JPH0767627A - ハイブリドーマ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 新規なモノクローン抗イデイオタイプ抗体を
効率的に産生する能力を有する新規なハイブリドーマを
提供する。 【構成】 Ｔ／Ｇ−５９（５Ｃ）株が産生するニコチン
性アセチルコリンレセプターに特異性を有するヒトＩｇ
Ｇ↓1型モノクローン抗体で動物を免疫して得られた抗
体産生細胞を新形成細胞と融合させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はモノクローン抗イデイオ
タイプ抗体を産生するハイブリドーマに関する。

【０００２】本発明によって提供されるハイブリドーマ
から産生されるモノクローン抗イデイオタイプ抗体は、
ニコチン性アセチルコリンレセプターに特異性を有する
ヒトＩｇＧ↓1型モノクローン抗体に特異性を有するこ
とから、神経筋接合部のシナプス後膜上に存在するニコ
チン性アセチルコリンレセプターに対する自己抗体に原
因する神経筋伝達障害が病態の中心であるとされている
重症筋無力症の診断及び治療において有用である。

【０００３】

【従来の技術】ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イム
ノロジー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）第１２巻、第７９０〜７９２頁
（１９８２年）には、重症筋無力症患者の血清中のＩｇ
Ｇ↓3に由来する抗原結合性フラグメント（Ｆａｂ）の
重鎖部分でＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫し、該ＢＡＬＢ／
ｃマウスから採取された脾細胞をＢリンパ細胞腫細胞株
ＳＰ２／０−Ａｇ１４と融合させてハイブリドーマを
得、次いでハイブリドーマをクローニングすることによ
って取得されたハイブリドーマ株の１つが、重症筋無力
症患者に由来するニコチン性アセチルコリンレセプター
に対する抗体に対するモノクローン抗イデイオタイプ抗
体を産生することが報告されている。

【０００４】ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第３０１巻、
第６１１〜６１４頁（１９８３年）には、重症筋無力症
患者の末梢血リンパ球とヒトＢ細胞の変異株ＧＫ−５と
を融合させることによって得られた細胞株が重鎖として
μ鎖を、軽鎖としてκ鎖をそれぞれ有するヒトモノクロ
ーン抗体を産生すること、及び該ヒトモノクローン抗体
がニコチン性アセチルコリンレセプターに対する抗体に
対する抗イデイオタイプ抗体であると推察されることが
報告されている。

【０００５】また特開昭５６−１２８７２２号公報に
は、重症筋無力症患者の血清から得られたアセチルコリ
ンレセプターに対する抗体でウサギを免疫し、そのウサ
ギより取得された抗血清から免疫グロブリンを分画し、
その免疫グロブリンをアセチルコリンレセプターに対す
る抗体を固定化したセファロースを用いてアフイニテイ
クロマトグラフィーに付することによりアセチルコリン
レセプターに対する抗体に対する抗体を得たとされてお
り、このアセチルコリンレセプターに対する抗体に対す
る抗体を有機質又は無機質の担体に担持させてなるアセ
チルコリンレセプターに対する抗体用の除去剤を、アセ
チルコリンレセプターに対する抗体を含有する体液と接
触させることによってアセチルコリンレセプターに対す
る抗体を除去する方法が記載されている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】ヨーロピアン・ジャー
ナル・オブ・イムノロジー第１２巻、第７９０〜７９２
頁（１９８２年）に報告されている方法は、抗原結合性
フラグメントの重鎖部分を与えるＩｇＧ↓3中にニコチ
ン性アセチルコリンレセプターに対する自己抗体が微量
しか存在しない点において実用的であるとは言い難い。
またネイチャー第３０１巻、第６１１〜６１４頁（１９
８３年）に報告されている方法は、重症筋無力症患者の
末梢血リンパ球中にニコチン性アセチルコリンレセプタ
ーに対する抗体に対する抗イデイオタイプ抗体を産生す
る能力を有するリンパ球が微量しか存在しない点におい
て実用的であるとは言い難い。特開昭５６−１２８７２
２号公報に記載されている方法は、重症筋無力症患者の
血清中にはアセチルコリンレセプターに対する抗体が微
量しか存在しない点、アセチルコリンレセプターに対す
る抗体でウサギを免疫して得られた抗血清中にもアセチ
ルコリンレセプターに対する抗体に対する抗体が微量し
か存在しない点において実用的であるとは言い難く、ま
たアセチルコリンレセプターに対する抗体用の除去剤は
それに含有されるアセチルコリンレセプターに対する抗
体に対する抗体が免疫したウサギの個体差によってその
性質を異にすることから均一な性能を有することが困難
である。

【０００７】しかして、本発明の目的は、新規なモノク
ローン抗イデイオタイプ抗体を効率的に産生する能力を
有する新規なハイブリドーマを提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】以下、ニコチン性アセチ
ルコリンレセプターをＡＣｈＲと称し、Ｔ／Ｇ−５９
（５Ｃ）株から産生されるニコチン性アセチルコリン−
レセプターに特異性を有するヒトＩｇＧ↓1型モノクロ
ーン抗体をヒトＩｇＧ↓1型モノクローン抗ＡＣｈＲ抗
体と称する。

【０００９】本発明によれば、上記の目的は、Ｔ／Ｇ−
５９（５Ｃ）株が産生するヒトＩｇＧ↓1型モノクロー
ン抗ＡＣｈＲ抗体で動物を免疫して得られた抗体産生細
胞を新形成細胞と融合させ、該ヒトＩｇＧ↓1型モノク
ローン抗ＡＣｈＲ抗体に特異的なモノクローン抗イデイ
オタイプ抗体を産生する能力を有するハイブリドーマを
提供することによって達成される。上記のヒトＩｇＧ↓
1型モノクローン抗ＡＣｈＲ抗体に特異的なモノクロー
ン抗イデイオタイプ抗体を産生する能力を有するハイブ
リドーマの取得は、まずヒトＩｇＧ↓1型モノクローン
抗ＡＣｈＲ抗体で動物を免疫して得られた抗体産生細胞
を新形成細胞と融合させ、次いで後述する操作を実施す
ることによって行われる。

【００１０】ヒトＩｇＧ↓1型モノクローン抗ＡＣｈＲ
抗体に対する抗体を産生する細胞としては、例えば、ヒ
トＩｇＧ↓1型モノクローン抗ＡＣｈＲ抗体で免疫した
動物の脾臓、リンパ節などに存在するリンパ球が使用さ
れる。ヒトＩｇＧ↓1型モノクローン抗ＡＣｈＲ抗体に
よる動物の免疫は動物を抗原で免疫する場合に採用され
る通常の方法に従って行うことができる。例えば、ヒト
ＩｇＧ↓1型モノクローン抗ＡＣｈＲ抗体を通常リン酸
緩衝塩類溶液（以下、これをＰＢＳと称する）、生理食
塩液などの塩類溶液及びフロイントの完全アジュバント
〔フロインツ・コンプリート・アジュバント（Ｆｒｅｕ
ｎｄ’ｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ）〕、
水酸化アルミニウムなどのアジュバントとの混合物で動
物の腹腔内、皮下、筋肉内などに２回以上投与し、最終
投与より約３日後に動物から抗体産生細胞を採取する。
動物としては、例えば、マウス、ラットなどのネズミ類
などのげつ歯類；ウサギなどの重歯類；ヒツジなどの反
芻類などの哺乳動物などが使用される。細胞融合に付す
る抗体産生細胞と新形成細胞とは後述するように同じ種
類の動物に由来するものが好ましく、その動物をとして
は、入手容易な新形成細胞が多数知られているネズミ類
を使用するのが好ましく、ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用す
るのが特に好ましい。

【００１１】新形成細胞としては、ヒトＩｇＧ↓1型モ
ノクローン抗ＡＣｈＲ抗体に特異的なモノクローン抗イ
デイオタイプ抗体を産生する能力を有する細胞に増殖能
を付与させ得るものであれば特に限定されないが、抗体
産生細胞との融合効率並びに得られたハイブリドーマの
クローニング効率、安定性、増殖能及び抗体産生能の高
さの観点から、抗体産生細胞を採取した動物と同種の動
物に由来するミエローマ細胞又はそれから誘導されたハ
イブリドーマを使用するのが好ましい。融合後、後述す
るようにヒトＩｇＧ↓1型モノクローン抗ＡＣｈＲ抗体
に特異的なモノクローン抗イデイオタイプ抗体を産生す
る能力を有するハイブリドーマと使用した新形成細胞と
の選別を容易にする観点から、新形成細胞としてはヒポ
キサンチン・アミノプテリン・チミジン感受性を有して
いる６−チオグアニン耐性細胞、８−アザグアニン耐性
細胞又は５−ブロモデオキシウリジン耐性細胞を使用す
るのが好適である。かかる新形成細胞としては、例え
ば、Ｐ↓3−ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１株〔ＡＴＣＣ番
号：Ｔ１Ｂ１８；ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イ
ムノロジー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）第６巻、第５１１頁（１９７
６年）参照〕、Ｐ↓3−Ｘ６３−Ａｇ８株〔ＡＴＣＣ番
号：Ｔ１Ｂ９；ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２５６
巻、第４９５頁（１９７５年）参照〕、Ｐ↓3−Ｘ６３
−Ａｇ８．６５３株〔ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１５８０；
ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）第１２３巻、第１５４８頁
（１９７９年）参照〕、Ｓ１９４／５．ＸＸ０．ＢＵ．
１株〔ＡＴＣＣ番号：Ｔ１Ｂ２０；ジャーナル・オブ・
エクスペリメンタル・メデイスン（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ）第１
４８巻、第３１３頁（１９７８年）参照〕、ＭＰＣ−１
１株〔ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ１６７；ジャーナル・オブ
・エクスペリメンタル・メデイスン（Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）
第１３１巻、第５１５頁（１９７０年）参照〕などのＢ
ＡＬＢ／ｃマウスに由来するミエローマ細胞株；Ｙ３−
Ａｇ１．２．３株〔ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ １６３１；
ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２７７巻、第１３１頁
（１９７９年）参照〕などのラットに由来するミエロー
マ細胞株；ＳＰ２／０−Ａｇ１４株〔ＡＴＣＣ番号：Ｃ
ＲＴ １５８１；ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２７６
巻、第２６９頁（１９７８年）参照〕などのＢＡＬＢ／
ｃマウスに由来するミエローマ細胞株を親株とするハイ
ブリドーマ株などが知られており、これらのなかでもＰ
↓3−ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１株を使用するのが好まし
い。

【００１２】抗体産生細胞と新形成細胞との融合は、一
般の細胞融合において用いられる方法に従って、通常は
融合剤の存在下に緩衝液中で実施される。抗体産生細胞
と新形成細胞とはそれらの細胞数の比が通常約１０対１
〜約１対１の範囲内、好ましくは約４対１〜約１．５対
１の範囲内となるような割合で用いられる。融合剤とし
てはポリエチレングリコール、センダイ・ウイルス〔ヘ
マグルチネイティング・ウイルス・オブ・ジャパン（Ｈ
ｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ Ｖｉｒｕｓｏｆ Ｊ
ａｐａｎ）〕などを使用することができるが、取り扱い
易さ、融合効率の高さなどの点から、平均分子量が約１
０００〜５０００の範囲内にあるポリエチレングリコー
ルを使用するのが好ましく、このポリエチレングリコー
ルを緩衝液中の濃度が約４０〜６０重量％の範囲内とな
るような量で使用するのが適当である。細胞融合は通
常、抗体産生細胞と新形成細胞とを動物細胞用培地又は
平衡塩類溶液に加え、さらに融合剤を加えた混合液を、
例えば約３７℃の温度で約２分間攪拌することによって
実施される。動物細胞用培地としては例えばＲＰＭＩ−
１６４０培地、ハンクスのＭＥＭ培地〔ハンクス・ミニ
マム・エッセンシャル・メデイウム（Ｈａｎｋｓ’ｍｉ
ｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ）〕、
イーグルのＭＥＭ培地〔イーグルズ・ミニマム・エッセ
ンシャル・メデイウム（Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｉｎｉｍｕ
ｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ）〕などが使用
され、また平衡塩類溶液としては例えばハンクス液〔ハ
ンクス・バランスト・ソルツ・ソルーション（Ｈａｎｋ
ｓ’ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔｓ ｓｏｌｕｔｉｏ
ｎ）〕、アール液〔アールズ・バランスト・ソルツ・ソ
ルーション（Ｅａｒｌｅ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａ
ｌｔｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）〕などが使用される。ま
た、抗体産生細胞と新形成細胞との融合は電気融合法に
よって行うこともできる。

【００１３】上記の融合操作終了後、得られた細胞混合
物からヒトＩｇＧ↓1型モノクローン抗ＡＣｈＲ抗体に
特異的なモノクローン抗イデイオタイプ抗体を産生する
能力を有するハイブリドーマを次のようにして選別す
る。まず、得られた細胞混合物から抗体産生細胞と新形
成細胞とのハイブリドーマを分類・取得する。新形成細
胞としてヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン感
受性を有する細胞を使用した場合、融合操作によって得
られた細胞混合物をヒポキサンチン・アミノプテリン及
びチミジンを含有する培地（以下、この培地をＨＡＴ培
地と称する）で培養することにより、抗体産生細胞と新
形成細胞とのハイブリドーマを選択的に増殖させること
ができる。このＨＡＴ培地での培養に際して、細胞混合
物の培地中での濃度を通常約１×１０↑6〜１×１０↑7
個／ｍｌの範囲内となるように調整することが良好な結
果を与える。ＨＡＴ培地は、例えば、ＲＰＭＩ−１６４
０培地などの動物細胞用培地に牛胎児血清を約１０〜１
５容量％の濃度となるように添加し、さらにヒポキサン
チン、アミノプテリン及びチミジンを添加することによ
って調製される。ヒポキサンチン、アミノプテリン及び
チミジンのＨＡＴ培地中での濃度は、目的とするハイブ
リドーマの増殖に悪影響を及ぼさない範囲内であれば特
に制限されないが、通常それぞれ約１×１０↑-4モル／
ｌ、約４×１０↑-7モル／ｌ及び約１．６×１０↑-5モ
ル／ｌとなるように調整することが好ましい。ＨＡＴ培
地での培養は、通常二酸化炭素を約５〜８％含む空気中
において、約３７℃の温度で約１〜４週間静置下に行
う。次に、細胞混合物から分離・取得されたハイブリド
ーマから、ヒトＩｇＧ↓1型モノクローン抗ＡＣｈＲ抗
体に特異性を有する抗体を産生する能力を有するハイブ
リドーマを選別する。ハイブリドーマがヒトＩｇＧ↓1
型モノクローン抗ＡＣｈＲ抗体に特異性を有する抗体を
産生する能力を有するものであるか否かは、例えば酸素
免疫測定法（以下、これをＥＬＩＳＡ法と称する）、ラ
ジオ・イムノ・アッセイ法（以下、これをＲＩＡ法と称
する）などによって判定することができる。このように
して選別されたハイブリドーマを、例えば限界希釈法に
よってクローニングすることにより、ヒトＩｇＧ↓1型
モノクローン抗ＡＣｈＲ抗体に特異的なモノクローン抗
イデイオタイプ抗体を産生する能力を有する増殖可能な
ハイブリドーマ株を取得することができる。かかるハイ
ブリドーマ株としては、例えばＴＡ−１株、ＴＡ−２
株、ＴＡ−３株及びＴＡ−５株が挙げられる。ＴＡ−１
株、ＴＡ−２株、ＴＡ−３株及びＴＡ−５株はいずれ
も、ＡＣｈＲに特異性を有するとともにドデシル硫酸ナ
トリウムの存在下に実施されるポリアクリルアミドゲル
電気泳動法により求められる分子量が１８００００±２
００００であるヒトＩｇＧ↓1型モノクローン抗体で免
疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓に存在するリンパ球を
Ｐ↓3−ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１株と融合させることに
よって得られたハイブリドーマから選別された株であ
る。

【００１４】このようにして得られたハイブリドーマ株
を、例えば、二酸化炭素を約５〜８％含む空気中で、Ｒ
ＰＭＩ−１６４０培地などの動物細胞用培地に牛胎児血
清を約１０〜１５容量％の濃度となるように添加するこ
とによって調整した培地において約３７℃の温度で培養
することにより、該ハイブリドーマ株の増殖に伴ってイ
ン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でヒトＩｇＧ↓1型モ
ノクローン抗ＡＣｈＲ抗体に特異的なモノクローン抗イ
デイオタイプ抗体が産生される。またハイブリドーマ株
を、融合に使用した新形成細胞を取得する際に用いた動
物と同種の動物の体内に移植し、その動物を飼育するこ
とによって、該ハイブリドーマ株の増殖に伴ってイン・
ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）でヒトＩｇＧ↓1型モノクロー
ン抗ＡＣｈＲ抗体に特異的なモノクローン抗イデイオタ
イプ抗体が産生される。

【００１５】ヒトＩｇＧ↓1型モノクローン抗ＡＣｈＲ
抗体に特異的なモノクローン抗イデイオタイプ抗体は、
ハイブリドーマ培養上清又はハイブリドーマを移植した
動物の腹水、血清などの体液から取得される。培養上清
又は体液からの目的とするモノクローン抗イデイオタイ
プ抗体の分離・精製は、例えば、培養上清又は体液を硫
酸アンモニウムなどの塩を用いて行う塩析、限外濾過、
ゲル浸透クロマトグラフィー、アフイニテイクロマトグ
ラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどの操作に
付することにより行われる。

【００１６】また本発明によれば、前記の他の１つの目
的は、ヒトＩｇＧ↓1型モノクローン抗ＡＣｈＲ抗体に
特異的なモノクローン抗イデイオタイプ抗体を含有する
ＡＣｈＲに対する抗体（以下、ＡＣｈＲに対する抗体を
抗ＡＣｈＲ抗体と称する）の検出用試薬を提供すること
によって達成され、また該モノクローン抗イデイオタイ
プ抗体を抗ＡＣｈＲ抗体と接触させることを特徴とする
抗ＡＣｈＲ抗体の除去方法を提供することによって達成
され、さらに上記のモノクローン抗イデイオタイプ抗体
を担体に固定化して形成される抗ＡＣｈＲ抗体除去用吸
着体を提供することによって達成される。

【００１７】ヒトＩｇＧ↓1型モノクローン抗ＡＣｈＲ
抗体に特異的なモノクローン抗イデイオタイプ抗体を含
有する抗ＡＣｈＲ抗体の検出用試薬をＥＬＩＳＡ法、Ｒ
ＩＡ法、蛍光免疫測定法、血球凝集反応法などの抗原・
抗体反応を利用して抗原を検出する方法において使用す
ることにより、血清などの試料中に存在する抗ＡＣｈＲ
抗体を安定的又は定量的に検出することができる。な
お、抗ＡＣｈＲ抗体の検出用試薬として使用する上記の
モノクローン抗イデイオタイプ抗体は、放射性標識、酵
素標識、ビオチン標識、蛍光標識などの標識が施された
ものであってもよい。

