KR20130094313A - 재조합 치료용 글리신 n-아실트랜스퍼라제 - Google Patents

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KR20130094313A
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데르 슬루위스 렌시아 반
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Abstract

본 발명은 재조합 효소의 생산 방법에 관한 것이며, 더욱 상세하게는, 본 발명은 수용성이며 효소적으로 활성인 재조합 글리신 N-아실트랜스퍼라제 (GLYAT(E.C.2.3.1.13))에 관한 것으로, 적합한 발현 숙주를 제공하는 단계; 발현 숙주에서 GLYAT를 발현시키기 위한 유전자를 포함하는 벡터를 제조하여 발현 플라스미드를 형성시키는 단계; 상기 숙주를 상기 발현 플라스미드로 형질전환시켜 발현 시스템을 형성시키는 단계; 상기 발현 시스템에서 GLYAT 유전자를 발현시키는 단계; 및 상기 발현 시스템으로부터 발현된 GLYAT를 분리시키는 단계를 포함한다.

Description

재조합 치료용 글리신 N-아실트랜스퍼라제{RECOMBINANT THERAPEUTIC GLYCINE N-ACYLTRANSFERASE}
본 발명은 재조합 효소의 생산 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 수용성이며 효소적으로 활성인 재조합 글리신 N-아실트랜스퍼라제 (GLYAT(E.C.2.3.1.13))의 생산 방법에 관한 것이다.
인체에 의한 독성 대사물질의 해독작용(detoxification)은 필수적인 생리학적 공정이다. 해독작용 공정으로 여러가지 내인성 대사물질, 예로서 스테로이드 호르몬, 및 식품 또는 공업적 화학물질 중의 화합물을 포함할 수 있는, 외인성 독소의 독성이 감소된다.
해독 공정은 3개의 주요 상(phase)으로 나누어진다. 상 I 해독작용은 작용성 기(들)을 첨가함으로써 매사물질을 활성화시킨다. 상기 상 1의 해독작용에 의해 발생되는 활성화된 화합물은 흔히 원래의 대사물질 보다 더욱 반응성이고 독성이 더 크며, 상 II 해독작용 시스템에 의해 추가로 가공된다. 상 II 해독작용에서는, 일련의 접합반응으로 상기 활성화된 화합물이 독성이 덜하고 예를 들어 오줌 및 담즙에서 더욱 가용성이 되도록 한다. 상 III 해독작용은 세포로부터 독소의 제거를 수반한다.
유기 산혈증(acidemias)은 역기능(dysfunctional) 유기산 대사작용에 의해 유발되는 일군의 대사성 질환이다. 특정 대사 효소의 결핍으로 산들(acids)이 축적되는데 이 산들은 통상 인체내에서 높은 수준으로 존재하지 않는다. 여러가지 알려진 유기 산혈증이 있으며, 메틸말론산계 산혈증, 프로피온산계 산혈증, 이소발레르산계 산혈증, 글루타르산계 산뇨, 및 단풍당뇨병을 일례로 들 수 있다.
이소발레르산계 산혈증은 상염색체(autosomal) 열성 질환이다. 이는 이소발레릴 조효소 A 데하이드로게나제의 결핍으로 유발된다. 이 효소가 결핍되면 이소발레르산, 3- 및 4-하이드록시이소발레르산, 이소발레릴-카르니틴 및 이소발레릴글리신을 포함한, 류신 이화작용의 중간체를 축적시킨다.
이소발레릴글리신은 글리신 N-아실트랜스퍼라제 (GLYAT)에 의해 이소발레르산이 글리신에 접합할 때 형성된다. 상기 이소발레릴글리신은 이소발레르산 보다 독성이 덜한데, 이는 글리신 접합이 이소발레르산계 산혈증의 치료에 있어서 매우 중요함을 나타내는 것이다.
요소회로질환(urea cycle disorder)은 혈액 스트림으로부터 암모니아를 제거하는데 관여하는 요소회로에서의 효소 결핍으로 유발되는 유전적 질환이다. 요소회로질환에서는, 질소가 암모니아 형태로 축적되어 고암모니아혈증이 발생되며 이는 궁극적으로 비가역적 뇌손상, 혼수상태(coma) 및(또는) 사망의 원인이 된다.
유기 산혈증을 앓고 있는 개체에서 글리신 접합능력(conjugation capacity)을 향상시키기 위한 공지의 방법은 글리신 보조물질을 투여하는 것이다. 그러나, 간 샘플에 대한 검정으로 인간에서의 글리신 접합능력에서는 변동성이 큰 것으로 밝혀졌다.
따라서, 글리신 접합에 대한 자연능력을 증강시키는 수단이 사람의 일반적인 건강에도 유익할 뿐만 아니라 유기 산혈증, 요소회로 질환, 아미노산뇨증, 및 일부 외인성 화학물질에 대한 노출에 영향을 받은 개체에 대한 대안적 치료 전략으로서 또한 존재할 수 있다.
GLYAT는 글리신으로의 접합 수단에 의한 수종의 독성 유기산의 상 II 해독작용에 관여하는 효소이다. 외인성 및 내재적으로 유도되는 대사물질 둘 다인, 수종의 독성 화합물은 글리신으로의 접합에 의해 해독된다. 벤조산의 해독에서의 GLYAT의 역할 외에, 상기 효소는 또한 대사작용의 특정한 선천적 오류(error)의 관리에 있어서 중요하다.
지금까지, 효소적으로 활성인 재조합 GLYAT의 세균 발현 및 정제에 대한 시스템이 보고된 바 없다.
효소적으로 활성인 재조합 GLYAT의 발현에 대한 시스템의 결여와 관련된 단점은 글리신-접합 해독작용 시스템의 능력, 특히 대사성 질환 환자의 경우에서의 이러한 시스템의 능력을 직접 향상시키기 위하여 현재 입수가능한 상업적인 생존성 제품이 없다는 것이다.
따라서, 본 발명의 목적은 수용성이며 효소적으로 활성인 재조합 글리신 N-아실트랜스퍼라제 (GLYAT) 효소의 신규한 생산 방법과 그러한 방법으로 생산된 GLYAT를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 포유동물에서 해독작용을 향상시키고 대사성 질환을 치료 및(또는) 방지하기 위한 방법에 있어서 약제학적 유효량의 GLYAT의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 단점이 극복될 수 있거나 적어도 최소화될 수 있는, 포유동물에서 해독작용의 향상 및 대사성 질환의 치료 및(또는) 방지하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 첫번째 태양에 따라서 수용성이며 효소적으로 활성인 재조합 글리신 N-아실트랜스퍼라제(GLYAT)의 생산 방법이 제공되는데, 이 방법은 다음 단계:
- 적합한 발현 숙주를 제공하는 단계;
- 발현 숙주에서 GLYAT를 발현시키기 위한 유전자를 포함하는 벡터를 제조하여 발현 플라스미드를 형성시키는 단계;
- 상기 숙주를 상기 발현 플라스미드로 형질전환시켜 발현 시스템을 형성시키는 단계;
- 상기 발현 시스템에서 GLYAT 유전자를 발현시키는 단계; 및
- 상기 발현된 GLYAT를 상기 발현 시스템으로부터 분리시키는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명에 따라서, 상기 발현 시스템으로부터 발현된 GLYAT를 분리시키는 단계가 상기 발현 시스템의 수용성 분획을 불용성 물질로부터 분리시키고 상기 분리된 GLYAT를 농축 또는 동결시키는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따라서, 상기 발현 숙주가 효모 세포 발현-, 곤충 세포 발현- 및 포유동물 세포 발현 시스템을 포함한, 진핵세포 시스템; 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)을 포함한, 전핵세포 시스템 및 고세균(archaeon) 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
또한, 본 발명에 따라서, 상기 방법이 상기 분리된 발현된 GLYAT를 글리신과 합하는 추가 단계를 포함한다.
본 발명의 두번째 태양에 따라서, 본 발명의 첫번째 태양에 따라서 제조된 수용성이며 효소적으로 활성인 재조합 GLYAT가 제공된다.
본 발명의 세번째 태양에 따라서, 본 발명의 첫번째 태양에 따라서 제조된 수용성이며 효소적으로 활성인 재조합 GLYAT를 포함하는 약제가 제공된다.
본 발명의 네번째 태양에 따라서, 다음 방법:
- 글리신-접합 해독작용 시스템의 능력을 향상시키는 방법;
- 해독작용을 향상시키는 방법; 또는
- 포유동물에서 대사성 질환 및 자일렌 또는 아스피린과 같은 화합물에 대한 급성 또는 만성 독성화의 치료 및(또는) 방지하는 방법에 있어서 본 발명의 첫번째 태양에 따라서 제조된, 약제학적 유효량의, 수용성이며 효소적으로 활성인 재조합 GLYAT의 용도가 제공된다.
