JPH07509485A - Ｏｖｃａｒ−３腺癌細胞治療用医薬及び治療方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ０ＶＣＡＲ−３腺癌細胞治療用医薬及び治療方法本発明は医薬に関し、より詳細 にはヒトに癌腫病を惹き起す細胞を処置するために使用する医薬に関する。

ＰＣＴ特許出願萱０８９１０９６０６及びｔｏ　９１１０７４３５は商標名オン コナーゼ（ＯＮＣＯＮＡＳＥ）と呼ばれる医薬を開示している。この医薬が３つ の他の薬品と混合療法で試験管内で使用するとき、その混合療法の成績はある病 例に於ては期待したよりも一層生物活性である。

これらの他の薬品はシスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）　、メルフアラン（置 ｅｌｐｈａｌａｎ）及びアドリアマイシン（＾ｄｒｉａ■ｙｃｉｎ）として知ら れている。

好ましい実施態様の詳細な説明 試験管内データーはオンコナーゼをシスプラチンの名称で販売されている薬品と 併用するとオンコナーゼ及びシスプラチンの単独の活性から期待される活性より もヒト卵巣ＯｖＣ＾ト３腺癌腫瘍に対し一層生物活性があることを示している。

また、試験管内データーはオンコナーゼとメルフアランの名称で販売されている 薬品との併用はオンコナーゼとメルフアランの単独の活性から期待される活性よ りもヒトの卵巣０ＶＣＡＲ−３腺癌に対し、より一層生物活性があることを示し ている。試験管内データーはオンコナーゼとアドリアマイシンという名称で販売 されている薬品と併用するとオンコナーゼ及びアドリアマイシンの単独の活性か ら期待される活性よりもヒト卵巣ＯｖＣ＾ト３腺癌に対し、一層生物活性がある ことを示している。

本発明の好しい実施態様は細胞培養試験を用いて試験される。斯様な試験に於て は予め決定した期間に亘り既に知られた成長速度の細胞株が試験される物質で処 置され、その処置された細胞の成長が未処置細胞から通常期待される成長と比較 される。

上述特許出願に記載され、またＰＣＴ特許出願ＷＯ８９１０９６０６に記載され ている方法論に従って製造されたオンコナーゼ（その方法論はこの中で充分に述 べられたように参照により本明細書に組入れられる）を燐酸緩衝化食塩水（ＰＢ Ｓ）に溶解して１曽ｇ／ｍｌのストック用溶液を作った。

シスージアミンジクロロプラチナムとして知られているシスプラチンは２ケのク ロライド原子により囲まれた白金を中央原子に２ケのアンモニア分子をシス位に 含有する重金属錯体である。水晶はＰｔ　（Ｊ、Ｈ，Ｎ、の分子式を有し、３０ ０．１の分子量である。

Ｌ−フェニルアラニンマスタード、フェニルアラニンマスタード、Ｌ　−ＰＡＷ 又はＬ−サルコリシン（Ｌ　−５ａｒｃｏｌｙｓｉｎ）として知られるメルフア ランは４−［ビス−（２−クロロエチル）アミノ］−Ｌ−フェニルアラニンであ る。

アドリアマイシンは塩酸ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ　ＩＣ１）、 ＵＳＰの商標名である。ドキソルビシンはストレブトマイセスピューセチウスバ ールセシウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ　ｖａｒ　ｃａ ｅｓｉｕｓ）の培養物から分離されたアントラサイクリン抗生物質である。ドキ ソルビシンはアミノ糖、ダウノサミンに環原子７で配糖体結合により結合するナ フタセンキノン核よりなる。

この試験システムはアメリカンタイプカルチャーコレクション（＾＊ｅｒｉｃａ ｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）　（寄託番号＾ＴＣＣ ＩＩＴＢ　１６１）から得られた０ＶＣＡＲ−３ヒト卵巣腺癌細胞株を使用した 。その細胞株は２０％加熱不活性化した牛胎児血清、２００ｍＭ　Ｌ−グルタミ ン、ペニシリン１ｍｌ当り１０．０００単位、ストレプトマイシン１ｍｌ当り１ ０ｍ９、ファンギゾンｌ＠／当り２５ｕ、１０＋ｓｌ　ＨＥＰＥＳ緩衝液及び牛 インシュリン１１１当り１０ｆｉ９を補足したＲＰＰＩ３１６４０培地で培養し た。これは完全増殖培地である。

