JPH07509704A

JPH07509704A - グリシルーヒスチジルーリシン（ｇｈｌ）誘導体

Info

Publication number: JPH07509704A
Application number: JP6504972A
Authority: JP
Inventors: スポルトレッティ，ジアンカルロ; ダル　ポッゾ，アルマ
Original assignee: エレム　インダストリア　ファルマチェウティカ　エッセ　エッレ　エッレ
Priority date: 1992-08-04
Filing date: 1993-07-28
Publication date: 1995-10-26
Also published as: EP0656009A1; ITMI921914A1; IT1261646B; ITMI921914A0; WO1994003482A1; AU4703393A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、細胞刺激および細胞保護活性を有するＧ　１　ｙ　−Ｈｉ　５−Ｌｙ　ｓ　（ＧＨＬ）ペプチド誘導体、それらの治療への用途、並びにそれらを含む薬学的組成物に関する。

本発明の誘導体は、改良された治療作用と共に、加水分解酵素に対して驚異的な抵抗が付与されている。

傷処理の診療に多くの方法が知られており、特別の器具（耐感染薬物処理したプラスターから火傷患者用の合成皮膚代替物までを含む）、軟膏、ゲル又はその他の、例えば亜鉛誘導体を含む局部塗布用の配合物がある。

最近、組織の回復機構のより深い知識と再編成りＮＡ技術の発展の結果、（１やしの過程を促進および／又は正常化し、そしてさもなければ治らなかった組織の損傷（例えば、床ずれ又は糖尿病性清釦を治し、そして傷あとおよびケロイドの形成を防止するために、種々の活性成分が調製および研究された。

−成長因子、例えば：ｂＦＧＦ、基本的な繊維芽細胞成長因子、ＥＧＦ、表面成長因子、ＧＨＬ（ＧＨＫとしても知られている）、血漿鋼−結合成長因子、等− 細胞外マトリックス　例えば繊維ネクチン、コラーゲン等。

しかしながら、多くの理由でこれらの誘導体の使用が難しい。それらは、物質の入手し易さ、ウィルス性又は細胞性疾病の伝染の危険性を、それら自体の原因、特に酵素系（例えばプロテアーゼおよびペプチターゼ：両者共に失怪円および生体外について）に対する不安定性に起因して、有している。上記の酵素系に対する不安定性は殆んどの蛋白質、糖蛋白質又はペプチド系物質の特徴であり、それらを薬として、特にプロテアーゼ活性が増大する病理、例えば全身および局所の炎症状態、における薬として使用する際の主な障害となる。

従って、殆んどの種々の治療分野において、更に安定な活性成分の要求がある。

治癒の特別な事例において、ＥＧＦ、ｂＦＧＦおよびコラーゲンのような再編成りＮＡ又は抽出によって得られる複合蛋白質をこの目的で試みると困難であることがわかる。２〜３の公知の例は、セリンプロテアーゼの阻止剤およびＥＧＦについてはコラーゲンのような対抗物質の両方を含む局部的生薬形体の使用に基づいている（例えば、奥村外、Ｐｈａ　ｒｍ、Ｒｅｓ、、ヱ、１２８９頁、１９９０年参照）。

Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ　（ＲＧＤ　フィブロネクチン、ラミニンおよびその他の細胞外マトリックスの蛋白質の細胞付着位置として知られている）および血漿銅−結合成長因子（Ｇ　ＨＬ又はＧＨＫ　トリペプチドＧｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ）のような単純なペプチド分子に関する限り、今日まで用いられた安定化の方法は、Ｎ−又はＣ−末端（又はアミノ酸側鎖の同等な基）の変性　即ち、該末端上に適゛）な残基をエステル結合又はアミド結合により導入し、ペプチド骨格は変えずにおくこと、に基づいている。かかる変更はプロテアーゼ分解にある程度の抵抗をもたらすが、該生成物の半減期はエステラーゼのような、対照とする組織の病原により多少活性化されそして導入された基を引き裂くことができる別の酵素系の局部的な存在に支配される（従って、生成するペプチドを自然破壊過程に曝すことになる）。

これに関連して、ビエルンユバッカー　エム、（ＰｉｃｒｓｃｈｂａｃｈｃｒＭ、）（ＷＯ９０１０６７６７、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｃｓ、Ｆｏｕｎｄ、）は、ヤルロニック酸（ｊａｌｕｒｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）、コンドロイチン　スルフェート、ヘパリン　スルフェート等のような生物分解性ポリマー物質と結合したＡ　ｒ　ｇ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ａ　ｓ　ｐ　（ＲＧＤ）のポリペプチドポリマーを提案している。

ピッカート　エル、　アール、（Ｐｉｃｋａｒｔ　Ｌ、Ｒ，）（米国特許４，６６５．０５４号、１９８５年１２１’ｌ　５ト１発行、出願人ビオヘッド　インク、）は、一般式　グリンルーヒスチジルーリシル−ＣＯＯＲ（ＲＯ−アルキル又はアリールアルコール残基；　Ｎｌ２基）を有するグリシル−ヒスチジル−リシン（ＧＨＬ）ペプチド誘導体の銅錯体の治癒作用を開示し、そして治癒過程の容易化においておよび血漿板によるトロンボキサン生成の阻止における有用性を請求の範囲としている。天然ペプチドと比較して、該誘導体はカルボキシペプチターゼ、即ち、分子をカルボキシ末端基（Ｃ−末端基）から始めて加水分解する酵素、による加水分解に対して安定性が高い。

事実、これらの酵素についての下記の半減期（大よそ且つ過大である）が上記の米国特許に報告されたデータから導くことができる。天然ＧＨＬ＜１分、ＧＨＬ −ＣＯＮＨ２〈２分；ＧＨＬ−ＣｏｏＭｅ＜１．５分；ＧＨＬ−ＣＯＯＣＨ２Ｃ６Ｈ５〉８〜１０分。

本発明によるＧＨＬペプチドの誘導体（および対応する銅複合体の誘導体）が、驚（べきことに、カルボキシ−およびアミノーペプチターゼ、並びにエステラーゼの両方に対して、ペプチドについての全般的な安定性を増加させることが見出された。

本発明は、ＧＨＬペプチドの安定化についての公知の問題に、一層好ましい解決法を与える。本発明の誘導体は、適用可能な治療分野（傷の治癒、種々の病因による？口瘍および組織損傷）に対しておよび美容上の適用（皮下脂肪の増大、しわおよび毛細血管拡張症の低減１毛の成長の刺激）に対して改良を与える。何故なら、ピッカート　エル、アール、が開示した公知の誘導体とは異なり、本願誘導体はカルボキシペプチターゼ、アミノペプチターゼおよびエステラーゼ（エステラーゼはＧＨＬとアルコール又はアミド残基との間のエステル結合を加水分解することができ、従って生成するＧＨＬを引続き急速な分解に曝す）のような加水分解剤に対して、一層高く且つ予想外の抵抗を示す。

これらの生成物はＣｕイオンと結合する能力を維持しており、そして活性度（単位本量当りの活性として定義される）および長時間の作用の両者について（両者は酵素加水分解に対する増大した抵抗性に関連する）、天然誘導体よりも高い生物学的活性を示す。

