JPH0759575A - 発現調節ｄｎａ - Google Patents
発現調節ｄｎａInfo
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- JPH0759575A JPH0759575A JP5206461A JP20646193A JPH0759575A JP H0759575 A JPH0759575 A JP H0759575A JP 5206461 A JP5206461 A JP 5206461A JP 20646193 A JP20646193 A JP 20646193A JP H0759575 A JPH0759575 A JP H0759575A
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- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 イネ科植物の種子で強力に発現するｗａｘｙ
遺伝子（アミロース合成酵素をコードする遺伝子）の
５’上流域の構造と機能を解析することにより、同遺伝
子の組織特異的、量的発現に必要なエンハンサー領域の
配列を特定した。 【効果】 外来遺伝子を本発明のエンハンサー領域と連
結しイネ科植物に導入すれば、種子の成分を意図的に改
良したり種子において物質生産を行うことが可能にな
る。
遺伝子（アミロース合成酵素をコードする遺伝子）の
５’上流域の構造と機能を解析することにより、同遺伝
子の組織特異的、量的発現に必要なエンハンサー領域の
配列を特定した。 【効果】 外来遺伝子を本発明のエンハンサー領域と連
結しイネ科植物に導入すれば、種子の成分を意図的に改
良したり種子において物質生産を行うことが可能にな
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、イネ科植物の種子で構
造遺伝子を強力に発現させる発現調節ＤＮＡに関する。
造遺伝子を強力に発現させる発現調節ＤＮＡに関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】イネ
に代表されるイネ科植物は、例えば貴重な食料源として
世界中で消費されている。日本におけるイネの品種改良
は、国あるいは県の農業試験機関により行われ、日本の
農業事情や食生活に寄与してきた。それは人工あるいは
自然の突然変異を選抜しかけ合わせる事で築かれてきた
技術である。その代表的な産物は、コシヒカリやササニ
シキであり、現在広く栽培されている品種の大部分はこ
れらの血筋を引いている。昨今では、恵まれた食生活を
反映して消費者の米に対する嗜好の多様化に対応する品
種の作出が望まれており、全く新しい種子形質を持った
育種母本を探している。ところが、従来のこの掛け合わ
せによる品種改良によっては、画期的に新しい品種の作
出は期待できないのが現状である。そこで、イネの種子
形質に着目し、この部分だけを狙って成分を改良し新し
い食味や形質をもつ米を作る事ができれば画期的である
と考えられた。
に代表されるイネ科植物は、例えば貴重な食料源として
世界中で消費されている。日本におけるイネの品種改良
は、国あるいは県の農業試験機関により行われ、日本の
農業事情や食生活に寄与してきた。それは人工あるいは
自然の突然変異を選抜しかけ合わせる事で築かれてきた
技術である。その代表的な産物は、コシヒカリやササニ
シキであり、現在広く栽培されている品種の大部分はこ
れらの血筋を引いている。昨今では、恵まれた食生活を
反映して消費者の米に対する嗜好の多様化に対応する品
種の作出が望まれており、全く新しい種子形質を持った
育種母本を探している。ところが、従来のこの掛け合わ
せによる品種改良によっては、画期的に新しい品種の作
出は期待できないのが現状である。そこで、イネの種子
形質に着目し、この部分だけを狙って成分を改良し新し
い食味や形質をもつ米を作る事ができれば画期的である
と考えられた。
【０００３】一方、今日植物への遺伝子導入が実用化に
向けて行われているが、この点についてはイネにおいて
も技術的にクリアされつつある。ここで必要とされるの
が組織特異的エンハンサーである。これは外来遺伝子を
目的の組織で、適当な時期に、必要十分量発現させるた
めの調節領域である。イネの遺伝子は今日までにいくつ
か単離されてきているが、それらが植物内でどのような
発現パターンを示すのか、あるいはどの領域が重要であ
るかについてはまだほとんど情報が得られていないのが
現状であった。
向けて行われているが、この点についてはイネにおいて
も技術的にクリアされつつある。ここで必要とされるの
が組織特異的エンハンサーである。これは外来遺伝子を
目的の組織で、適当な時期に、必要十分量発現させるた
めの調節領域である。イネの遺伝子は今日までにいくつ
か単離されてきているが、それらが植物内でどのような
発現パターンを示すのか、あるいはどの領域が重要であ
るかについてはまだほとんど情報が得られていないのが
現状であった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、イネ科植
物の種子で強力に発現するｗａｘｙ遺伝子（アミロース
合成酵素（ＷＡＸＹ蛋白）をコードする遺伝子）の調節
領域についてその構造と機能を明らかにし、イネ科植物
の種子の改良あるいは種子での物質生産に利用できるよ
うにしようと考えた。そこでイネ科植物の種子で強力に
発現するｗａｘｙ遺伝子の５’上流域の構造と機能を解
析した結果、その組織特異的、量的発現の調節に必要な
エンハンサー領域を初めて明らかにし、本発明を完成す
るに至った。
物の種子で強力に発現するｗａｘｙ遺伝子（アミロース
合成酵素（ＷＡＸＹ蛋白）をコードする遺伝子）の調節
領域についてその構造と機能を明らかにし、イネ科植物
の種子の改良あるいは種子での物質生産に利用できるよ
うにしようと考えた。そこでイネ科植物の種子で強力に
発現するｗａｘｙ遺伝子の５’上流域の構造と機能を解
析した結果、その組織特異的、量的発現の調節に必要な
エンハンサー領域を初めて明らかにし、本発明を完成す
るに至った。
【０００５】すなわち本発明の要旨は、イネｗａｘｙ遺
伝子の転写開始点より−６３７〜−２７５塩基５’上流
に存在する発現調節ＤＮＡに存する。以下、本発明につ
き詳細に説明する。 １．ｗａｘｙ遺伝子調節領域の構造ｗａｘｙ 遺伝子は種子での形質の変化（変異）を容易に
検出できるので、トウモロコシを中心に遺伝学的研究に
用いられてきた。ゲノミックＤＮＡは初めにトウモロコ
シで単離され（Ｋｌｏｓｇｅｎ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅ
ｎ．，２０３，２３７−２４４，１９８６）、これをプ
ローブにしてほかの植物でもｃＤＮＡやゲノミックＤＮ
Ａが単離されてきた（小麦：Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ，Ｐｌ
ａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１６，１
０９９−１１０１，１９９１；大麦：Ｒｏｈｄｅ，Ｎｕ
ｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６，７１８５，１９８
８；じゃがいも：Ｒｏｈｄｅ，Ｊ．Ｇｅｎ．ａｎｄ Ｂ
ｒｅｅｄ．，４４，３１１−３１５，１９９０；イネ：
Ｗａｎｇ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５
８９８，１９９０）。ｗａｘｙ遺伝子の最終的な産物で
あるアミロースの蓄積から、この遺伝子は胚乳、花粉、
胚嚢で発現することが知られている。しかしその組織特
異性や発現量を決める調節領域についての解析はまだ進
んでいない。ｗａｘｙ遺伝子の発現が抑制されるとアミ
ロースの合成はなくなるが、元来ｗａｘｙ遺伝子はそれ
が欠失していても致死的なものではなく、種子での澱粉
の合成は行われる（アミロペクチンのみ）ので、稔性も
維持される。これらのことからこの遺伝子が種子の改良
を行う目的で利用するのに適した材料であることがわか
る。特にイネ科植物の品種改良を目指す上でイネのｗａ
ｘｙ遺伝子の調節領域を解析し用いることが最も望まし
いと考えた。
伝子の転写開始点より−６３７〜−２７５塩基５’上流
に存在する発現調節ＤＮＡに存する。以下、本発明につ
き詳細に説明する。 １．ｗａｘｙ遺伝子調節領域の構造ｗａｘｙ 遺伝子は種子での形質の変化（変異）を容易に
検出できるので、トウモロコシを中心に遺伝学的研究に
用いられてきた。ゲノミックＤＮＡは初めにトウモロコ
シで単離され（Ｋｌｏｓｇｅｎ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅ
ｎ．，２０３，２３７−２４４，１９８６）、これをプ
ローブにしてほかの植物でもｃＤＮＡやゲノミックＤＮ
Ａが単離されてきた（小麦：Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ，Ｐｌ
ａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１６，１
０９９−１１０１，１９９１；大麦：Ｒｏｈｄｅ，Ｎｕ
ｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６，７１８５，１９８
８；じゃがいも：Ｒｏｈｄｅ，Ｊ．Ｇｅｎ．ａｎｄ Ｂ
ｒｅｅｄ．，４４，３１１−３１５，１９９０；イネ：
Ｗａｎｇ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５
８９８，１９９０）。ｗａｘｙ遺伝子の最終的な産物で
あるアミロースの蓄積から、この遺伝子は胚乳、花粉、