【００１８】ヒトＩｇＧ↓1型モノクローン抗ＡＣｈＲ
抗体に特異的なモノクローン抗イデイオタイプ抗体によ
る抗ＡＣｈＲ抗体の除去は、例えば、かかるモノクロー
ン抗イデイオタイプ抗体を担体に固定化して形成される
抗ＡＣｈＲ抗体除去用吸着体を抗ＡＣｈＲ抗体を含有す
る体液と接触させ、該吸着体に抗ＡＣｈＲ抗体を吸着さ
せることによって実施される。モノクローン抗イデイオ
タイプ抗体を固定化する際に使用される担体としは、体
液に不溶性であり、一般に抗体を固定化する際に用いら
れるような担体が挙げられるが、抗体との間で共有結合
を形成させるために利用し得るアミノ基、カルボキシル
基などの反応性の官能基を有し、かつ親水性の表面を有
するものが好ましい。担体は粒子状、繊維状、シート
状、中空糸状などの任意の形状であることができる。か
かる担体としては、例えば、セルロファインＧＣＬ−２
０００Ｃ（チッソ株式会社製）などのセルロース系担
体、トリスアクリルＧＦ２０００〔Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ
ＧＦ２０００；スウエーデン国エル・ケー・ビー・プ
ロダクター（ＬＫＢ Ｐｒｏｄｕｋｔｅｒ）社製〕など
のポリアクリルアミド系担体、ＴＳＫｇｅｌトヨパール
ＨＷ−７５Ｃ（東洋曹達工業株式会社製）などのポリビ
ニルアルコール系担体、ＣＮＢｒ−セファロースＣＬ
４Ｂ〔ＣＮＢｒ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ４Ｂ；スウ
エーデン国ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製〕
などのアガロース系担体などの有機質担体及び多孔性ガ
ラスなどの無機質担体が挙げられる。また担体として、
ヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシエチルメタ
クリレートなどの親水性のアクリレート系若しくはメタ
クリレート系の単量体をアクリル酸、メタクリル酸、ア
ミノエチルアクリレートなどのアミノアルキルアクリレ
ート又はアミノエチルメタクリレートなどのアミノアル
キルメタクリレートと共重合させて得られる共重合体を
多孔性ガラスなどの基材の表面に被覆して得られる担体
（特公昭６１−５９１７５号公報参照）を使用すること
もできる。モノクローン抗イデイオタイプ抗体の担体へ
の固定化は一般に抗体を担体に固定化する場合に採用さ
れる方法に従って行われる。その固定化方法としては、
例えば、モノクローン抗イデイオタイプ抗体のアミノ基
と担体のアミノ基とをグルタルアルデヒドで架橋する方
法、担体のカルボキシル基をＮ−ヒドロキシコハク酸イ
ミドと反応させることによってスクシンイミドオキシカ
ルボニル基に変換し、これにモノクローン抗イデイオタ
イプ抗体のアミノ基を反応させる方法などが挙げられ
る。またモノクローン抗イデイオタイプ抗体を重症筋無
力症患者などの抗ＡＣｈＲ抗体を体内に保有する患者に
血管内投与する場合、モノクローン抗イデイオタイプ抗
体は抗ＡＣｈＲ抗体と免疫複合体を形成し、次いでかか
る免疫複合体は網内系細胞によって分解されることか
ら、モノクローン抗イデイオタイプ抗体を患者に血管内
投与することによってもその患者の体内から抗ＡＣｈＲ
抗体を除去することができる。

【００１９】本発明のヒトＩｇＧ↓1型モノクローン抗
ＡＣｈＲ抗体に特異的なモノクローン抗イデイオタイプ
抗体を製造するに際し、動物の免疫原として用いるヒト
ＩｇＧ↓1型モノクローン抗ＡＣｈＲ抗体は、例えば、
抗ＡＣｈＲ抗体を産生する能力を有するヒト細胞（以
下、このヒト細胞を抗ＡＣｈＲ抗体産生ヒト細胞と称す
る）を、増殖可能なヒトリンパ芽球様細胞又はヒトミエ
ローマ細胞のようなヒト新形成細胞との細胞融合；エプ
スタイン−バール・ウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒ
ｒ ｖｉｒｕｓ）などのウイルスに感染させることによ
る形質転換；またはインターロイキン２（ＩＬ−２）、
インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン５
（ＩＬ−５）、Ｂ細胞刺激因子１（ＢＳＦ−１）、Ｂ細
胞刺激因子２（ＢＳＦ−２）などの細胞増殖因子の存在
下における長期培養の操作に付し、ヒトＩｇＧ↓1型モ
ノクローン抗ＡＣｈＲ抗体を産生する能力を有する増殖
可能な細胞を選別し、培養することによりヒトＩｇＧ↓
1型モノクローン抗ＡＣｈＲ抗体を生成せしめ、これを
採取することによって取得することができる。上記の抗
ＡＣｈＲ抗体産生ヒト細胞としては、抗ＡＣｈＲ抗体を
自己抗体として有する重症筋無力症などの自己免疫疾患
の患者の胸腺、脾臓、リンパ節、末梢血などから取得さ
れるリンパ球が挙げられる。このリンパ球は重症筋無力
症患者の胸腺、脾臓などに比較的大量にかつ高濃度で存
在することから、抗ＡＣｈＲ抗体産生ヒト細胞としては
重症筋無力症患者の胸腺、脾臓などに存在するリンパ球
を使用するのが実用的である。上記の細胞融合において
用いるヒト新形成細胞としては、融合後、ヒトＩｇＧ↓
1型モノクローン抗ＡＣｈＲ抗体を産生する能力を有す
るハイブリドーマとの選別を容易にする観点から、ヒポ
キサンチン・アミノプテリン・チミジン感受性を有して
いる６−チオグアニン耐性細胞、８−アザグアニン耐性
細胞又は５−ブロモデオキシウリジン耐性細胞が好適で
ある。増殖可能なヒトリンパ芽球様細胞は、例えば、ヒ
トリンパ球にエプスタイン−バール・ウイルスなどのウ
イルスを感染させることによって該ヒトリンパ球を形質
転換することにより取得される。ヒポキサンチン・アミ
ノプテリン・チミジン感受性を有する増殖可能なヒトリ
ンパ芽球様細胞としては、例えばＧ（Ａｇ↓1）↓2−ｃ
ｌ７Ｂ株、ＧＭ４６７２株〔ジャーナル・オブ・エクス
ペリメンタル・メディスン（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅ
ｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）第１５８
巻、第７１８〜７３０頁（１９８３年）参照〕、Ｈ３
５．１．１，０４６７．３株〔ジャーナル・オブ・エク
スペリメンタル・メディスン（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）第１５
６巻、第９３０〜９３５頁（１９８２年）参照〕、ＫＲ
−４株〔プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンシス・オブ・ザ・ユナイテ
ッド・ステーツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ
ｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍ
ｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔ
ｅｄＳｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）第７９巻、
第６６５１〜６６５５頁（１９８２年）参照〕、ＲＨ−
Ｌ４株〔ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソツズ
（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｍｅｔｈｏｄｓ）第６１巻、第１７〜３２頁（１９８
３年）参照〕、ＧＭ１５００ ６ＴＧ−Ａ１２株〔ネイ
チャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２８８巻、第４８８〜４８９
頁（１９８０年）参照〕、ＷＩ−Ｌ２−７２９ＨＦ↓2
株〔ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）第１３２巻、第１７９
８〜１８０３頁（１９８４年）参照〕、ＬＩＣＲ−ＬＯ
Ｎ−ＨＭｙ−２株〔プロシーディングス・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンシス・オブ・ザ
・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ
ｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａ
ｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ
Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃ
ａ）第８０巻、第２０２６〜２０３０頁（１９８３年）
参照〕などが知られている。

【００２０】上記のＧ（Ａｇ↓1）↓2−ｃｌ７Ｂ株はリ
ウマチ患者の末梢血リンパ球をエプスタイン−バール・
ウイルスを用いて形質転換させ、得られた形質転換細胞
株に８−アザグアニン耐性を付与させることによって取
得された細胞株である。なお、Ｇ（Ａｇ↓1）↓2−ｃｌ
７Ｂ株はウアバイン耐性をも有する。またヒポキサンチ
ン・アミノプテリン・チミジン感受性を有するヒトミエ
ローマ細胞としては、例えば、Ｕ−２６６ＡＲ↓1株
〔プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシス・オブ・ザ・ユナイテッド・
ステーツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ
ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏ
ｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ
Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）第７７巻、第５
４２９〜５４３１頁（１９８０年）参照〕、ＲＰＭＩ８
２２６株〔ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ１５５；ジャーナル・
オブ・イムノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ）第１３１巻、第１２０１〜１２０４頁
（１９８３年）参照〕などが知られている。ヒトＩｇＧ
↓1型モノクローン抗ＡＣｈＲ抗体を産生する能力を有
する増殖可能な細胞の取得方法としては、抗ＡＣｈＲ抗
体産生ヒト細胞と増殖可能なヒトリンパ芽球様細胞との
細胞融合によって得るのが、その細胞が効率よく取得で
きる点並びに抗体産生能及び増殖能において優れる点か
ら、好ましく、抗ＡＣｈＲ抗体産生ヒト細胞とＧ（Ａｇ
↓1）↓2−ｃｌ７Ｂ株との細胞融合によって得るのが特
に好ましい。抗ＡＣｈＲ抗体産生ヒト細胞と増殖可能な
ヒトリンパ芽球様細胞との細胞融合によるヒトＩｇＧ↓
1型モノクローン抗ＡＣｈＲ抗体を産生する能力を有す
る増殖可能な細胞の取得及びその細胞を培養することに
よるヒトＩｇＧ↓1型モノクローン抗ＡＣｈＲ抗体の取
得は、前記のヒトＩｇＧ↓1型モノクローン抗ＡＣｈＲ
抗体で免疫した動物から得られる抗体産生細胞と新形成
細胞との細胞融合によるヒトＩｇＧ↓1型モノクローン
抗ＡＣｈＲ抗体に特異的なモノクローン抗イデイオタイ
プ抗体を産生する能力を有するハイブリドーマの取得及
びそのハイブリドーマを培養することによるモノクロー
ン抗イデイオタイプ抗体の取得において採用される方法
と同様の方法により行われる。このようにして取得され
るヒトＩｇＧ↓1型モノクローン抗ＡＣｈＲ抗体を産生
する能力を有する増殖可能な細胞としては、例えば、重
症筋無力症患者の胸腺に存在するリンパ球とＧ（Ａｇ↓
1）↓2−ｃｌ７Ｂ株とを融合させることによって得られ
たハイブリドーマから選別されたＴ／Ｇ−５９（５Ｃ）
株が挙げられる。またヒトＩｇＧ↓1型モノクローン抗
ＡＣｈＲ抗体を産生する能力を有する増殖可能な細胞を
培養することにより得られるヒトＩｇＧ↓1型モノクロ
ーン抗ＡＣｈＲ抗体としては、例えば、上記のＴ／Ｇ−
５９（５Ｃ）株によって産生される分子量が１８０００
０±２００００であり、かつＡＣｈＲに特異性を有する
ヒトＩｇＧ↓1型モノクローン抗体が挙げられる。この
分子量は例えばネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２２７
巻、第６８０〜６８５頁（１９７０年）などに記載され
ているドデシル硫酸ナトリウムの存在下に実施されるポ
リアクリルアミドゲル電気泳動法により求められる。こ
の方法に従う電気泳動法はヒトＩｇＧ↓1型モノクロー
ン抗ＡＣｈＲ抗体が還元的に分解されるのを避けるため
に２−メルカプトエタノールなどの還元剤の不存在下に
行われる。

