JPH0759198B2 - ギ酸デヒドロゲナ−ゼを用いる共役反応方法 - Google Patents
ギ酸デヒドロゲナ−ゼを用いる共役反応方法Info
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- JPH0759198B2 JPH0759198B2 JP4958686A JP4958686A JPH0759198B2 JP H0759198 B2 JPH0759198 B2 JP H0759198B2 JP 4958686 A JP4958686 A JP 4958686A JP 4958686 A JP4958686 A JP 4958686A JP H0759198 B2 JPH0759198 B2 JP H0759198B2
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ギ酸デヒドロゲナーゼを用いる共役反応方法
に関する。
に関する。
（従来の技術） 式（Ｉ）のようなNAD（ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド）関与の酵素反応を工業的製造法に適用するた
めには、NADを元の還元型NAD（NADH2）に再生するため
の反応（II）と共役させる必要がある。
レオチド）関与の酵素反応を工業的製造法に適用するた
めには、NADを元の還元型NAD（NADH2）に再生するため
の反応（II）と共役させる必要がある。
Ａ＋NADH2＝AH2＋NAD （Ｉ） BH2＋NAD＝Ｂ＋NADH2 （II） さらに、式（Ｉ）、（II）の反応を連続的に行つてAH2
を効率よく製造するためには、NAD又はNADH2を反応器内
に保持ないし固定化して繰り返し使用しなければならな
い。
を効率よく製造するためには、NAD又はNADH2を反応器内
に保持ないし固定化して繰り返し使用しなければならな
い。
従来、NAD、NADH2の固定には、それを水溶性又は非水溶
性の高分子物質と結合させて高分子化し、半透膜で封じ
込む方法が一般的であるが、式（II）の反応を触媒する
酵素にNADを共有結合させ、反応（II）で生じたNADH2が
酵素に結合したままで、もう一方の酵素反応（式
（Ｉ））に利用される方法がある。その例としては、マ
ンソンらによつて、N6〔Ｎ−（６−アミノヘキシル）カ
ルバモイルメチル〕NADを馬肝臓アルコールデヒドロゲ
ナーゼに共有結合させ、これを乳酸デヒドロゲナーゼ反
応と共役させてピルビン酸から乳酸を生成させることが
報告されている（Eur.J.Biochem.,86,455−466,（197
8）。
性の高分子物質と結合させて高分子化し、半透膜で封じ
込む方法が一般的であるが、式（II）の反応を触媒する
酵素にNADを共有結合させ、反応（II）で生じたNADH2が
酵素に結合したままで、もう一方の酵素反応（式
（Ｉ））に利用される方法がある。その例としては、マ
ンソンらによつて、N6〔Ｎ−（６−アミノヘキシル）カ
ルバモイルメチル〕NADを馬肝臓アルコールデヒドロゲ
ナーゼに共有結合させ、これを乳酸デヒドロゲナーゼ反
応と共役させてピルビン酸から乳酸を生成させることが
報告されている（Eur.J.Biochem.,86,455−466,（197
8）。
（発明が解決しようとする問題点） 通常のNAD要求脱水素酵素を用いる共役反応において
は、反応液中に少くとも２系列の生成物が存在すること
になり、その分離がきわめて難しい。
は、反応液中に少くとも２系列の生成物が存在すること
になり、その分離がきわめて難しい。
これに対してギ酸デヒドロゲナーゼを用いて、共役反応
を充分進行させれば、原料側の残存をほとんどなくすこ
とも可能でその時は反応液中にNADH2要求酵素による生
成物のみが残ることになり工業的に非常に有利である。
を充分進行させれば、原料側の残存をほとんどなくすこ
とも可能でその時は反応液中にNADH2要求酵素による生
成物のみが残ることになり工業的に非常に有利である。
ここで、工業的に本共役反応を利用するとすれば、連続
的に酵素を再使用するためにも、酵素と補酵素の両方を
何らかの担体に固定化させるか、膜などによりある槽内