本発明の誘導体は下記の一般式を有するＧｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−ＯＲ（１）ここで：ＧｒｙはＦ記の残基の一つであるニー　グリシンニー　サルコシン゛ −式：Ｎｌ２−ＣＨ２ＮＨ−１［ｇｃｍ　（Ｇ　ｌ　ｙ）　］の基。

Ｈｉ　ｓは下記の９ふ基の一つであるＬｙｓは下記の残基の一つであるＲは水素、直鎖又は枝分かれ鎖のｃ、ＣＩ４アルキル基、Ｃ６Ｃｌ４アリール又はアルアルキル基である、但し、Ｇｌｙ、ＨｉｓおよびＬｙｓは同時に天然のアミノ酸りリンン、Ｌ−ヒスチジンおよびＩ、−リシンとはならない。

本発明はまた、化合物Ｉの薬学的に許容される塩および銅複合体（ｃ　ｏｍｐ　１ｅｘ）をも包含する。

式ｒの好ましい化合物は下記のものである１−Ｈｉｓ又はＬｙｓが対応するＤアミノ酸の残基であり、そしてＲがＨであるもの。

２−Ｈｉｓ又はＬｙｓが対応するＤアミノ酸のダ１基であり、そしてＲがＨ以外のもの：３−Ｈｉｓ又はＬｙｓが両方とも対応するＤアミノ酸の残基であり、そしてＲがＨであるもの。

４−Ｈｉｓ又はＬｙｓが両方とも対応するＤアミノ酸の残基であり、モしてＲはＨ以外であるもの。

５−Ｇ　Ｉ　Ｙがサルコシンであり、一方Ｈ４ｓ、ＬｙｓおよびＲは上記１〜４のいずれかに規定した通りであるもの。

６−ｃ；＋ｙが［ｇＣｍ　（Ｇ　Ｉ　Ｙ）］と前に規定した通り、ｇｅｍ−ジアミノ残基（ｇｅｍ−ｄｉａｍｉｎａｌ　ｒｅｓｉｄｕｅ）であり、そしてＨｉｓとＬｙｓ残基の一方は前に定義した通りの基ｍ（Ｈｉｓ）又はｍ（Ｌｙｓ）であり、他方はＬ又はＤ系の残基であり、モしてＲは水素であるものニア−Ｇｌｙが前に定へした［ｇｅｍ　（Ｇ　Ｉ　Ｙ）　］のような］ｇｅｍ−ジアミノ残であり、ＨｉｓとＬｙｓ残基の一方は前に規定した残基ｍ（Ｈｉｓ）又はｍ（Ｌｙｓ）であり、他方はＬ又はＤ系の残基であり、そしてＲが水素以外であるもの。

８−Ｇｌｙがグリシン、Ｈｉｓがｇｅｍ−ＨｉｓそしてＬｙｓが前に規定したようにｍ（Ｌｙｓ）であり、そしてＲが水素であるもの：ｇ−Ｇ＋ｙがグリシン、Ｈｉｓがｇｅｍ−ＨｉｓそしてＬｙｓが前に規定したようにｍ　（Ｌｙｓ）であり、そしてＲが水素以外であるもの。

本発明の誘導体について以前報告された生物学的性質を参照すると、これらの誘導体は細胞保護および／又は細胞刺激活性をめる治療用薬剤として、病理学的形体で使用し得る。

特に、式Ｉの化合物は潰瘍、傷あと、種々の組織損傷の治療に有用な薬剤および更に一般的には自己免疫性（ａｕ　ｔｏ　ｉｍｍｕｎｅ）疾病の治療用薬剤の調製に使用するのに便利である。

本発明の化合物は、単独で又は他の有用な活性成分と組合わせて、適当な薬学的組成物に処方される。

投与量は治療者により決定され、治療すべき病気、患者の年齢、含量および状態に依存するであろう。薬学的組成物の例はクリーム、軟膏、ゲル、傷用（ａｓｐｅｒｓｏｒｙ）粉末、薬剤添加石膏、制御放出性局部用銅形、局部注入（例えば筋肉的注射）のような局部的剤形、注射又は経口剤形、例えば錠剤、カプセル又はその他の便利な公知の形体、のような全身用銅形である。本発明の組成物は通常の方法、例えばレミントン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ）のＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｍａｃｋ出版社、ニューヨーク、アメリカ、に開示されている方法を用いて製造し得る。

下記の例は本発明を更に例示する。

使用した試薬、薬品および標準品は通常、市販品である。開示された、Ｄ又はＬアミノ酸のいずれかを含む誘導体の固相合成法はペプチド合成に通常使用される方法であるが、その方法は入手可能な知識に従って用いることができる種々の合成の可能性、例えば、Ｃ−末端がエステル化された誘導体の合成に本願で用いられた、均一相中での合成法、を制限するものではない。

Ｌ系のアミノ酸を含む反転（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｔｅｄ）誘導体の製造は、既に知られた方法（特に、Ａ、Ｓ、Ｖｅｒｄｉｎｉ外のＪ、Ｍｅｄ、Ｃｈｃｍ。

１９９１年、３４．３３７２〜３３７９頁）による。

特に記載のない限り、各トリペプチド（反転したものを除く）に含まれる単体アミノ酸の滴定量又は立体系（Ｌ又はＤ）の所属の決定に用いられた分析法は、Ｊ、Ｃｈｒｏｍ、３５２　（１９８６）、１６９−１７７頁にニムラ　ノリュキの方法の適当な変形に基づく。ＩＲスペクトルはＤ２０又はＫＢｒ中でＪａｓｃ。

Ｍｏｄ、Ｆｔ／ｌＲ５０００装置で記録した。

３４０４　ｃ　ｍ−１，３１８０ｃｍ　’のバント（Ｎ−ＨペプチドおよびＮＨイミダゾールのストレッチング）；３１００ｃｍ−’、２９９５ｃｍ−’（リシンおよび／又は塩化木端−ＮＨ２のＮＨ２中のＮ１］３のＮＨストレッチング）；１６５４ｃｍ”（Ｃｏアミドのストレッチング　アミドのバンドＩ）＋１５６５　（ＮＨ結合屈曲アミドのバンドＩＩ　；　１２３９ｃｍ−’　（Ｃ−Ｎ−ストレッチング十Ｎ−Ｈ屈曲。

アミドのバンド■）は、開示された誘導体のペプチド構造と一致し、一方、１４５９　ｃ　ｍ−’、１４４２ｃｍ−’（イミダゾールの環ストレッチング）はヒスチジンの存在と一致する。

ＦＡＢ−ＭＳ　（急速原子照射質量分析器）デ・−夕は、ガスとしてＸｅを、マトリックスとしてグリセロールを、そして３６３°にの温度を用いて、標準的な源を備えたＶＧ−７０−７０Ｃ０−ＨＦ装置を用いて得られた。サルコシンを含まない全ての非反転試料は３４０でＭＨやを示し、そしてサルコシンを含むものは３５０でＭＨ＋を示し、提案の構造と完全に一致した。