その細胞は１穴当り６０００個の生存細胞（５ｈｌ）の濃度で９６穴組織培養板 に接種された。細胞は２４時間静置して沈降させ、そして穴当り５０ｍ１の適当 なオンコナーゼ及び／又はシスプラチン、メルフアラン又はアドリアマイシン溶 液が加えられた。下記最終濃度が用いられた。

ａ）オンコナーゼ、２０ｕｇから１ｈｉ＋／ｍｌ；ｂ）　シスプラチン、ｌＯか ら５００ｎｌ　；Ｃ）　メルフアラン、０．２５から５ｔｔＭ：そしてｄ）　ア ドリアマイシン、５から１００ｎｌｌ平板は５％二酸化炭素の雰囲気下、３７℃ でさらに６日間培養された。

その結果総試験時間は７日間であった（細胞を沈降させるのに１日、培養に６日 間）。生存細胞のパーセントはＢｉｏ−Ｒａｄ　ＥＩ＾ミクロタイタープレート リーダーを使用するＭＴＴ比色定量試験で定量された。

細胞の数はノイバウエルの判定を使用するＡＯ−３ｐｅｎｃｅｒ”Ｂｒｉｇｈｔ ｌｉｎｅ″血球計の直接計算によりめた。付着細胞はハンクスの平衡塩類溶液で ３回洗浄し、緩衝化食塩水中０．２５％トリプシン−０，０２％ＥＤＴＡの溶液 の２ｙｓｌで約３０秒間処理した。その溶液は除かれ、その細胞は３７℃で１０ 分間置かれ、次いで完全成長培地のｌＱ＠Ａ’中に懸濁された。細胞懸濁液の０ ．２５ｍ／は完全成長培地の０．７５ｄで希釈され、モして０，５％トリパンブ ルー溶液の１ｍｌが加えられ、そして生存細胞が計数された。

表１．２及び３は上４記実験の結果を表わす。ＥＤ、。値以外はこれらの表はベ レンバウムによって開発された相互作用指数（Ｉｎｔｅｒ−ａｃｔｉｏｎ　Ｉｎ ｄｅｘ）で表わされている。この相互作用指数に於て、１．０の成績は２種の薬 品が相互作用しないことを示し、すなわち特定の細胞株に対しての併用効果は夫 々個別に使用した時予想されるそれと変らないことを意味している。１．０より 大きい相互作用指数を示すことは２種の薬品が拮抗的であって、特定の細胞株に 対する併用効果は夫々個別に使用した時予想される効果より小さい。一層高い相 互作用指数は一層大きい拮抗作用を示す。１．０より小さい相互作用指数は２種 の薬品が相乗的であることを示している即ち、特定の細胞株に対する併用効果は 夫々個別に使用した時よりも大きい。相互作用指数が０（最高相乗作用）に近づ くにつれ、これは一層相乗的であることを示す。斯くして低い数はこの実験に用 いられた細胞株に対する一層高い生物活性を示している。ＥＤｓ０値は中間有効 用量を表わし、それらは試験を受けている細胞の成長速度を半分にする用量を示 すものである。斯くして、ＥＤ、。値が低ければ低い程同じ生物活性を成就させ るのに要する用量は少量になる。

−」酌−−」−一 ０ｖＣＡＲ−３ヒト卵巣腺癌細胞に種々の用量でオンコナーゼとシスプラチンを 共用する場合の相互作用指数とＥＤ、。値及びオンコナーゼとシスプラチンの個 々のＥＤ、。値オンコナーゼ＋１０ｍ１ｌシスプラチン　１．１５９　０．８９ １　０．４８２　０．６９７オンコナ一ゼ＋２５ｗＩＩシスプラチン　１．０９ ８　・０．８３０　０．４２１　０．６０９オンコナ一ゼ＋５０＋ｅＭシスプラ チン　１．１３２　０．８６４　０．４５５　０．６５８オンコナーゼ＋１００ ｄシスプラチン　０．８５８　０．．５９０　０．１８１　０．２６２オンコナ 一ゼ＋２５０ａ＋Ｍシスプラチン　０．７００　０．４３２　０．０２３　０． ０３４オンコナーゼ＋５０（ｍｉｌシスプラチン　ｏ、６ｇ５．　０．４１７　 ｏ、ｏｏ′８０．０１１ＥＤ、。鎖車：　３１６．５０９　２１４．２９９　１ ２９．６１６　＜０．００１＊ニオンコナーゼの夫々の濃度に組合せたシスプラ チンのＥＤ、。値（垂直に）；オンコナーゼ０ｒｒｌにおけるシスプラチンのＥ Ｄ、。値はシスプラチンのみに対するものであり、０ＶＣＡＲ−３細胞はシスプ ラチン単独に耐性であると考えられる。