【００２１】

【実施例】以下、実施例により本発明を説明するが、本
発明は実施例により限定されるものではない。 参考例１ （１） 胸腺細胞の取得

【００２２】重症筋無力症患者より摘出した胸腺をダブ
ルベツコのＭＥＭ培地〔ダブルベツコズ・モディフアイ
ド・イークルズ・メデイウム（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ
ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）〕
で洗浄したのち、ステンレスメッシュ上で粉砕し、メッ
シュを通過した細胞をＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて
３回遠心洗浄した。 （２） 細胞融合

【００２３】上記（１）で得られた胸腺細胞の１．０４
×１０↑8個とＧ（Ａｇ↓1）↓2−ｃｌ７Ｂ株の５．２
×１０↑7個とを、平均分子量１５００のポリエチレン
グリコール１ｇとＲＰＭＩ−１６４０培地１ｍｌとの混
合液の１ｍｌと混合して、３７℃の温度で２分間攪拌し
た。得られた混合物にＲＰＭＩ−１６４０培地９ｍｌを
攪拌下に徐々に加えたのち、この混合物を遠心分離する
ことにより、細胞混合物を沈殿物として得た。ＲＰＭＩ
−１６４０培地にヒポキサンチン、アミノプテリン、チ
ミジン及び牛胎児血清をそれぞれ１×１０↑-4モル／
ｌ、４×１０↑-7モル／ｌ、１．６×１０↑-5モル／ｌ
及び約１３容量％の濃度となるように加えることによっ
てＨＡＴ培地を調製し、次いで得られたＨＡＴ培地に上
記の細胞混合物を２．５×１０↑6個／ｍｌの濃度とな
るように加えた。このようにして得られた細胞を含有す
る培地をポリスチレン製のマイクロウエルプレート〔デ
ンマーク国ヌンク（Ｎｕｎｃ）社製、９６ウエルマイク
ロウエルプレートフタツキ×６個〕の５７５ウエル中に
０．１ｍｌ／ウエルずつ分注し、二酸化炭素を７％の濃
度で含む空気中において３７℃の温度で静置培養した。
培養開始より１０〜２０日後に１１８ウエルにおいてハ
イブリドーマの増殖が認められた。 （３） ヒト型抗体を産生するハイブリドーマの選別

【００２４】ヒトＩｇＧ（重鎖及び軽鎖）に対するヤギ
抗血清のＩｇＧ分画〔イスラエル国マイルズ−イエダ
（Ｍｉｌｅｓ−Ｙｅｄａ）社製、ＩｇＧフラクション・
オブ・アンチ・ヒューマンＩｇＧ（ＨアンドＬチェイン
ズ）（ＩｇＧ Ｆｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉ Ｈ
ｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ Ｃｈａｉｎｓ））〕をＰＢ
Ｓに０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度となるように溶解し、得
られた溶液をポリ塩化ビニル製のマイクロウエルプレー
ト〔米国ベクトン−デイッキンソン・アンド・カンパニ
ー（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏ
ｍｐａｎｙ）社製、ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）３９１
２、９６穴プレート〕のウエル中に５０μｌ／ウエルず
つ分注し、４℃の温度で１晩静置することによって抗体
をプレートに吸着させた。各ウエルから溶液を除去した
のち、牛胎児血清を５容量％含有するＰＢＳ溶液を３０
０μｌ／ウエルずつ分注し、３７℃の温度で２時間静置
することによって抗体が吸着していない固相表面のブロ
ッキングを行った。牛胎児血清を５容量％含有するＰＢ
Ｓ溶液で各ウエルを洗浄したのち、上記（２）において
ハイブリドーマの増殖が認められた培地の上清を５０μ
ｌ／ウエルずつ各ウエルに分注し、３７℃の温度で１時
間静置し、次いで牛胎児血清を５容量％含有するＰＢＳ
溶液で各ウエルを洗浄した。西洋ワサビペルオキシダー
ゼで標識したヒト免疫グロブリンに対する抗体〔イギリ
ス国アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社製、アシチヒュ
ーマンＩｇ，ペルオキシターゼリンクド，スピーシーズ
スペシフィック・ホール・アンチボデイ（Ａｎｔｉ−ｈ
ｕｍａｎ Ｉｇ，Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｌｉｎｋｅ
ｄ，Ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｗｈｏｌｅ
Ａｎｔｉｂｏｄｙ）〕を牛胎児血清を５容量％含有する
ＰＢＳ溶液に約２μｇ／ｍｌの濃度で溶解し、この溶液
を５０μｌ／ウエルずつ各ウエルに分注し、３７℃の温
度で１時間静置した。各ウエルをＰＢＳで洗浄したの
ち、２，２′−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾ
リン−６−スルホン酸）を１ミリモル／ｌ含有し、かつ
過酸化水素を０．００４５重量％含有するトリス緩衝塩
類溶液（ｐＨ：７．４）を１００μｌ／ウエルずつ各ウ
エルに分注し、室温下で１５分間振盪することによって
発色操作を行った。各ウエル中の溶液について波長４０
９ｎｍと５０１ｎｍにおける吸光度を測定した結果、１
１８ウエル中の溶液のうちの４９ウエル中の溶液につい
てその両波長での吸光度の差が大きいことから、これら
４９ウエル中に分注した上清を与えたハイブリドーマは
ヒト型抗体を産生していると判定した。 （４） ＡＣｈＲに特異性を有するヒトＩｇＧ型抗体を
産生するハイブリドーマの選別

【００２５】上記（３）で得られた４９種類のヒト型抗
体を産生するハイブリドーマについて、それらの培養上
清のＡＣｈＲに対する抗体価をＲＩＡ法によって評価し
た。すなわち、牛胎児筋肉２５ｇより抽出したＡＣｈＲ
を含有し、かつトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００
〔米国シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製、α−〔４−（１，
１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル〕−ω−ヒ
ドロキシポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）〕を２
容量％含有するトリス緩衝塩類溶液（ｐＨ：７．４）５
０ｍｌに↑125Ｉで標識したブンガロトキシン〔イギリ
ス国アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社製、α−ブンガ
ロトキシン（α−Ｂｕｎｇａｒｏｔｏｘｉｎ）；比活
性：約２００キユリー／ミリモル〕を放射能濃度が２０
０ナノキユリー／ｍｌとなるように混合し、混合液を室
温下で約２時間振盪した。得られた混合液の５０μｌず
つを各ハイブリドーマの培養上清５０μｌに加え、４℃
の温度で１晩静置した。得られた各々の混合液に、ヒト
ＩｇＧに対する抗血清〔西ドイツ国ヘキスト（Ｈｏｅｃ
Ｈｓｔ）社製、抗ＩｇＧ（γ鎖）血清（ウサギ）〔Ａｎ
ｔｉ−γＧ−Ｇｌｏｂｕｌｉｎ／ＩｇＧ（γ−ｃｈａｉ
ｎ）−Ｓｅｒｕｍ ｆｒｏｍ ｒａｂｂｉｔ〕〕をトリ
トンＸ−１００を０．１容量％含有するトリス緩衝塩類
溶液（ｐＨ：７．４）で２倍の容積となるように希釈し
て得られた溶液を５０μｌずつ加え、４℃の温度で１晩
静置した。生成した沈殿物の各々をトリトンＸ−１００
を０．１容量％含有するトリス緩衝塩類溶液（ｐＨ：
７．４）で３回遠心洗浄（回転数：３０００ｒｐｍ；所
要時間：２０分間）したのち、放射活性をオートウエル
ガンマカウンター（アロカ株式会社製、オートウエルガ
ンマシステムＡＲＣ−３６１）で測定した。前述の４９
種類のハイブリドーマのうちの４４種類のハイブリドー
マの培養上清を用いた場合に生成した沈殿物（試料Ｎ
ｏ．１〜４４）の放射活性を第１図に示す。また、比較
のため、ハイブリドーマの培養上清の代わりにＧ（Ａｇ
↓1）↓2−ｃｌ７Ｂ株の培養上清をを用いる以外は同様
の方法によって沈殿物（試料Ｎｏ．４５）を生成させ、
この沈殿物の放射活性を測定した。この測定結果も併せ
て第１図に示す。第１図に示されるように、試料Ｎｏ．
１０の沈殿物が高い放射活性を有することから、この沈
殿物が生成した培養上清はＡＣｈＲに対して高い抗体価
を有しており、この培養上清を与えたハイブリドーマは
ＡＣｈＲに特異性を有するヒトＩｇＧ型抗体を産生した
と判定した。（５） ハイブリドーマのクローニング

【００２６】上記（４）で得られたＡＣｈＲに特異性を
有するヒトＩｇＧ型抗体を産生するハイブリドーマにつ
いて限界希釈法によりクローニングを行った。すなわ
ち、このハイブリドーマを５０個／ｍｌ、１０個／ｍｌ
及び５個／ｍｌの濃度となるように牛胎児血清を約１３
容量％含有するＲＰＭＩ−１６４０培地で希釈し、これ
らの５０個／ｍｌ、１０個／ｍｌ及び５個／ｍｌの濃度
の希釈液をそれぞれポリスチレン製のマイクロウエルプ
レート〔デンマーク国ヌンク（Ｎｕｎｃ）社製、９６ウ
エルマイクロウエルプレートフタツキ〕の４０ウエル、
３２ウエル及び２４ウエルの中に０．１ｍｌ／ウエルず
つ分注し、二酸化炭素を７％含有する空気中において３
７℃の温度で静置培養した。培養開始より２〜４週間後
にプレートの１７ウエルにおいて細胞のコロニーが出現
した。コロニーが出現した各ウエルの培養上清につい
て、前記（４）におけると同様なＲＩＡ法によりＡＣｈ
Ｒに対する抗体価を測定し、ヒトＩｇＧ型モノクローン
抗ＡＣｈＲ抗体の産生能が高い１細胞株を取得した。こ
れをＴ／Ｇ−５９（５Ｃ）株と命名した。 （６） Ｔ／Ｇ−５９（５Ｃ）株が産生するヒトＩｇＧ
型モノクローン抗ＡＣｈＲ抗体の精製