単一誘導体の純度および種々の酵素に対するそれらの挙動は、Ｅｒｂａｓ　ｉｌ（商標名）Ｃ１８Ｓ　（３μ）　、４Ｘ２５０ｍｍ装置を有する水６００Ｅ装置上のＲＰ−ＨＰＬＣにより、溶離剤としてリン酸中の０．１Ｍ　ＮａＣ＋０４　０．１％Ｖ／Ｖを用いて、或いはＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　２７０Ａ−ＨＴ装置テノ毛管電気泳動により、ＫＨ２ＰＯ，緩衝剤、ｐＨ＝７．５．２０Ｋｖおよび３０℃を用いて決定した。

用いた省略は以下の通りであるＺ：ヘンジルオキシカルボニル基、Ｔｏｓ　トシル基、Ｂｚｌ−ヘンシル基、Ｂｏｃ：Ｌ−ブチルオキシカルボニル基、ＯｃＬ：ｎ−オクチル基、Ｄ、Ｃ，Ｃ，ジシクロへキシルカルボジイミド、ＨＯＴＢ・１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ＰＩＦ：ピペリジン、ＤＭＦ・ジメチルホルムアミド、Ｐｒｐ　ペンタフルオロフェニル残基、ＴＦＡニトリフルオロ酢酸、Ｓａｒ・サルコシン（Ｎ−メチル−グリシン）、Ｂｏｍ・ベンジルオキシメチル基。

コール樹脂）を、ＰＩＦ／ＤＭＦで処理してα−アミノ基から保護基を除去した後、ペンタフルオロフェニル活性化エステルＦｍｏｃ−Ｈｉ　ｓ　（Ｂｏｃ）− ＯＰ「ｐに添加した。樹脂上で不動化した二量体、Ｆｍｏｃ−Ｈｉ　ｓ　（Ｂｏｃ）　−Ｄ−Ｌｙｓ　（Ｂｏｃ）　−Ｒ，をＰＴ　Ｐ／ＤＭＦで処理すると、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ｏｐｒｐと結合したＨｉｓ　（Ｂｏｃ）−Ｄ−Ｌｙｓ　（Ｂｏａ）一旦が生成した。

不動化しそして保護したトリペプチド、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｈｊｓ　（Ｂｏｃ） −ＤＬｙｓ−Ｒ１を、保護解除しそして樹脂から水中９０％のトリフルオロ酢酸に分離した後に、化学量論的ｆｆｉ　（３：　１）のＨＣＩに加え、次に凍結乾燥した（Ｉ　ｙｏｐｂ　ｉ　ｌ　ｉ　ｚｅｄ）。

該誘導体Ｃ，Ｉｙ−Ｈｉｓ−Ｄ　Ｌｙｓ、３ＨＣ１が得られた。生成物のサンプルをＧｌｙ−Ｄ　Ｈｉｓ−Ｌｙｓ、Ａｃ０Ｈ（酢酸エステル）中で、ＮｏｖａＰａｃｋ　ＨＲＣｌ８（水）ＨＰＣＬカラム上に吸着させそして０．２％酢酸水溶液を用いて溶出して変形した。

Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｄ　Ｌｙｓ　Ｃｕ　（［１）複合体を、冷却下で、該ペプチドを水に溶解し、等モル量の酢酸鋼・１水和物を加え、そして希水酸化ナトリウムを用いてｐＨを調節して製造した。低温で遠心分離して溶液を澄ませた後、生成物を凍結乾燥した。

アミノ酸含量（３値の決定）ｃｒｙ・１．０２±Ｑ、Ｑｌ；Ｈｉｓ：０．９８±０．０３；Ｄ　Ｌｙｓ：１．００−ル樹脂）を、ＰＩＦ／’ＤＭＦで処理した後、ジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）およびヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＬ）を用いてＦｍｏ　ｃ−Ｄ　Ｈｉ　ｓ　（Ｂｏｃ）−ＯＨと結合させた。Ｆｍｏ　ｃ−Ｇ　Ｉ　ｙ−ＯＰ　ｆ　ｐとの反応および引続（９０％ＴＦＡを用いての脱保護によりトリフルオロアセテートが生成し、それにＨＣｌ３：１を添加しそして凍結乾燥すると、トリペプチドＧｌｙ−Ｄ　Ｈｉｓ−Ｌｙｓ、３ＨＣＩが生成した。対応する酢酸エステルを、例１に記載したようにして得た。

銅複合体Ｇｌｙ−Ｄ　Ｈｉｓ−Ｌｙｓ　Ｃｕ（ＩＩ）を、例１に記載のようにして製造した。

アミノ酸含量（３値の決定）ルコール樹脂）を、ＰＩＦ／ＤＭＦで処理した後、ＤＣＣ／ＨＯＢｔの存在下でＦｍｏｃ−Ｄ　Ｈｉ　ｓ　（Ｂｏｃ）　−ＯＨに加え、そして次にＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ｏｐｒに加えた。Ｇｌｙ−Ｄ　Ｈｉｓ−Ｄ　Ｌｙｓ、３ＨＣ１誘導体の回収を、前の例のようにして行った。

Ｇｌｙ−Ｄ　Ｈ４５−Ｄ−Ｌｙｓ　Ｃｕ（ＩＩ）複合体が例１に記載したように得られた。

アミノ酸含量（３値の決定）Ｇｌｙ：０．９９±０．０２；Ｄ　Ｈｉｓ：１．０４±０．０３；Ｄ　Ｌｙｓ：１．００±０．０３例４　（Ｎ−メチル）Ｇｌｙ−Ｄ　Ｈｉｓ−Ｄ　Ｌｙｓ（Ｓａｒ−Ｄ　Ｈｉｓ− Ｄ　Ｌｙｓ）（よ７）Ｓａｒ−Ｄ　Ｈｉｓ−Ｄ　Ｌｙｓ誘導体の合成を、Ｆｍｏｃ−３ａｒ−ＯＰｆｐを用いて行うジペプチドＨ−Ｄ　Ｈｉｓ　（Ｂｏａ）−Ｄ　Ｌｙｓ　（Ｂｏｃ） −足の結合以外は誘導体Ｇｌｙ−Ｄ　Ｈｉｓ−Ｄ−Ｌｙｓについて開示した方法に従って実施した。誘導体５ａｒ−Ｄ　Ｈｉｓ−Ｄ　Ｌｙｓ　３ＨＣＩ、５ａｒ −Ｄ　Ｈｉｓ　−Ｄ　Ｌｙｓ　Ａｃ（酢酸エステル）および複合体５ａｒ−Ｄ− Ｈｉｓ−ＤＬｙｓＣｕ（■）の製造を、前の例で記載したように実施した。

