JP6267285B2 - 治療用組換えグリシンn−アシルトランスフェラーゼ - Google Patents
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Description
素的に活性な組換えグリシンN−アシルトランスフェラーゼ(GLYAT(E.C.2.
3.1.13))を生産する方法に関する。
イドホルモンなどのいくつかの内因性の代謝産物、および食物中の化合物または工業用化
学物質を含み得る外因性毒素の毒性を減少させる。
って代謝産物を活性化する。第I相解毒により生成される活性化された化合物は、もとの
代謝産物より反応性および毒性が高いことが多く、第II相解毒系によってさらに処理さ
れる。第II相解毒において、様々な抱合反応が、尿および胆汁中への排泄のために、活
性化された化合物をより低毒性かつより可溶性にするように働く。第III相解毒は、細
胞からの毒素の排出を伴う。
定の代謝酵素の欠損は、ヒトの体内に高いレベルで通常存在しない酸の蓄積を引き起こす
。いくつかの既知の有機酸血症があり、メチルマロン酸血症、プロピオン酸血症、イソ吉
草酸血症、グルタル酸尿症およびメープルシロップ尿症がいくつかの一般的な例である。
ゲナーゼの欠損によって引き起こされる。この酵素の欠損は、イソ吉草酸、3−および4
−ヒドロキシイソ吉草酸、イソバレリルカルニチンならびにイソバレリルグリシンを含む
、ロイシン異化の中間体の蓄積をもたらす。
トランスフェラーゼ(GLYAT)によって形成される。イソバレリルグリシンは、イソ
吉草酸より低毒性であり、イソ吉草酸血症の治療においてグリシン抱合が決定的に重要で
あることを示している。
によって引き起こされる遺伝的障害である。尿素回路異常症において、窒素はアンモニア
の形態で蓄積し、高アンモニア血症をもたらし、これは最終的に、回復不能な脳損傷、昏
睡および/または死を引き起こす。
リシンサプリメントの投与である。しかしながら、肝臓試料についてのアッセイは、ヒト
のグリシン抱合能力には大きな変動性があることを示している。
益と思われるだけでなく、さらに、有機酸血症、尿素回路異常症、アミノ酸尿症、および
いくつかの生体異物化学物質への曝露の影響を受けている個体のための代替の治療戦略と
なり得ることが明らかである。
する酵素である。生体異物および内因性由来の代謝産物の両方の、いくつかの毒性化合物
は、グリシンへの抱合によって解毒される。安息香酸の解毒におけるGLYATの役割に
加えて、この酵素はまた、ある特定の先天性代謝異常の管理においても重要である。
れていない。
有する患者の場合において、グリシン抱合解毒系の能力を直接向上させるために現在利用
可能な商業的に実現性のある製品がないことである。
ンスフェラーゼ(GLYAT)酵素を生産する新規な方法を提供することおよびそのよう
な方法を用いて生産されたGLYATを提供することである。
治療および/または予防するための方法における、製薬学的に有効な量のGLYATの使
用を提供することである。
とができる、哺乳動物において、解毒を増強する方法、および代謝障害を治療および/ま
たは予防するための方法を提供することである。
ンスフェラーゼ(GLYAT)を生産する方法であって、
適切な発現宿主を用意するステップと、
発現宿主においてGLYATを発現させるための遺伝子を含むベクターを調製して、発
現プラスミドを形成するステップと、
宿主を発現プラスミドで形質転換して、発現系を形成するステップと、
発現系においてGLYAT遺伝子を発現させるステップと、
発現されたGLYATを発現系から分離するステップと
を含む方法が提供される。
系の水溶性画分を不溶性物質から分離するステップおよび分離されたGLYATを濃縮ま
たは凍結乾燥するステップを含んでもよい。
細胞発現系を含む真核生物系、大腸菌(Escherichia coli)および枯草
菌(Bacillus subtilis)ならびに古細菌系を含む原核生物系からなる
群から選択することができる。
合わせるさらなるステップを含む。
に活性な組換えGLYATが提供される。