【００２７】上記（５）で得られたＴ／Ｇ−５９（５
Ｃ）株を１×１０↑5個／ｍｌの濃度となるように牛胎
児血清を約１３容量％含有するＲＰＭＩ−１６４０培地
中に懸濁し、二酸化炭素を７％含有する空気中において
３７℃の温度で培養した。培地中の細胞の濃度が１×１
０↑6個／ｍｌ以上となった時点で、培養液から細胞を
遠心分離した。得られた細胞を１×１０↑5個／ｍｌの
濃度となるように組織培養用無血清培地（日本薬品開発
株式会社製、ハイブリティ−１）中に懸濁し、二酸化炭
素を７％含有する空気中において３７℃の温度で培養し
た。培地中の細胞の濃度が１×１０↑6個／ｍｌ以上と
なった時点で、培養液を遠心分離することにより上清を
約１．５ｌ得た。この上清を分画分子量１００００の限
外濾過膜〔米国ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）社製、
ＰＴＧＣ ０４３ １０〕で濃縮し、濃縮液を約３０ｍ
ｌ得た。濃縮液をゲル浸透クロマトグラフィー〔カラ
ム：東洋曹達工業株式会社製、ＴＳＫゲルＧ３０００Ｓ
Ｗ；溶離液：０．１モル／ｌの酢酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ：５．０）；流速：１ｍｌ／分〕に付し、流出液
を３０秒ごとに分画した。各画分のＡＣｈＲに対する抗
体価を前記（４）におけると同様なＲＩＡ法により測定
した。流出液の波長２８０ｎｍ（蛋白質の特異的な吸収
位置）における吸光度及び上記の一部の画分のＡＣｈＲ
に対する抗体価を第２図に示す。ＡＣｈＲに対して抗体
活性を有し、かつ波長２８０ｎｍにおいて高い吸光度を
示す溶出時間が１１．５〜１５．０分の範囲内にある画
分を合せ、これよりアフィニティクロマトグラフィー
〔担体：スエーデン国エル・ケー・ビー・プロダクター
（ＬＫＢ Ｐｒｏｄｕｋｔｅｒ）社製、ブルー・トリス
アクリルＭ（Ｂｌｕｅ Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ Ｍ）〕を
用いてアルブミンを除去した。得られたヒトＩｇＧ型モ
ノクローン抗ＡＣｈＲ抗体の一部をポリアクリルアミド
ゲル（アクリルアミドとＮ，Ｎ′−メチレンビスアクリ
ルアミドとの構成重量比＝３７対１；ゲル濃度：８重量
％）を用いてドデシル硫酸ナトリウム（濃度：０．１重
量％）の存在下に電気泳動させた結果、ヒトＩｇＧ型モ
ノクローン抗ＡＣｈＲ抗体の分子量は１８００００±２
００００であることが判明した。ヒトＩｇＧ型モノクロ
ーン抗ＡＣｈＲ抗体の電気泳動像及びヒトＩｇＧの市販
品〔米国マイルズ・ラボラトリーズ（Ｍｉｌｅｓ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製、ヒューマンＩｇＧ（Ｈｕ
ｍａｎ ＩｇＧ）の電気泳動像をそれぞれ第３図及び第
４図に示す。なお、上記のアフィニティクロマトグラフ
ィーによって得られたヒトＩｇＧ型モノクローン抗ＡＣ
ｈＲ抗体を含有するＰＢＳ溶液の波長２８０ｎｍにおけ
る吸光度とヒトＩｇＧの市販品を０．１重量％含有する
ＰＢＳ溶液の同波長における吸光度との比から、ヒトＩ
ｇＧ型モノクローン抗ＡＣｈＲ抗体の収量は約４．９ｍ
ｇであると判定した。 （７） ヒトＩｇＧ型モノクローン抗ＡＣｈＲ抗体のサ
ブクラスの決定

【００２８】上記（６）で得られたヒトＩｇＧ型モノク
ローン抗ＡＣｈＲ抗体のサブクラスをＥＬＩＳＡ法によ
り決定した。すなわち、得られたヒトＩｇＧ型モノクロ
ーン抗ＡＣｈＲ抗体をＰＢＳで希釈してまず５０μｇ／
ｍｌの溶液を調製し、次いでこの濃度より１／２倍ごと
の濃度にＰＢＳで希釈して０．０４９μｇ／ｍｌまでの
１１種類の濃度の溶液を調製した。各濃度の溶液をポリ
塩化ビニル製のマイクロウエルプレート〔米国ベクトン
−ディッキンソン・アンド・カンパニー（Ｂｅｃｔｏｎ
−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）社
製、ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）３９１２、９６穴ブレ
ート〕に５０μｌ／ウエルの量で４ウエルずつ分注し、
４℃の温度で１晩静置することにより、ヒトＩｇＧ型モ
ノクローン抗ＡＣｈＲ抗体をプレートに吸着させた。各
ウエルから溶液を除去したのち、牛胎児血清を５容量％
含有するＰＢＳ溶液を３００μｌ／ウエルずつ分注し、
３７℃の温度で２時間静置することによってヒトＩｇＧ
型モノクローン抗ＡＣｈＲ抗体が吸着していない固相表
面のブロッキングを行い、次いで各ウエルを牛胎児血清
を５容量％含有するＰＢＳ溶液で洗浄した。ヒトＩｇＧ
↓1、ヒトＩｇＧ↓2、ヒトＩｇＧ↓3及びヒトＩｇＧ↓4
に対するマウスモノクローン抗体〔それぞれイスラエル
国バイオ・イエダ（Ｂｉｏ−Ｙｅｄａ）社製、モノクロ
ーナル・アンチヒューマンＩｇＧ↓1：クローンＳＧ−
１１（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ
ＩｇＧ↓1：Ｃｌｏｎｅ ＳＧ−１１）；モノクローナ
ル・アンチヒューマンＩｇＧ↓2：クローンＨＰ−６０
１４（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ
ＩｇＧ↓2：ＣｌｏｎｅＨＰ−６０１４）；モノクロー
ナル・アンチヒューマンＩｇＧ↓3：クローンＨＰ−６
０５０（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ
ＩｇＧ↓3：ＣｌｏｎｅＨＰ−６０５０）及びモノク
ローナル・アンチヒューマンＩｇＧ↓4：クローンＨＰ
−２５（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ
ＩｇＧ↓4：ＣｌｏｎｅＨＰ−２５）〕をそれぞれ牛
胎児血清を５容量％含有するＰＢＳ溶液に５μｇ／ｍｌ
の濃度となるように溶解し、得られた４種類のマウスモ
ノクローン抗体の溶液をそれぞれヒトＩｇＧ型モノクロ
ーン抗ＡＣｈＲ抗体の吸着量が相異なる１１ウエル中に
５０μｌ／ウエルずつ分注し、３７℃の温度で１時間静
置し、次いで牛胎児血清を５容量％含有するＰＢＳ溶液
で各ウエルを洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼで
標識したマウス免疫グロブリンに対する抗体〔イギリス
国アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）アンチマウスＩｇ，
ペルオキシダーゼリンクド，スピーシーズスペシフイッ
ク・ホール・アンチボデイ（Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ Ｉ
ｇ，Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｌｉｎｋｅｄ，Ｓｐｅｃｉ
ｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｗｈｏｌｅ Ａｎｔｉｂｏｄ
ｙ）〕を牛胎児血清を５容量％含有するＰＢＳ溶液に約
２μｇ／ｍｌの濃度となるように溶解し、この溶液を各
ウエルに５０μｌ／ウエルずつ加えたのち、３７℃の温
度で１時間静置した。各ウエルをＰＢＳで洗浄したの
ち、各ウエルに２，２′−アジノ−ビス（３−エチルベ
ンゾチアゾリン−６−スルホン酸）を１ミリモル／ｌ含
有し、かつ過酸化水素を０．００４５重量％含有するト
リス緩衝塩類溶液（ｐＨ：７．４）を１００μｌ／ウエ
ルずつ分注し、室温下で１５分間振盪することによって
発色操作を行った。各ウエル中の溶液について波長４０
９ｎｍと５０１ｎｍにおける吸光度を測定し、両波長に
おける吸光度の差を第５図においてグラフで示す。Ｔ／
Ｇ−５９（５Ｃ）株によって産生されるヒトＩｇＧ型モ
ノクローン抗ＡＣｈＲ抗体はヒトＩｇＧ↓1に対するマ
ウスモノクローン抗体と特異的に結合したことが第５図
から明らかであるから、該ヒトＩｇＧ型モノクローン抗
ＡＣｈＲ抗体はＩｇＧ↓1サブクラスに属すると判定し
た。 実施例１： （１） 脾細胞の取得