に閉じこめることが必要である。しかしながら、酵素に
ついてはその目的にかなう固定化方法及び膜などによる
閉じこめ方法が開発されているが、補酵素については工
業的に優れた方法が開発されておらず、これが本共役酵
素反応の工業化を阻害する最大の要因となつていた。
的に酵素を再使用するためにも、酵素と補酵素の両方を
何らかの担体に固定化させるか、膜などによりある槽内
に閉じこめることが必要である。しかしながら、酵素に
ついてはその目的にかなう固定化方法及び膜などによる
閉じこめ方法が開発されているが、補酵素については工
業的に優れた方法が開発されておらず、これが本共役酵
素反応の工業化を阻害する最大の要因となつていた。
そこで、本発明者らは、ギ酸デヒドロゲナーゼを用いる
共役反応において、ギ酸デヒドロゲナーゼ又はNADH2要
求酵素の少なくとも一方の酵素にNADを共有結合させる
ことにより、精製が容易で、かつ補酵素が固定化された
方法を見出し、本発明に到達した。
共役反応において、ギ酸デヒドロゲナーゼ又はNADH2要
求酵素の少なくとも一方の酵素にNADを共有結合させる
ことにより、精製が容易で、かつ補酵素が固定化された
方法を見出し、本発明に到達した。
（問題点を解決するための手段） すなわち、本発明の要旨は、ギ酸デヒドロゲナーゼを用
いる脱水素反応と、還元型補酵素NADH2を電子供与体と
する酵素反応において、その両酵素の少なくとも一方は
NADと共有結合させることを特徴とするギ酸デヒドロゲ
ナーゼを用いる共役反応方法にある。この方法により、
結合固定化されたNADが両酵素反応間で酸化還元のリサ
イクルをくりかえし、目的とするNADH2要求酵素反応が
円滑に進行し、その反応の生成物が効率的に得られる。
いる脱水素反応と、還元型補酵素NADH2を電子供与体と
する酵素反応において、その両酵素の少なくとも一方は
NADと共有結合させることを特徴とするギ酸デヒドロゲ
ナーゼを用いる共役反応方法にある。この方法により、
結合固定化されたNADが両酵素反応間で酸化還元のリサ
イクルをくりかえし、目的とするNADH2要求酵素反応が
円滑に進行し、その反応の生成物が効率的に得られる。
以下、本発明を詳細に説明する。
まず、本発明における共役反応は、ギ酸デヒドロゲナー
ゼとNADH2要求酵素を用いて行なわれる。
ゼとNADH2要求酵素を用いて行なわれる。
ギ酸デヒドロゲナーゼは、ギ酸を脱水素として、炭酸ガ
スを発生させる酵素である。
スを発生させる酵素である。
この際、酸化型補酵素NADが電子受容体として必要であ
り、本反応（ギ酸→CO2）の進行に伴ないNADはNADH2へ
転換される。
り、本反応（ギ酸→CO2）の進行に伴ないNADはNADH2へ
転換される。
一方、NADH2要求酵素反応は、目的とする方向の反応を
進行させるのに、電子供与体として補酵素NADH2を必要
とする反応であり、この反応の進行とともにNADH2はNAD
に酸化される。
進行させるのに、電子供与体として補酵素NADH2を必要
とする反応であり、この反応の進行とともにNADH2はNAD
に酸化される。
たとえば、ロイシンデヒドロゲセーゼによる２−オキシ
イソカプロン酸からのＬ−ロイシンの生成、アラニンデ
ヒドロゲナーゼによるピルビン酸からのＬ−アラニンの
生成、リンゴ酸デヒドロゲナーゼによるオギザロ酢酸か
らのリンゴ酸の生成、乳酸デヒドロゲナーゼによるピル
ビン酸からの乳酸の生成、フエニルピルビン酸からのＬ
−フエニルアラニンの生成、メタン酸素添加酵素による
メタンからメタノールの生成、アルカン酸素添加酵素に
よるアルカンから対応する第１級アルコールの生成、な
どの反応があげられる。
イソカプロン酸からのＬ−ロイシンの生成、アラニンデ
ヒドロゲナーゼによるピルビン酸からのＬ−アラニンの
生成、リンゴ酸デヒドロゲナーゼによるオギザロ酢酸か
らのリンゴ酸の生成、乳酸デヒドロゲナーゼによるピル
ビン酸からの乳酸の生成、フエニルピルビン酸からのＬ
−フエニルアラニンの生成、メタン酸素添加酵素による
メタンからメタノールの生成、アルカン酸素添加酵素に
よるアルカンから対応する第１級アルコールの生成、な
どの反応があげられる。