に活性な組換えGLYATを含む医薬が提供される。
グリシン抱合解毒系の能力を向上させる方法、
解毒を増強する方法、または
代謝障害、およびキシレンまたはアスピリンなどの化合物による急性または慢性中毒を
治療および/または予防する方法
における、製薬学的に有効な量の、本発明の第1の態様によって調製される水溶性の酵素
的に活性な組換えGLYATの使用が提供される。
要とする哺乳動物に、増加したグリシン抱合の要求に応じて、体重1キログラム当たり0
.1mgから160mgの間の生物学的に有効な量の水溶性の酵素的に活性な組換えGL
YATを投与することによって、哺乳動物において、
グリシン抱合解毒系の能力を向上させる方法、
解毒を増強する方法、または
代謝障害、およびキシレンまたはアスピリンなどの化合物による急性または慢性中毒を
治療および/または予防する方法
において使用されてもよい。
グリシン抱合解毒系の能力を向上させること、
解毒を増強すること、または
代謝障害、およびキシレンまたはアスピリンなどの化合物による急性または慢性中毒を
治療および/または予防すること
に使用するための医薬を製造する方法における、製薬学的に有効な量の、本発明の第1の
態様の方法によって調製される水溶性の酵素的に活性な組換えGLYATの使用が提供さ
れる。
ル酸尿症から選択される有機酸血症、メープルシロップ尿症および高グリシン血症から選
択されるアミノ酸尿症、ならびに尿素回路異常症からなる群から選択される疾患のいずれ
か1つまたは複数であり得る。
えGLYAT、ならびに少なくとも1つの不活性な製薬学的に許容される担体または賦形
剤から調製される、錠剤、カプセル剤、懸濁剤、シロップ剤、皮内注射剤、筋肉内注射剤
、静脈内注射剤、および皮下注射剤からなる群から選択される剤形の医薬が提供される。
素の製剤を用いて、静脈内注入(IV)によって投与されてもよい。代替として、水溶性
の酵素的に活性な組換えGLYATは、膜透過TAT(転写のトランス活性化因子)ペプ
チドと融合したGLYAT酵素を使用することによって投与されて、組換え酵素が細胞膜
を効率的に通過して、所望のミトコンドリアマトリックスに到達することを可能にしても
よい。さらに代替として、水溶性の酵素的に活性な組換えGLYATは、サブミクロンサ
イズおよびミクロンサイズの独特で安定な脂質系構造体を含有するコロイド系を使用する
ことによって投与されてもよい。
Tを投与するステップは、グリシン抱合能力をさらに刺激するために、水溶性の酵素的に
活性な組換えGLYATをグリシンと組み合わせて投与するさらなるステップを含んでも
よい。
シルトランスフェラーゼ(GLYAT)を生産するための方法が提供される。
発現宿主においてGLYATを発現させるための遺伝子を含むベクターを調製して、発現
プラスミドを形成するステップと、宿主を発現プラスミドで形質転換して、発現系を形成
するステップと、GLYATを発現系において発現させるステップと、発現GLYATを
発現系から分離するステップと、分離した発現GLYATをグリシンと組み合わせるステ
ップとを含む。
大腸菌および枯草菌を含む原核生物系ならびに古細菌系からなる群から選択される。大腸
菌(E.coli)は、特に適切な宿主を提供することが見出された。
びポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅によって、pColdIII発現ベクター中にク
ローニングされた(図1において示されているとおり)。pColdIII発現ベクター
は、摂氏15度での大腸菌におけるタンパク質の発現を可能にし、これは、可溶性の酵素
的に活性な組換えタンパク質の発現を増強する。
換えヒトGLYATおよび組換えウシGLYATまたは他のGLYAT変異体の発現のた
めに使用され得る。
接続される。C末端ヒスチジンタグの代替として、タグは、N末端ヘキサヒスチジンタグ
、マルトース結合タンパク質(MBP)、グルタチオンS−トランスフェラーゼ、GST
タグおよびStrep−Tag IIからなる群から選択される。
用することによって発現宿主のタンパク質から分離される。GLYATはヌクレオチド−
補因子結合酵素であるという事実のために、GLYATはさらに代替として、アフィニテ
ィークロマトグラフィーによって精製されてもよい。
組換えウシGLYATを、C末端ヒスチジンタグをコードしている3つの改変されたp
ColdIII(pColdIII−E、pColdIII−AおよびpColdIII
−EH)発現ベクターのセットにクローニングした。
するためのNdeIおよびXhoI制限酵素部位を含むプライマーを使用したポリメラー
ゼ連鎖反応(PCR)によって配列を増幅する。PCR反応混合物は、1×Takara
ExTaqバッファー、10nmolの各dNTP、25pmolの各プライマー、約
50ngの鋳型DNAおよび2ユニットのTakara ExTaqポリメラーゼを最終
体積50μl中に含有していた。サーマルサイクリング条件は、摂氏94度で1分間、次
いで摂氏94度で30秒間を30サイクル、摂氏70度で30秒間および摂氏72度で1
分間、続いて摂氏72度で10分間の最終伸長であった。
析またはPCR増幅のいずれかを使用して、コロニーを所望の組換えプラスミドについて
スクリーニングした。図2において示されているように、アガロースゲルにおいて約90
0bpの切り取られた断片が見られれば、コロニーを陽性であるとみなした。
えGLYATと融合したヒスチジンタグは、ニッケルイオンが固定された樹脂を通過する
と、その表面に固定されたニッケルイオンと配位結合を形成することによってカラムマト
リックスに強固に結合する。このことにより、ヒスチジンタグ付きGLYATは結合した
ままでありながら、大部分の他のタンパク質をカラムから洗浄することが可能となる。タ
グ付きタンパク質を高濃度のイミダゾールを含有するバッファーで溶出し、イミダゾール
がヒスチジン残基とニッケルイオンとの間の配位結合と置き換わり、部分的に精製された
組換えタンパク質をもたらした。
(PAGE)を使用して、pColdIIIベクターからのウシGLYATの発現を分析
した。タンパク質を、クマシーブリリアントブルーで染色することによって可視化した。
レーン2は発現されたタンパク質の全画分を示し、レーン3は細菌溶解物の可溶性画分を
示しており、発現された可溶性組換えGLYATは、細菌タンパク質のバックグラウンド
においてはっきりと見られない。
IIから発現した。可溶性画分を、ニッケルアフィニティー精製カラムに通過させて、タ
グ付き組換えGLYAT酵素を精製した。発現された可溶性組換えウシGLYATのレベ
ルは低く、よって、精製の最後の溶出液をかなり濃縮した。SDS−PAGE分析は、レ
ーン2において発現されたタンパク質の全画分を明らかにした。レーン3は、組換えGL
YATの可溶性画分を表し、細菌タンパク質のバックグラウンドに対して顕著な量の可溶
性組換えGLYATは見られない。レーン4は、ニッケルアフィニティー精製の結果とし
て部分的に精製された酵素を示す。下のバンドは、GLYAT酵素の活性な形態を示す。
した。バッファーにおいてイミダゾールを使用することにより、以前に同時精製したタン
パク質の大部分が失われる結果となった。図5における下のバンドは、酵素的に活性なウ
シGLYATおよび未知のタンパク質を表す。
YAT酵素と同様の生化学的特性を有することが見出された。
ヒトGLYAT配列をコードしているヌクレオチド配列を合成し、pET32発現ベク
ター中にクローニングした。
にするN末端ヘキサヒスチジンタグおよびN末端Trxタグを有するヒトGLYATの発
現を可能にする。
した。細胞はまた、TakaraのpGro7ベクターでも形質転換し、これにより、G
roESおよびGroELシャペロンタンパク質の共発現をもたらした。シャペロンタン
パク質は、タンパク質の正しいフォールディングを助け、可溶性組換え酵素の収率を増加
させる。
rigami細胞を、液体培地中で増殖させた。可溶性GLYATの最適な発現は、IP
TG(イソプロピルβ−D−1−チオガラクトピラノシド)の非存在下で起こり、したが
って、IPTGを用いて融合タンパク質の発現を誘導する公知の方法とは対照的に、遅い
基本速度でGLYATの発現を可能にすることが見出された。
バッファー、pH8.0、10%グリセロール、1%Triton−X、リゾチームおよ
びプロテアーゼ阻害剤を含有する最適化されたネイティブ溶解バッファーを使用して溶解
した。細胞溶解物を、10000gで30分間遠心分離を使用して清澄化して不溶性物質
を除去し、Protinoニッケルアフィニティー精製カラムを通してヘキサヒスチジン
タグ付き酵素を選択的に結合させた。カラムを洗浄し、精製されたタンパク質を最終体積
3ml中に溶出した。
タグを付けて発現させた。レーン1は、分子サイズマーカーを含有する。レーン2および
レーン3は、BugBusterタンパク質抽出試薬を使用して溶解した細胞の培養物の
、それぞれ不溶性画分および可溶性画分を含有する。可溶性組換えヒトGLYATは見ら
れなかったため、この溶解試薬は組換えヒトGLYATの抽出に適していないことが見出
された。
で発現しているタンパク質を培養物から単離し、可溶性画分をレーン5〜9にロードした
。ヘキサヒスチジン−Trx−GLYAT融合タンパク質を、55kDa範囲にある矢印
によって示す。
−TEDカラムを使用したニッケルアフィニティークロマトグラフィーによって精製され
る。レーン1は、分子量マーカーを含有し、レーン2には何も入っていない。レーン3は
、精製後の野生型組換えヒトGLYAT融合タンパク質を含有する。レーン4〜9は、G
LYAT遺伝子の一塩基多型(SNP)の既知異変に関する、本発明に従って調製された
精製済み組換えヒトGLYAT融合タンパク質を含有する。
活性についてアッセイした。アッセイにおいて、ウシGLYATを陽性対照として使用す
る。観察される酵素活性がグリシン依存的であることを示す陰性対照として、グリシンを
用いない反応を行った。組換えヒトGLYATは、412nmでの吸光度(OD)の増加
を示し、本発明に従って調製した組換えヒトGLYATのグリシン存在下での酵素活性を
裏付けた。
新規な形態が、合理的なおよび半合理的な酵素工学戦略によって得られ得ること、および
これらが代替的にそれらの特殊化した機能のために使用され得ることが考えられる。酵素
工学戦略による改変を受け得るGLYAT酵素の特質には、触媒反応速度、基質特異性、
安定性、免疫学的側面および最適基質濃度が含まれる。
異的突然変異誘発を使用して、野生型配列からこれらの変異体コード配列を生成した。6
種のSNP変異体のうち、2種は野生型GLYATより高い酵素活性を有し、残りは野生
型GLYATよりはるかに低い活性を有することが見出された。例えば触媒反応速度が増
加した変異体を使用すれば明らかな利益が伴うと予想することができる。
使用において、代謝障害の性質および程度に応じて、体重1キログラム当たり0.1m
g〜160mgの製薬学的に有効な量の組換えGLYAT酵素が、それを必要とする患者
に、所望の細胞内区画を標的とする形態の酵素の製剤を用いて、静脈内注入(IV)によ
って投与される。代替として、調製された組換えGLYAT酵素は、膜透過剤として作用
するTAT(転写のトランス活性化因子)ペプチドを使用することによって投与され、こ
れにより、組換え酵素が、細胞膜を効果的に通過して、所望のミトコンドリアマトリック
スに到達することが可能になろう。さらに代替として、調製された組換えGLYAT酵素
は、サブミクロンサイズおよびミクロンサイズの独特で安定な脂質系構造体を含むコロイ
ド系を使用して投与することにより、哺乳動物において解毒を増強し、代謝障害、および
キシレンまたはアスピリンなどの化合物による急性中毒または慢性中毒を治療および/ま
たは予防する。
有機酸血症、メープルシロップ尿症および高グリシン血症から選択されるアミノ酸尿症、
ならびに尿素回路異常症からなる群から選択される疾患のいずれか1つまたは複数でもよ
い。
プ剤、皮内注射剤、筋肉内注射剤、静脈内注射剤、および皮下注射剤を含む剤形のいずれ
かに製剤化される。
よび工業溶媒に曝露された患者の治療、および急性アスピリン中毒の救急治療において、
グリシン抱合解毒系の能力が直接向上する。いくつかの有機酸のグリシン抱合は、治療用