【００２９】参考例１におけると同様な方法で得られた
ヒトＩｇＧ↓1型モノクローン抗ＡＣｈＲ抗体を含有す
る０．１モル／ｌの酢酸ナトリウム緩衝液をＰＢＳ（ｐ
Ｈ：７．４）に対して透析し、得られたヒトＩｇＧ↓1
型モノクローン抗ＡＣｈＲ抗体を含有するＰＢＳ溶液を
ＰＢＳで希釈することによってヒトＩｇＧ↓1型モノク
ローン抗ＡＣｈＲ抗体を１ｍｇ／ｍｌの濃度で含有する
ＰＢＳ溶液を調製し、次いでこれを濾過滅菌した。この
ヒトＩｇＧ↓1型モノクローン抗ＡＣｈＲ抗体を１ｍｇ
／ｍｌの濃度で含有するＰＢＳ溶液をこれと等容積のフ
ロイントの完全アジュバントと混合し、得られたエマル
ジョンの０．５ｍｌをＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に注
入することによって該マウスを免疫した。３週間後、上
記の滅菌したヒトＩｇＧ↓1型モノクローン抗ＡＣｈＲ
抗体を１ｍｇ／ｍｌの濃度で含有するＰＢＳ溶液を水酸
化アルミニウム微粒子の塩化ナトリウム水溶液中の懸濁
液（水酸化アルミニウム含有率：約１．２％；塩化ナト
リウム濃度：０．１５モル／ｌ）と等容積の割合で混合
し、得られた混合物の０．５ｍｌを上記のＢＡＬＢ／ｃ
マウスの腹腔内に注入することによって該マウスを追加
免疫した。追加免疫の３日後に、免疫されたＢＡＬＢ／
ｃマウスから脾臓を摘出し、これをステンレスメッシュ
上で粉砕し、メッシュを通過した粉砕物中の赤血球を塩
化アンモニウム及び２−アミノ−２−ヒドロキシメチル
−１，３−プロパンジオール（トリス）をそれぞれ０．
１４４モル／ｌ及び０．０１７モル／ｌの濃度で含む水
溶液（ｐＨ：７．２５）に溶血させることによって除去
した。赤血球を除去した脾細胞をＲＰＭＩ−１６４０培
地を用いて３回遠心洗浄した。 （２） 細胞融合

【００３０】上記（１）で得られた脾細胞の２．５×１
０↑8個とＰ↓3−ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１株の１．２５
×１０↑8個とを、平均分子量１５００のポリエチレン
グリコール１ｇとＲＰＭＩ−１６４０培地１ｍｌとの混
合液の１ｍｌとの混合して、３７℃の温度で２分間攪拌
した。得られた混合物にＲＰＭＩ−１６４０培地９ｍｌ
を攪拌下に徐々に加えたのち、この混合物を遠心分離す
ることにより、細胞混合物を沈殿物として得た。参考例
１の（２）で用いたものと同じＨＡＴ培地に細胞混合物
を１×１０↑7個／ｍｌの濃度となるように加えた。こ
のようにして得られた細胞を含有する培地をポリスチレ
ン製のマイクロウエルプレート〔デンマーク国ヌンク
（Ｎｕｎｃ）社製、９６ウエルマイクロウエルプレート
フタツキ×４個〕の３７１ウエル中に０．１ｍｌ／ウエ
ルずつ分注し、二酸化炭素を７％含む空気中において３
７℃の温度で静置培養した。培養開始より１０〜２０日
後に３０５ウエルにおいてハイブリドーマの増殖が認め
られた。 （３） 抗イデイオタイプ抗体を産生するハイブリドー
マの選別

【００３１】参考例１で得られたヒトＩｇＧ↓1型モノ
クローン抗ＡＣｈＲ抗体を０．０５ｍｇ／ｍｌ含有する
ＰＢＳ溶液をポリ塩化ビニル製のマイクロウエルプレー
ト〔米国ベクトン−ディッキンソン・アンド・カンパニ
ー（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏ
ｍｐａｎｙ）社製、ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）３９１
２、９６穴プレート〕のウエル中に５０μｌ／ウエルず
つ分注し、４℃の温度で１晩静置することによって抗体
をプレートに吸着させた。各ウエルから溶液を除去した
のち、牛胎児血清を５容量％含有するＰＢＳ溶液を３０
０μｌ／ウエルずつ分注し、３７℃の温度で２時間静置
することによって抗体が吸着していない固相表面のブロ
ッキングを行った。牛胎児血清を５容量％含有するＰＢ
Ｓ溶液で各ウエルを洗浄したのち、上記（２）において
ハイブリドーマの増殖が認められた培地の上清を５０μ
ｌ／ウエルずつ各ウエルに分注し、３７℃の温度で１時
間静置し、次いで牛胎児血清を５容量％含有するＰＢＳ
溶液で各ウエルを洗浄した。西洋ワサビペルオキシダー
ゼで標識したマウス免疫グロブリンに対する抗体〔イギ
リス国アマシヤム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社製、アンチマ
ウスＩｇ，ペルオキシダーゼリンクド，スピーシーズス
ペシフィック・ホール・アンチボデイ（Ａｎｔｉ−ｍｏ
ｕｓｅ Ｉｇ，Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｌｉｎｋｅｄ，
Ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｗｈｏｌｅ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｙ）〕を牛胎児血清を５容量％含有するＰＢ
Ｓ溶液に約２μｇ／ｍｌの濃度で溶解し、この溶液を５
０μｌ／ウエルずつ各ウエルに分注し、３７℃の温度で
１時間静置した。各ウエルをＰＢＳで洗浄したのち、
２，２′−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン
−６−スルホン酸）を１ミリモル／ｌ含有し、かつ過酸
化水素を０．００４５重量％含有するトリス緩衝塩類溶
液（ｐＨ：７．４）を１００μｌ／ウエルずつ各ウエル
に分注し、室温下で１５分間振盪することによって発色
操作を行った。各ウエル中の溶液について波長４０９ｎ
ｍと５０１ｎｍにおける吸光度を測定した。

【００３２】また参考例１で得られたヒトＩｇＧ↓1型
モノクローン抗ＡＣｈＲ抗体の代わりにヒトＩｇＧの市
販品〔米国マイルズ・ラボラトリーズ（Ｍｉｌｅｓ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製、ヒューマンＩｇＧ（Ｈ
ｕｍａｎ ＩｇＧ）〕を使用する以外は上記におけると
同様な操作を行い、各ウエル中の溶液について吸光度を
測定した。

【００３３】上記の吸光度測定の結果、上記（２）でハ
イブリドーマの増殖が認められた３０５ウエル中の培地
のうちの５ウエル中の培地の上清に由来する溶液につい
て、ヒトＩｇＧ↓1型モノクローン抗ＡＣｈＲ抗体を使
用した場合に得られた溶液においてはその波長４０９ｎ
ｍと５０１ｎｍにおける吸光度の差が大きいが、ヒトＩ
ｇＧの市販品を使用した場合に得られた溶液においては
その吸光度の差が実質的に認められなかったことから、
これら５ウエル中の培地の上清を与えたハイブリドーマ
はヒトＩｇＧ↓1型モノクローン抗ＡＣｈＲ抗体に特異
性を有する抗イデイオタイプ抗体を産生していると判定
した。 （４） ハイブリドーマのクローニング

【００３４】上記（３）で得られたヒトＩｇＧ↓1型モ
ノクローン抗ＡＣｈＲ抗体に特異性を有する抗イデイオ
タイプ抗体を産生するハイブリドーマについて限界希釈
法によりクローニングを行った。このクローニングは参
考例１の（５）におけると同様の方法により行い、コロ
ニーが出現した各ウエルの培養上清について上記（３）
におけると同様なＥＬＩＳＡ法によりヒトＩｇＧ↓1型
モノクローン抗ＡＣｈＲ抗体及びヒトＩｇＧの市販品に
対する抗体価を測定し、ヒトＩｇＧ↓1型モノクローン
抗ＡＣｈＲ抗体に特異的なモノクローン抗イデイオタイ
プ抗体の産生能が高い４細胞株を取得した。これらをそ
れぞれＴＡ−１株、ＴＡ−２株、ＴＡ−３株及びＴＡ−
５株と命名した。 （５） モノクローン抗イデイオタイプ抗体のサブクラ
スの決定

【００３５】上記（４）で得られた４細胞株が産生する
モノクローン抗イデイオタイプ抗体のサブクラスをＥＬ
ＩＳＡ法により決定した。すなわち、４細胞株の培養上
清をそれぞれマウス免疫グロブリン用検定キット〔米国
ザイメット（Ｚｙｍｅｄ）社製、ＭｏｎｏＡｂ−ＩＤ
ＥＩＡキット（ＭｏｎｏＡｂ−ＩＤ ＥＩＡ Ｋｉ
ｔ）〕を用いて検定した結果、これらの４細胞株が産生
するモノクローン抗イデイオタイプ抗体はいずれもＩｇ
Ｇ↓1（κ）サブクラスに属すると判定した。 （６） モノクローン抗イデイオタイプ抗体の特異性の
評価

【００３６】上記（４）で得られた４細胞株が産生する
モノクローン抗イデイオタイプ抗体の特異性をＥＬＩＳ
Ａ法により評価した。すなわち、４細胞株の培養上清を
それぞれ牛胎児血清を５容量％含有するＰＢＳ溶液で希
釈してまず２倍の希釈倍数の溶液を調製し、次いで順次
牛胎児血清を５容量％含有するＰＢＳ溶液で２倍ごとの
希釈倍数で希釈して２０４８倍の希釈倍数までの１１種
類の希釈溶液を調製した。上記（３）においてハイブリ
ドーマの培養上清の代わりに４細胞株の培養上清及びそ
れらを希釈して調製した各希釈溶液を使用する以外は同
様なＥＬＩＳＡ法により、各溶液についてヒトＩｇＧ↓
1型モノクローン抗ＡＣｈＲ抗体に対する抗体価及びヒ
トＩｇＧの市販品に対する抗体価をそれぞれ測定した。
ＴＡ−１株、ＴＡ−２株、ＴＡ−３株及びＴＡ−５株の
培養上清並びにそれらを希釈して調製した各溶液につい
て波長４０９ｎｍと５０１ｎｍにおける吸光度を測定
し、両波長における吸光度の差を第６図、第７図、第８
図及び第９図においてそれぞれグラフで示す。４細胞株
によって産生されるモノクローン抗イデイオタイプ抗体
はいずれもヒトＩｇＧ↓1型モノクローン抗ＡＣｈＲ抗
体に特異的に結合したことがグラフから明らかであるか
ら、これらのモノクローン抗イデイオタイプ抗体はヒト
ＩｇＧ↓1型モノクローン抗ＡＣｈＲ抗体に特異性を有
すると判定した。 （７） モノクローン抗イデイオタイプ抗体の精製