０ＶＣＡＲ−３ヒト卵巣腺癌細胞に対してオンコナーゼとメルフアランとを種々 の用量で共用する場合の相互作用指数とＥＤ、。及びオンコナーゼとメルフアラ ンの個々のＥＤ、。値オンコナーゼ用量Ｑｇ／ｍｚ）　一旦一　入四−」じし− λ１−」旦□オンコナーゼ単独　２．３１７ オンコナーゼ＋〇、　２５ｊＭメルフアラン　１．７０１　１．４９２　０．７ ４７　１．７０５オンコナーゼ＋〇、５ｉメルフアラン　１．７７８　１．５６ ９　０．８２４　１．８８１オンコナーゼ＋０．７５μ麗メルフアラン　１’、 ７４６１．５３７　０．７９２　１．８０８オンコナーゼ＋１．ＯｙＭメルフア ラン　１．１４２　０．９３４　０．１８９　０．４１１オンコナーゼ＋２．５ ＋＋Ｍメルフアラン　０．９８７　０．７７９　０．０３４　０．０５１オンコ ナーゼ＋５．０μ麗メルフアラン　０．９７５　０．７６６　０．０２１　０． ０２２ＥＤ、。鎖車：　４．７８６　４．６２３　３．６２４　０．０５６＊： オンコナーゼの夫々の濃度に組合せたメルフアランのＥＤ、、値（垂直に）；オ ンコナーゼＯｐｌにおけるメルフアランのＥＤ、。値はメルフアラン単独に対す るものであり、０ＶＣＡＲ−３細胞はメルフアランのみに耐性であると考えられ る。

表　３ ０ＶＣＡＲ−３ヒト卵巣腺癌細胞に対してオンコナーゼとアドリアマイシンとを 種々の用量で共用する場合の相互作用指数とＥＤｓ　ｏ及びオンコナーゼとアド リアマイシンの個々のＥＤ、。値オンコナーゼ用量（μｑ／ｗｓｌ）　一旦一　 副」鼾　０．２　２．０　−印□オンコナーゼ単独　１．１６６ オンコナ一ゼ＋５ｎＭアドリアマイシン　１．７４４　１．３０５　０．８８１ 　０．９５７オンコナ一ゼ刊ＱｎＭアドリアマイシン　１．７０２　１．２６３ 　０．８３９　０．９０８オンコナ一ゼ＋２５ｎＭアドリアマイシン　１．２０ ８　０．７６９　０．３４６　０．３３２オンコナ一ゼ＋５ＱｎＭアドリアマイ シン　０．９２３　０．４８４　Ｑ、０６１　０．０ＱＩＥＤ、。値＊・　３７ ．３４０　３４．４７３　１８．０９０　２．２６５＊：オンコナーゼの夫々の 濃度に組合せたアドリアマイシンのＥＤ、。値（垂直に）：オンコナーゼ０μｌ におけるアドリアマイシンのＥＤ０値はアドリアマイシンのみのものであり、０ ＶＣＡＲ−３細胞はアドリアマイシンのみに耐性であると考えられる。

これらの結果は以下のことを実証している。即ち、示された例に於ては０ＶＣＡ Ｒ−３ヒト卵巣腺癌に及ぼすシスプラチン、メルフアラン及びアドリアマイシン と組合せたオンコナーゼの生物活性は個々の薬品のみの生物活性から予想された より一層大きいことを実証している。（実は、この０ＶＣＡＲ−３細胞株はシス プラチン、メルフアラン及びアドリアマイシンに臨床的に耐性の患者の細胞株で ある）。これは表の右端に並んでいるＥＤｓｏ数字かられかるものである。これ らの数字は計算された中間有効用量を表わし、その示された数字は試験を受ける 細胞の成長速度を半減させるために必要とする物質の量である。斯くして、ＥＤ ５ｏ値が低ければ低い稈同じ生物活性を成就せしめるに要する用量は一層少くな るのである。

一方ではオンコナーゼ、そして他方ではシスプラチン、メルフアラン又はアドリ アマイシンを同時に又は同時期に患者に投与する必要がない（そして当然通常投 与しないであろう）ことが理解されるであろう。むしろ、オンコナーゼは一つの 用量スケジュールに従って投与し、シスプラチン、メルフアラン又はアドリアマ イシンはもう一つの用量スケジュールに従って投与してもよい。只必要なことは 患者の身体の中でオンコナーゼとシスプラチン、メルフアラン又はアドリアマイ シンとが相互作用するように用量とスケジュールを選択することである。　・ オンコナーゼの化学分析と組成 オンコナーゼは化学的によく特徴が把握されている。オンコナーゼはトノサマガ エル（Ｒａｎａ　ｐｉｐｉｅｎｓ）から分離された蛋白質であるので、最終結果 が以下の化学及び構造をもつ限りに於ては遺伝子工学技術を使用して生産するこ とができる。

オンコナーゼは純粋な蛋白質である。（即ち、蛋白質の同質性を試験するために 用いられている標準試験によって確認される同質性である）。電気泳動法による と、オンコナーゼの分子量は約１４．５００ダルトンである。以下に表示したア ミノ酸配列に基づいた分子量の計算は分子量が１１．８１９ダルトンであること を示している。しかしながら、金属イオンを除（あらゆる努力をするにも拘らず 金属イオンが蛋白質に結合している可能性があり、そして異なるアイソトープが 含まれる可能性があるので、質量分析により決定されるオンコナーゼの分子量は １２．４３０ダルトンである。この不一致を考慮すると、質量分析により決定さ れるオンコナーゼの分子量は約１２．０００ダルトンと考えられるであろう、。

オンコナーゼは等電点ｐＩを有しそれは少くとも９．５であり１０．５の高さか もしれない。オンコナーゼはブロックされたアミノ末端基を持ち、本質的に炭水 化物はない（アンスロン及びオルシノール法により決定される）。

オンコナーゼは下記アミノ酸組成を有する二アミノ酸分析 アスパラギン酸／アスパラギン　１３．３９スレオニン　９．８４（註１） セリン　８．０８（註１） グルタミン酸／グルタミン　５．８８ イソロイシン　５．２９（註２） フェニルアラニン　５．７３ トリプトフアン　測定されない（註３）概略総計　９９．９９％ 註１：スレオニン及びセリンは加水分解中一部分解され、そしてこの値は斯様な 一部分解につき補正がなされている。

註２：この値は不完全な加水分解に対し補正されている。

註３ニトリブトファンは蛋白質の酸加水分解に於て検出することができない。何 故ならばそれは分解し、そして結果として測定されないものとして示されるから である。しかしながら、紫外部スペクトルの分析では分子当り１個のトリプトフ ァン残基の存在が明らかになっている。

アミノ酸組成 （アミノ酸配列から計算） アミノ酸　物質の分子当りの残基の数 アスパラギン酸　６ グルタミン酸　３ ピログルタミン酸　１ 概略総計　１０４ オンコナーゼの配列は決定されている。以下に示されている通り、配列の総計の 長さは１０４残基である。蛋白質のＮ−末端はピログルタミン酸（＜Ｇｌｕ）で ある。これは直接配列に必要な遊離アミノ基を欠いたグルタミン酸の環化誘導体 であり、そしてそれ故に該蛋白質のＮ−末端を“ブロック”している。

ＰＣＴ特許出願ｔｏ　８９１０９６０６に記載されている短かいフラグメントが ピログルタミン酸アミノ−ペプチダーゼで開裂した時、ピログルタミン酸は短か いフラグメントから除去され、二番目の残基で始まる配列を与えた。斬新な開裂 はピログルタミン酸アミノペプチダーゼのみがピログルタミン酸を開裂するので Ｎ−末端がピログルタミン酸であるということを強く示しているものである。ピ ログルタミン酸の存在は参照の短かいフラグメントについての質量分析法で更に 確認された。質量分析法で決定した短かいフラグメントの分子量はピログルタミ ン酸が存在すると仮定して計算した重量とよ（一致し、グルタミン酸が存在する と仮定して計算した重量と一致していない。