組換えGLYAT酵素の使用によって増強される。
性な組換えグリシンN−アシルトランスフェラーゼ(GLYAT)酵素を生産する新規な
方法を提供する際の詳細の変更が、添付の特許請求の範囲から逸脱することなく可能であ
ることは理解されよう。
Claims (7)
- グリシン抱合解毒系の能力の向上、解毒の増強、または代謝障害、およびキシレンまたはアスピリンなどの化合物による急性または慢性中毒の治療および/または予防における使用のための、水溶性の酵素的に活性な組換えグリシンN−アシルトランスフェラーゼ(GLYAT E.C. number 2.3.1.13)を含む医薬を製造する方法であって、
適切な発現宿主を用意するステップと、
前記発現宿主においてGLYAT(E.C. number 2.3.1.13)を発現させるための遺伝子を含むベクターを調製して、発現プラスミドを形成するステップと、
前記宿主を前記発現プラスミドで形質転換して、発現系を形成するステップと、
前記発現系において前記GLYAT(E.C. number 2.3.1.13)を発現させるステップと、
前記発現されたGLYAT(E.C. number 2.3.1.13)を前記発現系から分離するステップと、
前記分離した発現されたGLYAT(E.C. number 2.3.1.13)をグリシンと組み合わせるステップと
を含む方法。 - 前記発現されたGLYAT(E.C. number 2.3.1.13)を前記発現系から分離する前記ステップが、前記発現系の水溶性画分を不溶性物質から分離するステップおよび前記分離されたGLYAT(E.C. number 2.3.1.13)を濃縮または凍結乾燥するステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記発現宿主が、酵母細胞発現系、昆虫細胞発現系および哺乳動物細胞発現系を含む真核生物系、大腸菌および枯草菌を含む原核生物系、ならびに古細菌系からなる群から選択される、請求項1または2に記載の方法。
- 前記発現宿主が、大腸菌を含む原核生物系のとき、ベクターは、原核生物系発現宿主において、GLYAT(E.C. number 2.3.1.13)と、GroESおよびGroELを含むシャペロンタンパク質とを発現させるための遺伝子を含むように調製されて、発現プラスミドを形成し、前記GLYAT(E.C. number 2.3.1.13)とシャペロンタンパク質とが前記発現システム中で発現される、請求項3に記載の方法。
- 分離した発現されたGLYATとグリシンとを、錠剤、カプセル剤、懸濁剤、シロップ剤、サブミクロンサイズおよびミクロンサイズの独特で安定な脂質に基づく構造体を含有するコロイド系を含む群から選択される少なくとも1つの不活性な製薬学的に許容される担体または賦形剤に組み合わせるステップ、
分離した発現されたGLYATとグリシンとを、膜透過剤として使用されるTAT(転写のトランス活性化因子)ペプチドと融合させるステップ、
分離した発現されたGLYATとグリシンとを、皮内注射剤、筋肉内注射剤、静脈内注射剤、または皮下注射剤のための適切な形態で提供するステップ
のいずれか一つのさらなるステップを含む請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。 - 前記医薬が、それを必要とする哺乳動物に、水溶性の酵素的に活性な組換えGLYATが体重1キログラム当たり0.1mgから160mgの間の生物学的に有効な量で与えられる、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記代謝障害が、プロピオン酸血症、イソ吉草酸血症およびグルタル酸尿症から選択される有機酸血症、メープルシロップ尿症および高グリシン血症から選択されるアミノ酸尿症、ならびに尿素回路異常症からなる群から選択される疾患のいずれか1つまたは複数である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
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