存在すると考えられている。 Ｎ←−−→Ｉ←−−→Ｕ
【０００７】溶液中の酵素が不安定で失活しやすいの
は、上記の平衡式の変性中間体（Ｉ）や変性分子（Ｕ）
が例えばアグリゲーションのような不可逆的な分子種
（Ｘ）に移行してしまいやすいからである。従って、溶
液中の酵素蛋白質を安定化するためには、上記の変性中
間体（Ｉ）や変性分子（Ｕ）をできるだけ安定に保護し
てやればよいことになる。
は、上記の平衡式の変性中間体（Ｉ）や変性分子（Ｕ）
が例えばアグリゲーションのような不可逆的な分子種
（Ｘ）に移行してしまいやすいからである。従って、溶
液中の酵素蛋白質を安定化するためには、上記の変性中
間体（Ｉ）や変性分子（Ｕ）をできるだけ安定に保護し
てやればよいことになる。
【０００８】シャペロニン蛋白質を使用すると、シャペ
ロニン蛋白質はこれら変性中間体（Ｉ）や変性分子
（Ｕ）を疎水的相互作用によって特異的に認識して結合
し、それらの分子種が不可逆的分子種（Ｘ）に変化しな
いように保護し、ヌクレオチドによってもとの活性構造
を形成するように作用することが判明した。
ロニン蛋白質はこれら変性中間体（Ｉ）や変性分子
（Ｕ）を疎水的相互作用によって特異的に認識して結合
し、それらの分子種が不可逆的分子種（Ｘ）に変化しな
いように保護し、ヌクレオチドによってもとの活性構造
を形成するように作用することが判明した。
【０００９】本発明に使用する酵素としては、動物、植
物及び微生物由来のいずれでもよく、酵素の種類として
は、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素等のいずれ
でもよい。また、酵素の分子量、１次構造、２次構造、
立体構造、４次構造（オリゴマー状態）の違いにも左右
されない。
物及び微生物由来のいずれでもよく、酵素の種類として
は、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素等のいずれ
でもよい。また、酵素の分子量、１次構造、２次構造、
立体構造、４次構造（オリゴマー状態）の違いにも左右
されない。
【００１０】本発明の対象となる酵素溶液の酵素濃度と
しては特に限定されるものではないが、例えば数μg/ml
から数mg/mlの範囲である。
しては特に限定されるものではないが、例えば数μg/ml
から数mg/mlの範囲である。
【００１１】又、シャペロニン蛋白質とは、分子シャペ
ロンのうちで大腸菌熱ショック蛋白質（GroEL）と相同
性の高い一群の蛋白質をいい、例えば葉緑体のRubisco
結合蛋白、GroE蛋白、真核生物ミトコンドリア（mt）の
Hsp60等が挙げられる。これらは蛋白質の構造形成過程
に関する研究により明らかにされてきた蛋白質であり、
蛋白質の折り畳み、サブユニットの集合及び構造変化の
ときに他の蛋白質と間違った相互作用をしないように働
き、自分自身は、最終的に出来上がった蛋白質の構成要
素とはならないという、蛋白質の大きな構造変化、構造
形成の際の介添え蛋白質であり、このシャペロニン蛋白
質のひとつがGroEである。GroEはATPase活性を持ってい
る。本発明には上記のシャペロニン蛋白質が用いられ、
好適にはGroEが用いられる。
ロンのうちで大腸菌熱ショック蛋白質（GroEL）と相同
性の高い一群の蛋白質をいい、例えば葉緑体のRubisco
結合蛋白、GroE蛋白、真核生物ミトコンドリア（mt）の
Hsp60等が挙げられる。これらは蛋白質の構造形成過程
に関する研究により明らかにされてきた蛋白質であり、
蛋白質の折り畳み、サブユニットの集合及び構造変化の
ときに他の蛋白質と間違った相互作用をしないように働
き、自分自身は、最終的に出来上がった蛋白質の構成要
素とはならないという、蛋白質の大きな構造変化、構造
形成の際の介添え蛋白質であり、このシャペロニン蛋白
質のひとつがGroEである。GroEはATPase活性を持ってい
る。本発明には上記のシャペロニン蛋白質が用いられ、
好適にはGroEが用いられる。
【００１２】GroEは大量発現系の大腸菌DH1/pKY206の粗
抽出液から硫酸アンモニウム沈降、ゲル濾過、陰イオン
交換クロマトグラフィーによって単一に精製され〔ジャ
ーナル オブ バイオロジカル ケミストリ（J. Biol.
Chem.），267巻，17773-17779頁（1992）〕、本発明に
使用される。もちろんその精製度合いは、本発明である
酵素溶液を安定化させる効果が発揮される程度であれば
よく、その添加量としては特に限定されないが通常、酵
素の２〜５倍モル濃度で使用する。
抽出液から硫酸アンモニウム沈降、ゲル濾過、陰イオン
交換クロマトグラフィーによって単一に精製され〔ジャ
ーナル オブ バイオロジカル ケミストリ（J. Biol.