したがつて、NADを要求するギ酸から炭酸ガスへのギ酸
デヒドロゲナーゼによる反応と、上記NADH2要求酵素反
応とを組み合わせると、NADがリサイクルし両反応が都
合よく進行する。しかも本共役反応においては、ギ酸か
ら生成する炭酸ガスは気体として反応系外に逸散するの
で、生成物はNADH2要求酵素反応によるもののみになり
精製が容易になる。
デヒドロゲナーゼによる反応と、上記NADH2要求酵素反
応とを組み合わせると、NADがリサイクルし両反応が都
合よく進行する。しかも本共役反応においては、ギ酸か
ら生成する炭酸ガスは気体として反応系外に逸散するの
で、生成物はNADH2要求酵素反応によるもののみになり
精製が容易になる。
本発明においては、上記共役反応において、ギ酸デヒド
ロゲナーゼとNADH2要求酵素の少なくとも一方をNADと共
有結合させたものを用いる。この共有結合をつくるに
は、たとえばマンソンらの方法（Eur.J.Biochemistry.,
86、455−465、1978）によることができる。この場合、
トリエタノールアミン溶液での反応はpH7〜９程度で行
なうのが一般的である。
ロゲナーゼとNADH2要求酵素の少なくとも一方をNADと共
有結合させたものを用いる。この共有結合をつくるに
は、たとえばマンソンらの方法（Eur.J.Biochemistry.,
86、455−465、1978）によることができる。この場合、
トリエタノールアミン溶液での反応はpH7〜９程度で行
なうのが一般的である。
本発明による共役反応は、一般化すれば次の反応式であ
らわされる。
らわされる。
反応は通常、緩衝液中で行なわれる。
その際のpHは、ギ酸デヒドロゲナーゼ反応の最適pH7.5
と共役するもう一方の反応の最適pHとを考慮して、通常
は、この両pH間ないしはその周辺で行なわれる。
と共役するもう一方の反応の最適pHとを考慮して、通常
は、この両pH間ないしはその周辺で行なわれる。
温度についても同様のことがいえる。
すなわち、ギ酸デヒドロゲナーゼの最適温度（45℃）と
共役するもう一方の反応の最適温度とを考慮して選ばれ
るが、通常は20〜55℃が採用される。
共役するもう一方の反応の最適温度とを考慮して選ばれ
るが、通常は20〜55℃が採用される。
反応においては、少なくとも一方の酵素はNADを共有結
合させて、二つの酵素を適当量添加するが、添加量が多
いと通常、反応ははやく進行する。
合させて、二つの酵素を適当量添加するが、添加量が多
いと通常、反応ははやく進行する。
通常は両酵素とも１ユニツト/ml以上添加するのが望ま
しい。
しい。
ギ酸デヒドロゲナーゼは、通常、ギ酸脱水素能を有する
微生物から既知の方法を用いて分離・精製される。この
ような微生物としては、たとえば、メタノール酵母キヤ
ンデイダボイデニイ（Candida boidinii）があげられ
る。共役するもう一方の酵素は種々の源から得られる
が、微生物起源が多い。たとえば、メタン酸素添加酵素
はメチロコツカスカプスラータス（Methylococcus caps
ulatus）などのメタン酸化細菌である。
微生物から既知の方法を用いて分離・精製される。この
ような微生物としては、たとえば、メタノール酵母キヤ
ンデイダボイデニイ（Candida boidinii）があげられ
る。共役するもう一方の酵素は種々の源から得られる
が、微生物起源が多い。たとえば、メタン酸素添加酵素
はメチロコツカスカプスラータス（Methylococcus caps
ulatus）などのメタン酸化細菌である。
本発明における上記共役反応による微生物の分離・精製
は常法によることができる。
は常法によることができる。
（実施例） 以下、実施例によりさらに本発明を詳細に説明する。
実施例１ NAD誘導体、N6〔Ｎ−（６−アミノヘキシル）カルバモ
イルメチル〕NADの調製とギ酸デヒドロゲナーゼとのカ
ツプリングは、上記マンソン（Mansson）らの方法に準
じて行なつた。
イルメチル〕NADの調製とギ酸デヒドロゲナーゼとのカ
ツプリングは、上記マンソン（Mansson）らの方法に準
じて行なつた。
すなわち、トリエタノールアミン溶液中に5mg/1.5mlの