胚嚢で発現することが知られている。しかしその組織特
異性や発現量を決める調節領域についての解析はまだ進
んでいない。ｗａｘｙ遺伝子の発現が抑制されるとアミ
ロースの合成はなくなるが、元来ｗａｘｙ遺伝子はそれ
が欠失していても致死的なものではなく、種子での澱粉
の合成は行われる（アミロペクチンのみ）ので、稔性も
維持される。これらのことからこの遺伝子が種子の改良
を行う目的で利用するのに適した材料であることがわか
る。特にイネ科植物の品種改良を目指す上でイネのｗａ
ｘｙ遺伝子の調節領域を解析し用いることが最も望まし
いと考えた。
【０００６】よって本発明者らは、イネアミロース合成
酵素（ＡＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅ：ｓｔａｒｃｈ ｇｌｕ
ｃｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＷＡＸＹ蛋白）
遺伝子の５’上流の調節域に着目した。これは、イネ、
例えばＯｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．ｃｖ．Ｌａｂｅ
ｌｌｅのゲノムライブラリーからｃＤＮＡ（特開平５−
１５３９８１号公報）を検索子として単離したｗａｘｙ
遺伝子をコードする領域の上流に隣接して存在する。こ
の５’側上流域の中でのｗａｘｙ遺伝子調節領域の機能
を調べるためには、５’上流域より順に欠失させたレポ
ーターベクター（例えば後述の実施例に示すｐＷＸＧＵ
Ｓシリーズ）をイネに導入し、レポーター遺伝子の発現
の有無または強弱を測定する。この結果から、発現調節
領域を特定することができる。
酵素（ＡＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅ：ｓｔａｒｃｈ ｇｌｕ
ｃｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＷＡＸＹ蛋白）
遺伝子の５’上流の調節域に着目した。これは、イネ、
例えばＯｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．ｃｖ．Ｌａｂｅ
ｌｌｅのゲノムライブラリーからｃＤＮＡ（特開平５−
１５３９８１号公報）を検索子として単離したｗａｘｙ
遺伝子をコードする領域の上流に隣接して存在する。こ
の５’側上流域の中でのｗａｘｙ遺伝子調節領域の機能
を調べるためには、５’上流域より順に欠失させたレポ
ーターベクター（例えば後述の実施例に示すｐＷＸＧＵ
Ｓシリーズ）をイネに導入し、レポーター遺伝子の発現
の有無または強弱を測定する。この結果から、発現調節
領域を特定することができる。
【０００７】２．ベクターの構築 次にベクターの構築について述べる。ｗａｘｙ遺伝子の
翻訳開始部位を含む５’上流域を、レポーター遺伝子を
含むベクター、例えばプラスミドベクターｐＢＩ２２１
（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，ＥＭＢＯ Ｊ，６，３９０１−
３９０７，１９８７）由来のｇｕｓ遺伝子（β−グルク
ロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする遺伝子）とｎｏｓ遺
伝子（ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）をコードする遺伝
子）のタ−ミネ−タ−に連結し、レポーターベクター
（例えば後述の実施例に示すｐＷＸＧＵＳ−１．２）を
得る。ｗａｘｙ遺伝子５’調節域とレポ−タ−ｇｕｓ遺
伝子とを連結する場合は、例えばＷＡＸＹ蛋白のＮ末９
アミノ酸のつぎにＢａｍＨＩ部位を介し、読み枠をあわ
せてＧＵＳ蛋白が作られるように設計することが望まし
い。ｗａｘｙ遺伝子５’調節域−ｇｕｓ−ｎｏｓからな
る遺伝子を、ｐＵＣ１９ベクター（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐ
ｅｒｒｏｎ，Ｇｅｎｅ，３３，１０３−１１９，１９８
５）等にクローニングする。このとき５’側の長さの違
いによる質的、量的な違いを調べるために、５’上流側
から段階的に欠失させたベクターを作製する。ベクター
プラスミドは、例えば大腸菌ＤＨ５αを大量培養し、ア
ルカリＳＤＳ法（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．，７，１５１３，１９７９）および塩化
セシウム法等による超遠心法で精製される。かくして精
製されたベクタープラスミドは、常法に従ってその塩基
配列を決定することができる。
翻訳開始部位を含む５’上流域を、レポーター遺伝子を
含むベクター、例えばプラスミドベクターｐＢＩ２２１
（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，ＥＭＢＯ Ｊ，６，３９０１−
３９０７，１９８７）由来のｇｕｓ遺伝子（β−グルク
ロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする遺伝子）とｎｏｓ遺
伝子（ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）をコードする遺伝
子）のタ−ミネ−タ−に連結し、レポーターベクター
（例えば後述の実施例に示すｐＷＸＧＵＳ−１．２）を
得る。ｗａｘｙ遺伝子５’調節域とレポ−タ−ｇｕｓ遺
伝子とを連結する場合は、例えばＷＡＸＹ蛋白のＮ末９
アミノ酸のつぎにＢａｍＨＩ部位を介し、読み枠をあわ
せてＧＵＳ蛋白が作られるように設計することが望まし
い。ｗａｘｙ遺伝子５’調節域−ｇｕｓ−ｎｏｓからな
る遺伝子を、ｐＵＣ１９ベクター（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐ
ｅｒｒｏｎ，Ｇｅｎｅ，３３，１０３−１１９，１９８
５）等にクローニングする。このとき５’側の長さの違
いによる質的、量的な違いを調べるために、５’上流側
から段階的に欠失させたベクターを作製する。ベクター
プラスミドは、例えば大腸菌ＤＨ５αを大量培養し、ア
ルカリＳＤＳ法（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．，７，１５１３，１９７９）および塩化
セシウム法等による超遠心法で精製される。かくして精
製されたベクタープラスミドは、常法に従ってその塩基
配列を決定することができる。
【０００８】３．形質転換イネ科植物の作出 形質転換は、例えばＳｈｉｍａｍｏｔｏらのＮａｔｕｒ
ｅ，３３８，２７４−２７６，１９８９、特開平１−１
８１７９１号公報に記載の方法で行うことができる。す
なわち上記２．で精製したベクターをイネ科植物由来の
プロトプラストに導入、再生することによって、形質転
換植物を作出することができる。
ｅ，３３８，２７４−２７６，１９８９、特開平１−１
８１７９１号公報に記載の方法で行うことができる。す
なわち上記２．で精製したベクターをイネ科植物由来の
プロトプラストに導入、再生することによって、形質転
換植物を作出することができる。
【０００９】プロトプラストは次のようにして調製する
ことができる。例えば、日本晴、コシヒカリ、ササニシ
キ等の栽培イネの完熟及び未熟種子、葉しよう、根の組
織に由来するサスペンジョン細胞あるいはカルスを液体
培地で培養した後、常法に従い、例えばセルラーゼやマ
セロザイム等の細胞壁分解酵素を含む酵素液中２５〜３
０℃、０〜５０ｓｐｍの条件で３〜１６時間程度酵素処
理する。酵素処理終了後、濾過して未消化物を除き、ろ
液に２〜５倍量のＫＭＣ液（０．１１８Ｍ 塩化カリウ
ム、０．０８１７Ｍ 塩化マグネシウム、０．０８５Ｍ
塩化カルシウム，ｐＨ６．０）（Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐ
ｌ．Ｇｅｎｅｔ．，５３，５７−６３，１９７８）等を
加え遠心分離して、精製されたプロトプラストを得るこ
とができる。
ことができる。例えば、日本晴、コシヒカリ、ササニシ
キ等の栽培イネの完熟及び未熟種子、葉しよう、根の組
織に由来するサスペンジョン細胞あるいはカルスを液体
培地で培養した後、常法に従い、例えばセルラーゼやマ
セロザイム等の細胞壁分解酵素を含む酵素液中２５〜３
０℃、０〜５０ｓｐｍの条件で３〜１６時間程度酵素処
理する。酵素処理終了後、濾過して未消化物を除き、ろ
液に２〜５倍量のＫＭＣ液（０．１１８Ｍ 塩化カリウ
ム、０．０８１７Ｍ 塩化マグネシウム、０．０８５Ｍ
塩化カルシウム，ｐＨ６．０）（Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐ
ｌ．Ｇｅｎｅｔ．，５３，５７−６３，１９７８）等を
加え遠心分離して、精製されたプロトプラストを得るこ
とができる。
【００１０】上記のようにして調製したベクター、さら
に選抜遺伝子として例えばハイグロマイシンフォスフォ
トランスフェラーゼをコードする遺伝子を有するベクタ
ー（ｐＧＬ２：Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎ
ａｔｕｒｅ，３３８，２７４−２７６，１９８９）をそ
れぞれ１〜１００μｇ／ｍｌと、上記植物由来のプロト
プラスト、例えば（２〜１０）×１０6 個／ｍｌとを、
３０〜２００ｍＭ 塩化カリウム、０〜５０ｍＭ 塩化
マグネシウム、０．２〜０．６Ｍ マニトールを含む緩
衝液等の液体媒体中に懸濁し、これに電気パルスを印加
してプラスミドをプロトプラスト中に導入する。電気パ
ルス処理は,１００〜１０００μＦのコンデンサーを用
いて得られる２００〜１０００Ｖ／ｃｍの初期電圧の直
流パルスで、パルス幅１〜２０ｍｓｅｃ程度の条件で印
加するのが好適である。
に選抜遺伝子として例えばハイグロマイシンフォスフォ
トランスフェラーゼをコードする遺伝子を有するベクタ
ー（ｐＧＬ２：Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎ
ａｔｕｒｅ，３３８，２７４−２７６，１９８９）をそ
れぞれ１〜１００μｇ／ｍｌと、上記植物由来のプロト
プラスト、例えば（２〜１０）×１０6 個／ｍｌとを、
３０〜２００ｍＭ 塩化カリウム、０〜５０ｍＭ 塩化
マグネシウム、０．２〜０．６Ｍ マニトールを含む緩
衝液等の液体媒体中に懸濁し、これに電気パルスを印加
してプラスミドをプロトプラスト中に導入する。電気パ
ルス処理は,１００〜１０００μＦのコンデンサーを用
いて得られる２００〜１０００Ｖ／ｃｍの初期電圧の直
流パルスで、パルス幅１〜２０ｍｓｅｃ程度の条件で印
加するのが好適である。
【００１１】上述のように電気パルス処理したプロトプ
ラストを、例えばＲ2 培地（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐ
ｈｙｓｉｏｌ．，１４，１１１３，１９７３）の無機成
分とＢ５培地（Ｇａｍｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘ
ｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．，５０，１５１，１９６８）の
ビタミン混合液を含む液体培地（Ｒ2／Ｂ５）、好まし
くは窒素源として硝酸カリウムを０．２〜０．５％含有
する培地に懸濁し、これを１．０〜３．０％程度のアガ
ロースを含むＲ2 ／Ｂ５培地等と等量ずつ混ぜ、速やか
にシャーレ中に広げて薄く固める。この時のプロトプラ
ストの密度は約（５〜５０）×１０5 個／ｍｌとなるよ
うにし、またアガロースの厚さは平均で０．７ｍｍ程度
となるようにするのが好ましい。
ラストを、例えばＲ2 培地（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐ
ｈｙｓｉｏｌ．，１４，１１１３，１９７３）の無機成
分とＢ５培地（Ｇａｍｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘ
ｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．，５０，１５１，１９６８）の
ビタミン混合液を含む液体培地（Ｒ2／Ｂ５）、好まし
くは窒素源として硝酸カリウムを０．２〜０．５％含有
する培地に懸濁し、これを１．０〜３．０％程度のアガ
ロースを含むＲ2 ／Ｂ５培地等と等量ずつ混ぜ、速やか
にシャーレ中に広げて薄く固める。この時のプロトプラ
ストの密度は約（５〜５０）×１０5 個／ｍｌとなるよ
うにし、またアガロースの厚さは平均で０．７ｍｍ程度
となるようにするのが好ましい。
【００１２】続いて固化したアガロースを５〜２０ｍｍ
大の大きさに切断し、上記液体培地上で培養する。その
際、イネ科植物由来のプロトプラストを使用した場合に
は、好ましくは培地中にイネ培養細胞を１００〜３００
ｍｇＦＷ／シャーレ程度共存させ、２０〜５０ｒ．ｐ．
ｍ．の回転でゆっくり振とうしながら、暗条件下２３〜
３３℃で培養する。イネ培養細胞と共存させる方法は上
記の方法のほかに、プロトプラストを含む液体培地を、
底にメンブレンフィルターを設けた容器内に入れ、その
容器をイネ培養細胞と共に液体培地を入れたシャーレに
浸して共存させる方法がある。ここに示すイネ培養細胞
は、旺盛に分裂している細かい細胞塊から成る物が好ま
しい。このような培養細胞は、例えばイネ植物の種子、
茎、根あるいは葯より得られたカルスを液体培地中に継
代して分裂速度の早い細胞を選抜していく等の公知の方
法に準じて容易に得られる。
大の大きさに切断し、上記液体培地上で培養する。その
際、イネ科植物由来のプロトプラストを使用した場合に
は、好ましくは培地中にイネ培養細胞を１００〜３００
ｍｇＦＷ／シャーレ程度共存させ、２０〜５０ｒ．ｐ．
ｍ．の回転でゆっくり振とうしながら、暗条件下２３〜
３３℃で培養する。イネ培養細胞と共存させる方法は上
記の方法のほかに、プロトプラストを含む液体培地を、
底にメンブレンフィルターを設けた容器内に入れ、その
容器をイネ培養細胞と共に液体培地を入れたシャーレに
浸して共存させる方法がある。ここに示すイネ培養細胞
は、旺盛に分裂している細かい細胞塊から成る物が好ま
しい。このような培養細胞は、例えばイネ植物の種子、
茎、根あるいは葯より得られたカルスを液体培地中に継
代して分裂速度の早い細胞を選抜していく等の公知の方
法に準じて容易に得られる。
【００１３】培養後３〜４週間で、０．５〜１ｍｍφ程
度のコロニーが形成される。その際、例えば選択標識遺
伝子でもあるハイグロマイシンホスホトランスフェラー
ゼ遺伝子（ｈｐｈ）を導入しておいた場合、培養開始後
７〜２０日にハイグロマイシンを１０〜１００μｇ／ｍ
ｌ程度培養液中に添加し、さらに培養を続けると目的と
する形質転換細胞の選択を効率よく行うことができる。
度のコロニーが形成される。その際、例えば選択標識遺
伝子でもあるハイグロマイシンホスホトランスフェラー
ゼ遺伝子（ｈｐｈ）を導入しておいた場合、培養開始後
７〜２０日にハイグロマイシンを１０〜１００μｇ／ｍ
ｌ程度培養液中に添加し、さらに培養を続けると目的と
する形質転換細胞の選択を効率よく行うことができる。
【００１４】次いでこのコロニーを増殖培地、例えばＲ
２基本培地（Ｓｃｉ．Ｓｉｎ．，１６，６５９−６８
８，１９７５）に植物ホルモン、例えば２，４−ジクロ
ロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）を２ｍｇ／ｌ程度、ア
ガロースを０．１〜１．０％加えた寒天培地上で２〜４
週間、照明下（１０００〜４０００ｌｕｘ）、２７〜３
３℃で培養し３〜６ｍｍφのカルスを得る。このカルス
に、レポーター遺伝子の産物が発現されているか否かを
確認することにより、形質転換カルスとして二次選抜す
ることができる（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，ＥＭＢＯ Ｊ，
６，３９０１−３９０７，１９８７）。
２基本培地（Ｓｃｉ．Ｓｉｎ．，１６，６５９−６８
８，１９７５）に植物ホルモン、例えば２，４−ジクロ
ロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）を２ｍｇ／ｌ程度、ア
ガロースを０．１〜１．０％加えた寒天培地上で２〜４
週間、照明下（１０００〜４０００ｌｕｘ）、２７〜３
３℃で培養し３〜６ｍｍφのカルスを得る。このカルス
に、レポーター遺伝子の産物が発現されているか否かを
確認することにより、形質転換カルスとして二次選抜す
ることができる（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，ＥＭＢＯ Ｊ，
６，３９０１−３９０７，１９８７）。
【００１５】こうして選抜されたカルスを、例えば０．
５〜１．５％アガロースを含む再生培地（Ｒ2 培地にお
いて、ホルモンフリーあるいはサイトカイニンを１〜１
０ｍｇ／ｌ添加したもの）で２７〜３３℃、２０００〜
４０００ｌｕｘの条件下で培養すれば、２〜１０週間で
不定胚または不定芽の形成が認められる。さらに２〜３
週間ホルモンを含まない上記再生培地等で培養すること
により、移植可能な幼植物体が得られる。こうして得ら
れた幼植物体は、バーミュキュライト等に移植して成長
させると、形質転換されたイネ科植物の植物体を得るこ
とができる。
５〜１．５％アガロースを含む再生培地（Ｒ2 培地にお
いて、ホルモンフリーあるいはサイトカイニンを１〜１
０ｍｇ／ｌ添加したもの）で２７〜３３℃、２０００〜
４０００ｌｕｘの条件下で培養すれば、２〜１０週間で
不定胚または不定芽の形成が認められる。さらに２〜３
週間ホルモンを含まない上記再生培地等で培養すること
により、移植可能な幼植物体が得られる。こうして得ら
れた幼植物体は、バーミュキュライト等に移植して成長
させると、形質転換されたイネ科植物の植物体を得るこ
とができる。
【００１６】また形質転換体にｗａｘｙ遺伝子の５’上
流域が導入されたことの確認は、常法に従い再生植物体
から調製したゲノミックＤＮＡのサザン解析、ＰＣＲ解
析等により行うことができる。 ４．形質転換体の解析から得られたｗａｘｙ遺伝子の
５’機能領域ｗａｘｙ −レポーターの融合遺伝子が導入された再生体
の胚乳における活性、例えばＧＵＳ活性（Ｊｅｆｆｅｒ
ｓｏｎ，ＥＭＢＯ Ｊ，６，３９０１−３９０７，１９
８７）を測定する。すなわち、胚乳から常法に従ってレ
ポーター遺伝子の産物を抽出し、その活性を測定する。
そして特に種子での発現に変化のみられるベクターを検
出する。すなわち種子で強力に機能する発現調節領域を
特定することができる。 ５．本発明の発現調節ＤＮＡを用いた形質転換植物の作
製 本発明の発現調節ＤＮＡおよび構造遺伝子を導入した発
現ベクターを構築する。発現ベクターは、その５’側か
ら本発明の発現調節ＤＮＡ（エンハンサーＤＮＡ）、狭
義の意味での最小プロモーターＤＮＡ、構造遺伝子の順
で構成される。
流域が導入されたことの確認は、常法に従い再生植物体
から調製したゲノミックＤＮＡのサザン解析、ＰＣＲ解
析等により行うことができる。 ４．形質転換体の解析から得られたｗａｘｙ遺伝子の
５’機能領域ｗａｘｙ −レポーターの融合遺伝子が導入された再生体
の胚乳における活性、例えばＧＵＳ活性（Ｊｅｆｆｅｒ
ｓｏｎ，ＥＭＢＯ Ｊ，６，３９０１−３９０７，１９
８７）を測定する。すなわち、胚乳から常法に従ってレ
ポーター遺伝子の産物を抽出し、その活性を測定する。
そして特に種子での発現に変化のみられるベクターを検
出する。すなわち種子で強力に機能する発現調節領域を
特定することができる。 ５．本発明の発現調節ＤＮＡを用いた形質転換植物の作
製 本発明の発現調節ＤＮＡおよび構造遺伝子を導入した発
現ベクターを構築する。発現ベクターは、その５’側か
ら本発明の発現調節ＤＮＡ（エンハンサーＤＮＡ）、狭
義の意味での最小プロモーターＤＮＡ、構造遺伝子の順
で構成される。
【００１７】本発明の発現調節ＤＮＡはイネ科植物の種
子での強力な発現を可能にするエンハンサー的機能を有
する。従って本発明の発現調節ＤＮＡは、その下流に位
置する遺伝子をイネ科植物の種子で強力に発現させるこ
とができる。一般にベクターを構築する際には組織特異
的プロモーターを用いることが重要となる。本発明にお
いては、現在イネ胚乳での発現が確認されているイネＷ
ｘプロモーター（Ｈｉｒａｎｏ，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ
Ｐｈｙｓｉｏｌ．，ａｃｃｅｐｔｅｄ）、トウモロコ
シＡｄｈ１プロモーター（Ｋｙｏｚｕｋａ，Ｍｏｌ．Ｇ
ｅｎ．Ｇｅｎ．，２２８，４０−４８，１９９１）、カ
リフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（Ｔｅ
ｒａｄａ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎ．，２２０，３８９
−３９２，１９９０）等が好適に使用される。
子での強力な発現を可能にするエンハンサー的機能を有
する。従って本発明の発現調節ＤＮＡは、その下流に位
置する遺伝子をイネ科植物の種子で強力に発現させるこ
とができる。一般にベクターを構築する際には組織特異
的プロモーターを用いることが重要となる。本発明にお
いては、現在イネ胚乳での発現が確認されているイネＷ
ｘプロモーター（Ｈｉｒａｎｏ，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ
Ｐｈｙｓｉｏｌ．，ａｃｃｅｐｔｅｄ）、トウモロコ
シＡｄｈ１プロモーター（Ｋｙｏｚｕｋａ，Ｍｏｌ．Ｇ
ｅｎ．Ｇｅｎ．，２２８，４０−４８，１９９１）、カ
リフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（Ｔｅ
ｒａｄａ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎ．，２２０，３８９
−３９２，１９９０）等が好適に使用される。
【００１８】構造遺伝子としては特に制限はされない
が、イネ科植物中で翻訳効率のよい核酸配列を持つもの
が望ましい。すなわち、イネ科植物由来の構造遺伝子が
最も望ましい。具体的には、ｗａｘｙ遺伝子等のでんぷ
ん合成系の酵素遺伝子群が挙げられる。また、遺伝子の
発現効率を上げるため、あるいはＲＮＡの安定性を上げ
るために、発現調節ＤＮＡおよびプロモーターと構造遺
伝子の間にイネ科植物で機能するイントロンを連結させ
ることも効果的である。例えばイネの場合、トウモロコ
シＡｄｈ１（アルコールデヒドロゲナーゼ）の第一イン
トロン（Ｋｙｏｚｕｋａ，Ｍａｙｄｉｃａ，３５，３５
３−３５７，１９９０）やヒマ カタラーゼのイントロ
ン（Ｔａｎａｋａ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，
１８，６７６７−６７７０，１９９０）が効果的であ
る。
が、イネ科植物中で翻訳効率のよい核酸配列を持つもの
が望ましい。すなわち、イネ科植物由来の構造遺伝子が
最も望ましい。具体的には、ｗａｘｙ遺伝子等のでんぷ
ん合成系の酵素遺伝子群が挙げられる。また、遺伝子の
発現効率を上げるため、あるいはＲＮＡの安定性を上げ
るために、発現調節ＤＮＡおよびプロモーターと構造遺
伝子の間にイネ科植物で機能するイントロンを連結させ
ることも効果的である。例えばイネの場合、トウモロコ
シＡｄｈ１（アルコールデヒドロゲナーゼ）の第一イン
トロン（Ｋｙｏｚｕｋａ，Ｍａｙｄｉｃａ，３５，３５
３−３５７，１９９０）やヒマ カタラーゼのイントロ
ン（Ｔａｎａｋａ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，
１８，６７６７−６７７０，１９９０）が効果的であ
る。
【００１９】さらに、効率良く遺伝子の転写を集結さ
せ、またＲＮＡを安定させるために、ターミネーターが
用いられる。具体的には、例えばカリフラワーモザイク
ウイルス３５Ｓ（１９Ｓ）ＲＮＡターミネーター（ｐＧ
Ｌ２：Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒ
ｅ，３３８，２７４−２７６，１９８９）や、前述した
ＮＯＳのターミネーター等があげられる。
せ、またＲＮＡを安定させるために、ターミネーターが
用いられる。具体的には、例えばカリフラワーモザイク
ウイルス３５Ｓ（１９Ｓ）ＲＮＡターミネーター（ｐＧ
Ｌ２：Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒ
ｅ，３３８，２７４−２７６，１９８９）や、前述した
ＮＯＳのターミネーター等があげられる。
【００２０】ベクターとしては、ｐＵＣ系列のプラスミ
ド（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ，Ｇｅｎｅ，３３，
１０３−１１９，１９８５）等が好適に使用される。本
発明においては更に、ハイグロマイシンフォスフォトラ
ンスフェラーゼ遺伝子、ネオマイシンフォスフォトラン
スフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルト
ランスフェラーゼ遺伝子等、目的とするコロニーを選択
する際に有効な、いわゆる選択マーカー遺伝子を使用す
るのが好ましい。かかる選択マーカー遺伝子としては、
ハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子
が最も好ましい。
ド（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ，Ｇｅｎｅ，３３，
１０３−１１９，１９８５）等が好適に使用される。本
発明においては更に、ハイグロマイシンフォスフォトラ
ンスフェラーゼ遺伝子、ネオマイシンフォスフォトラン
スフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルト
ランスフェラーゼ遺伝子等、目的とするコロニーを選択
する際に有効な、いわゆる選択マーカー遺伝子を使用す
るのが好ましい。かかる選択マーカー遺伝子としては、
ハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子
が最も好ましい。
【００２１】本発明においては、選択マーカー遺伝子と
構造遺伝子とを同一のベクター中に有するものを使用し
てもよいし、選択マーカー遺伝子を有するベクターと構
造遺伝子を有するベクターとを併用してもよい。かかる
ベクターを前述した方法に従いイネ科植物由来のプロト
プラストに導入、再生することによって、形質転換され
た植物体を作出することができる。この形質転換体では
種子で構造遺伝子を大量に発現することから、種子の形
質の改変あるいは種子での物質生産を行うことができ
る。
構造遺伝子とを同一のベクター中に有するものを使用し
てもよいし、選択マーカー遺伝子を有するベクターと構
造遺伝子を有するベクターとを併用してもよい。かかる
ベクターを前述した方法に従いイネ科植物由来のプロト
プラストに導入、再生することによって、形質転換され
た植物体を作出することができる。この形質転換体では
種子で構造遺伝子を大量に発現することから、種子の形
質の改変あるいは種子での物質生産を行うことができ
る。
【００２２】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、
本発明はその要旨を越えない限り本例に制約されるもの
ではない。 １．ｗａｘｙ遺伝子５’調節領域の構造解析（図１）ｗａｘｙ 遺伝子５’調節領域はゲノミックＤＮＡ上で
は、ＯＲＦの５’側に隣接して存在する。従ってｃＤＮ
Ａをプローブにして単離できるゲノミッククローンから
翻訳開始を目印にこれの５’上流側に隣接するＤＮＡを
取得した。
本発明はその要旨を越えない限り本例に制約されるもの
ではない。 １．ｗａｘｙ遺伝子５’調節領域の構造解析（図１）ｗａｘｙ 遺伝子５’調節領域はゲノミックＤＮＡ上で
は、ＯＲＦの５’側に隣接して存在する。従ってｃＤＮ
Ａをプローブにして単離できるゲノミッククローンから
翻訳開始を目印にこれの５’上流側に隣接するＤＮＡを
取得した。
【００２３】まずイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ
Ｌ．ｃｖ．Ｌａｂｅｌｌｅ）の葉からＷａｌｂｏｔの方
法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎ．，２１１，２７−３４，
１９８８）により調製したゲノミックＤＮＡをＨｉｎｄ
ＩＩＩで切断し、Ｌａｍｂｄａ２００１（Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎｅ社製）と連結してライブラリーとした。これを
撒いて得られるファージに対してイネのｗａｘｙ ｃＤ
ＮＡ（特開平５−１５３９８１号公報）をプローブにし
てプラークハイブリダイゼーション（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２．８２章）を行い、１５ｋｂの
インサートを持つゲノミッククローンを得た。ＥｃｏＲ
ＩとＰｓｔＩの制限酵素地図を作成し、６ｋｂのＥｃｏ
ＲＩ断片にｃＤＮＡプローブがハイブリッドを形成する
ことからここにＯＲＦが存在することがわかった。従っ
て、これより５’上流域の中でのｗａｘｙ遺伝子調節領
域の機能を調べることとした。この断片の５’側に隣接
する３ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片をｐＵＣ１９にサブクロー
ニングし、制限酵素地図を作成した。この断片をＭｌｕ
Ｉで切断して得られる３’側の１．５ｋｂについて、そ
の塩基配列を上述の方法あるいは蛍光シークエンサー
（ＡＢＩ ３７３Ａ ＤＮＡシークエンサー）を用いて
解析した。
Ｌ．ｃｖ．Ｌａｂｅｌｌｅ）の葉からＷａｌｂｏｔの方
法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎ．，２１１，２７−３４，
１９８８）により調製したゲノミックＤＮＡをＨｉｎｄ
ＩＩＩで切断し、Ｌａｍｂｄａ２００１（Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎｅ社製）と連結してライブラリーとした。これを
撒いて得られるファージに対してイネのｗａｘｙ ｃＤ
ＮＡ（特開平５−１５３９８１号公報）をプローブにし
てプラークハイブリダイゼーション（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２．８２章）を行い、１５ｋｂの
インサートを持つゲノミッククローンを得た。ＥｃｏＲ
ＩとＰｓｔＩの制限酵素地図を作成し、６ｋｂのＥｃｏ
ＲＩ断片にｃＤＮＡプローブがハイブリッドを形成する
ことからここにＯＲＦが存在することがわかった。従っ
て、これより５’上流域の中でのｗａｘｙ遺伝子調節領
域の機能を調べることとした。この断片の５’側に隣接
する３ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片をｐＵＣ１９にサブクロー
ニングし、制限酵素地図を作成した。この断片をＭｌｕ
Ｉで切断して得られる３’側の１．５ｋｂについて、そ
の塩基配列を上述の方法あるいは蛍光シークエンサー
（ＡＢＩ ３７３Ａ ＤＮＡシークエンサー）を用いて
解析した。
【００２４】２．５’上流域欠失ベクタ−の構築（ｐＷ
ＸＧＵＳシリ−ズ）ｗａｘｙ 遺伝子の発現に必要な上流域を調べるためにさ
まざまな長さのｗａｘｙ遺伝子の５’上流域をｇｕｓ遺
伝子に連結したベクターを作製した。図２に該ベクター
の構築の過程を表す。図２中、Ｅ、Ｐ、Ｈ、Ｖ、Ｂはそ
れぞれＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｅｃｏ
ＲＶ、ＢａｍＨＩの制限酵素部位を示し、ｍｃｓはマル
チクローニングサイト、ｏｒｆはオープンリーディング
フレーム、ｏはプライマー、ｔｓｐは転写開始点を示
す。
ＸＧＵＳシリ−ズ）ｗａｘｙ 遺伝子の発現に必要な上流域を調べるためにさ
まざまな長さのｗａｘｙ遺伝子の５’上流域をｇｕｓ遺
伝子に連結したベクターを作製した。図２に該ベクター
の構築の過程を表す。図２中、Ｅ、Ｐ、Ｈ、Ｖ、Ｂはそ
れぞれＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｅｃｏ
ＲＶ、ＢａｍＨＩの制限酵素部位を示し、ｍｃｓはマル
チクローニングサイト、ｏｒｆはオープンリーディング
フレーム、ｏはプライマー、ｔｓｐは転写開始点を示
す。
【００２５】蛋白の翻訳開始効率を考慮してＷＡＸＹ蛋
白のＮ末を持つ融合型のＧＵＳ蛋白を作らせる形を設定
した。そこで以下のようにｗａｘｙ遺伝子とｇｕｓ遺伝
子を連結した。まず翻訳開始部位を含むゲノミックＤＮ
Ａクローン（図１のＰｓｔＩ２．３ｋｂをもつｐＰＳＴ
２．３。特開平５−１５３９８１号公報）を鋳型にして
３塩基を挿入するためのプライマー ＧＡＧＧＴＧＧＡ
ＴＣＣＧＡＧＣＴＧ（配列表の配列番号２、図２中、
で示す）を合成した。このプライマーはＷＡＸＹ蛋白の
Ｎ末より第１２番目のアミノ酸に対応するコドンから第
８番目のコドンへと上流へ向かうプライマーで、中央付
近の第１０コドンに３塩基を挿入しＢａｍＨＩ部位を作
り出す。これとリバーサルプライマー ＣＡＧＧＡＡＡ
ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ（配列表の配列番号３、図２中、
で示す）を用い、ｐＰＳＴ２．３を鋳型にしてＰＣＲ
を行いＷＡＸＹ蛋白の第１０アミノ酸に対応する地点に
ＢａｍＨＩ部位を作った。このＰＣＲ断片をＨｉｎｄＩ
ＩＩとＢａｍＨＩで消化してｐＢＩ２０１ＥのＨｉｎｄ
ＩＩＩ，ＢａｍＨＩ部位に挿入しプラスミドｐＷＸＧＵ
Ｓ−ＰＣＲを得た。ここでｐＢＩ２０１Ｅは、ｐＢＩ２
２１（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ、ＥＭＢＯ Ｊ，６，３９０
１−３９０７，１９８７）のｇｕｓ遺伝子とｎｏｓ遺伝
子のターミネーターを含むＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片
をｐＵＣ１９に導入した後に、ＥｃｏＲＩ部位をＫｌｅ
ｎｏｗ酵素で埋めたものである。ｐＷＸＧＵＳ−ＰＣＲ
のｗａｘｙ遺伝子とｇｕｓ遺伝子の連結部位付近の配列
をＧＵＳ蛋白本来のＮ末直下の上流へ向かうプライマー
ＣＡＣＧＧＧＴＴＧＧＧＧＴＴＴＣＴ（配列表の配列
番号４、図２中、で示す）を用いて塩基配列を確認し
た。つぎにｐＷＸＧＵＳ−ＰＣＲをＥｃｏＲＩ消化し、
０．８ｋｂの断片を除去した（ｐＷＸＧＵＳＥＣＯ）。
このプラスミドのＥｃｏＲＩ部位から下流の塩基配列を
リバーサルプライマー（配列表の配列番号３）を用いて
確認した。ＰＣＲで置換されたのはＢａｍＨＩ部位の挿
入だけであり、その他の領域は本来のゲノミックＤＮＡ
と同じであった。ついでｐＷＸＧＵＳＥＣＯのＥｃｏＲ
Ｉ部位にゲノミッククローンからＥｃｏＲＩ ３ｋｂを
順方向に挿入した（ｐＷＸＧＵＳ−２．２）。このプラ
スミドはｗａｘｙ遺伝子の転写開始より上流２．２ｋｂ
を持つ。このプラスミドを基に以下３種のプラスミドを
作製した。ｐＷＸＧＵＳ−１．２はｐＷＸＧＵＳ−２．
２をＨｉｎｄＩＩＩとＳｔｕＩで消化後セルフライゲー
ションで得られたものであり、同様にｐＷＸＧＵＳ−
０．６４はＨｉｎｄＩＩＩとＭｌｕＩで消化、ｐＷＸＧ
ＵＳ−０．２８はＨｉｎｄＩＩＩとＳｐｈＩで消化して
得られたものである。それぞれ転写開始点より−１．２
ｋｂ，−０．６４ｋｂ，−０．２８ｋｂ上流域を持ちＷ
ＡＸＹ蛋白のＮ末９アミノ酸までゲノミックＤＮＡを反
映する配列を持っており、ＢａｍＨＩ部位を含むリンカ
ーを介してｇｕｓ遺伝子に連結されている。これらのプ
ラスミドの大量培養は大腸菌ＤＨ５αを用い、アルカリ
ＳＤＳ法と塩化セシウム超遠心法でＤＮＡを精製した。
ＤＮＡは分光光度計を用いＯＤ２６０を測定して濃度を
求めた。以下の植物への形質転換においてはプラスミド
をｐＵＣ１９に由来する制限酵素ＰｖｕＩＩあるいはＳ
ｃａＩで線状化しエタノールで精製してから用いた。
白のＮ末を持つ融合型のＧＵＳ蛋白を作らせる形を設定
した。そこで以下のようにｗａｘｙ遺伝子とｇｕｓ遺伝
子を連結した。まず翻訳開始部位を含むゲノミックＤＮ
Ａクローン（図１のＰｓｔＩ２．３ｋｂをもつｐＰＳＴ
２．３。特開平５−１５３９８１号公報）を鋳型にして
３塩基を挿入するためのプライマー ＧＡＧＧＴＧＧＡ
ＴＣＣＧＡＧＣＴＧ（配列表の配列番号２、図２中、
で示す）を合成した。このプライマーはＷＡＸＹ蛋白の
Ｎ末より第１２番目のアミノ酸に対応するコドンから第
８番目のコドンへと上流へ向かうプライマーで、中央付
近の第１０コドンに３塩基を挿入しＢａｍＨＩ部位を作
り出す。これとリバーサルプライマー ＣＡＧＧＡＡＡ
ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ（配列表の配列番号３、図２中、
で示す）を用い、ｐＰＳＴ２．３を鋳型にしてＰＣＲ
を行いＷＡＸＹ蛋白の第１０アミノ酸に対応する地点に
ＢａｍＨＩ部位を作った。このＰＣＲ断片をＨｉｎｄＩ
ＩＩとＢａｍＨＩで消化してｐＢＩ２０１ＥのＨｉｎｄ
ＩＩＩ，ＢａｍＨＩ部位に挿入しプラスミドｐＷＸＧＵ
Ｓ−ＰＣＲを得た。ここでｐＢＩ２０１Ｅは、ｐＢＩ２
２１（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ、ＥＭＢＯ Ｊ，６，３９０
１−３９０７，１９８７）のｇｕｓ遺伝子とｎｏｓ遺伝
子のターミネーターを含むＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片
をｐＵＣ１９に導入した後に、ＥｃｏＲＩ部位をＫｌｅ
ｎｏｗ酵素で埋めたものである。ｐＷＸＧＵＳ−ＰＣＲ
のｗａｘｙ遺伝子とｇｕｓ遺伝子の連結部位付近の配列
をＧＵＳ蛋白本来のＮ末直下の上流へ向かうプライマー
ＣＡＣＧＧＧＴＴＧＧＧＧＴＴＴＣＴ（配列表の配列
番号４、図２中、で示す）を用いて塩基配列を確認し
た。つぎにｐＷＸＧＵＳ−ＰＣＲをＥｃｏＲＩ消化し、
０．８ｋｂの断片を除去した（ｐＷＸＧＵＳＥＣＯ）。
このプラスミドのＥｃｏＲＩ部位から下流の塩基配列を
リバーサルプライマー（配列表の配列番号３）を用いて
確認した。ＰＣＲで置換されたのはＢａｍＨＩ部位の挿
入だけであり、その他の領域は本来のゲノミックＤＮＡ
と同じであった。ついでｐＷＸＧＵＳＥＣＯのＥｃｏＲ
Ｉ部位にゲノミッククローンからＥｃｏＲＩ ３ｋｂを
順方向に挿入した（ｐＷＸＧＵＳ−２．２）。このプラ
スミドはｗａｘｙ遺伝子の転写開始より上流２．２ｋｂ
を持つ。このプラスミドを基に以下３種のプラスミドを
作製した。ｐＷＸＧＵＳ−１．２はｐＷＸＧＵＳ−２．
２をＨｉｎｄＩＩＩとＳｔｕＩで消化後セルフライゲー
ションで得られたものであり、同様にｐＷＸＧＵＳ−
０．６４はＨｉｎｄＩＩＩとＭｌｕＩで消化、ｐＷＸＧ
ＵＳ−０．２８はＨｉｎｄＩＩＩとＳｐｈＩで消化して
得られたものである。それぞれ転写開始点より−１．２
ｋｂ，−０．６４ｋｂ，−０．２８ｋｂ上流域を持ちＷ
ＡＸＹ蛋白のＮ末９アミノ酸までゲノミックＤＮＡを反
映する配列を持っており、ＢａｍＨＩ部位を含むリンカ
ーを介してｇｕｓ遺伝子に連結されている。これらのプ
ラスミドの大量培養は大腸菌ＤＨ５αを用い、アルカリ
ＳＤＳ法と塩化セシウム超遠心法でＤＮＡを精製した。
ＤＮＡは分光光度計を用いＯＤ２６０を測定して濃度を
求めた。以下の植物への形質転換においてはプラスミド
をｐＵＣ１９に由来する制限酵素ＰｖｕＩＩあるいはＳ
ｃａＩで線状化しエタノールで精製してから用いた。
【００２６】３．イネへのｐＷＸＧＵＳベクターの導入 粳米（日本晴）の完熟種子に由来するカルスを通常使用
され得る液体培地で培養した後、常法に従い、例えばセ
ルラーゼやマセロザイム等の細胞壁分解酵素を含む酵素
液中２５〜３０℃、３〜１６時間程度酵素処理した。酵
素処理終了後ろ過して未消化物を除き、ろ液に２〜５倍
量のＫＭＣ液（塩化カリウム ０．１１８Ｍ、塩化マグ
ネシウム ０．０８１７Ｍ、塩化カルシウム ０．０８
５Ｍ，ｐＨ６．０）（Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅ
ｔ．，５３，５７−６３，１９７８）等を加え遠心分離
し、精製されたプロトプラストを得た。
され得る液体培地で培養した後、常法に従い、例えばセ
ルラーゼやマセロザイム等の細胞壁分解酵素を含む酵素
液中２５〜３０℃、３〜１６時間程度酵素処理した。酵
素処理終了後ろ過して未消化物を除き、ろ液に２〜５倍
量のＫＭＣ液（塩化カリウム ０．１１８Ｍ、塩化マグ
ネシウム ０．０８１７Ｍ、塩化カルシウム ０．０８
５Ｍ，ｐＨ６．０）（Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅ
ｔ．，５３，５７−６３，１９７８）等を加え遠心分離
し、精製されたプロトプラストを得た。
【００２７】粳米（日本晴）由来プロトプラスト、例え
ば（２〜１０）×１０6 個／ｍｌに対して、上記の様に
して調製した、ｐＷＸＧＵＳシリ−ズあるいはｐＢＩ２
２１１〜１００μｇ／ｍｌ、さらに各々の組合せに対
し、選抜遺伝子としてハイグロマイシンホスホトランス
フェラーゼをコードするベクター（ｐＧＬ２：Ｓｈｉｍ
ａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３３８，２７
４−２７６，１９８９）、例えば１〜１００μｇ／ｍｌ
を３０〜２００ｍＭ 塩化カリウム、０〜５０ｍＭ 塩
化マグネシウム、０．２〜０．６Ｍ マニトールを含む
緩衝液等の液体媒体中に懸濁し、これに電気パルスを印
加してプラスミドをプロトプラスト中に導入した。電気
パルス処理は、１００〜１０００μＦのコンデンサーを
用いて得られる２００〜１０００Ｖ／ｃｍの初期電圧の
直流パルスで、パルス幅１〜３０ｍｓｅｃ程度の条件で
印加した（特開平１−１８１７９１号公報）。
ば（２〜１０）×１０6 個／ｍｌに対して、上記の様に
して調製した、ｐＷＸＧＵＳシリ−ズあるいはｐＢＩ２
２１１〜１００μｇ／ｍｌ、さらに各々の組合せに対
し、選抜遺伝子としてハイグロマイシンホスホトランス
フェラーゼをコードするベクター（ｐＧＬ２：Ｓｈｉｍ
ａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３３８，２７
４−２７６，１９８９）、例えば１〜１００μｇ／ｍｌ
を３０〜２００ｍＭ 塩化カリウム、０〜５０ｍＭ 塩
化マグネシウム、０．２〜０．６Ｍ マニトールを含む
緩衝液等の液体媒体中に懸濁し、これに電気パルスを印
加してプラスミドをプロトプラスト中に導入した。電気
パルス処理は、１００〜１０００μＦのコンデンサーを
用いて得られる２００〜１０００Ｖ／ｃｍの初期電圧の
直流パルスで、パルス幅１〜３０ｍｓｅｃ程度の条件で
印加した（特開平１−１８１７９１号公報）。
【００２８】上述のようにして電気パルス処理したプロ
トプラストを、上記Ｒ2 培地の無機成分と上記Ｂ５培地
のビタミン混合液を含む液体培地（Ｒ2 ／Ｂ５）に窒素
源として硝酸カリウムを０．２〜０．５％含有する培地
に懸濁し、これを１．０〜３．０％程度のアガロースを
含むＲ2 ／Ｂ５培地と等量ずつ混ぜ、速やかにシャーレ
中に広げてうすく固めた。この時のプロトプラストの密
度は約（５〜５０）×１０5 個／ｍｌとなるようにし、
またアガロースの厚さは平均０．７ｍｍ程度となるよう
にした。
トプラストを、上記Ｒ2 培地の無機成分と上記Ｂ５培地
のビタミン混合液を含む液体培地（Ｒ2 ／Ｂ５）に窒素
源として硝酸カリウムを０．２〜０．５％含有する培地
に懸濁し、これを１．０〜３．０％程度のアガロースを
含むＲ2 ／Ｂ５培地と等量ずつ混ぜ、速やかにシャーレ
中に広げてうすく固めた。この時のプロトプラストの密
度は約（５〜５０）×１０5 個／ｍｌとなるようにし、
またアガロースの厚さは平均０．７ｍｍ程度となるよう
にした。
【００２９】固化したアガロースゲルを５〜２０ｍｍ程
度の大きさに切り、上記液体培地中で培養する。その
際、培地中にイネ培養細胞を１００〜３００ｍｇＦＷ／
シャーレ程度共存させ、２０〜５０ｒ．ｐ．ｍの回転で
ゆっくり振とうしながら、暗条件下２７〜３３℃で培養
した。培養開始して３〜４週間後、０．５〜１ｍｍφ程
度のコロニーが形成された。このとき、培養開始後７〜
２０日にハイグロマイシンを１０〜５０μｇ／ｍｌ程度
培養液中に添加し、更に培養を続けることにより、形質
転換細胞の一次選択を効率よく行うことができた。
度の大きさに切り、上記液体培地中で培養する。その
際、培地中にイネ培養細胞を１００〜３００ｍｇＦＷ／
シャーレ程度共存させ、２０〜５０ｒ．ｐ．ｍの回転で
ゆっくり振とうしながら、暗条件下２７〜３３℃で培養
した。培養開始して３〜４週間後、０．５〜１ｍｍφ程
度のコロニーが形成された。このとき、培養開始後７〜
２０日にハイグロマイシンを１０〜５０μｇ／ｍｌ程度
培養液中に添加し、更に培養を続けることにより、形質
転換細胞の一次選択を効率よく行うことができた。
【００３０】次いで、このコロニーを上記Ｒ２基本培地
に２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）を２
ｍｇ／ｌ程度、アガロースを０．１〜１．０％加えた寒
天培地上で２〜４週間、照明下（１０００〜４０００ｌ
ｕｘ）、２７〜３３℃で培養し、３〜６ｍｍφのカルス
を得た。このカルスの一部をＸ−ｇｌｕｃｒｏｎｉｄｅ
で染色し、陽性のものをＤＮＡのとり込まれた形質転換
カルスとして二次選択した。
に２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）を２
ｍｇ／ｌ程度、アガロースを０．１〜１．０％加えた寒
天培地上で２〜４週間、照明下（１０００〜４０００ｌ
ｕｘ）、２７〜３３℃で培養し、３〜６ｍｍφのカルス
を得た。このカルスの一部をＸ−ｇｌｕｃｒｏｎｉｄｅ
で染色し、陽性のものをＤＮＡのとり込まれた形質転換
カルスとして二次選択した。
【００３１】目的の遺伝子を取り込んだカルスを再生培
地Ｒ２Ｒ（上記Ｒ２基本培地＋０．５μｇ／ｌ ゼアチ
ン＋ １μｇ／ｌ ＩＡＡ）で２週間ごとに植え継ぎ、
照明下（１０００〜４０００ｌｕｘ）、２７〜３３℃で
培養すると幼植物が得られた。これをカルスから分離し
てさらに再生培地Ｒ２Ｒをいれたマジェンダボックスで
照明下（１０００〜４０００ｌｕｘ）、２７〜３３℃で
培養することにより、順化可能な根と葉を持った苗が得
られた。これを滅菌した土（バーミキュライトと培土）
を入れたマジェンタボックスに移しビニール袋で覆い、
徐々に通気させて順化させた。順化を終えた苗を、ポッ
トに植え再生体を得た。
地Ｒ２Ｒ（上記Ｒ２基本培地＋０．５μｇ／ｌ ゼアチ
ン＋ １μｇ／ｌ ＩＡＡ）で２週間ごとに植え継ぎ、
照明下（１０００〜４０００ｌｕｘ）、２７〜３３℃で
培養すると幼植物が得られた。これをカルスから分離し
てさらに再生培地Ｒ２Ｒをいれたマジェンダボックスで
照明下（１０００〜４０００ｌｕｘ）、２７〜３３℃で
培養することにより、順化可能な根と葉を持った苗が得
られた。これを滅菌した土（バーミキュライトと培土）
を入れたマジェンタボックスに移しビニール袋で覆い、
徐々に通気させて順化させた。順化を終えた苗を、ポッ
トに植え再生体を得た。
【００３２】 ４．形質転換された個体における遺伝子導入の確認 形質転換体にｇｕｓ遺伝子が導入されたことはその活性
から明らかであるが、ｗａｘｙ遺伝子の５’上流域が導
入されたか否かを確認するために、サザン解析およびＰ
ＣＲ解析を行い、核酸レベルでの３次選抜を行った。
から明らかであるが、ｗａｘｙ遺伝子の５’上流域が導
入されたか否かを確認するために、サザン解析およびＰ
ＣＲ解析を行い、核酸レベルでの３次選抜を行った。
【００３３】材料となるゲノミックＤＮＡは、形質転換
された再生体の若葉より上記Ｗａｌｂｏｔの方法により
調製した。その４μｇをＲｓａＩで消化、エタノール沈
殿後、１％アガロースゲル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ ６章）で電気泳動し、０．５μｇ／ｍｌ
臭化エチジウムで染色した後、０．２５Ｎ ＨＣｌで３
０分間ＤＮＡを酸で部分分解し、０．５Ｎ ＮａＯＨ−
１．５Ｎ ＮａＣｌで１５分間アルカリ処理して、０．
２５Ｎ ＮａＯＨ−１．５Ｎ ＮａＣｌ下でナイロン膜
ハイボンドＮ+（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）へ核酸を移し