Chem.），267巻，17773-17779頁（1992）〕、本発明に
使用される。もちろんその精製度合いは、本発明である
酵素溶液を安定化させる効果が発揮される程度であれば
よく、その添加量としては特に限定されないが通常、酵
素の２〜５倍モル濃度で使用する。
【００１３】また、本発明に使用するヌクレオチドとし
ては、GroEにより分解されず、GroEと相互作用をするヌ
クレオチドであればいずれでもよく、例えばADP、5'-ア
デニリルイミド二リン酸及びアデノシン5'-o-3-チオ三
リン酸等のATP類縁体が使用される。その使用量として
は特に限定されないが、通常１〜２mMで用いられる。
ては、GroEにより分解されず、GroEと相互作用をするヌ
クレオチドであればいずれでもよく、例えばADP、5'-ア
デニリルイミド二リン酸及びアデノシン5'-o-3-チオ三
リン酸等のATP類縁体が使用される。その使用量として
は特に限定されないが、通常１〜２mMで用いられる。
【００１４】酵素、シャペロニン蛋白質、ヌクレオチド
を組み合わせて使用する場合の好適条件は酵素により変
化するが、通常の好適条件としては、酵素が数μM〜数
十μM、シャペロニン蛋白質（GroELとGroES）は酵素サ
ブユニットに対して５倍モル量、ヌクレオチド（ADP）
は２mMの条件である。
を組み合わせて使用する場合の好適条件は酵素により変
化するが、通常の好適条件としては、酵素が数μM〜数
十μM、シャペロニン蛋白質（GroELとGroES）は酵素サ
ブユニットに対して５倍モル量、ヌクレオチド（ADP）
は２mMの条件である。
【００１５】また、安定化する酵素溶液としては、10mM
〜20mM程度のカリウムイオンやマグネシウムイオンが存
在し、pH６〜８であることが望ましい。更に１mM程度の
ジチオスレイトールを共存させることがより好適な条件
である。以下、実施例にて本発明を具体的に説明する。
〜20mM程度のカリウムイオンやマグネシウムイオンが存
在し、pH６〜８であることが望ましい。更に１mM程度の
ジチオスレイトールを共存させることがより好適な条件
である。以下、実施例にて本発明を具体的に説明する。
【００１６】
実施例１ 乳酸脱水素酵素（天野製薬製）を10mM塩化カリウム及び
10mM酢酸マグネシウムを含む50mM 3-（N-モルホリン）
プロパンスルホン酸−水酸化カリウム緩衝液（pH7.0）
に溶解し、ADPを２mMになるように加え、GroEをモル比
で乳酸脱水素酵素の５倍量加えた後、42℃で放置し、残
存酵素活性を測定した。尚、乳酸脱水素酵素は、最終濃
度が1.4μg／mlになるように溶解した。結果は図１に示
される。
10mM酢酸マグネシウムを含む50mM 3-（N-モルホリン）
プロパンスルホン酸−水酸化カリウム緩衝液（pH7.0）
に溶解し、ADPを２mMになるように加え、GroEをモル比
で乳酸脱水素酵素の５倍量加えた後、42℃で放置し、残
存酵素活性を測定した。尚、乳酸脱水素酵素は、最終濃
度が1.4μg／mlになるように溶解した。結果は図１に示
される。
【００１７】無添加及びデキストランを添加した場合の
２時間後の残存活性が約30％であるのに対してGroE及び
ADPを添加した場合は、約70％の残存活性が認められ
た。
２時間後の残存活性が約30％であるのに対してGroE及び
ADPを添加した場合は、約70％の残存活性が認められ
た。
【００１８】実施例２ ヌクレオチドとしてADPのかわりに5'-アデニリルイミド
二リン酸を用いて、実施例１と同様に行った。結果を図
２に示す。実施例１と全く同様な安定化効果が認められ
た。
二リン酸を用いて、実施例１と同様に行った。結果を図
２に示す。実施例１と全く同様な安定化効果が認められ
た。
【００１９】実施例３ グルコース脱水素酵素（天野製薬製）を用いて実施例１
と同じ方法で行った。尚、グルコース脱水素酵素は4.1
μg／mlとなるように溶解した。結果を図３に示す。
と同じ方法で行った。尚、グルコース脱水素酵素は4.1
μg／mlとなるように溶解した。結果を図３に示す。
【００２０】本酵素の安定化剤として知られている牛血
清アルブミンをGroEの代わりに添加した場合の結果も同
時に示した。
清アルブミンをGroEの代わりに添加した場合の結果も同
時に示した。
【００２１】42℃、20分後の残存活性は、無添加が約５
％、アルブミン添加が約20％、ADP及びGroE添加が約55
％であり、ADP及びGroEを添加することにより、従来の
安定化剤であるアルブミンよりも強い安定化効果が認め
られた。
％、アルブミン添加が約20％、ADP及びGroE添加が約55
％であり、ADP及びGroEを添加することにより、従来の
安定化剤であるアルブミンよりも強い安定化効果が認め
られた。
【００２２】実施例４ アスコルビン酸オキシダーゼ（天野製薬製）を用い、実
施例１と同じ方法で行った。アスコルビン酸オキシダー
ゼは最終濃度が2.7μg／mlとなるように溶解した。結果
を図４に示す。
施例１と同じ方法で行った。アスコルビン酸オキシダー
ゼは最終濃度が2.7μg／mlとなるように溶解した。結果
を図４に示す。
【００２３】本酵素は、元来、安定な酵素であるがADP
及びGroEを添加することにより、更に安定化されること
が認められた。
及びGroEを添加することにより、更に安定化されること
が認められた。
【図１】実施例１の結果を示す。図中で○はGroE及びAD
Pを添加した場合を示し、△はデキストランを添加した
場合を示し、□は無添加の場合を示す。
Pを添加した場合を示し、△はデキストランを添加した
場合を示し、□は無添加の場合を示す。
【図２】実施例２の結果を示す。図中で○はGroE及び
５’−アデニリルイミド二リン酸を添加した場合を示
し、□は無添加の場合を示す。
５’−アデニリルイミド二リン酸を添加した場合を示
し、□は無添加の場合を示す。