濃度で酵素を添加し、最終的に5mMのN6〔Ｎ−（６−ア
ミノヘキシル）カルバモイルメチル〕、最終的に50mMの
シアナミド、最終的に25mMのＮ−ヒドロキシサクシニミ
ドを添加し、10℃、72時間反応させた。なお、トリエタ
ノールアミン溶液のpHを8.5とし、酵素サブユニツトあ
たり少なくとも1.2モルのNADを結合することができた
（マンソンらの方法では、pH7.5で、0.2モルのNADを結
合。）。
濃度で酵素を添加し、最終的に5mMのN6〔Ｎ−（６−ア
ミノヘキシル）カルバモイルメチル〕、最終的に50mMの
シアナミド、最終的に25mMのＮ−ヒドロキシサクシニミ
ドを添加し、10℃、72時間反応させた。なお、トリエタ
ノールアミン溶液のpHを8.5とし、酵素サブユニツトあ
たり少なくとも1.2モルのNADを結合することができた
（マンソンらの方法では、pH7.5で、0.2モルのNADを結
合。）。
調製したNAD結合酵素は、含まれる過剰のNAD誘導体を除
去するために、合計100,000倍の容量の10mMリン酸カリ
緩衝液（pH7.5）で透析し、“セフアデツクス"G25で２
回ゲルろ過を行つた後に、酵素画分を限外ろ過膜で濃縮
した。遊離のNAD又はNAD誘導体が存在するか否かは、90
％メタノールで酵素を処理し、その抽出物中のNAD又はN
AD誘導体の存在を紫外線吸収、螢光分析、アルコールデ
ヒドロゲナーゼを用いる酵素分析法で確認した。調製し
たNAD結合酵素には遊離のNADおよびNAD誘導体は存在せ
ず、NADはすべて共有結合されていると判定された。
去するために、合計100,000倍の容量の10mMリン酸カリ
緩衝液（pH7.5）で透析し、“セフアデツクス"G25で２
回ゲルろ過を行つた後に、酵素画分を限外ろ過膜で濃縮
した。遊離のNAD又はNAD誘導体が存在するか否かは、90
％メタノールで酵素を処理し、その抽出物中のNAD又はN
AD誘導体の存在を紫外線吸収、螢光分析、アルコールデ
ヒドロゲナーゼを用いる酵素分析法で確認した。調製し
たNAD結合酵素には遊離のNADおよびNAD誘導体は存在せ
ず、NADはすべて共有結合されていると判定された。
反応は30℃で静置して行い、生成したアミノ酸はアミノ
酸自動分析装置で、有機酸は等速電気泳動装置を用いて
それぞれ定性、定量を行つた。
酸自動分析装置で、有機酸は等速電気泳動装置を用いて
それぞれ定性、定量を行つた。
（１）NAD結合ギ酸デヒドロゲナーゼとロイシンデヒド
ロゲナーゼとの共役反応によるロイシンの生成。
ロゲナーゼとの共役反応によるロイシンの生成。
反応組成： アンモニア緩衝液（pH7.5） 500mM ２−オキソイソカプロン酸 10mM ギ酸 50mM ロイシンデヒドロゲナーゼ 10ユニツト/ml NAD結合ギ酸デヒドロゲナーゼ 5ユニツト/ml （反応液1ml） 図１に示すように、添加した２−オキソイソカプロン酸
は、大略定量的にロイシンに転換した。
は、大略定量的にロイシンに転換した。
（２）NAD結合ギ酸デヒドロゲナーゼとアラニンデヒド
ロゲナーゼとの共役反応によるアラニンの生成。
ロゲナーゼとの共役反応によるアラニンの生成。
反応組成： アンモニア緩衝液（pH7.5） 500mM ピルビン酸 10mM ギ酸 50mM アラニンデヒドロゲナーゼ 10ユニツト/ml NAD結合ギ酸デヒドロゲナーゼ 5ユニツト/ml （反応液1ml） 図２に示したように、添加したピルビン酸は大略定量的
にロイシンに転換した。
にロイシンに転換した。
（３）NAD結合ギ酸デヒドロゲナーゼとリンゴ酸デヒド
ロゲナーゼとの共役反応によるリンゴ酸の生成。
ロゲナーゼとの共役反応によるリンゴ酸の生成。
反応組成： リン酸カリ緩衝液（pH8.0） 50mM オギザロ酢酸 10mM ギ酸 100mM リンゴ酸デヒドロゲナーゼ 10ユニツト/ml NAD結合ギ酸デヒドロゲナーゼ 5ユニツト/ml （反応液1ml） 図３に示したように、添加したオギザロ酢酸は大略定量
的にリンゴ酸に転換した。
的にリンゴ酸に転換した。
（４）NAD結合ロイシンデヒドロゲナーゼとギ酸デヒド
ロゲナーゼとの共役反応によるロイシンの生成。
ロゲナーゼとの共役反応によるロイシンの生成。