とった（Ｖａｃｕｏ Ｇｅｎｅ 真空ブロッター，６０
ｃｍ・Ｈ2Ｏで１時間）。膜を２×ＳＳＣ（ＮａＣｌ
１７．５ｇ／ｌ、クエン酸ナトリウム ８．８２ｇ／
ｌ）で中和・洗浄した後乾燥させ、紫外線を２分間照射
して核酸を固定した。サザン解析のプローブは、ｐＢＩ
２０１Ｅ １０μｇをＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＶで消
化して得られるＧＵＳ蛋白のＮ末部分を含む６００ｂｐ
の断片２５ｎｇを、32Ｐ−ｄＣＴＰで標識（Ｍｕｌｔｉ
ｐｒｉｍｅ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｋｉｔ，Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ社製）して調製した。
された再生体の若葉より上記Ｗａｌｂｏｔの方法により
調製した。その４μｇをＲｓａＩで消化、エタノール沈
殿後、１％アガロースゲル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ ６章）で電気泳動し、０．５μｇ／ｍｌ
臭化エチジウムで染色した後、０．２５Ｎ ＨＣｌで３
０分間ＤＮＡを酸で部分分解し、０．５Ｎ ＮａＯＨ−
１．５Ｎ ＮａＣｌで１５分間アルカリ処理して、０．
２５Ｎ ＮａＯＨ−１．５Ｎ ＮａＣｌ下でナイロン膜
ハイボンドＮ+（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）へ核酸を移し
とった（Ｖａｃｕｏ Ｇｅｎｅ 真空ブロッター，６０
ｃｍ・Ｈ2Ｏで１時間）。膜を２×ＳＳＣ（ＮａＣｌ
１７．５ｇ／ｌ、クエン酸ナトリウム ８．８２ｇ／
ｌ）で中和・洗浄した後乾燥させ、紫外線を２分間照射
して核酸を固定した。サザン解析のプローブは、ｐＢＩ
２０１Ｅ １０μｇをＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＶで消
化して得られるＧＵＳ蛋白のＮ末部分を含む６００ｂｐ
の断片２５ｎｇを、32Ｐ−ｄＣＴＰで標識（Ｍｕｌｔｉ
ｐｒｉｍｅ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｋｉｔ，Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ社製）して調製した。
【００３４】上述の膜を、１０ｍｌのプレハイブリダイ
ゼーション液（４×ＳＳＣＰ、５０％ ホルムアミド、
１％ ＳＤＳ、２５０μｇ／ｍｌ サケ精巣ＤＮＡ）中
で４２℃、１時間処理した後、プローブを混和したハイ
ブリダイゼーション液（０．１ｇ／ｍｌ デキストラン
硫酸を含むプレハイブリダイゼーション液）１０ｍｌと
置換し、４２℃で一晩ハイブリッドを形成させた。反応
後、１００ｍｌの洗浄液Ｉ（２×ＳＳＣ、０．１％ Ｓ
ＤＳ）で室温、１５分間の振とうを２回、洗浄液ＩＩ
（０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ）で室温、１５分
間振とう、さらに６５℃で１５分間振とうして非特異的
なプローブを膜から除去し、本来のシグナルをＸ線フィ
ルムに感光させた。これにより、ｗａｘｙＤＮＡとｇｕ
ｓのＤＮＡ上にあるＲｓａＩで切り取られる１．８ｋｂ
（ｗａｘｙから１．４ｋｂ、ｇｕｓから０．４ｋｂ）が
ＧＵＳ蛋白のＮ末ＤＮＡでプローブされてシグナルとな
る。そこでこの１．８ｋｂのバンドとして検出されたも
のを選抜した。ＲｓａＩは転写開始点より上流−０．１
６ｋｂにあり、ｐＷＸＧＵＳのすべてのベクターでこの
シグナルが得られる。
ゼーション液（４×ＳＳＣＰ、５０％ ホルムアミド、
１％ ＳＤＳ、２５０μｇ／ｍｌ サケ精巣ＤＮＡ）中
で４２℃、１時間処理した後、プローブを混和したハイ
ブリダイゼーション液（０．１ｇ／ｍｌ デキストラン
硫酸を含むプレハイブリダイゼーション液）１０ｍｌと
置換し、４２℃で一晩ハイブリッドを形成させた。反応
後、１００ｍｌの洗浄液Ｉ（２×ＳＳＣ、０．１％ Ｓ
ＤＳ）で室温、１５分間の振とうを２回、洗浄液ＩＩ
（０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ）で室温、１５分
間振とう、さらに６５℃で１５分間振とうして非特異的
なプローブを膜から除去し、本来のシグナルをＸ線フィ
ルムに感光させた。これにより、ｗａｘｙＤＮＡとｇｕ
ｓのＤＮＡ上にあるＲｓａＩで切り取られる１．８ｋｂ
（ｗａｘｙから１．４ｋｂ、ｇｕｓから０．４ｋｂ）が
ＧＵＳ蛋白のＮ末ＤＮＡでプローブされてシグナルとな
る。そこでこの１．８ｋｂのバンドとして検出されたも
のを選抜した。ＲｓａＩは転写開始点より上流−０．１
６ｋｂにあり、ｐＷＸＧＵＳのすべてのベクターでこの
シグナルが得られる。
【００３５】同様にして、これより上流域のｗａｘｙＤ
ＮＡを持つものは、別の制限酵素Ａ（ｐＷＸＧＵＳベク
ター上で１ヶ所切断するもの。例えば図２に示したＳｔ
ｕＩ、ＭｌｕＩ、ＳｐｈＩ）を用い、ｇｕｓ遺伝子内の
ＥｃｏＲＶとともに切断することにより、［制限酵素Ａ
から開始コドンＡＴＧまでの距離＋ｇｕｓ内の０．６ｋ
ｂ］で得られるＤＮＡを上述のプローブで検出すれば、
目的とする遺伝子の導入を確認することができる。
ＮＡを持つものは、別の制限酵素Ａ（ｐＷＸＧＵＳベク
ター上で１ヶ所切断するもの。例えば図２に示したＳｔ
ｕＩ、ＭｌｕＩ、ＳｐｈＩ）を用い、ｇｕｓ遺伝子内の
ＥｃｏＲＶとともに切断することにより、［制限酵素Ａ
から開始コドンＡＴＧまでの距離＋ｇｕｓ内の０．６ｋ
ｂ］で得られるＤＮＡを上述のプローブで検出すれば、
目的とする遺伝子の導入を確認することができる。
【００３６】またＲｓａＩでの選抜を終えたものは、Ｐ
ＣＲ法（Ｓａｉｋｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５
０，１９８８）を使って上流域遺伝子の導入を確認し
た。すなわち、ｐＷＸＧＵＳベクターはそのｗａｘｙＤ
ＮＡの５’側にｐＵＣ１９由来のリバーサルプライマー
対応領域を持つ。そこで配列表の配列番号３に記載のリ
バーサルプライマーおよびＲｓａＩ部位より下流の逆向
きプライマー ＧＧＴＧＴＣＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＴ
（配列表の配列番号５）を用いて、ＰＣＲ反応を９４℃
で１分間（変性ステップ）、５２℃で２分間（アニーリ
ングステップ）、７２℃で３分間（伸長ステップ）の操
作を３０サイクル行った。完全長のものが導入されたも
のについて、ｐＷＸＧＵＳ−１．２なら１．１ｋｂ、ｐ
ＷＸＧＵＳ−０．６４で０．４７ｋｂ、ｐＷＸＧＵＳ−
０．２８で０．１１ｋｂの増幅断片が得られた。このよ
うにして、目的とするベクターの導入された個体を選抜
した。
ＣＲ法（Ｓａｉｋｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５
０，１９８８）を使って上流域遺伝子の導入を確認し
た。すなわち、ｐＷＸＧＵＳベクターはそのｗａｘｙＤ
ＮＡの５’側にｐＵＣ１９由来のリバーサルプライマー
対応領域を持つ。そこで配列表の配列番号３に記載のリ
バーサルプライマーおよびＲｓａＩ部位より下流の逆向
きプライマー ＧＧＴＧＴＣＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＴ
（配列表の配列番号５）を用いて、ＰＣＲ反応を９４℃
で１分間（変性ステップ）、５２℃で２分間（アニーリ
ングステップ）、７２℃で３分間（伸長ステップ）の操
作を３０サイクル行った。完全長のものが導入されたも
のについて、ｐＷＸＧＵＳ−１．２なら１．１ｋｂ、ｐ
ＷＸＧＵＳ−０．６４で０．４７ｋｂ、ｐＷＸＧＵＳ−
０．２８で０．１１ｋｂの増幅断片が得られた。このよ
うにして、目的とするベクターの導入された個体を選抜
した。
【００３７】５．形質転換体を用いたｗａｘｙ−ｇｕｓ
遺伝子の発現解析 再生体を用いて胚乳でのｗａｘｙ−ｇｕｓレポーター遺
伝子の発現をグルクロニダーゼ活性（Ｊｅｆｆｅｒｓｏ
ｎ，ＥＭＢＯ Ｊ．，６，３９０１−３９０７，１９８
７）で調べた。酵素サンプルは開花後２０日の胚乳から
２ｍｍ径の切片をとり４００μｌの緩衝液に抽出し遠心
上清を得、その２μｌを用いて酵素活性を測定した。２
００μｌの酵素活性試験系には２０％メタノールを含む
（Ｋｏｓｕｇｉ，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ，４，２０９−２１２，１９９２）。測定結果
を図３に示す。
遺伝子の発現解析 再生体を用いて胚乳でのｗａｘｙ−ｇｕｓレポーター遺
伝子の発現をグルクロニダーゼ活性（Ｊｅｆｆｅｒｓｏ
ｎ，ＥＭＢＯ Ｊ．，６，３９０１−３９０７，１９８
７）で調べた。酵素サンプルは開花後２０日の胚乳から
２ｍｍ径の切片をとり４００μｌの緩衝液に抽出し遠心
上清を得、その２μｌを用いて酵素活性を測定した。２
００μｌの酵素活性試験系には２０％メタノールを含む
（Ｋｏｓｕｇｉ，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ，４，２０９−２１２，１９９２）。測定結果
を図３に示す。
【００３８】ｐＷＸＧＵＳ−０．２８を導入した再生体
で１０4 ｐｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ蛋白の発現があり、さ
らに長い上流域を持つｐＷＸＧＵＳ−０．６４やｐＷＸ
ＧＵＳ−１．２ではその１０倍の１０5 ｐｍｏｌ／ｍｉ
ｎ／ｍｇ蛋白が認められた。これらの値を対照として用
いた通常の遺伝子導入に汎用される３５Ｓプロモーター
のみを有するｐＢＩ２２１のＧＵＳ活性値１００〜５０
０ｐｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ蛋白と比較して、ｗａｘｙ遺
伝子の発現の強さが明らかになった。これは今までの報
告にないきわめて高いレベルの発現である。
で１０4 ｐｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ蛋白の発現があり、さ
らに長い上流域を持つｐＷＸＧＵＳ−０．６４やｐＷＸ
ＧＵＳ−１．２ではその１０倍の１０5 ｐｍｏｌ／ｍｉ
ｎ／ｍｇ蛋白が認められた。これらの値を対照として用
いた通常の遺伝子導入に汎用される３５Ｓプロモーター
のみを有するｐＢＩ２２１のＧＵＳ活性値１００〜５０
０ｐｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ蛋白と比較して、ｗａｘｙ遺
伝子の発現の強さが明らかになった。これは今までの報
告にないきわめて高いレベルの発現である。
【００３９】以上の結果から、−０．６４ｋｂと−０．
２８ｋｂの間に胚乳で機能するエンハンサー配列のある
ことが明らかになった。配列表の配列番号１に、Ｍｌｕ
Ｉ部位：−０．６４ｋｂからＳｐｈＩ部位：−０．２８
ｋｂまでの塩基配列を示した。これはタンパク質をコー
ドする構造遺伝子を種子で強力に発現させるためにｗａ
ｘｙ遺伝子の−０．６４ｋｂから−０．２８ｋｂの領域
が必要であることを示している。
２８ｋｂの間に胚乳で機能するエンハンサー配列のある
ことが明らかになった。配列表の配列番号１に、Ｍｌｕ
Ｉ部位：−０．６４ｋｂからＳｐｈＩ部位：−０．２８
ｋｂまでの塩基配列を示した。これはタンパク質をコー
ドする構造遺伝子を種子で強力に発現させるためにｗａ
ｘｙ遺伝子の−０．６４ｋｂから−０．２８ｋｂの領域
が必要であることを示している。
【００４０】
【発明の効果】本発明はイネ科植物の種子で強力な発現
をするｗａｘｙ遺伝子の調節領域に関するものである。
外来遺伝子をこの調節領域と連結しイネ科植物に導入す
れば、種子の成分を意図的に改良したり種子において物
質生産を行うことが可能になる。
をするｗａｘｙ遺伝子の調節領域に関するものである。
外来遺伝子をこの調節領域と連結しイネ科植物に導入す
れば、種子の成分を意図的に改良したり種子において物
質生産を行うことが可能になる。
【００４１】
配列番号：１ 配列の長さ：３６３ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノミックＤＮＡ 起源 生物名：イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．） 株名：Ｌａｂｅｌｌｅ 配列の特徴 特徴を表わす記号：ｅｎｈａｎｃｅｒ 存在位置：１−３６３ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 CGCGTACCCG ACGGCTCACA CATCCCCCGG TGCCCAACAG AAACCACACA CCACCCGCAC 60 GAAAAAAACC GAACCGAACC GCACGTGCGC GCGCGCTCCA CGCACACCCC AAACAGACGG 120 CACGGCGGGA GCGCGCGCGC GCGCACGCGA GCCGAGGAGA AAACAAACGG GGGAAACAAG 180 CTGGAAAAGC AAAAGGGGAA AAGAACGGAG CGGAGGCTTC ACCCACGGCC ACCGCGACGC 240 GCCACCAGCG TGCGGTGCAA TGCAACGTAC GCCAAGCCGA AACGGCAGGC AGCGTCGCGC 300 ACGCACGCAC ACACAGGCCA CAGCACACGC GAGCGACGTA CGCGAGTGCA TGCAGATGCA 360 TGC 363
【００４２】配列番号：２ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GAGGTGGATC CGAGCTG 17
【００４３】配列番号：３ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CAGGAAACAG CTATGAC 17
【００４４】配列番号：４ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CACGGGTTGG GGTTTCT 17
【００４５】配列番号：５ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGTGTCGACG ATGACAT 17
【図１】イネの葉より調製したゲノミッククローンのＨ
ｉｎｄＩＩＩ断片（１５ｋｂ）およびその制限酵素地図
を表す図面である。３ｋｂ、６ｋｂおよび２．３ｋｂと
記した直線は、本願で取得したサブクローンを表す。３
ｋｂのＥｃｏＲＩ断片には転写開始点を含むｗａｘｙ遺
伝子の５’調節上流域が、６ｋｂのＥｃｏＲＩ断片には
ＷＡＸＹ蛋白のコード領域が、２．３ｋｂのＰｓｔＩ断
片にはＷＡＸＹ蛋白の翻訳開始点が含まれる。
ｉｎｄＩＩＩ断片（１５ｋｂ）およびその制限酵素地図
を表す図面である。３ｋｂ、６ｋｂおよび２．３ｋｂと
記した直線は、本願で取得したサブクローンを表す。３
ｋｂのＥｃｏＲＩ断片には転写開始点を含むｗａｘｙ遺
伝子の５’調節上流域が、６ｋｂのＥｃｏＲＩ断片には
ＷＡＸＹ蛋白のコード領域が、２．３ｋｂのＰｓｔＩ断
片にはＷＡＸＹ蛋白の翻訳開始点が含まれる。
【図２】種々の長さのｗａｘｙ遺伝子５’調節上流域と
ｇｕｓ遺伝子との連結ベクターの構築を表す図面であ
る。
ｇｕｓ遺伝子との連結ベクターの構築を表す図面であ
る。
【図３】ベクターｐＷＸＧＵＳ−１．２、ｐＷＸＧＵＳ
−０．６４、ｐＷＸＧＵＳ−０．２８およびｐＢＩ２２
１それぞれが独立して導入された複数の形質転換再生体
を得、そこから得られる複数の種子（胚乳）におけるＧ
ＵＳ活性を表した図面である。
−０．６４、ｐＷＸＧＵＳ−０．２８およびｐＢＩ２２
１それぞれが独立して導入された複数の形質転換再生体
を得、そこから得られる複数の種子（胚乳）におけるＧ
ＵＳ活性を表した図面である。
Claims (5)
- 【請求項１】 イネｗａｘｙ遺伝子の転写開始点より−
６３７〜−２７５塩基５’上流に存在する発現調節ＤＮ
Ａ。 - 【請求項２】 配列表の配列番号１に記載の塩基配列で
表されることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ。 - 【請求項３】 請求項１記載のＤＮＡの下流に胚乳で発
現するプロモーターおよびタンパク質をコードする遺伝
子を導入してなるベクター。 - 【請求項４】 請求項３に記載のベクターをイネ科植物
由来のプロトプラストに導入し、コロニーを形成させた
後該コロニーから植物体を再生させて得られたイネ科植
物。 - 【請求項５】 請求項３に記載のベクターおよびイネ科
植物由来のプロトプラストを液体媒体に懸濁し、電気パ
ルスを印加して該ベクターを該プロトプラストに導入し
た後、イネ培養細胞を含有する培地で培養してコロニー
を形成させ、該コロニーから植物体を再生させることを
特徴とするイネ科植物の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20646193A JP3489142B2 (ja) | 1993-08-20 | 1993-08-20 | 発現調節ｄｎａ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20646193A JP3489142B2 (ja) | 1993-08-20 | 1993-08-20 | 発現調節ｄｎａ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0759575A true JPH0759575A (ja) | 1995-03-07 |
| JP3489142B2 JP3489142B2 (ja) | 2004-01-19 |
Family
ID=16523767
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20646193A Expired - Fee Related JP3489142B2 (ja) | 1993-08-20 | 1993-08-20 | 発現調節ｄｎａ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3489142B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108531645A (zh) * | 2018-07-09 | 2018-09-14 | 江苏省农业科学院 | 低直链淀粉含量基因wx-C39的功能标记及其应用 |
-
1993
- 1993-08-20 JP JP20646193A patent/JP3489142B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108531645A (zh) * | 2018-07-09 | 2018-09-14 | 江苏省农业科学院 | 低直链淀粉含量基因wx-C39的功能标记及其应用 |
| CN108531645B (zh) * | 2018-07-09 | 2021-07-27 | 江苏省农业科学院 | 低直链淀粉含量基因wx-C39的功能标记及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3489142B2 (ja) | 2004-01-19 |
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