アミノ酸含量（３値の決定）Ｇｌｙ：１．０３±０．０３：Ｄ　Ｈｉｓ：１．０１±０．０２；Ｄ　Ｌｙｓｏ、９７±０．０４例５　（Ｎ−メチル）Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｄ　Ｌｙｓ　（Ｓａｒ−Ｈｉｓ−Ｄ　ＬｙＳ　↓↓）および（Ｎ−メチル）Ｇｌｙ−Ｄ　Ｈｉｓ−Ｌｙｓ（Ｓａｒ−二つの誘導体をｍｌの例のようにして、Ｆｍｏｃ−３ａ　ｒ−ＯＰｆｐと結合した中間体Ｈ−Ｈ４ｓ　（Ｂｏｃ）−Ｄ　Ｌｙｓ　（Ｂｏｃ）−ＲおよびＨＤ　Ｈｉｓ化学−物理的特性アミノ酸含量（３値の決定）１上　Ｓａ　ｒ　：　１．０１±０．０３；Ｈｉｓ：０．９８±０．０２：Ｄ　Ｌｙｓ：０．９９±０．０４上０：Ｓａｒ：０．９７±０．０２：Ｄ　Ｈｉｓ：１．０１±０．０３；Ｌｙｓ：０．９８±０．０２例６：ＧＩｙ−Ｄ　Ｈｉｓ−Ｄ　Ｌｙｓ−０−ベンジルエステル（旦）適当な溶媒（ヘキサン／酢酸エチル）中でＨ−Ｄ　Ｌｙｓ　（Ｚ）　−０−Ｂｚ　１およびＢｏｃ−Ｈｉｓ　（Ｔｏｓ）をり、　Ｃ，Ｃ，の存在下で結合させた。Ｎ　ａ　ＨＣＯ３で処理し、抽出しそして水で洗った後、有機相を蒸発させそして残留物をヘキサン−酢酸エチルから結晶させた。結晶生成物を５０％フッ化水素酸のジクロロメタン溶液に溶解し、次に溶媒を除去した。残留物をヘキサン／酢酸エチル中でり、　Ｃ，Ｃ，の存在下にて溶解し、Ｂｏｃ−Ｇｌｙと結合させた。乾燥後、氷酢酸中に溶解しそしてＰｂ／Ｃの存在下で水素添加した後、トリペプチドをカチオンおよびアニオン交換樹脂により精製した。溶離液を酢酸又はＨＣＩで中和した。

Ｇｌｙ−Ｄ　Ｈｉｓ−Ｄ　Ｌｙｓ−０−Ｂｚｌを例１に開示したようにＣｕ（ＩＩ）複合体に変換した。

アミノ酸含量（３値の決定）Ｇｌｙ：１．０１±０．０２＋Ｄ　Ｈｉｓ：０．９７±０．０５；Ｄ　Ｌｙｓ：１．００±０．０３例７：ＧＩｙ−Ｄ　Ｉ（ｉｓ−Ｌｙｓ−０−オクチルエステル（ｉ）エル、ピッカートによる特許（引用特許）に従う誘導体（Ｄ又はＬ）Ｌｙｓ（Ｚ）　−０− Ｒ（Ｒ炭素数１ないし１４の直鎖又は枝分がれ鎖アルキル基）の製造：Ｈ−Ｌ（又はＤ）Ｌｙｓ　（Ｚ）−ＯＨを、無水ベンゼン中の過剰量の所望のアルコールおよび？＆量のｐ−トルエンスルホン酸りａリド（又は無水ＨＣＩ）で処理した。約２時間還流した後、ベンゼン／水共沸混合物を約１２時間連続して蒸留した。この期間の後、該混合物を０℃に保ち、そして沈殿物を水中の重炭酸カリウムおよび塩化メチレンで処理し、そして水で洗いそして無水硫酸マグネシウム上で乾燥させた後、有機相を蒸発させた。残留物をクロマトグラフィーにより精製した。

ｎ−オクチノげルコールから出発して上述のようにして製造した誘導体ＬＬｙｓ（Ｚ）　０−Ｏｃｔを無水溶媒中に溶解し、そしテＤ、　Ｃ，Ｃ，およびＨＯＢＴの存在下にてＢｏｃ−Ｄ　Ｈｉｓ（Ｔｏｓ）−ＯＨと反応させた。引続き塩化メチレン中の５０％ＨＦで処理し、次いで例６のようにして場合によってはＨＯＢＴの存在下にてＢｏｃ−Ｇｌｙと結合させると、Ｇｌｙ−Ｄ　Ｈｉｓ−Ｌｙｓ −Ｏ−Ｏｃｔが生成し、クロマトグラフィーにより精製した。

対応するＣｕ（１複合体の調製は例１のように実施した。

アミノ酸含量（３値の決定）Ｇｌｙ：０．９７＝！＝０．０２；Ｄ　Ｈｉｓ：０．９８−ｔｏ、０５；Ｄ　Ｌｙｓｏ、９６±０．０５例８：５ａｒ−Ｄ　Ｈｉｓ−ＤＬｙｓ−０−ヘンシルエステル（１旦）例７に開示したようにして調製した誘導体Ｄ　Ｌｙｓ　（Ｚ）−０−Ｏｃ　ｔをり。

Ｃ，Ｃ，およびＨＯＢＴの存在−１こて前に記載したのと同じ条件でＢｏｃ−Ｄ　Ｈｉ　ｓ　（Ｔｏｓ）−ＯＨと反応させる。得られた誘導体をＢｏｃ−Ｓａｒとり、　Ｃ。

Ｃ，／ＨＯＢＴを用いて縮合させ、氷酢酸中に溶解した粗生成物を、Ｐｄ／Ｃを用いて水素添加し、そして最終生成物をクロマトグラフィーにより精製した。

複合体５ａｒ−Ｄ　Ｈｉｓ−Ｄ　Ｌｙｓ−０−ベンジルエステルＣｕ（ＩＩ）が例１に開示されたように得られた。

？ミノ酸含ｆｌ（３値の決定）Ｓａｒ：０．９６±０．０４；Ｄ　Ｈｉｓ：０．９８±０．０２；Ｄ　Ｌｙｓ：０．９７±０．０５Ｂｏｃ−Ｈｊ　ｓ　（Ｂｏｍ）−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ）１．２ｇ　（３，０５ミリモル）を、ピリジン３０５ミリモルおよびペンタフルオロフェノール３．０５モルを含む２０ｍ１のジクロロメタン中に溶解したニジシクロヘキシルカルポジイミド（Ｄ、Ｃ，Ｃ，）　７．６２５ミリモルをこの溶液に加え、０℃に冷却した。３時間後、反応混合物を濾過し、乾燥し、そして残留物を繰り返し石油エーテルで洗浄し、テトラヒドロフランｌＱｍｌ中に懸濁し、２５％アンモニア２．６ｍｌを撹拌下でこの懸濁液に加えて黄色溶液を得た：これを蒸発させそして残留物を１００ｍｊのクロロホルム中に溶解させた。クロロホルム溶液を、水１０ｍ１．５％ＮａＨＣＯ：＋　２０ｍ１、次に再びＮａＣｌ飽和水を用いて洗浄液が中性になるまで洗浄した。クロロホルム溶液から得た残留物を１２ｍ１のＨＣｌ　３．２Ｍ中に懸濁し、６０℃で２０分間撹拌した。得られた溶液を、冷却した後にＮ　ａ　ＨＣＯ：＋（３，６ｇ）を用いてｐＨ７，５に調節した。この蒸発溶液から残留物が得られ、それをベンゼン−メタノール　６４共沸混合物を繰り返し添加することにより七分脱水し、次に無機塩を、繰り返しクロロホルム抽出により除去した。

得られたアミド（１，７８７ミリモル）を、等量のトリエチルアミンと共に１３ｍ１のジクロロメタン中に溶解した。

１．７８７ミリモルのＢｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＰｆｐ　（Ｂｏｃ−Ｇｌｙ、Ｂａｃｈｅｍ、から出発して、ペンタフルオロフェノールを用いてヒスチジンについて前に開示した方法に従ってカルボキシ基を活性化することにより、得られる）を添加した後、溶液を撹拌下で室温にて２時間放置した。