オンコナーゼは以下のアミノ酸配列を有する。

Ｌｙｓ−＾５ｐ−Ｌｙｓ−＾ｓｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−１１ｅ−Ｔｙｒ−３ｅｒ− Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−３ｅｒ−Ｃｙｓ 好しい実施態様は上述されているけれども、本発明の範囲は以下のクレームによ ってのみ限定される。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. １．質量分析法により約１２，０００ダルトンの分子量又はゲル電気泳動性によ り約１４，５００ダルトンの分子量を有する蛋白質で、且つ凡そ次の通りのアミ ノ酸組成 モル％ アミノ酸残基（２４時間酸加水分解） アスパラギン酸／アスパラギン１３．３９スレオニン９．８４ セリン８．０８ グルタミン酸／グルタミン５．８８ プロリン３．９８ グリシン２．９８ アラニン２．９２ シスチン／２７．７７ バリン７．７７ メチオニン０．９４ イソロイシン５．２９ ロイシン４．９５ チロシン２．８５ フェニルアラニン５．７３ ヒスチジン２．９９ リジン１１．７８ アルギニン２．８５ トリプトファン測定されない 大略総計９９．９９％ を有する蛋白質及び ａ）シスプラチン、 ｈ）４−〔ビス（２−クロロエチル）アミノ〕−Ｌ−フェニルアラニン、又は ｃ）塩酸ドキソルビシンＵＳＰ よりなる生物活性な医薬。
2. ２．質量分析法により約１２，０００ダルトンの分子量又はゲル電気泳動法によ る約１４，５００ダルトンの分子量を有する蛋白質で、且つ凡そ次の通りのアミ ノ酸組成 アミノ酸物質の分子当りの残基の数 アスパラギン酸６ アスパラギン８ スレオニン１０ セリン８ グルタミン酸３ ピログルタミン酸１ グルタミン２ プロリン４ グリシン３ アラニン３ シスチン／２８ バリン８ メチオニン１ イソロイシン６ ロイシン５ チロジン３ フェニルアラニン６ ヒスチジン３ リジン１２ アルギニン３ トリプトファン１ 大略合計１０４ を有する蛋白質及び ａ）シスプラチン、 ｂ）４−〔ビス（２−クロロエチル）アミノ〕−Ｌ−フェニルアラニン、又は ｃ）塩酸ドキソルビシンＵＳＰ よりなる生物活性な医薬。
3. ３．質量分析法により約１２，０００ダルトンの分子量、少くとも９．５の等電 点ｐＩ及びブロックされたアミノ末端基を有し、本質的に炭水化物を含まない純 粋な蛋白質と ａ）シスプラチン、 ｂ）４−〔ビス（２−クロロエチル）アミノ〕−Ｌ−フェニルアラニン、又は ｃ）塩酸ドキソルビシンＵＳＰ の何れかとよりなる生物活性の医薬。
4. ４．有力なアミノ酸がりジン及びスレオニンである請求項３の組合せ。
5. ５．蛋白質の各分子が確実にトリプトファンの一残基を含む請求項３の組合せ。
6. ６．蛋白質の各分子が確実にメチオニンの一残基を含む請求項３の組合せ。
7. ７．下記アミノ酸配列、 【配列があります】 を有する蛋白質、並びに ａ）シスプラチン、 ｂ）４−〔ビス（２−クロロエチル）アミノ〕−Ｌ−フェニルアラニン、及び ｃ）塩酸ドキソルビシンＵＳＰ よりなる群から選択された化学組成物よりなる生物活性な医薬。
8. ８．下記アミノ酸配列 【配列があります】 【配列があります】 を有する蛋白質と ａ）シスプラチン、 ｂ）４−〔ビス（２−クロロエチル）アミノ〕−Ｌ−フェニルアラニン、及び ｃ）塩酸ドキソルビシンＵＳＰ よりなる群から選択された化学組成物との治療的活性量を前記蛋白質及び前記化 学物質が腫瘍細胞成長速度を減少するよう患者内で作用するような方法で投与す る段階よりなる患者の腫瘍を治療する方法。