【００３７】上記（４）で得られた４細胞株をそれぞれ
濃度が５×１０↑4個／ｍｌとなるように牛胎児血清を
約１３容量％含有するＲＰＭＩ−１６４０培地中に懸濁
し、二酸化炭素を７％含有する空気中において３７℃の
温度で培養した。培地中の細胞の濃度が１×１０↑6個
／ｍｌ以上となった時点で培養液を遠心分離することに
より上清を得た。マウスＩｇＧに対するヤギ抗血清〔イ
スラエル国バイオ−イエダ（Ｂｉｏ−Ｙｅｄａ）社製、
アンチ・マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＡｎｔｉＭｏｕｓｅ
ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ））〕を硫酸アンモニウムで塩析する
ことによってマウスＩｇＧに対する抗体を得、このマウ
スＩｇＧに対する抗体をアガロース系担体〔スウエーデ
ン国ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製、ＣＮＢ
ｒ−セファロースＣＬ ４Ｂ（ＣＮＢｒ−Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅ ＣＬ ４Ｂ）〕に固定化してマウスＩｇＧ用吸
着体を得た。このマウスＩｇＧ用吸着体を用いて前記の
４細胞株の培養上清のうちの１００ｍｌずつをアフィニ
ティクロマトグラフィーに付した。マウスＩｇＧ用吸着
体におけるヒトＩｇＧ↓1型モノクローン抗ＡＣｈＲ抗
体に特異的なモノクローン抗イデイオタイプ抗体をグリ
シン−塩酸緩衝液（ｐＨ：２．５）で溶出させることに
よって、該モノクローン抗イデイオタイプ抗体をそれぞ
れ約５ｍｇ得た。４細胞株のそれぞれによって産生され
たモノクローン抗イデイオタイプ抗体の一部を参考例１
の（６）におけると同様な方法でポリアクリルアミドゲ
ルを用いてドデシル硫酸ナトリウムの存在下に電気泳動
させた結果、それらのモノクローン抗イデイオタイプ抗
体の分子量はいずれも１７００００±２００００である
ことが判明した。 参考例２

【００３８】参考例１の（７）で得られたＴＡ−１株、
ＴＡ−２株、ＴＡ−３株及びＴＡ−５株によって産生さ
れるモノクローン抗イデイオタイプ抗体の約２ｍｇずつ
をそれぞれ０．１ミリモル／ｌの濃度の炭酸水素ナトリ
ウム水溶液の２ｍｌに溶解し、この溶液にスルホスクシ
ンイミジル ６−（ビオチンアミド）ヘキサノエート
〔米国ピアス・ケミカル（ＰＩＥＲＣＥ ＣＨＥＭＩＣ
ＡＬ）社製、ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（ＮＨＳ−ＬＣ−
ＢＩＯＴＩＮ）〕を１ｍｇ／ｍｌの濃度で含有するジメ
チルホルムアミド溶液２００μｌを加え、混合液を室温
で４時間静置した。得られた各混合液を４℃の温度でＰ
ＢＳに対して透析することにより、ビオチンで標識した
モノクローン抗イデイオタイプ抗体を含有するＰＢＳ溶
液をそれぞれ得た。 実施例２

【００３９】実施例１の（７）で得られたＴＡ−３株に
よって産生されたモノクローン抗イデイオタイプ抗体及
び参考例２で該モノクローン抗イデイオタイプ抗体から
得たビオチンで標識したモノクローン抗イデイオタイプ
抗体を抗ＡＣｈＲ抗体の検出用試薬として用い、重症筋
無力症患者の血清中での抗ＡＣｈＲ抗体の濃度をＥＬＩ
ＳＡ法により定量した。

【００４０】実施例１の（７）で得られたＴＡ−３株に
よって産生されたモノクローン抗イデイオタイプ抗体を
０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度で含有するＰＢＳ溶液をポリ
スチレン製のマイクロウエルプレート〔米国ベクトン−
ディッキンソン・アンド・カンパニー（Ｂｅｃｔｏｎ−
Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）社製、
ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）３９１５、９６穴プレー
ト〕のウエル中に５０μｌ／ウエルずつ分注し、４℃の
温度で１晩静置することによってモノクローン抗イデイ
オタイプ抗体をプレートに吸着させた。各ウエルから溶
液を除去したのち、牛胎児血清を５容量％含有するＰＢ
Ｓ溶液を３００μｌ／ウエルずつ分注し、３７℃の温度
で２時間静置することによって、モノクローン抗イデイ
オタイプ抗体が吸着していない固相表面のブロッキング
を行い、次いで各ウエルを牛胎児血清を５容量％含有す
るＰＢＳ溶液で洗浄した。重症筋無力症患者２０人から
採取した血清の５０μｌを１ウエルずつに注ぎ、３７℃
で２時間静置し、次いで各ウエルを牛胎児血清を５容量
％含有するＰＢＳ溶液で洗浄した。参考例２においてＴ
Ａ−３株によって産生されたモノクローン抗イデイオタ
イプ抗体から得たビオチンで標識したモノクローン抗イ
デイオタイプ抗体を含有するＰＢＳ溶液を用いて、該ビ
オチンで標識したモノクローン抗イデイオタイプ抗体及
び牛胎児血清をそれぞれ４μｇ／ｍｌ及び５容量％の濃
度で含有するＰＢＳ溶液を調製し、得られたＰＢＳ溶液
を５０μｌ／ウエルずつ各ウエルに分注し、３７℃の温
度で１時間静置し、次いで各ウエルを牛胎児血清を５容
量％含有するＰＢＳ溶液で洗浄した。西洋ワサビペルオ
キシターゼで標識したストレプトアビジン〔米国ビー・
アール・エル（ＢＲＬ）社製、ストレプトアビジン−ホ
ースラディッシュ・ペルオキシターゼ・コンジュゲート
（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ
ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）〕を牛
胎児血清を５容量％含有するＰＢＳ溶液で約５００倍の
重量に希釈し、この希釈溶液を各ウエルに５０μｌ／ウ
エルずつ加えたのち、３７℃の温度で１時間静置した。
各ウエルをＰＢＳで洗浄したのち、２，２′−アジノ−
ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）
を１ミリモル／ｌ含有し、かつ過酸化水素を０．００４
５重量％含有するトリス緩衝塩類溶液（ｐＨ：７．４）
を１００μｌ／ウエルずつ各ウエルに分注し、室温下で
１５分間振盪することによって発色操作を行った。

【００４１】上記の操作において、重症筋無力症患者か
ら採取した血清の代わりに、参考例１で得られたヒトＩ
ｇＧ↓1型モノクローン抗ＡＣｈＲ抗体を０．１ｎｇ／
ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの範囲内の既知濃度で含有し、か
つ牛胎児血清を５容量％の濃度で含有するＰＢＳ溶液を
用いる以外は同様な操作を行った。

【００４２】血清並びにヒトＩｇＧ↓1型モノクローン
抗ＡＣｈＲ抗体及び牛胎児血清を含有するＰＢＳ溶液に
ついて波長４０９ｎｍと５０１ｎｍにおける吸光度を測
定し、両波長における吸光度の差を求めた。ヒトＩｇＧ
↓1型モノクローン抗ＡＣｈＲ抗体及び牛胎児血清を含
有するＰＢＳ溶液について求めた吸光度の差に基づいて
検量線を作成し、この検量線を用いて血清中の抗ＡＣｈ
Ｒ抗体の濃度を求めた。その結果、重症筋無力症患者か
ら採取した血清中の抗ＡＣｈＲ抗体の濃度はいずれも約
１０〜３０ｎｇ／ｍｌの範囲内であることが判明した。

【００４３】ＴＡ−３株によって産生されたモノクロー
ン抗イデイオタイプ抗体及びそれから得たビオチン標識
したモノクローン抗イデイオタイプ抗体の代わりに、Ｔ
Ａ−１株、ＴＡ−２株及びＴＡ−５株によってそれぞれ
産生されたモノクローン抗イデイオタイプ抗体並びにそ
れから得たビオチンで標識したモノクローン抗イデイオ
タイプ抗体をそれぞれ抗ＡＣｈＲ抗体の検出用試薬とし
て用いる以外は上記におけると同様なＥＬＩＳＡ法によ
って重症筋無力症患者の血清中での抗ＡＣｈＲ抗体の濃
度を求めた。いずれの抗ＡＣｈＲ抗体の検出用試薬を用
いた場合においても、重症筋無力症患者から採取した血
清中での抗ＡＣｈＲ抗体の濃度は約１０〜３０ｎｇ／ｍ
ｌの範囲内であることが判明した。 実施例３

【００４４】臭化シアンで活性化されたアガロース粒子
〔スウエーデン国ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
社製、ＣＮＢｒ−セファロースＣＬ ４Ｂ（ＣＮＢｒ−
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ ４Ｂ）〕の１ｇを塩化ナト
リウム及び炭酸水素ナトリウムをそれぞれ０．５モル／
ｌ及び０．１モル／ｌ含有する水溶液（ｐＨ：８．３）
で洗浄し、得られた懸濁物を吸引濾過した。得られたゲ
ルを、実施例１におけると同様な方法で得られたＴＡ−
３株によって産生されたモノクローン抗イデイオタイプ
抗体を７ｍｇ含有し、かつ塩化ナトリウム及び炭酸水素
ナトリウムをそれぞれ０．５モル／ｌ及び０．１モル／
ｌの濃度で含有する水溶液（ｐＨ：８．３）の１０ｍｌ
に加え、得られた混合物を４℃の温度で一晩攪拌した。
攪拌終了後、混合物を吸引濾過した。濾液について波長
２８０ｎｍにおける吸光度を測定したが、モノクローン
抗イデイオタイプ抗体に基づく吸収は認められなかっ
た。得られたゲルをグリシンを１モル／ｌ含有するＰＢ
Ｓ溶液の１０ｍｌ中に加え、この混合物を４℃の温度で
一晩攪拌した。得られた混合物をＰＢＳで洗浄し、吸引
濾過することによって、モノクローン抗イデイオタイプ
抗体の７ｍｇが固定化されたアガロース粒子のゲルを約
３．５ｇ得た。