反応混合物を蒸発させ、アセトニトリル中に溶解しそして再び蒸発させ、この操作を多数回繰り返した。残留物を最終的には最小量のＣＨＣｌ、を用いて溶解させそして７０−２３０メツシユメルクシリ力ゲルカラム２０ｇ上で、溶離剤としてＣＨＣ］３　ＭｃＯＨ９：　ｌを用いて精製した。

純粋なりｏｃ−Ｇｌ　ｙ−Ｈｉｓ　（Ｂｏｍ）−ＮＨ２６００ｍｇがこのようにして得られた。前に開示したように、アミドの形体で得られたジペプチド（１゜３８６モル）を５ｍｌのＣＨ３ＣＮ中に溶解し、次に１．５ｍｌのＨ２Ｏを加えた。

そこにビス−トリフルオロアセトキシ−ヨードベンゼン試薬を加え（８２０ｒｎｇ：２．０８７ミリモル）、そして次に２２０μｍのピリジンを加えた。

次に反応混合物を室温で１時間撹拌し、次に固体Ｎ　ａ　ＨＣ０３５２６ｍ　ｇを加え、そして混合物を更に１０分間撹拌した。混合物を最後には蒸発させ、ベンゼン−メタノール技部混合物を用いて繰り返し蒸発させることにより乾燥させた後、残留物をメルク７０−２３０メツシユシリ力ゲルカラム５５ｇ上で多段階溶離により精製した。使用した移動相はそれぞれ次の通りである　１）ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ７：３，２）ＣＨｃＩ３−ＭｅＯＨ１０：１，３）ＣＨＣｌ、−ＭｅＯＨ７：　１，４）ＣＨＣｌ３　ＭｃＯＨ６：　１゜Ｂｏ　ｃ−Ｇ　ｌ　ｙ− ｇ−Ｈｉ　ｓ　（Ｂｏｍ）　Ｈがこのようにして得られた。

４−ＮＨ２−ブチルアルデヒドジエチルアセタール（３，７ｍＬ　２１．４ミリモル）を、２．６２ｇのジエチルアミノピリジンと共に、４０ｍ１のＣＨＣｌ：ｌ中に溶解し、そして溶液を０℃に冷却した。無水トリフルオロ酢酸を撹拌下で滴液した。撹拌を３０分間、温度を５ないし１０℃の間に保ちながら続け、そして次に室温で更に２時間続けた。懸濁液を濾過し、濾液をＮａＨＣＯ３１０ｍ１で洗浄した。室温にて１晩経た後、この溶液をＮａＣ１で飽和させ、そしてジクロロメタン（ＩＸ３０ｍｌ、ｌＸ２０．ｍｌおよび４Ｘ１０ｍｌ）で抽出した。

プールしそして濃縮した有機相の残留物は黄色油状物的３ｇであり、それを直接法の工程で使用した。

シアノホウフッ化物溶液（ＴＨＦ中ＬＭ）８．７ｍｌを減圧下で蒸発させ、残留物を５ｍｌのＤＭＦ中に溶解した。メルドラム酸（２，２−ジメチル−１，３− ジオキサン−４，６−シオン）（１，７９ｇ、１２．４モル）もまたこの溶液に加えた。この溶液を第１工程で得た油状物に、０〜５℃に冷却して発熱反応を回避しながら加え、そして混合物を室温にて２時間放置した。

次に反応混合物を４０ｍ１の冷Ｈ２ｏで希釈した。白い沈殿物が形成し、そしてｍＨＣｌを注意深く加えてｐＨを４に調整した。この懸濁液を常に０〜５℃にして１時間撹拌した：生成物をフィルター上でＨ２Ｏ、そして次にエーテルを用いて洗浄し、その後Ｐ２Ｏ６上で十分乾燥すると、融点１２９〜１３０’Ｃを有し、最終収率４０％であった。

６−ジオンＮ−トリフルオロアセチルブチル誘導体（ｂで調製したもの）　１．１７ｇ　（３゜７７モル）を３ｍｌのジオキサン中に懸濁した。１．９ｍｌの５Ｎ　ＮａＯＨを加え、生成した澄んだ溶液を撹拌下、室温で４時間放置した。５℃冷却後、ジー第３−ブチルジカーボネート（１，６ｍｌ、７．５４ミリモル）を滴液した。反応混合物を室温で、必要に応じてｐＨを８に調整して、１２時間保持した。

その後、溶液をｌＱｍｌの水で希釈しそして濾過した。濾液を減圧下で蒸発させて容量を半分にし、再び希釈し、そして同じ工程をジオキサンが除去されるまで繰り返した。。

ｐＨをＩＭ　ＫＨＳＯ３を用いて５に調整し、溶液をＣＨＣｌ３　（１×５０ｍ１および２Ｘ２０ｍｌ）で抽出した１、溶媒を蒸発した後、油状残留物をシリカゲルカラム（５０ｇＬＩ−でＣＨＣｌ３ＥｔＯＡＣ５：１を用いて精製した。

純粋な生成物が７４％収率で得られた。

Ｂｏｃ　−Ｇ　ｌ　ｙ−ｇ−Ｈｉ　ｓ　（Ｂｏｍ）　−ｍ−Ｌｙｓ　（Ｔｆ　ａ）　−０Ｈ２，２−ジメチル−５−（Ｎ−トリフルオロアセチルブチル）−１，３−ジオキサン−４，６−シオン１．０１２ｇ　（３，２５モル）を５９８ｍｇのペンタフルオロフェノールと混合し、混合物の融点（約１１０℃）に加熱した。溶融混合物をこの温度で３時間撹拌し、次に水ポンプにより１５分以上減圧に付した。残留物をジクロロメタン１０ｍ１中に溶解し、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ｇ−Ｈｉｓ　（Ｂｏｒｎ）Ｈ１，３１１ｇおよびトリエチルアミン８５０μｍを加えた。室温で一夜撹拌した後、反応混合物を分ＨＰＬＣにより、Ｄｅ　Ｉ　ＬａｐａｃｋカラムＣｌ８−ＩＱＱＡ　Ｗａｔｅｒｓ、１５μ上で精製し、溶液Ａ　（Ｎ２０＋０．１％Ｔｆａ）＋溶液Ｂ　（ＣＨ３ＣＮ−Ｎ２０，８０　：２０＋０．０９％Ｔｆａ）５０：５０からの勾配を２０分間で、０〜１００まで溶離した。

流速１２ｍ１／分。

ｅ）　Ｂｏｃ　−Ｇ　Ｉ　ｙ−ｇ−Ｈｉ　ｓ　（Ｂｏｍ）　−ｍ−Ｌｙｓ　（Ｔ　ｆ　ａ）　−０Ｐｈ２．２−ジメチル−５−（Ｎ−トリフルオロアセチルブチル）−１，３−ジオキサン−４，６−シオン５２８．２ｍｇ　（１，７ミリモル）を１５９．７＋ｎｇのフェノールと混合し、２５時間撹拌下でそして次に減圧下で１５分間、混合物の融点（１１０℃）に加熱した。冷却後、油状物を４ｍｌのＮａＨＣＯ，飽和溶液に溶解し、それをＣＨＣｌ、（ＩＸｌｏｍｌおよび２ｘ５ｍｌ）で洗浄した。有機相を再度５ｒｎｌのＮ２０そして５ｍｌのＮａＣｌ飽和溶液で洗浄し、Ｎ　ａ　２　Ｓ　Ｏ４で乾燥し、そして蒸発させると、純粋な生成物から成る白色固体残留物が７４％の収率で生じた。前に得られたフェニルエステル１．６７７ｇ　（４，８３モル）、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ｇ−Ｈｉｓ　（Ｂｏｍ）−Ｈ１，９５ｇ　（４，８３モル）、ピリジン０．３９０μｍおよびヒドロキシベンゾトリアゾール７８３ｍｇ　（５，７０５モル）を４０ｍ１のジクロロメタン中に溶解し、そして溶液を０℃に冷却した：撹拌下でり、Ｃ，Ｃ，１，３１５を加えそして反応を室温で３時間続けた。懸濁液の濾過が終わると、濾液を４０ｍ１のジクロロメタンで希釈し、５０ｍＨＤ１０％Ｎａ２Ｃｏ３溶液でそして次に種々の量のＨ，０およびＮａＣ１飽和溶液で洗浄した。溶媒を乾燥しそして濃縮して、完全に保護されたトリペプチド２ｇを黄色固体として得た。収率５７％。

ｆ）Ｂｏｃ−Ｇｌ　ｙ−ｇ−Ｈｉ　ｓ　（Ｂｏｍ）−ｍ−Ｌｙｓ　（Ｂｏｃ）− ＯＨＢｏａ−Ｇ　ｌ　ｙ−ｇ−Ｈｉ　ｓ　（Ｂｏｍ）−Ｈ７７０ｍｇ　（１，９１ミリモル）を撹拌下、アルゴン雰囲気中で１５ｍ１のＣＨ２Ｃｌ２中に懸濁し、該懸濁液にＮ。

Ｏ−ビス−シリルアセトアミド（ＢＳＡ）１．２ｇ　（５，９１モル）を加えた。澄んだ溶液が得られ、それを６時間還流し、その後室温に冷却した。次に５４２ｍｇ（１，７２ミリモル）の２，２−ジメチル−５−（Ｎ−Ｂｏｃ−ブチル） −１゜３−ジオキサン−４，６−ジオンを加え、−夜（約１６時間）撹拌した。

反応混合物を最後に蒸発させ、第３−ブチルオキシカルボニル基を例７に開示したように直接除去した。

ｇ）ＧｌｙおよびＬｙｓがらＢｏｃ基の除去前記の反応（例６参照）からの夕１留物を２９ｍ１のトリフルオロ酢酸で処理し、室温で２０分間撹拌し、次に蒸発させ、再び１０ｍ１のＣＨ，ＣＮ中に溶解し、モして分取ＨＰＬＣカラム上で精製した：カラム：Ｄｅｌｔａｐａｃｋ　１９Ｘ３００ｍｍ、１５ミクロン、水。

移動相：Ａ、Ｎ２０中０．１％Ｔｆａ　：　Ｂ、Ｎ２０中２０ｆａ，２０分間でＢの線状勾配０〜２０％。

流速：１９ｍ１／分．注入１１　：　１　＋ｎ　１回収された残留物はトリフルオロアセテートの形体のＧ　ｌ　ｙ−ｇ−Ｈ　ｉ　ｓ　（Ｂｏｍ）　−ｍ−Ｌｙｓ−ＯＨ　５８６ｍｇ％純度９５％から成った。収率４２．５％。

ｈ）　ｇｅｍ−ヒスチジン残留物からベンジルオキシメチル基の除去Ｇ　Ｉ　ｙ −ｇ−Ｈｉ　ｓ　（Ｂｏｍ）−ｍ−Ｌｙｓ　−ＯＨ　５８６ｍｇ　（０．７３ミリモル）およびチオアニソール４．７４ｇ　（３８．１６ミリモル）をアルゴン雰囲気中で２４ｍ１のＴＦＡ中に溶解した。１〜２℃に冷却後、８．４８ｇ　（３８．　１　６ミリモル）のトリフレート（トリメチルーンリルートリフルオロメタンスルホネート）を加え、混合物を３０分間撹拌した。次に３６ｍ１のエチルエーテルを加えた　遠心分離により分離した白色沈殿物が得られた。残留物を他の２０ｍ１のエーテルを用いて３回デカンテーションにより洗浄した。最後に残留物を１．１８ｇのＮＨ，Ｆを含む２１ｍ１の５％ＮＨ４ＯＨ中に溶解し、１時間撹拌し、そしてＡｃ０Ｈ５Ｎを用いてｐＨを５に調整した。

クロマトグラフィーの条件。

カラム　Ｎｏｖｏｐａｃｋ　１９Ｘ３００ｍｍ，ＨＲＣ１８、Ａｏ、６ミクロン、水。

移動相．０．２％ＡｃＯＨ　Ｎ２０流速　１２ｍ１／分；　２００ｕ　Ｉ注入。

生成物を含む各画分をプールしそして濃縮し、残留物を１ｍｌのＮ２０を用いて溶解させ、そして再び蒸発させ、この操作を多数回繰り返して、残留物から過剰の酢酸を除去した。その終わりに、凍結乾燥後、純粋なペプチド８６ｍｇが得られたが、下記の構造に対応した・Ｈ−Ｇｌｙ−ｇ−Ｈｉｓ−ｍ−Ｌｙｓ−ＯＨ　ＡｃＯＨ　２．５、Ｈ２０元素分析　計算値％：Ｃ４３．１４、Ｎ７．４１、Ｎ１８．８７実験値％　Ｃ４２．８２、Ｎ７．１８、Ｎ　１８．８３’Ｈ−ＮＭＲ１１０％　ｉｎ　Ｄ２０、ｐｐｎ＋：８．３８，　７．３１　（ｓ，　ＣＨ　１ｍ１ｄ．）；５．９５　（ｔ，ＣＨ　ｇ−Ｈｉｓ）；３．９０　（ｓ，ＣＨｚＧｌ　３’）；　３．３８　２．９８　（ｍ；　ＣＨ２　ｇ　Ｈｉ　ｓ　；　ＣＨｚＮＨｚｍ−Ｌｙｓ　：ＣＨ　ｍ −Ｌｙｓ）　；２．０４　（Ｓ，　ＣＨ３ＣＯＯ　）　＋　１。

７８　（ｒｎ，　ａ　ａｎｄ　β　ＣＨ２　ｍ　Ｌｙｓ）：　１．３８　（ｑ，ｒ　Ｃ、Ｎ２　ｍ−Ｌｙｓ）。

Ｃ）に記載したようにして得た完全に保護されたペプチド１２　５ｍｇ　（０．　１７ミリモル）をＱ．５ｍｌのＭｅＯＨ＋０．１７ｍ１のＮａＯＨ　ＳＮ中に溶解し、室温で４時間撹拌した。次に水酸化ナトリウムを３ＮＨＣ１で中和し、メタノールを蒸発させた。残留物を２ｍｌのＮ２０中で希釈し、ＣＨＣ　Ｎ３（２ＸＯ６５ｍｌ）で洗浄した。水性相を減圧下で蒸発させ、Ｎ２０の痕跡量を、共沸混合物を用いる繰り返し蒸発により除去した。残留物（２３２ｍｇ）を次の工程に直接使用した。