본 발명의 다섯번째 태양에 따라서, 수용성이며 효소적으로 활성인 재조합 GLYAT를, 증가된 글리신 접합에 대한 요구에 따라 체중 킬로그램 당 수용성이며 효소적으로 활성인 재조합 GLYAT를 0.1 ㎎ 내지 160 ㎎의 생물학적 유효량을 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여함으로써 포유동물에서
- 글리신-접한 해독작용 시스템의 능력을 향상시키는 방법;
- 해독작용을 향상시키는 방법; 또는
- 대사성 질환 및 자일렌 또는 아스피린과 같은 화합물에 대한 급성 또는 만성 독성화를 치료 및(또는) 방지하는 방법에 사용할 수 있다.
본 발명의 여섯번째 태양에 따라서,
- 글리신-접한 해독작용 시스템의 능력의 향상;
- 해독작용의 향상; 또는
- 대사성 질환 및 자일렌 또는 아스피린과 같은 화합물에 대한 급성 또는 만성 독성화의 치료 및(또는) 방지하는데 사용하기 위한 약제의 제조 방법에 있어서 본 발명의 첫번째 태양의 방법에 따라서 제조된, 약제학적 유효량의, 수용성이며 효소적으로 활성인 재조합 GLYAT의 용도가 제공된다.
또한, 본 발명에 따라서, 상기 대사성 질환이 프로피온산계 산혈증, 이소발레르산계 산혈증 및 글루타르산계 산혈증으로부터 선택된 유기 산혈증, 단풍당뇨병 및 고글리신혈증으로부터 선택된 아미노산뇨증; 및 요소회로질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 상태일 수 있다.
본 발명의 일곱번째 태양에 따라서, 적어도 1종의 불활성의, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 본 발명의 첫번째 태양에 따르는 수용성이며 효소적으로 활성인 재조합 GLYAT로부터 제조된, 정제; 캡슐제; 현탁제, 시럽제; 피내(intradermal)-; 정맥내-; 및 피하 주사로 이루어진 군으로부터 선택되는 투여형의 약제가 제공된다.
상기 수용성이며 효소적으로 활성인 재조합 GLYAT는 목적하는 세포하(sub-cellular) 구획으로 표적화되는 형태의 효소 제제를 갖는 정맥내 주사(IV)에 의해 투여될 수 있다. 달리, 수용성이며 효소적으로 활성인 재조합 GLYAT는 재조합 효소가 효과적으로 세포막을 횡단하여 목적하는 미토콘드리아 매트릭스에 도달할 수 있도록 하는, 막 투과 TAT (transactivator of transcription)에 융합된 GLYAT 효소를 사용하여 투여될 수 있다. 또 다른 대안으로, 수용성이며 효소적으로 활성인 재조합 GLYAT를 독특하고 안정한 지질-기본 서브마이크론- 및 마이크론-크기의 구조를 함유하는 콜로이드 시스템을 사용하여 투여할 수 있다.
또한, 본 발명에 따라서, 생물학적으로 유효량의, 수용성이며 효소적으로 활성인 재조합 GLYAT의 투여 단계가 상기 수용성이며 효소적으로 활성인 재조합 GLYAT를 글리신과 함께 투여함으로써 글리신 접합 능력을 추가로 자극하는 추가 단계를 포함할 수 있다.
이제, 본 발명을 단지 실례로서, 첨부되는 도면을 참고로 하여 추가로 설명하고자 한다.
도 1은 본 발명의 바람직한 양태에 따르는 소의 GLYAT의 발현용으로 사용되는 pColdIII 발현 벡터를 설명하는 다이아그램이다.
도 2는 소의 GLYAT를 암호화하는 ORF (open reading frame)가 이미 클로닝되어 있는 플라스미드로부터 소의 GLYAT를 암호화하는 ORF의 폴리머라제 연쇄반응 (PCR) 증폭이다 (원래의 PCR 증폭과 클로닝은 소간으로부터의 cDNA를 사용하여 수행하였다).
도 3은 재조합 소의 GLYAT 발현의 전체 및 가용성 분획 (각각 레인 2 및 3)을 설명하는 나트륨 도데실 술페이트(SDS) 폴리아크릴아미드 겔 전기이동도 (PAGE)이다.
도 4는 재조합 소의 GLYAT 발현의 전체 및 가용성 분획 (각각 레인 2 및 3) 뿐만 아니라 레인 4에서의 부분적으로 정제된 효소 (니켈 친화성 크로마토그라피)를 설명하는 SDS-PAGE 분석이다.
도 5는 니켈 친화성 크라마토그라피를 사용한 부분적 정제 후의 효소를 설명하는 SDS-PAGE 분석이다 (상기 정제에서는 20 mM 이미다졸을 세척 정제 완충액에 첨가하였다).
도 6은 헥사히스티딘 tag 및 Trx-tag의 N-말단 융합에 의한, 가용성 재조합 인간 GLYAT 유전자의 발현 (레인 4 내지 9)을 설명하는 SDS-PAGE 분석이다.
도 7은 와일드-타입 재조합 인간의 GLYAT (레인 3)와 인간의 GLYAT의 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP) 변이체 (레인 4 내지 9)의 니켈-친화성 정제를 설명하는 SDS-PAGE 분석이다.
도 8은 글리신의 존재 및 부재하에서 재조합 인간의 GLYAT와 소간 GLYAT의 효소 활성을 설명하는 분광광도계 검정이다.
본 발명의 바람직한 양태에 따라서, 수용성이며 효소적으로 활성인 재조합 글리신 N-아실트랜스퍼라제(GLYAT)의 생산 방법이 제공된다.
이 방법은 GLYAT 발현 유전자를 제공하는 적합한 발현 숙주를 제공하는 단계; 발현 숙주에서 GLYAT를 발현시키기 위한 유전자를 포함하는 벡터를 제조하여 발현 플라스미드를 형성시키는 단계; 상기 숙주를 상기 발현 플라스미드로 형질전환시켜 발현 시스템을 형성시키는 단계; 상기 발현 시스템에서 GLYAT를 발현시키는 단계; 상기 발현 시스템으로부터 발현된 GLYAT를 분리시키는 단계; 및 상기 분리된 발현된 GLYAT를 글리신과 합하는 단계를 포함한다.
상기 발현 숙주는 효모 세포 발현, 곤충 세포 발현 및 포유동물 세포 발현을 포함한, 진핵세포 시스템; 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)을 포함한, 전핵세포 시스템 및 고세균(archaeon) 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli)가 특히 적합한 숙주를 제공하는 것으로 밝혀졌다.
소의 GLYAT를 암호화하는 유전자를 소간 RNA로부터 단리시켜 역전사 및 폴리머라제 연쇄반응(PCR) 증폭법을 사용하여, pColdIII 발현 벡터중으로 클로닝시킨다 (도 1에서 설명된 바와 같음). 상기 pColdIII 발현 벡터는 가용성이며, 효소적으로 활성인 재조합 단백질의 발현을 향상시키는, 15 ℃에 E.coli에서 단백질이 발현되도록 한다.
진핵세포, 전핵세포 및 고세균 발현 숙주에서, 재조합 인간 및 소의 GLYAT, 또는 기타 GLYAT 변이체의 발현을 위하여 다양한 다른 벡터들이 또한 사용될 수 있다.
적합한 벡터를 수득하기 위하여, 히스티딘-tag (His-tag)을 상기 유전자의 C-말단에 부착시킨다. C-말단 히스티딘 tag에 대한 대안으로, tag가 N-말단 헥사히스티딘 tags, 말토오스 결합 단백질 (MBP), 글루타티온 S-트랜스퍼라제, GST tags 및 Strep-Tag II로 이루어진 군으로부터 선택된다.
GLYAT는 달리 정제용 tags없이 발현시켜, 공지의 단백질 정제 전략을 이용하여 발현 숙주의 단백질로부터 분리시킨다. GLYAT가 뉴클레오티드-보조인자 결합 효소라는 사실로 인하여, 친화성 크로마토그라피에 의해 추가로 달리 정제할 수 있다.
실시예 1: 재조합 소의 GLYAT
재조합 소의 GLYAT를 C-말단 히스티딘 tags를 암호화하는, 3종의 개량된 pColdIII (pColdIII-E, pColdIII-A 및 pColdIII-EH) 발현 벡터 세트중으로 클로닝시켰다.
암호화 서열을 발현 벡터중으로 클로닝시키기 위하여, 지향성 클로닝의 편의를 위한 Ndel 및 Xhol 제한 효소 부위를 함유하는 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄반응(PCR)을 통하여 상기 서열을 증폭시킨다. 상기 PCR 반응 혼합물은 1X Takara ExTaq 완충액, 10 nmol의 각 dNTP, 25 pmol의 각 프라이머, 대략 50 ng의 주형 DNA 및 2 단위의 Takara ExTaq 폴리머라제를 50 ㎕의 최종 용적으로 함유하였다. 열 사이클 조건 (thermal cycling conditions)은 94 ℃에서 1분간, 이어서 94 ℃에서 30초간 30 사이클, 70 ℃에서 30초간, 및 72 ℃에서 1분간, 이후 72 ℃에서 10분간 최종 연장이었다.
E. coli를 재조합 GLYAT 암호화 서열을 함유하는 발현 플라스미드로 형질전환시킨 후, 제한 분석법 또는 PCR 증폭법 중 하나를 사용하여 목적하는 재조합 플라스미드에 대해 클론들을 선별하였다. 도 2에 설명되어 있는 바와 같이, 대략 900 bp의 절단된 단편을 아가로스 겔상에서 볼 수 있을 경우, 콜로니는 포지티브인 것으로 간주하였다.
재조합 단백질을 니켈 친화성 정제법을 사용하여 정제하였다. 니켈 이온이 고정화되어 있는 수지를 통과할 때, 재조합 GLYAT에 융합되어 있는 히스티딘 tags는 수지의 표면상에 고정화되어 있는 니켈 이온과 배위 결합을 형성함으로써 컬럼 매트릭스에 단단하게 결합한다. 이는 대부분의 다른 단백질들이 컬럼으로부터 세척되도록 하는 한편, 히스티딘 태그된(tagged) GLYAT는 결합된 상태로 남아있게 된다. 상기 태그된 단백질은 히스티딘 잔기와 니켈 이온간의 배위결합을 대체시키는, 고농도의 이미다졸을 함유하는 완충액으로 용출시킴으로써, 부분적으로 정제된 재조합 단백질을 발생시켰다.
도 3을 언급하면, 나트륨 도데실 술페이트(SDS) 폴리아크릴아미드 겔 전기이동도(PAGE)를 사용하여 pColdIII 벡터로부터 소의 GLYAT의 발현을 분석하였다. 상기 단백질을 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue)로 염색하여 가시화하였다. 레인 2는 발현된 단백질의 전체 분획을 설명하는 것이며 레인 3은 세균 용해물의 가용성 분획을 설명하는 것으로; 상기 발현된 가용성 재조합 GLYAT는 세균 단백질의 배경상에 명확하게 보이지 않는다.
도 4를 언급하면, 재조합 소의 GLYAT가 C-말단 히스티딘 tag가 있는 pColdIII로부터 발현되었다. 상기 가용성 분획을 니켈 친화성 정제 컬럼에 통과시켜 태그된 재조합 GLYAT 효소를 정제하였다. 발현된 가용성 재조합 소의 GLYAT의 농도가 너무 낮아, 상기 정제 단계의 최종 용출액을 상당히 농축시켰다. SDS-PAGE 분석으로 레인 2중에 발현된 단백질의 전체 분획이 밝혀졌다. 레인 3은 재조합 GLYAT의 가용성 분획을 나타내는데, 세균 단백질의 배경에 대해 가시성인 확실한 양의 가용성 재조합 GLYAT는 없다. 레인 4는 니켈-친화성 정제의 결과로서 부분적으로 정제된 효소를 설명한다. 더 낮은 밴드는 활성 형태의 GLYAT 효소를 나타낸다.
도 5를 언급하면, 20 mM 이미다졸을 상기 정제 키트의 컬럼 세척 완충액에 첨가하였다. 완충액중에 이미다졸을 사용함으로써 이미 동시에 정제되는 단백질 중 대부분이 소실되었다. 도 5에서 더 낮은 밴드는 효소적으로 활성인 소의 GLYAT와 미지의 단백질을 나타낸다.
본 발명에 따라서 제조된, 재조합 소의 GLYAT 효소가 소간으로부터 정제된 GLYAT효소와 유사한 생화학적 특성을 갖고 있음이 밝혀졌다.
실시예 2: 재조합 인간의 GLYAT
인간의 GLYAT 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 합성하여 pET32 발현 벡터중으로 클로닝하였다.
pET32 발현 벡터는 각각 효소의 정제와 정확한 폴딩에 도움이 되는, N-말단 헥사히스티딘 tag와 N-말단 Trx-tag와 함께 인간의 GLYAT 발현을 가능케한다.
인간의 GLYAT를 암호화하는 발현 벡터를 Origami 발현 세포중으로 형질전환시켰다. 상기 세포는 또한 Takara로부터의 pGro7 벡턱로 형질전환시켜, GroES와 GroEL 샤프론(chaperone) 단백질을 동시에 발현시켰다. 샤프론 단백질은 단백질의 정확한 폴딩에 도움을 주어 가용성 재조합 효소의 수율을 증가시킨다.
재조합 인간의 GLYAT와 샤프론 단백질의 발현용 플라스미드를 함유하는 Origami 세포를 액체 컬쳐에서 성장시켰다. 가용성 GLYAT의 최적 발현은 IPTG (이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드)의 부재하에서 일어나는 것으로 밝혀졌으며, 따라서 발현시키기 위하여 IPTG로 융합 단백질을 유발시키는 공지의 방법과는 반대로 느린 기본 속도로 GLYAT가 발현되도록 한다.
발현 후, 세포를 원심분리법을 사용하여 하베스트하고, 300 mM NaCl, 50 mM 인산염 완충액, pH 8.0, 10% 글리세롤, 1% Triton-X, 라이조자임(lysozyme), 및 프로테아제 억제제를 함유하는, 최적화된 천연 용해 완충액 (native lysis buffer)을 사용하여 용해시켰다. 10,000 g에서 30분간 원심분리법을 사용하여 세포 용해물을 청정화시켜 불용성 물질을 제거하고 Protino 니켈 친화성 정제 컬럼에 통과시켜 헥사히스티딘 태그된 효소를 선택적으로 결합시켰다. 상기 컬럼을 세척하고, 정제된 단백질을 3 ㎖의 최종 용적으로 용출시켰다.
도 6을 언급하며, 가용성 재조합 인간의 GLYAT가 N-말단 헥사히스티딘-Trx-융합 tag와 함께 발현되었다. 레인 1은 분자 크기 마커를 함유한다. 레인 2와 3은 각각 BugBuster 단백질 추출 시약을 사용하여 세포를 용해시킨 컬쳐의, 불용성 및 가용성 분획을 함유한다. 가용성 재조합 인간의 GLYAT를 볼 수 없었으므로, 상기 용해 시약은 재조합 인간의 GLYAT의 추출에 적합하지 않은 것으로 밝혀졌다.
대안으로서, 상기 최적화된 천연 용해 완충액을 사용하여 0시간 부터 4시간 까지 발현시키는 컬쳐로부터 단백질을 단리시켰고, 가용성 분획이 레인 5 내지 9에 부하되었다. 헥사히스티딘-Trx-GLYAT 융합 단백질은 55 kDa 범위에서 화살표로 표시되어 있다.
도 7을 언급하면, 가용성 재조합 인간의 GLYAT 융합 단백질을 Portino Ni-TED 컬럼을 사용하는, 니켈-친화성 크로마토그라피로 정제한다. 레인 1은 분자량 마커를 함유하며, 레인 2는 비어있다. 레인 3은 정제 후, 와일드-타입 재조합 인간의 GLYAT 융합 단백질을 함유한다. 레인 4 내지 9는 본 발명에 따라서 제조된 바와 같은, 정제된 재조합 인간의 GLYAT, 상기 유전자의 공지되어 있는 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 변이체의 융합 단백질을 함유한다.
도 8을 언급하면, 생성된 효소 제제를 GLYAT에 대한 분광광도계 검정법을 사용하여 효소 활성에 대해 검정하였다. 상기 검정에서는, 소의 GLYAT를 포지티브 대조물로 사용한다. 네가티브 대조물로서 글리신 없이 반응을 수행하여 관찰된 효소 활성이 글리신 의존적임을 설명한다. 상기 재조합 인간의 GLYAT는 글리신의 존재하에서, 본 발명에 따라 제조된, 재조합 인간의 GLYAT의 효소 활성을 확인하는 412 nm에서의 광학밀도(OD)에서의 증가를 설명하였다.