【図３】実施例３の結果を示す。図中で○はGroE及びAD
Pを添加した場合を示し、△は牛血清アルブミンを添加
した場合を示し、□は無添加の場合を示す。
Pを添加した場合を示し、△は牛血清アルブミンを添加
した場合を示し、□は無添加の場合を示す。
【図４】実施例４の結果を示す。図中で○はGroE及びAD
Pを添加した場合を示し、□は無添加の場合を示す。
Pを添加した場合を示し、□は無添加の場合を示す。
Claims (6)
- 【請求項１】酵素含有溶液にシャペロニン蛋白質及びヌ
クレオチドを含有せしめ、該溶液中の酵素を安定化する
方法。 - 【請求項２】酵素含有溶液にシャペロニン蛋白質、ヌク
レオチド並びにカリウムイオン及び／又はマグネシウム
イオンを含有せしめ、該溶液中の酵素を安定化する方
法。 - 【請求項３】酵素含有溶液にシャペロニン蛋白質、ヌク
レオチド及びジチオスレイトールを含有せしめ、該溶液
中の酵素を安定化する方法。 - 【請求項４】シャペロニン蛋白質がGroEである請求項１
乃至請求項３記載の酵素を安定化する方法。 - 【請求項５】ヌクレオチドがATP類縁体である請求項１
乃至請求項４記載の酵素を安定化する方法。 - 【請求項６】ATP類縁体がADP、5'−アデニリルイミド二
リン酸又はアデノシン5'-o-3-チオ三リン酸である請求
項５記載の酵素を安定化する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24036993A JPH0767641A (ja) | 1993-08-31 | 1993-08-31 | 酵素を安定化する方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24036993A JPH0767641A (ja) | 1993-08-31 | 1993-08-31 | 酵素を安定化する方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0767641A true JPH0767641A (ja) | 1995-03-14 |
Family
ID=17058472
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24036993A Pending JPH0767641A (ja) | 1993-08-31 | 1993-08-31 | 酵素を安定化する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0767641A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH1084954A (ja) * | 1996-07-25 | 1998-04-07 | Rikagaku Kenkyusho | 酵素を熱活性化する方法 |
| US7795388B2 (en) | 2001-11-08 | 2010-09-14 | The United States Of America As Represented By The Administrator Of The National Aeronautics And Space Administration (Nasa) | Versatile platform for nanotechnology based on circular permutations of chaperonin protein |
| US7816491B2 (en) | 2001-11-08 | 2010-10-19 | The United States Of America As Represented By The Administrator Of The National Aeronautics And Space Administration | Ordered biological nanostructures formed from chaperonin polypeptides |
-
1993
- 1993-08-31 JP JP24036993A patent/JPH0767641A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH1084954A (ja) * | 1996-07-25 | 1998-04-07 | Rikagaku Kenkyusho | 酵素を熱活性化する方法 |
| US7795388B2 (en) | 2001-11-08 | 2010-09-14 | The United States Of America As Represented By The Administrator Of The National Aeronautics And Space Administration (Nasa) | Versatile platform for nanotechnology based on circular permutations of chaperonin protein |
| US7816491B2 (en) | 2001-11-08 | 2010-10-19 | The United States Of America As Represented By The Administrator Of The National Aeronautics And Space Administration | Ordered biological nanostructures formed from chaperonin polypeptides |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040608 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20041019 |