ＩｔｉＩ記の残留物をＣＨ３ＣＮＺｍＩ中の２００ｍｇのＮａｌを用いて、撹拌下にてアルゴン雰囲気中で懸濁させた。塩化トリメチルシリル０．１７ｍ１を懸濁液に加え、８０℃に３時間保持した。次にＮａＩ　１３０ｍｇとＴＭＳｉＣｌ　０。

１　１ｍｌを加え、同じ条件で３時間放置した。室温に冷却後、４ｍｌのＮ２０中のチオ硫酸ナトリウム２７０ｍｇを該混合物に加えた；ｐＨ４の澄んだ溶液が得られた。これを次にＮａＯＨを用いてｐＨ７に調整した。形成した沈殿物を濾過により除去し、そして溶解した生成物を例８のようにして厳密に精製した。

純粋なペプチドＨ−Ｇｌｙ−ｇ−Ｈｉ　ｓ−ｍ−Ｌｙｓ−ＯＨモノアセテートは、１】）に開示した異なる合成法を用いて得たものと同じ特性を有した。

１）トリペプチドＧ−ｇＨ−ｍＬの銅複合体ｑ製潰３２、３ｍｇ　（０．０９５モル）のＧ−ｇＨ−ｍＬを０．３ｍｌの水に溶解し、そして２２．６ｍｇのＣｕ　（ＣＨ３ＣＯＯ）　２・Ｎ２０　（０．１１３ミリモル）を含むＱ．３ｍｌの水溶液をこの溶液に添加した。この溶液を０．ＩＮ（２．４モル）のＮａＯＨにて中和し、冷蔵器（４℃）中にて一夜放置し、そして遠心分離しそしてデカント処理した。

上澄液をセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１０）カラムを通して流出し、そして蒸留水にて流出しそして凍結乾燥して、Ｇ−ｇＨ−ｍＬ−Ｃｕからなる青色粉末３４．７ｍｇを得た。

ＨＯＢＴ／ＤＣＣの存在において２−Ｎ−トリフルオロアセチルブチル　マロン酸のモノフェニルエステルおよびＨＤ−Ｈｉ　ｓ−（Ｂｏｍ）−０−ｔＢｕを出発材料として製品を得た。酸処理した後に、）（ＯＢＴおよびＤＣＣの存在にてグリシンアミドと反応させたＨＯ−Ｄ　Ｈｉｓ　（Ｂｏｍ）−（Ｒ，Ｓ）ｍＬｙｓ（ＴＦＡ）−０−ｐｈ中にて、ｔＢｕ−０−Ｄ　Ｈｊｓ　（Ｂｏｍ）−（Ｒ，Ｓ）ｍＬｙｓ　（ＴＦＡ）−０Ｐｈを変換した。

Ｈ２Ｎ−Ｃ０−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃｏ−Ｄ　Ｈｉ　ｓ　（Ｂｏｍ）−（Ｒ，Ｓ）ｍＬＹｓ　（ＴＦＡ）−０Ｐ’ｈ誘導体のアミド部分に関して、ＤＭＦ中のＴＩＢ液を用いてアミノ基を転換した。はじめにアルカリそして次にトリメチルシリルアイオダイドを用いて、該保護基を除去して、Ｈ−ｇｅｍ　Ｇｌｙ−Ｄ　Ｈｉｓ −（Ｒ。

Ｓ）ｍＬｙｓ−ＯＨ誘導体を得た。

ＮＭＲスペクトルによって予定した構造を確認した。

同様にして、Ｈ−ｇｅｍ　Ｇｌｙ−（Ｒ，Ｓ）ｍ−Ｈｉｓ−Ｌ　Ｌｙｓ−ＯＨおよびＨ−ｇｅｍ　ｃｌｙ−（Ｒ，Ｓ）ｍ　Ｈｉｓ−Ｄ　Ｌｙｓ−ＯＨを製造した。

例１１−生物学的活性ａ）色の槍墳第−の方法：ダンキン−ハートレイ（Ｄｕｎｋ　ｉ　ｎ−Ｈａ　ｒ　ｔ　ｌ　ｃｙ）ギニアビッグを麻酔し、そして背中の部分に５個の正方形の傷（７Ｘ７０１１）を、背側の皮膚をそりそして清浄した後に真皮の表面を完全に除去して設けた（Ｆ、Ｂｕｆｆｏｎｉ他−ｐＨａｒｍａｃｏ１．　Ｒｃｓ、　２５．５ｕｐｐ１．２．３３２．１９９２）、対照動物および治療動物の両者の傷を治癒させた。施術後の４日、８日および１１日後に、各グループの５匹の動物を処理し、新しく形成された組織を切り取り、そして組織学的および生化学的方法によって分析した。

下記の生化学的パラメーターを測定した：ヒトロキシプロリンの作成（コラーゲン生成のインデックス）（Ｊ、Ｆ、Ｗｏｃｓｓｎｃｒ、Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、旦３．４４０．１９６１）；蛋白質含量（０，Ｈ，Ｌｏｗｒｙ他、Ｊ、　Ｂ　ｉ　ｏ　１．　Ｃｈｅｍ、↓９３．２６５．１９５１）；ＤＮＡ含量（Ｃ。

Ｌ３ｂａｒｃａ他、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、よ０２．３４４．１９８０）。

組織学的測定は、ヘマトキシリン／エオシンにて染色した後に実施した。

実験グループ（グループあたり１５匹の動物）は、２０μ【の蒸留水を摂取した対照動物、２）２０μｌの蒸留水に溶解した表１に記述したＣｕ　（ＩＩ）複合体１０μｇにて処置した動物、３）２０μｌの蒸留水中の１０μｇのＧＨＬ−Ｃｕ（ＩＩ）複合体にて処置した動物であった。投与ルートは、水溶液を傷に適用して行った。

第４日の動物から取得した組織片は、再生された組織およびかさぶた（主に死んだ細胞のクラスター）の両者を含み、従って三種の分析パラメーターは第８日および第１１日におけるパラメーターよりも高い値を示した。しかし面記の製品にて処理された動物から得られた結果は、非処置またはＧＨＬ−Ｃｕ　（ｎ）にて処置された動物から得られた結果と比較して、高度の化学的整復および／または細胞外組織の生成の増加が認められた。

第８日および第１１日に得られた三種類のパラメーターを比較すると、本発明の化合物にて処置した動物においては皮膚が８日目には既に回復されており、これに対してＧＨＬ−Ｃｕ　（Ｉｆ）にて処置した動物の場合は同程度の治癒が第１１日月に達成されたことを明示している。対照動物およびＧＨＬ−Ｃｕ　（ｎ）処置動物に関して、上記のことは本発明の化合物は傷の治癒時間を低減することを示す、。

組織学的分析にて、上記の化合物にて処置された動物の組織は良好に組織されていた。

第二の方法。

ウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）ラット（体重的２２０ｇ）の背中の皮膚から毛を除去し、そして麻酔して２個の丸い傷（径１０ｍｍ）をパンチによって形成した。