상기 설명한 방법으로 재조합 치료적 GLYAT 효소를 사용하는 것 외에, 합리적(rational) 및 반-합리적(semi-rational) 효소 공학 전략으로 신규한 형태의 GLYAT 효소를 수득할 수 있으며, 이들은 이들의 특수화된 기능에 대해 대안적으로 사용될 수 있음이 가능하다. 효소 공학 전략에 의해 개량할 수 있는 GLYAT 효소의 품질은 촉매 속도, 기질 특이성, 안정성, 면역학적 특성, 및 최적의 기질 농도를 포함한다.
인간의 GLYAT의 6종의 공지된 천연 SNP (단일 뉴클레오티드 다형성) 변이체가 있으며 부위-지시된 돌연변이법 사용하여 와일드-타입 서열로부터 이들 변이체 암호화 서열을 발생시켰다. 상기 6종의 SNP 변이체중, 2개는 와일드-타입 GLYAT 보다 더 높은 효소 활성을 가지며, 나머지는 와일드-타입 GLYAT 보다 훨씬 더 낮은 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 증가된 촉매 속도를 갖는 변이체를 사용하는 것과 관련하여 명백한 장점이 있을 것으로 예측된다.
추가적인 조사결과와 분석
사용시, 대사성 질환의 특성 및 정도에 따라, 체중 킬로그램 당 약제학적 유효량의 0.1 ㎎ 내지 160 ㎎의 재조합 GLYAT 효소를 치료를 필요로 하는 환자에게 목적하는 세포하 부위를 표적으로 하는 형태의 효소 제제로 정맥내 주사(IV)에 의해 투여한다. 달리, 제조된 재조합 GLYAT 효소를 막 투과제로 작용하여, 재조합 효소가 세포막을 효과적으로 횡단하여 목적하는 미토콘드리아 매트릭스에 도달할 수 있도록 하는 TAT (transactivator of transcription) 펩타이드를 사용하여 투여한다. 또 다른 대안으로, 상기 제조된 재조합 GLYAT 효소를 해독작용을 향상시키고 포유동물에서 대사성 질환 및 자일렌 또는 아스피린과 같은 화합물에 대한 급성 또는 만성 독성화를 치료 및(또는) 방지하기 위하여 독특하고 안정한 지질-기재 서브마이크론- 및 마이크론-크기의 구조를 함유하는 콜로이드 시스템을 사용하여 투여한다.
상기 대사성 질환이 프로피온산계 산혈증, 이소발레르산계 산혈증 및 글루타르산계 산뇨로부터 선택된 유기 산혈증; 단풍당뇨병, 및 고글리신혈증으로부터 선택된 아미노산뇨증, 및 요소회로질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 상태 중 1종 이상일 수 있다.
재조합 GLYAT는 추가로 달리 정제; 캡슐제; 현탁제; 시럽제; 피내(intradermal)-; 근육내-; 정맥내-; 및 피하 주사를 포함하는 투여형 중 어느 하나로 제형화한다.
글리신과 함께 재조합 GLYAT로부터 제조된 약제는 화학물질 및 공업용 용매에 노출된 환자의 치료 및 급성 아스피린 독성화의 응급 치료에 있어서 글리신-접합 해독작용 시스템의 능력을 직접 향상시키기 위하여 사용된다. 수종의 유기산의 글리신 접합은 재조합 치료적 GLYAT 효소를 사용함으로써 향상된다.
본 발명에 있어서, 재조합 효소를 생산하는 신규한 방법을 제공하는데 있어서, 더욱 상세하게는 수용성이며 효소적으로 활성인 재조합 글리신 N-아실트랜스퍼라제 (GLYAT) 효소를 생산하는 신규 방법과 관련하여 세부적인 변화는 첨부되는 특허청구의 범위의 범주로부터 벗어나지 않고 가능할 수 있음을 인식하게 될 것이다.

Claims (13)

  1. - 적합한 발현 숙주를 제공하는 단계;
    - 상기 발현 숙주에서 GLYAT를 발현시키기 위한 유전자를 포함하는 벡터를 제조하여 발현 플라스미드를 형성시키는 단계;
    - 상기 숙주를 상기 발현 플라스미드로 형질전환시켜 발현 시스템을 형성시키는 단계;
    - 상기 발현 시스템에서 GLYAT 유전자를 발현시키는 단계; 및
    - 상기 발현된 GLYAT를 상기 발현 시스템으로부터 분리시키는 단계
    를 포함하는, 수용성이며 효소적으로 활성인 재조합 글리신 N-아실트랜스퍼라제 (GLYAT)의 생산 방법.