【００４５】ＴＡ−３株によって産生されたモノクロー
ン抗イデイオタイプ抗体の代わりにＴＡ−１株、ＴＡ−
２株及びＴＡ−５株によってそれぞれ産生されたモノク
ローン抗イデイオタイプ抗体を用いる以外は上記におけ
ると同様な方法によりモノクローン抗イデイオタイプ抗
体の７ｍｇが固定化されたアガロース粒子のゲルをそれ
ぞれ約３．５ｇ得た。 実施例４

【００４６】５０容量％のジオキサン水溶液の１５ｍｌ
中にエピクロルヒドリン２．５ｍｌを加えて攪拌した。
得られた溶液を、セルロース粒子（チッソ株式会社製、
セルロファインＧＣＬ−２０００Ｃ）を含水させて得ら
れたゲルの１０ｇ及び２規定の水酸化ナトリウム水溶液
６．５ｍｌと混合し、混合物を４０℃の温度で２時間攪
拌した。得られた混合物を水洗し、吸引濾過した。得ら
れたゲルのうちの８．３ｇを２５〜２８重量％のアンモ
ニア水溶液１６．８ｍｌと混合し、この混合物を４０℃
の温度で２．５時間攪拌した。得られた混合物を水及び
ジオキサンで順次洗浄し、吸引濾過することによって、
ジオキサンを含有するゲルを得た。このゲルの７．５３
ｇを、無水コハク酸１．６ｇとジオキサン２４ｍｌとか
らなる溶液と混合し、混合物を室温下で一晩攪拌した。
得られた混合物をジオキサンで洗浄し、吸引濾過した。
得られたゲルの７．４５ｇをＮ−ヒドロキシコハク酸イ
ミド０．３５８ｇ、ジシクロヘキシルカルボジイミド
０．７７１ｇ及びジオキサン２９．８ｍｌと混合し、混
合物を室温下で一晩攪拌した。得られた混合物をジオキ
サン及び１０ミリモル／ｌのリン酸塩緩衝液（ｐＨ：
７．４）で順次洗浄し、次いで吸引濾過した。得られた
ゲルのうちの３．５ｇを、実施例１におけると同様な方
法によって得られたＴＡ−３株によって産生されたモノ
クローン抗イデイオタイプ抗体の７ｍｇ及び１０ミリモ
ル／ｌのリン酸塩緩衝液（ｐＨ：７．４）１５ｍｌと混
合し、混合物を４℃の温度で一晩攪拌した。得られた混
合物を吸引濾過した。濾液について波長２８０ｎｍにお
ける吸光度を測定したが、モノクローン抗イデイオタイ
プ抗体に基づく吸引は認められなかった。得られたゲル
をＰＢＳで洗浄し、吸引濾過することによって、モノク
ローン抗イデイオタイプ抗体の７ｍｇが固定化されたセ
ルロース粒子のゲルを約３．５ｇ得た。

【００４７】ＴＡ−３株によって産生されたモノクロー
ン抗イデイオタイプ抗体の代わりにＴＡ−１株、ＴＡ−
２株及びＴＡ−５株によってそれぞれ産生されたモノク
ローン抗イデイオタイプ抗体を用いる以外は上記におけ
ると同様な方法によって、モノクローン抗イデイオタイ
プ抗体の７ｍｇが固定化されたセルロース粒子のゲルを
それぞれ約３．５ｇ得た。 実施例５

【００４８】重症筋無力症患者３人から採取した血清
（血清番号１〜３）の各１ｍｌに、実施例３で得られた
ＴＡ−３株によって産生されたモノクローン抗イデイオ
タイプ抗体が固定化されたアガロース粒子のゲルを５０
ｍｇずつ加え、該アガロース粒子を３７℃の温度で３時
間懸濁させた。得られた懸濁物を遠心分離し、上清を得
た。得られた上清中及び懸濁処理前の血清中における抗
ＡＣｈＲ抗体の濃度を実施例２におけると同様なＥＬＩ
ＳＡ法により定量した。その結果を第１表に示す。 比較例１

【００４９】実施例５において、ＴＡ−３株によって産
生されたモノクローン抗イデイオタイプ抗体が固定化さ
れたアガロース粒子のゲル５０ｍｇの代わりに実施例３
におけると同様な方法により得られたヒトＩｇＧの市販
品〔米国マイルズ・ラボラトリーズ（Ｍｉｌｅｓ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製、ヒューマンＩｇＧ（Ｈｕ
ｍａｎ ＩｇＧ）〕が固定化されたアガロース粒子のゲ
ル５０ｍｇを用いる以外は、同様な操作を行った。得ら
れた上清中における抗ＡＣｈＲ抗体の濃度の定量結果を
第１表に示す。

【００５０】

【表１】 実施例６

【００５１】実施例５において、ＴＡ−３株によって産
生されたモノクローン抗イデイオタイプ抗体が固定化さ
れたアガロース粒子のゲル５０ｍｇの代わりにＴＡ−１
株、ＴＡ−２株及びＴＡ−５株によってそれぞれ産生さ
れたモノクローン抗イデイオタイプ抗体が固定化された
アガロース粒子のゲル５０ｍｇずつを用いる以外は、同
様な操作を行った。懸濁処理後に得られた上清中での抗
ＡＣｈＲ抗体の濃度を定量した結果、血清中の抗ＡＣｈ
Ｒ抗体の除去率はいずれの場合も約５０〜７０％の範囲
内であることが判明した。 実施例７

【００５２】実施例５において、ＴＡ−３株によって産
生されたモノクローン抗イデイオタイプ抗体が固定化さ
れたアガロース粒子のゲル５０ｍｇの代わりに、実施例
４において得られたＴＡ−１株、ＴＡ−２株、ＴＡ−３
株及びＴＡ−５株によってそれぞれ産生されたモノクロ
ーン抗イデイオタイプ抗体が固定化されたセルロース粒
子のゲル５０ｍｇずつを用いる以外は、同様な操作を行
った。懸濁処理後に得られた上清中での抗ＡＣｈＲ抗体
の濃度を定量した結果、血清中の抗ＡＣｈＲ抗体の除去
率はいずれの場合も約５０〜６５％の範囲内であること
が判明した。

【００５３】

【発明の効果】本発明によれば、上記の実施例から明ら
かなとおり、新規なハイブリドーマを用いることにより
ヒトＩｇＧ↓1型モノクローン抗ＡＣｈＲ抗体に特異的
な新規なモノクローン抗イデイオタイプ抗体が効率的に
製造される。該モノクローン抗イデイオタイプ抗体は抗
ＡＣｈＲ抗体の検出用試薬及び抗ＡＣｈＲ抗体除去用吸
着体において利用される。この抗ＡＣｈＲ抗体除去用吸
着体を使用することによって、抗ＡＣｈＲ抗体を除去す
ることが可能である。

【図面の簡単な説明】

【図１】参考例１の（４）においてヒト型抗体を産生す
る４９種類のハイブリドーマのうちの４４種類のハイブ
リドーマの培養上清を用いた場合に生成した沈殿物（試
料Ｎｏ．１〜４４）及びＧ（Ａｇ↓1）↓2−ｃｌ ７Ｂ
株の培養上清を用いた場合に生成した沈殿物（試料Ｎ
ｏ．４５）の放射活性を示す。

【図２】参考例１の（６）においてＴ／Ｇ−５９（５
Ｃ）株の培養上清の濃縮液をゲル浸透クロマトグラフィ
ーに付して得られた流出液の波長２８０ｎｍにおける吸
光度及び一部の画分についてＲＩＡ法で測定したＡＣｈ
Ｒに対する抗体価を示す。

【図３】参考例１の（６）において得られたヒトＩｇＧ
型モノクローン抗ＡＣｈＲ抗体の電気泳動像を示す。

【図４】ヒトＩｇＧの市販品の電気泳動像を示す。

【図５】参考例１の（７）において発色操作に付して得
られたマイクロウエルプレートの各ウエル中の溶液につ
いて測定した波長４０９ｎｍと５０１ｎｍにおける吸光
度の差を示す。横軸は各ウエルに分注したヒトＩｇＧ型
モノクローン抗ＡＣｈＲ抗体を含有するＰＢＳ溶液中で
の該ヒトＩｇＧ型モノクローン抗ＡＣｈＲ抗体の濃度を
示す。

【図６】ＴＡ−１株の培養上清（希釈倍数１の溶液）並
びにそれらを希釈して調製した溶液について測定した波
長４０９ｎｍと５０１ｎｍにおける吸光度の差を示す。
横軸は各ウエルに分注した溶液における培養上清の希釈
倍数を示す。

【図７】ＴＡ−２株の培養上清（希釈倍数１の溶液）並
びにそれらを希釈して調製した溶液について測定した波
長４０９ｎｍと５０１ｎｍにおける吸光度の差を示す。
横軸は各ウエルに分注した溶液における培養上清の希釈
倍数を示す。

【図８】ＴＡ−３株の培養上清（希釈倍数１の溶液）並
びにそれらを希釈して調製した溶液について測定した波
長４０９ｎｍと５０１ｎｍにおける吸光度の差を示す。
横軸は各ウエルに分注した溶液における培養上清の希釈
倍数を示す。

【図９】ＴＡ−５株の培養上清（希釈倍数１の溶液）並
びにそれらを希釈して調製した溶液について測定した波
長４０９ｎｍと５０１ｎｍにおける吸光度の差を示す。
横軸は各ウエルに分注した溶液における培養上清の希釈
倍数を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/08 9161−4Ｂ // Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＡＲ Ｎ ＡＢＪ Ｃ０７Ｋ 16/28 8318−4Ｈ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｎ 33/577 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 大村 祐章 大阪市北区梅田１丁目12番39号 株式会社 クラレ内 (72)発明者 高倉 孝一 大阪市北区梅田１丁目12番39号 株式会社 クラレ内

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｔ／Ｇ−５９（５Ｃ）株が産生するニコ
   チン性アセチルコリンレセプターに特異性を有するヒト
   ＩｇＧ↓1型モノクローン抗体で動物を免疫して得られ
   た抗体産生細胞を新形成細胞と融合させることによって
   得られ、該ヒトＩｇＧ↓1型モノクローン抗体に特異的
   なモノクローン抗イデイオタイプ抗体を産生する能力を
   有するハイブリドーマ。