切開の１０分後に、２０μｌの蒸留水だけ（対照グループ）またはテストする生成物１０μｇを含有する蒸留水２０μｌ　（処置グループ）を用いて傷を処置し、次いで外科用カーゼにて被覆した。接着性バンデージにて固定された適当な直径を有するテフロン製リングによって、傷の床からガーゼを隔離した。該処置を三種類の連続した期間行った。５日後、８日後および１２日後に、傷の治癒の百分率を下記のように評価した、１００％：全体的治癒０％；治癒なし。

実験グループはグループあたり６匹の動物であった。投与ルートは傷に適用した水溶液を用いた。表２に示す結果は、従来物に関連して、本発明の化合物が治癒の時間を低減することを示す。従って組織学的分析によって、組織の完全な復元および結合ならびに生理学的経過と同様な皮膚形成効果が示される。

ｂ）スーパーオキシドによるディスミュターゼ（Ｄｉｓｔｎｕｔａｓｅ）活性下記の生成物のスーパーオキシド（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ）によるディスミュターゼ活性を、Ｃ，ボーチャンプ（Ｂｅａｕｃｈａｍｐ）他による方法（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、４４，２７６．１９７１）に従って測定した。この方法はスーパーオキシドイオンの存在において、ＮＢＴ　にトロブルー　テトラゾリウム）の５６０ｎｍの最大吸収を有する着色種の外観によるものである。検査する生成物の存在において吸収強度の低下は、スーパーオキシトディスミュターゼ状活性を定める。この活性は、最大の抑制の５０％を生起する生成物の濃度としてｎモル／ｍｌの単位にて表される。表３に示す結果は、ＧＨＬ−Ｃｕ　（ＩＩ）の活性に相当する活性をテストする誘導体が提供することを示す。

択　３Ｃ）アンチ−トロンボキサン活性検査する生成物の活性をＮ、ラド（Ｌａｄ）他（Ｂｒ、Ｊ、Ｐｈａｒｍａｃ。

に冨むプラズマ）にて測定した。トロンボキサン（Ｔｈｒｏｍｂｏｘａｎｅ）Ｂ２　１２５−１評価システム（Ａｒｎｅｒｓｈａｍ　Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎｃｅ１Ｕ、　Ｋ、　）を用いて、ＴｘＢ２最終滴定を実施した。

表４に示す結果は、検査した生成物がＧＨＬ−Ｃｕ　（ＩＩ）の活性と同等またはより優れた活性を有することを示す。

友４例１２　ペプチダーゼに対する抵抗性ミトコンドリアルロイシノアミノペプターゼ（アミノペプチダーゼＭ）、カルボキシペプチダーゼＢおよび健康な人間のヒトの血漿（ｐ　ｌ　ａ　ｓｍａ）の存在において、表５に示す誘導体の安定性をテストした。テストした各生成物の賎存量を、上記の条件を用いるＨＰＬＣによって種々の実験時間にて測定した。酵素作用（純粋な酵素および希釈しないプラズマの両者について３７℃におけるリン酸塩緩衝液ｐＨ＝７．４）に、５分および３５分間さらして得られた結果を表５に示す。従来のＧＨＬと比較して、この結果はテストした生成物の該酵素に対する非常に高い抵抗性を示す。

この増加した抵抗性は、これらの化合物によって生体内にて示されたより大きな生理学的活性を明示する。

遊離のペプチドおよびペプチド銅複合体の間の有意な差は、生理学的活性に関しては検出されなかった。

手続補正書坊式）平成７年３　Ｊ］ｌ　３日

Claims

【特許請求の範囲】

１．下記の一般式（Ｉ）：Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−ＯＲ（Ｉ）ここで；ＧＩｙは下記の残基の一つである： −グリシン； −サルコシン； −式：ＮＨ２−ＣＨ２ＮＨ−、［ｇｅｍ（Ｇｌｙ）］の基；Ｈｉｓは下記の残基の一つである： −Ｌ−ヒスチジン； −Ｄ−ヒスチジン； −式：▲数式、化学式、表等があります▼，〔ｇｅｍ（Ｈｉｓ）〕の基；−式： ▲数式、化学式、表等があります▼Ｌｙｓは下記の残基の一つである； −Ｌ−リシン； −Ｄ−リシン； −式：▲数式、化学式、表等があります▼の基；Ｒは水素、直鎖又は枝分かれ鎖のＣ１−Ｃ１４アルキル基、Ｃ６−Ｃ１４アリール又はアルアルキル基である、但し、Ｇｌｙ、ＨｉｓおよびＬｙｓは同時に天然のアミノ酸グリシン、Ｌ−ヒスチジンおよびＬ−リシンとはなりない、で表される化合物、およびその薬学的に許容される塩および銅複合体。
２．Ｈｉｓ又はＬｙｓが対応するＤアミノ酸の残基であり、そしてＲがＨである、請求の範囲１記載の化合物。
３．Ｈｉｓ又はＬｙｓが対応するＤアミノ酸の残基であり、そしてＲがＨ以外のものである、請求の範囲１記載の化合物。
４．Ｈｉｓ又はＬｙｓが両方とも対応するＤアミノ酸の残基であり、そしてＲがＨである、請求の範囲１記載の化合物。
５．Ｈｉｓ又はＬｙｓが両方とも対応するＤアミノ酸の残基であり、そしてＲはＨ以外である、請求の範囲１記載の化合物。
６．Ｇｌｙがサルコシン残基であり、一方Ｈｉｓ、ＬｙｓおよびＲは上記１〜４のいずれかに規定した通りである、請求の範囲１記載の化合物。
７．Ｇｌｙが［ｇｅｍ（Ｇｌｙ）〕と前に規定した通り、ｇｅｍ−ジアミノ残基（ｇｃｍ−ｄｉａｍｉｎａｌ　ｒｅｓｉｄｕｅ）であり、そしてＨｉｓとＬｙｓ残基の一方は前に定義した通りの基ｍ（Ｈｉｓ）又はｍ（Ｌｙｓ）であり、他方はＬ又はＤ系の残基であり、そしてＲは水素である、請求の範囲１記載の化合物。
８．Ｇｌｙが前に定義した［ｇｅｍ（Ｇｌｙ）〕のようなｇｅｍ−ジアミノ残基であり、ＨｉｓとＬｙｓ残基の一方は前に規定した残基ｍ（Ｈｉｓ）又はｍ（Ｌｙｓ）であり、他方はＬまたはＤ系の残基であり、そしてＲが水素以外である、請求の範囲１記載の化合物。
９．Ｇｌｙがグリシン、Ｈｉｓがｇｅｍ−ＨｉｓそしてＬｙｓが前に規定したようにｍ（Ｌｙｓ）であり、そしてＲが水素である、請求の範囲１記載の化合物。
１０．Ｇｌｙがグリシン、Ｈｉｓがｇｅｍ−ＨｉｓそしてＬｙｓが前に規定したようにｍ（Ｌｙｓ）であり、そしてＲが水素以外である、請求の範囲１記載の化合物。
１１．請求の範囲１ないし１０記載の化合物の治療用薬剤としての用途。
１２．請求の範囲１ないし１０記載の化合物の、潰瘍、種々の病因による組織損傷および自己免疫退化病理的状態の治療用薬剤の製造への用途。
１３．活性成分として治療有効量の請求の範囲１ないし１０記載の化合物を含む、薬剤組成物。