  2. 제1항에 있어서, 발현된 GLYAT를 발현 시스템으로부터 분리시키는 단계가 상기 발현 시스템의 수용성 분획을 불용성 물질로부터 분리시키고 상기 분리된 GLYAT를 농축 또는 동결시키는 단계를 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 발현 숙주가 효모 세포 발현-, 곤충 세포 발현-, 및 포유동물 세포 발현 시스템을 포함하는 진핵세포 시스템; 에쉐리키아 콜리(Escherichia coli), 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 포함하는 전핵세포 시스템; 및 고세균(archaeon) 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 분리된 발현된 GLYAT를 글리신과 합하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  5. 제1항 내지 4항 중 어느 한 항의 방법에 따라서 제조된 수용성이며 효소적으로 활성인 재조합 GLYAT.
  6. 제1항 내지 4항 중 어느 한 항의 방법에 따라서 제조된 수용성이며 효소적으로 활성인 재조합 GLYAT를 포함하는 약제.
  7. - 글리신-접합 해독작용 시스템의 능력을 향상시키는 방법;
    - 해독작용을 향상시키는 방법; 또는
    - 포유동물에서 대사성 질환 및 자일렌 또는 아스피린과 같은 화합물에 대한 급성 또는 만성 독성화를 치료 및(또는) 방지하는 방법에서의 약제학적 유효량의, 제1항 내지 4항 중 어느 한 항의 방법에 따라서 제조된 수용성이며 효소적으로 활성인 재조합 GLYAT의 용도.
  8. 수용성이며 효소적으로 활성인 재조합 GLYAT를 체중 킬로그램 당 0.1 ㎎ 내지 160 ㎎의 생물학적 유효량으로 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여함으로써, 포유동물에서
    - 글리신-접합 해독작용 시스템의 능력을 향상시키는 방법;
    - 해독작용을 향상시키는 방법; 또는
    - 대사성 질환 및 자일렌 또는 아스피린과 같은 화합물에 대한 급성 또는 만성 독성화를 치료 및(또는) 방지하는 방법에 사용하기 위한, 수용성이며 효소적으로 활성인 재조합 GLYAT.
  9. - 글리신-접합 해독작용 시스템의 능력의 향상;
    - 해독작용의 향상; 또는
    - 포유동물에서 대사성 질환 및 자일렌 또는 아스피린과 같은 화합물에 대한 급성 또는 만성 독성화의 치료 및(또는) 방지에 사용하기 위한 약제의 제조 방법에 있어서, 약제학적 유효량의, 제1항 내지 4항 중 어느 한 항의 방법에 따라서 제조된 수용성이며 효소적으로 활성인 재조합 GLYAT의 용도.
  10. 제7항 내지 9항 중 어느 한 항에 있어서, 대사성 질환이 프로피온산계 산혈증, 이소발레르산계 산혈증 및 글루타르산계 산뇨로부터 선택된 유기 산혈증; 단풍당뇨병, 및 고글리신혈증으로부터 선택된 아미노산뇨증, 및 요소회로질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 상태 중 1종 이상인 용도.
  11. 제7항 내지 10항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 4항 중 어느 한 항의 방법에 따라서 제조된 수용성이며 효소적으로 활성인 재조합 GLYAT를 글리신 접합 능력을 추가로 자극하기 위하여 글리신과 함께 투여하는 용도.
  12. 글리신과 함께, 제1항 내지 4항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 수용성이며 효소적으로 활성인 재조합 GLYAT를, 적어도 하나의 불활성인 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 정제; 캡슐제; 현탁제; 시럽제; TAT (transactivator of transcription) 펩타이드; 독특하고 안정한 지질-기재 서브마이크론- 및 마이크론-크기의 구조를 함유하는 콜로이드 시스템; 피내(intradermal)-; 근육내-; 정맥내-; 및 피하 주사를 포함하는 군으로부터 선택되는 투여형에 포함하는 약제.
  13. 첨부되는 도면을 참고로 하여, 명세서에 기재되고 예시된 바와 같이 수용성이고 효소적으로 활성인 재조합 글리신 N-아실트랜스퍼라제(GLYAT)를 생산하는 방법.
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