反応組成： アンモニア緩衝液（pH7.5） 500mM ２−オキソイソカプロン酸 10mM ギ酸 50mM ギ酸デヒドロゲナーゼ 10ユニツト/ml NAD結合ロイシンデヒドロゲナーゼ 5ユニツト/ml （反応液1ml） 添加した２−オキソイソカプロン酸は大略定量的にロイ
シンに転換した。
シンに転換した。
（５）NAD結合ギ酸デヒドロゲナーゼと乳酸デヒドロゲ
ナーゼとの共役反応によるピルビン酸の生成。
ナーゼとの共役反応によるピルビン酸の生成。
反応組成： リン酸カリ緩衝液（pH8.0） 50mM ピルビン酸 10mM ギ酸 100mM 乳酸デヒドロゲナーゼ 20ユニット/ml NAD結合ギ酸デヒドロゲナーゼ 10ユニツト/ml （反応液1ml） 図４は乳酸デヒドロゲナーゼとNAD結合ギ酸デヒドロゲ
ナーゼとを繰り返し使用した場合のピルビン酸から乳酸
の生成を調べた結果である。１回目の反応では２時間で
添加したピルビン酸は乳酸に転換した。
ナーゼとを繰り返し使用した場合のピルビン酸から乳酸
の生成を調べた結果である。１回目の反応では２時間で
添加したピルビン酸は乳酸に転換した。
この反応液を限外ろ過膜を用いて酵素のみを回収し、再
び上記の組成の反応液を調製して、反応を行つた。
び上記の組成の反応液を調製して、反応を行つた。
図４に示すように、NADを添加することなしに、乳酸デ
ヒドロゲナーゼとNAD結合ギ酸デヒドロゲナーゼは繰り
返し使用することができた。調べた範囲では、少なくと
も８回の使用でも乳酸への転換率は変わらなかつた。
ヒドロゲナーゼとNAD結合ギ酸デヒドロゲナーゼは繰り
返し使用することができた。調べた範囲では、少なくと
も８回の使用でも乳酸への転換率は変わらなかつた。
（発明の効果） 本発明方法によれば、ギ酸デヒドロゲナーゼを用いる共
役反応を効率よく行なうことができる。
役反応を効率よく行なうことができる。
図１〜４は、本発明による共役反応における反応時間
と、生成物の生成量との関係を示す。
と、生成物の生成量との関係を示す。
Claims (1)
- 【請求項１】ギ酸デヒドロゲナーゼを用いる脱水素反応
と、還元型補酵素NADH2を電子供与体とする酵素反応と
を組合わせる共役反応において、その両酵素の少なくと
も一方はNADと共有結合させることを特徴とするギ酸デ
ヒドロゲナーゼを用いる共役反応方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4958686A JPH0759198B2 (ja) | 1986-03-07 | 1986-03-07 | ギ酸デヒドロゲナ−ゼを用いる共役反応方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4958686A JPH0759198B2 (ja) | 1986-03-07 | 1986-03-07 | ギ酸デヒドロゲナ−ゼを用いる共役反応方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62208290A JPS62208290A (ja) | 1987-09-12 |
| JPH0759198B2 true JPH0759198B2 (ja) | 1995-06-28 |
Family
ID=12835326
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4958686A Expired - Lifetime JPH0759198B2 (ja) | 1986-03-07 | 1986-03-07 | ギ酸デヒドロゲナ−ゼを用いる共役反応方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0759198B2 (ja) |
-
1986
- 1986-03-07 JP JP4958686A patent/JPH0759198B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62208290A (ja) | 1987-09-12 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |