JPH07509370A - ウイルスタンパク質の発現を増大する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ウィルス　ンパ　の　る　。

ｌ五生１１ １人立１ 本発明は、一般にタンパク質の組換え産生に関する。さらに詳細には、本発明は ニスコートを用いて、宿主細胞から組換え的に産生じたタンパク質の分泌を促進 する方法に関する。

光ｊじどｌ景 タンパク質の産生の望ましい方法には、組換え発現が含まれる。しかし、商業的 に有用な量のタンパク質を得るのは困難であり得る。組換え産生が、ウィルス感 染の期間の発現を常に模倣するわけではないウィルスの糖タンパク質では特にそ うである。特に、いくつかのウィルスタンパク質はウィルス感染の期間に細胞表 面で発現されるが、組換えシステムでは細胞内で発現される。従って、タンパク 質を単離するために、さらに精製工程をとらなければならない。さらに、タンパ ク質は精製する前に細胞内酵素により分解を受けやすい。

このような細胞内発現は、ヘルペスウィルスシステムにおける糖タンパク質Ｈ（ ｇＨ）の発現に関して観察されてきた（Ｇｏｉ＋ｐｅＩｓおよびＭｉｎｓｏｎ、 　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、（１９８９）６３：４７４４−４７５５）：　５ｐａｅｔｅ ら、Ｐｒｏ　ｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｃｔｏｍｅ　ａｌｏｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓｅａｒｃ ｈ（Ｍ、Ｐ、Ｌａｎｄｉｎｉ　ｌｉ　１９９１）ｐｐ、　１３３−１３６）。

シャペロンは新たに生合成されたポリペプチドに結合し、これらのポリペプチド を正しい天然の構造に組立てるまで、または他の細胞区画に輸送（すなわち、分 泌のために）するまで、安定化するようである（ＳａｆｆｌｂｒｏｏｋおよびＧ ｅｔｈｉｎｇＳＮａｔｕｒｅ（１９８９）３４２：２２４−２２５）。Ｇｏａ＋ ｐｅｌｓおよびＭｉｎｓｏｎ（前出）は、さらに別のウィルス遺伝子産物が、粗 面小胞体−ゴルジ体ネットワークを介して細胞表面に単純ヘルペスウィルスｌ型 （）ＩＳＶ−１）ｇＨの輸送のために必要であると仮定する。同様に、細胞表面 へサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）ｇ）Ｉをニスコートするウィルス機能の存在 が５ｐａｅｔｅら（前出）により提案された。しかし、細胞表面へのウィルス糖 タンパク質の分泌に関連するヘルペスウィルス１ｃＰ１８．５の同族体であるＣ １１Ｖ　ＵＬ５６（Ｐａｎｃａｋｅら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、（１９８３）４７：５ ６８−５８５）は、細胞表面への短縮型および全長型の両方のＣＭＶ　ｇＨの移 動を促進しなかった。

ｇｌｌと同様、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）　１型エンベロープ糖タンパク 質（ｇｐ１６０）をコードする遺伝子でトランスフェクトした細胞株もまた、タ ンパク質のプロセッシングまたは輸送をしない。Ｈａｆｆａｒら（Ｊ、　Ｖｉｒ ｏｌ、　（１９９０）６４：３１００−３１０３）により、これは組換え産生の 間に他のウィルスタンパク質が不在であるためと推論された。

新規のＨ３Ｖ糖タンパク質のｇＬが現在同定されている（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ ら、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　（１９９２）６６：２２４０−２２５０、およびＨｕ ｔｃｈｉｎｓｏｎら、要旨集ＸＶＩ国際ヘルペスウィルスワークショップ、１９ ９１年７月７日〜１２日）。このタンパク質はｌｌ５Ｖ−１のＵＬＩ遺伝子によ りコードされている。ｇｌｌと同様、ｇＬは他のｌｌ５Ｖポリペプチドが不在な まま発現された場合には正しくプロセッシングされない。しかし、ＩＳＶ　ｇＬ およびＩＳＶ　ｇＨが同時発現された場合、そのタンパク質は、感染細胞で見出 されるタンパク質に抗原として類似しており、そしてそのタンパク質はプロセッ シングされ、細胞表面に輸送される。従って、実験者らはｌｌ５Ｖ　ｇＬ／ｇＨ 複合体の形成が、両分子のプロセッシングおよび輸送について必要であると仮定 した。しかし、いずれかのタンパク質の組換え発現を増大する手段としてのｇＬ ／ｇＨ複合体の使用は扱わなかった。

フィブロブラスト（繊維芽細胞）増殖因子（ＦＧＦ）は、種々の細胞タイプの増 殖および分化を調節する構造的に関連のあるポリペプチドのファミリーである。

現在のところ、７つの別個の遺伝子産物が同定された。これらは、酸性ＦＧＦお よび塩基性ＦＧＦ（Ｊａｙｅら、５ｃｉｅｎｃｅ（１９８６）２３３：５４１− ５４５；　＾ｂｒａｈａＩＩｌら、５ｃｉｅｎｃｅ（１９８６）２３３：５４５ −５４８；　＾ｂｒａｈａｍら、ＥＭＢＯＪ（１９８６）５：２５２３−２５２ ８）、劫１」腫瘍遺伝子の産物（Ｍｏｏｒｅら、ＥＭＢＯＪ（１９８６）５：９ １９−９２４ＨＪａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃ ｉ、ＵＳＡ（１９８６）８３ニア８０６−７８１０、ｈｓｔ−１またはＫＳ−Ｆ ＧＦとして知られているカボジ肉腫ＤＮＡから同定された増殖因子（Ｂｏｖｉら 、Ｃｅ１ｌ（１９８７）５０ニア２９−７３７ＨＴａ１ｒａら、Ｐｒ、ｏｃ、Ｎ ａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ（１９８７）Ｌ４：２９８０−２９８４、　 ＦＧＦ−５（Ｚａｈｎら、　１ｌｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、（１９８Ｂ） 旦：３４８７−３４９５）、ＦＧＦ−６（Ｍａｒｉｃｓら、担並■朋（１９８９ ）４　：　３３５−３４０　）およびケラチノサイト増殖因子であるＫＧＦまた はＦＧＦ−７（Ｆｉｎｃｈら、５ｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４５ニア５２−７ ５５）を含む。

ＦＧＦレセプターは、細胞上の種々のＦＧＦの効果を媒介するようである。２ク ラスのレセプターが、酸性ＦＧＦおよび塩基性ＦＧＦについて同定され、多くの ＦＧＦレセプターが現在クローン化された。例えば、Ｋａｎｅｒら、Ｓｃｉｅｎ ｃｅ（１９９０）ｇ４ｆｉ：１４１０−１４１３；　Ｍａｎｓｕｋｈａｎｉら、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ（１９９０）８７：４３７８− ４３８２；　Ｄｉｏｎｎｅら、ＥＩＩＢＯＪ（１９９０）ｉ：２６８５−２６９ ２；　Ｍｉｒｄａおよびｆｉｌｌｉａｍｓ、　Ｃ１１ｎ、　Ｒｅｓ、（１９９０ ）３８：３１０＾；およびＫｉｅｆｅｒら、ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒｓ（１９ ９１）５：１１５−１２７を参照のこと。前出のＫｉｅｆｅｒらは、ヒト細胞株 ｃＤＮ＾ライブラリーからＦＧＦレセプターをクローン化した。このｃＤＮ＾は ３つのイムノグロブリン様ドメインＦＧＦレセプターをコードし、そして酸性Ｆ ＧＦおよび塩基性ＦＧＦの両方を結合し得る。可溶性の細胞外ドメイン型のＦＧ Ｆレセプターが、バキュロウィルス発現システムで産生され、ＥＣ−ＦＧＦと名 付けられた。

ＦＧＦレセプターはｏｓｖ−ｔの細胞レセプターとして関連付けられる（Ｋａｎ ｅｒら、５ｃｉｅｎｃｅ（１９９０）２４８　：　１４１０−１４１３）。細胞 への初期の）ＩＳＶ−１ピリオンの粘着では、ヘパリン様の細胞に結合したグリ コサミノグリカンと相互作用する必要があり、Ｈ３Ｖエンベロープ糖タンパク質 ｇＢおよびｇＣにより媒介され得る（ＶｕＤｕｎｎおよび５ｐｅａｒＳＪ、　Ｖ ｉｒｏｌ、（１９８９）６３：５２−５８）。ｇＢおよびｇＤは、ウィルスの細 胞内への進入をもたらす細胞表面での二次的な相互作用に必須であり（Ｃａｉら 、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、（１９８８）６２：２５９６−２６０４；　Ｆｕｌｌｅｒ および５ｐｅａｒ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ（ １９８７）８Ａ：５４５４−５４５８；　ＬｉｇａｓおよびＪｏｈｎｓｏｎ　Ｊ 、Ｖｉｒｏｌ、（１９８８）６２：１４８６−１４９４：　Ｊｏｈｎｓｏｎら、 Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、（１９９０）６４：２５６９−２５７６）、そしてｇｌｌもお そらくまたウィルスの浸透に含まれる（Ｆｕｌｌｅｒら、Ｊ、　Ｖｉｒ。

１、　（１９８９）頻：　３４３５−３４４３）。ＦＧＦレセプターの、所望の タンパク質の組換え発現を増大するためのニスコートとしての使用はこれまで示 唆されていなかった。

λ豆度皿工 本発明は、ニスコートタンパク質が細胞表面でウィルス糖タンパク質の発現を顕 著に増強し得るとの発見に基づく。従って、タンパク質は形質転換した細胞から 分泌され、それによりさらに広範囲の手技および精製を必要とせずにタンパク質 の収量を劇的に増大する。

従って、１つの実施態様において、本発明は、宿主細胞中でタンパク質をコード する第１の遺伝子をニスコートをコードする第２の遺伝子と、タンパク質が宿主 細胞から分泌される条件下で同時発現することを含むタンパク質を組換え産生ず る方法に関する。

さらに他の実施態様において、本発明は、宿主細胞中でｇＨをコードする第１の 遺伝子と可溶性ＦＧＦレセプターをコードする第２の遺伝子とを、ｇＨが宿主細 胞から分泌される条件下で同時発現することを含むｃｌｌｖ　ｇｌｌを組換え産 生ずる方法に関する。

他の実施態様において、本発明は免疫学的に反応性の短縮型ＣＭＶ　ｇ）Ｉ（短 縮型ｇＨが天然のヒトＣＭＶ　ｇｌｌに存在するトランスメンブレン結合ドメイ ンの全部または一部を欠損している）を組換え産生ずる方法に関する。本方法は 、短縮型ｇＨをコードする第１の遺伝子と可溶性ＦＧＦレセプターをコードする 第２の遺伝子を、短縮型ｇｅ１が宿主細胞から分泌される条件下で同時発現する ことを含む。

さらに他の実施態様では、本発明は、ＵＬｌ１５をコードする第２の遺伝子とｇ ｌ（をコードする第１の遺伝子とを、ｇＨが宿主細胞から分泌される条件下で同 時発現することを包含する、ＣＭＶ　ｇＨを組換え産生ずる方法に関する。

他の実施態様では、本発明は、免疫学的に反応性の短縮型ＣＭｖｇ）Ｉを組換え 産生ずる方法（ここで短縮型ｇＨは天然のヒトＣＭＹ　ｇＨに存在するトランス メンブレン結合ドメインの全部または一部を欠損している）に関し、この方法は 、宿主細胞中で短縮型ｇＨをコードする第１の遺伝子とＵＬ１１５をコードする 第２の遺伝子とを、短縮型ｇＨが宿主細胞から分泌される条件下で同時発現する ことを含む方法に関する。

さらに他の実施態様では、本発明は、免疫学的に反応性のヘルペスウィルスポリ ペプチドとニスコートとの組み換え体を含有する複合体に関する。

本発明のこれらのおよび他の実施態様は、本明細書の開示を考慮して当業者に容 易に行われる。

区１諺と！浬ヱｄ１皿 図１は、ＣＭＶ　Ｔｏｖｎｅ　ｇＨ遺伝子のヌクレオチド配列である。

ＤＮＡ配列および予想されるアミノ酸配列を示す。推定のＴＡＴＡ、ＣＡＴ、お よびポリアデニル化配列に下線を付した。可能なＮ−結合グリコシル化部位の上 に線を付し、予想されるシグナル配列およびトランスメンブレンドメインを箱で 囲った。ｇＨの初期の同定に用いられたｐ８６トリブシン処理のペプチドの位置 を破線で示した（ＧｌｎｓｉｎからＰｒ０ｓｓ４およびＧ１ｎ５ｖｏからＧＬｎ ｓｙｔ）。

図２は、短縮型ｇＨ遺伝子をコードするＣＭＶ　ｇＨ哺乳類発現ベクター、ｐＣ ＭＡｄｇＨ６の図である。

図３は、ｇＨコード配列がｐＡｃ３７３のＢａｍ１（１部位にスプライシングさ れた（ＪＶ　ｇ１１バキュロウィルストランスファーベクター、ｐＡｃｇＨ２の 図である。

図４は、ＣＩＪＶ　ｇＨコード配列がｐＡｃ３７３のＢａｌ１１旧部位にスプラ イシングされた短縮型ｇＨヒトンスファーベクター（ｐＡＣｇ１１６）の図であ る。

図５はヒトＦＧＦレセプターｃＤＮＡ（抛５）および配列決定方法の概略図を示 す。翻訳される領域を箱で囲み、種々の陰影を付したドメインは以下を示す：８ １シグナルペプチド；ｌ〜３、免疫グロブリン様ドメイン１〜３　、　ＡＲＲ１ 酸性アミノ酸冨化領域：Ｔ輩、トランスメンブレン領域；ＴＫ、チロシンキナー ゼドメイン。可能な＾ｓｎ−結合グリコシル化部位もまた、Ｂｇｌ　Ｉ　Ｉ（Ｇ ）およびＥｃｏＲＩ（Ｅ）の制限エンドヌクレアーゼ部位と同様に示される（◆ ）。図には示したが、はとんどのカルボキシル末端コンセンサスグリコシル化部 位の位置が、多分使用されていないらしい。配列は、１１１３プライマーおよび 特定の内部プライマーを用いて得られた。矢印は、個々の配列決定の方向および 範囲を示す。ＤＮＡ配列はＧｅｎｂａｎｋおよびＥｌｉＢＬデータベースにあり 、受諾番号は、これらの組織から入手可能である。

図６は、６種の異なるヒトＦＧＦレセプター形態のアミノ酸配列比較を示す。配 列は、最も一致するように配列し、異なる配列または欠失した配列は箱で囲った 。種々のドメイン（図５に略号を示す）およびＰＣＲプライマーに用いられる領 域（Ｐｉ〜Ｐ４）を上記配列１（ｊｊｇ５）に示す。推定シグナルペプチダーゼ 切断部位もまた（↓）で示す。配列２はＡ、　ｌ５ａｃｃｈｉら、ＮｕｃＬｅｉ ｃ＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、（１９９０）Ｌｆｌ：１９０６から、配列３〜６は、Ｄ 、　Ｅ、　Ｊｏｈｎｓｏｎら、１１ｏ１．Ｃｅ１Ｌ、　Ｂｉｏｌ、　（１９９０ ）１０：４７２Ｂ−４７３６から得た。

図７は、ＣＭＶ　Ｔｏｗｎｅ株由来のＵＬ１１５オープンリーディングフレーム （ＯＲＦ）のヌクレオチド配列と＾Ｄ１６９株由来のものとの比較である。Ｔｏ ｗｎｅ配列は予測される一文字アミノ酸コードの翻訳産物とともにその全体を示 す。＾Ｄ１６９株配列中のヌクレオチドの差異を、Ｔｏｗｎｅ配列の上に下の場 合の文字で示す。星印を付した塩基の変化は、＾Ｄ１６９遺伝子産物におけるア ミノ酸の変化の結果となる変異を示す。

図８は、ＵＬ１１５オーブンリーディングフレームの遺伝子産物とｇＨとの同時 発現の結果、ｇ）Ｉの分泌を生じることを示すオートラジオグラムを示す。安定 なｇＨ発現性ＣＩＯ細胞株１７１は、以下のプラスミドでトランスフェクトされ た：（１）短縮型ＦＧＦを発現して細胞株１７に−３−１６を生じるプラスミド ｐＦＧＦｒｔｐａｎｅｏ（レーン２）、（２）細胞株１７１−ｎｅｏ−ＩＳ１７ １−ｎｅｏ−２，１７１−ｎｅｏ−３，１７１−ｎｅｏ−５，１７１−ｎｅｏ− ６，１７１−ｎｅｏ−８を生じる、ベクター制御プラスミドｐｓＶ２ｎｅｏ（レ ーン３〜８）、および（３）細胞株１７１−υＬ１１５−１８．１７１−ＵＬ１ １５−３５．１７１−ＵＬ１１５−４４、および１７１−ＵＬｌ１５−９１を生 じる、ＣＭＶ　Ｔｏｗｎｅ株由来のＵＬｌ１５０ＲＦの遺伝子産物を発現するプ ラスミドｐＭｃＩＪＬｌ１５ｎｅｏ（レーン９〜１２）。ＣＨＯ細胞株１１Ｃ１ ｉＶ−＾ｄｈｆｒ（レーンｌ）は、ＣＩＯ細胞を哺乳類細胞発現ベクターｐＭｃ ＭＶ＾ｄｈｆｒでトランスフェクトすることにより生じ（Ｓｐａｅｔｅら、訂■ 旦り、　（１９９０）６Ａ：２９２２−２９３１）、陰性コントロールを示す。

細胞を２３０μＣｉ／ｎｌ［”Ｓ］システィンで５時間、１０％の透析されたウ シ胎児血清を加えたシスティンを欠（ＤＭＥで標識した。調整培地を、ＣＩＩＶ 　ｇＨに特異的なマウスモノクローナル抗体１４−４ｂで免疫沈降した（Ｕｒｂ ａｎら、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　（１９９２）６６：１３０３−１３１１）。タン パク質分子量標準を、オートラジオグラムの左にキロダルトンで示し、ｇｌ（お よびＵＬｌ１５沈殿生成物の移動度を右に示す。

免且旦圧豊立盈旦 本発明の実施には、特に示さない限り、当該技術分野の範囲のウィルス学、微生 物学、分子生物学、および組換えＤＮＡ技術の従来法を用いる。このような技術 は文献に充分説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１ｉｏｌｅｃｕｌ ａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ（第２版、１ ９８９）　；　Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１゜ｎ１ｎ：＾Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ（１９８２）ＨＤＮＡ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：　Ａ 　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａ　ｒｏａｃｈ、１巻および１１巻（Ｄ、Ｇｌｏｖｅｒ ｔり；　Ｏｌｉ　ｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄ虹釘１山姐長（Ｎ、　Ｇ　ａ　ｉ　ｔ　 編、１９８４）；　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｈｂｒｉｄｉｚａｔｉ。

ｎ（Ｂ、　ＨａＩｎｅｓおよびＳ、１１１ｇｇ１ｎｓ！、　１９８５）；　Ｔｒ ａｎｓｃｒｉ　ｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ、　Ｈａｖｅｓ およびＳ、　Ｈｉｇｇｉｎｓ４ｉ１Ｓ１９８４）；＾ｎ１ｎａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃ ｕ１ｔｕｒｅ（Ｒ，Ｆｒｅｓｈｎｅｙｌｉ、　１９８６）；　Ｐｅｒｂａｌ、＾ 　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　１ｌｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｕ皿 （１９８４）を参照のこと。

本明細書で援用される上記または下記のいずれかに記載の全ての出版物、特許、 および特許出願は、その全体が本明細書中に参考として援用されている。

本発明の記載において、次の用語を用い、下記に示すように定義することを意図 する。

用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーをいい 、生成物の最小の長さに限定されない。

従って、ペプチド、オリゴペプチド、ダイマー、マルチマーなどが定義内に含ま れる。全長のタンパク質およびそのフラグメントも定義内に包含する。この用語 はまた、ポリペプチドの発現後修飾（例えば、グリコジル化、アセチル化、リン 酸化など）も含む。

ポリペプチドは、１つまたはそれ以上のエピトープを有し、従って感染性を中和 する抗体を誘導し、および／または、抗体−補体もしくは抗体依存性細胞の細胞 毒性を仲介して、免疫された宿主を保護する場合に、［免疫学的に反応性である 」。

免疫学的反応性は、競合アッセイのような当該技術分野で公知の標準のイムノア ッセイで測定され得る。

参照ポリペプチドの「フラグメント」は、参照ポリペプチド中に見出される任意 の連続したアミノ酸配列である。このようなフラグメントは、通常少なくとも５ アミノ酸の長さであり、好ましくは、少なくとも約ＩＯアミノ酸から１５アミノ 酸の長さである。フラグメントの長さの重要な上限はなく、はとんど全長のタン パク質配列または融合タンパク質でさえ包含し得る。好ましくは、フラグメント は、ポリペプチド由来のエピトープをコードし、最も好ましくは中和性のエピト ープである。第１のポリペプチド中の相同のドメインが他のポリペプチドのフラ グメントでないアミノ酸配列に隣接する場合でさえ、第１のポリペプチドは他の ポリペプチドのフラグメントを含む。

本明細書に用いられる用語「ニスコート」は、それと共に同時発現されたタンパ ク質と会合し得、それによってタンパク質が分泌され得る細胞表面へのタンパク 質の輸送を促進し得る任意の化合物として機能的に定義される。例として、可溶 性ヒトＦＧＦレセプターおよびＣＭＶ　ＵＬｌ１５が、ＣＭＶ　ｇＨと複合体を 形成し得ることが見出され、それによって宿主細胞を通じてｇＨの分泌を助ける 。同様に、ＥＩＳＶ　ｇＬは、２種のタンパク質が分泌のために細胞表面に輸送 され得るように１１ｓＶ　ｇＨとの複合体を形成することを示した。従って、こ れらの分子は、本発明中の「ニスコート」と考えられる。ニスコートの機能をな すために、全長のタンパク質が存在する必要はない。実際、可溶性ＦＧＦレセプ ターは、細胞外ドメイン（さらに以下に記載する）のみ有する短縮型分子である 。他のニスコートおよびそれらが相互作用するタンパク質は、以下にさらに充分 記載される。

「サイトメガロウィルスｇＨポリペプチドまたはＣＭＶ　ｇＨポリペプチド」は 、天然のヒトＣＭＶ　ｇＨのフラグメントを含むポリペプチドをいう。従って、 この用語は天然のｇＨ配列を含むポリペプチド（全長のものおよび短縮型のもの ）およびそのアナログの両方を含む。好ましいアナログは、対応する天然アミノ 酸配列に実質的に相同なアナログであり、最も好ましくは少なくとも１種の天然 ｇｌ＋エピトープ（例えば、中和性エピトープ）をコードする。特に好ましいＣ ＭＶ　ｇｆｌポリペプチドのクラスは、Ｃ末端トランスメンブレンドメインのか なりの部分を欠損している短縮型分子であり、効率的な発現および／または宿主 細胞からの高レベルのＣＭＶ　ｇＨポリペプチドの分泌を促進する。約２５個の Ｃ末端アミノ酸残基（Ｔｏｖｎｅ株の７１８位から７４２位の残基、図１）は、 トランスメンブレンドメインを包含するが、他の領域もまたトランスメンブレン 結合に重要であり得る。

トランスメンブレン結合をなくするまたは実質的に減少するようなドメイン、お よびこれらのドメインに隣接する配列の全部または一部の欠失が望ましい。代表 的には、少なくとも約５個のアミノ酸が欠失し得、好ましくは少なくとも約ｌＯ 残基、そして最も好ましくは少なくとも約２０残基から３４残基が天然の配列の Ｃ末端から欠失し得る。このような１つの株からの欠失の例は、図１で番号を付 した残基であり、７３２から７４２．７２２から７４２．７２０から７４２．７ １８から７４２、および７１２から７４２である。もちろん、他の機能的な欠失 は、宿主細胞でのポリペプチドの発現により、同一ドメインまたは他のドメイン からの欠失を構築し、モしてスクリーニングすることにより当業者により容易に 定義され得る。欠失に対する唯一の本当の上限は、有用なエピトープを維持する ための実用上の制限である（例えば、中和性エピトープ）。しかし、代表的には 、欠失は、天然ｇＨ配列の約１００アミノ酸（特に１００Ｃ末端残基）より多く を含まない。トランスメンブレンドメインの１部分の「欠失」は、特定の天然ア ミノ酸配列がポリペプチドに現れないこと、および他のアミノ酸（親水性残基の ような）が欠失した残基に置換し得ることのみを意味する事がまた理解されるべ きである。

用ＨｒｇＬＪ　ハ、Ｈ８Ｖ１７）ＵＬＩ　０ＲＦＩ７）遺伝子産物ライう。ＨＳ Ｖ−１ｇＬをコードする遺伝子は以前に記載されている（ＭｃＧｅｏｃｈら、Ｊ 、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、（１９８８）６９：１５３１−１５７４）。ヌクレ オチド配列分析で、推定シグナル配列、および単一のＮ結合性のオリゴ糖の接着 部位を有する２２４アミノ酸のタンパク質が予測される。ＨＳＶ−１ｇＬタンパ ク質は、３０ｋＤａの前駆体型および４０ｋＤａの成熟型として存在しているよ うである。さらに、Ｉ（ＳＶ−１ｇＬの記載については、Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ ら、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　（１９９２）６６：２２４０−２２５０、およびＨｕ ｔｃｈｉｎｓｏｎら、要旨集ＸＹ［、国際ヘルペスウィルスワークショップ、１ ９９１年７月７〜１２日を参照のこと。ｇＨと同様、本発明で用いるｇＬは、ｇ Ｌポリペプチドであり得、全長分子またはそれらの活性フラグメントのいずれか であり得る。さらに、この用語は、実質的に相同であり免疫学的に反応性である 天然の配列のアナログを含む。従って、本明細書ではタンパク質の免疫反応性を 破壊しないアミノ酸の置換、欠失、および付加が予期される。

ｒＵＬｌ１５Ｊ　ハ、ＣＭＶ　ＵＬｌ１５０ＲＦ（７）遺伝子産物ｔ、ｌ実質的 ｉ：相同のタンパク質を意味し、これは、天然タンパク質のニスコート機能を保 持している。全長のＬＩＬｌ１５についてのＴｏｗｎｅ株およびＡＤ１６９株の Ｃ蓋ｖヌクレオチド配列を図７に示す。両方の株で、ＵＬ１１５０ＲＦは８３４ 　ｂｐの長さであり、２７８アミノ酸の主要な翻訳産物をコードしている。ＵＬ １１５は、ＨＳＶ−１ｇＬに対するＣＭＶホモログであると見られ、ＨＳＶ−１ のＵＬＩ遺伝子にコードされている。

（ＨＳＶ　ｇＬのさらなる考察については、Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎら、Ｊ、Ｖｉ ｒｏｌ。

（１９９２）６６：２２４０−２２５０、およびＨｕｔｃｈｉｎｓｏｎら、要旨 集ｘｖｒ、国際ヘルペスウィルスワークショップ、１９９１年７月７〜１２日、 を参照のこと）。ｒ　ＵＬＩ　１５ポリペプチド」は、ＵＬｌ１５由来の連続し た配列のアミノ酸である。ポリペプチドは、天然配列からなり得るか、あるいは 分子がそれとともに同時発現するタンパク質と複合体を形成する能力を保持し、 そしてタンパク質を分泌するために細胞表面にニスコートする限り、置換、付加 、または欠失を含み得る。このような複合体の形成は、実施例にさらに記載した 免疫沈降法のようなアッセイを用いてモニターし得る。

本明細書で使用される用語ｒ　ＦＧＦレセプター」またはｒ　ＦＧＦ−ＲＪは、 ヒトＦＧＦレセプターまたはそのフラグメントをいい、ヘパリンの存在下でＦＧ Ｆを結合する。ＦＧＦレセプターは、実質的に図６に示すようなアミノ酸配列を 有する。用語ｒ　ｒＦＧＦ−ＲＪは、組換え手段により調製した活性なＦＧＦ− Ｒをいう。ｒＦＧＦ−Ｈの好ましい型は、可溶性ｒＦＧＦ−Ｒ（ｒ　５ＦＧＦ− ＲＪまたはｒＥＣ−ＦＧＦＪ　）であり、細胞外ドメインのみを発現することに より得られる短縮型である。驚くべきことに、短縮型はウィルス糖タンパク質の ニスコートとして作用し得ることが見出された。本発明の好ましい５ＦＧＦ−Ｒ は、ｂＦＧＦと２〜５　ｎＭのに４で結合する５８ｋＤａの糖タンパク質である 。ＵＬ１５５と同様、　ｒＦＧＦレセプターポリペプチド」は天然の配列からな り得るか、あるいはその分子がそれと同時発現するタンパク質と複合体を形成す る能力を保持し、そしてタンパク質を分泌するために細胞表面にニスコートする 限り、置換、付加、または欠失を含み得るＦＧＦレセプター由来のアミノ酸の連 続配列である。このような複合体の形成は、実施例にさらに記載された、免疫沈 降法のようなアッセイを用いてモニターし得る。

ｒ［ＩｓＶｇＪまたはｒＨ３Ｖ　ｇｌポリペプチド」は、単純ヘルペスウィルス 由来の当該技術分野で公知のｇＨタンパク質、ならびにその活性なフラグメント およびアナログを意味する。従って、上記のように、この用語はタンパク質の免 疫反応性を破壊しないアミノ酸の置換、欠失、および付加を含む。ＨＳＶ−ｌ　 ｇＨは、約ｔｉｏ、　ｏｏｏの見かけの分子量を有し、このタンパク質をコード する遺伝子が配列決定された（ＧｏｍｐｌｅｓおよびＭｉｎｓｏｎ、■皿江釘（ １９８６）１５３：２３０−２４７：　ＭｃＧｅｏｃｈおよびＤａｖｉｓｏｎ、 　Ｎｕｃｅｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、（１９８６）口：４２８１−４２９ ２）。この遺伝子は、哺乳類細胞中で発現されティる（ＧｏｍｐｅｌｓおよびＭ ｉｎｓｏｎ、　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、（１９８９）録：４７４４−４７５５）。

本明細書で使用される用語「複合体」は、会合の性質に関わらず、適合するタン パク質とのニスコートのあらゆる会合を示す。従って、この用語は互いに共有結 合している分子、ならびに互いに静電力および他の力を介して会合している分子 を指す。複合体は、実施例に記載された免疫沈降法のようなアッセイを用いて検 出され得る。

「作動可能に連結する」はそのように記載された成分が、意図したように機能し 得る関係で並置されることをいう。構造配列に「作動可能に連結」された調節因 子は、構造配列の発現が調節因子と適合する条件下で達成されるような方法で連 結される。

本明細書でポリヌクレオチドについて記載するために用いられるように「組換え 」は、ゲノム、ｃＤＮ＾、半合成、あるいは合成起源のポリヌクレオチドであり 、その起源または操作のために：（１）自然界ではそれと会合するポリヌクレオ チドの全部または部分と会合しない；および／または（２）自然界ではそれに連 結するポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドと連結するポリヌクレオチドを 意味する。タンパク質またはポリペプチドに関して用いられる用語「組換え」は 、組換えポリヌクレオチドの発現により産生されるポリペプチドを意味する。「 組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞株」、「細胞培養」、およ び単細胞体として培養した原核微生物または真核細胞株を示す他のそのような用 語は交換可能に用いられ、組換えベクターまたは他の転移ＤＮＡの受容体として 用いられ得、または用いられてきており、そしてトランスフェクトされた元の細 胞の子孫を包含する。１つの親細胞の子孫は、偶然の突然変異または故意の突然 変異のため、形態、あるいはゲノムまたは全ＤＮＡ成分において元の親と完全に 一致する必要はないことが理解される。所望のペプチドをコードするヌクレオチ ド配列の存在のような相当する（ｒｅｌｅｖａｎｔ）特性により特徴付けられる 親に顕著に類似している親細胞の子孫は、この定義で意図する子孫に包含され、 上記の用語にカバーされる。

「調節因子」は、それに連結するコード配列の発現に影響を与えるポリヌクレオ チド配列をいう。この用語は、プロモーター、ターミネータ−１および適当な場 合には、リーダー配列およびエンハンサ−を含む。

「レプリコン」は、任意の遺伝要素（例えば、プラスミド、コスミド、クロモソ ーム、ウィルス、またはファージ）であり、細胞内でポリヌクレオチド複製の自 己増殖単位として挙動する。

参照配列に「実質的に相同な」配列は、少なくとも約５０％の配列相同性を共有 し、好ましくは少なくとも約７５％、さらに好ましくは少なくとも約８５％とし て、そして最も好ましくは少なくとも約９０％から９５％を共有する。本明細書 で用いられる用語「実質的に相同な」はまた、参照配列に一致する配列を示すタ ンパク質を含む。

本明細書で用いられる「形質転換」は、挿入に用いた方法（例えば、直接取り込 み、形質導入、またはｆ−交配）に関わらず、宿主細胞への外因性ポリヌクレオ チドの挿入をいう。

外因性ポリヌクレオチドは、組込まれないベクター（例えばプラスミド）として 維持され得るか、あるいは宿主のゲノムに組込まれ得る。

「ベクター」は、プラスミド、トランスポゾン、ファージなどのような、接着し たセグメントの複製および／または発現を引き起こすために異種のポリヌクレオ チドセグメントが接着されるレプリコンである。

本明細書で用いられる「同時発現」は、宿主細胞中での２種またはそれ以上の異 なるタンパク質の発現をいう。タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、同 じ調節因子の制御下または別の因子の制御下のいずれかで、単一のプラスミドに 担持され得る。従って、２種またはそれ以上のタンパク質配列の活性部分を含む 融合タンパク質の産生は、内部のリポソーム進入部位を使用する２つのシストロ ン性の（ｄｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）構造として２つの遺伝子の発現であり得、本 発明の定義の目的のために「同時発現された」と考えられ得る。同様に、分離し た調節因子により制御される、同一ベクターから発現されたタンパク質もまた「 同時発現された」と考えられる。

この用語はまた、分離した構造からの２種またはそれ以上のタンパク質の発現を いう。従って、宿主細胞中で分離したベクターに存在する遺伝子からコードされ たタンパク質の発現もまた、本発明の目的では「同時発現された」と考えられる 。

Ｌ！１１！！　た　の　ン。

本発明は、特定のニスコートの発見に基づき、このニスコートは、ニスコートと 同時発現されるタンパク質を発現された産物が分泌され得る細胞表面へ往復させ 得る。それにより、タンパク質の収量は、促進されたタンパク質の分泌のために 増大し、発現産物の精製は容易に達成され得る。特定の理論に結びついていない が、ニスコートはタンパク質と会合することにより宿主細胞から出て行くことを 可能にし、それにより小胞体からタンパク質を放出させるようである。ニスコー トは、保持（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）シグナルを隠しおよび／またはこのように出 て行くことを可能にするタンパク質の三次構造を与える可能性がある。

本発明は、広範囲のタンパク質での用途が見出され得る。

実際、はとんどあらゆる所望のタンパク質は、適合するニスコートを用いて産生 じ得る。従って、本発明は、ワクチンおよび診断用薬に使用するウィルス抗原お よびバクテリア抗原、ペプチドホルモンおよび医薬に用いる薬物、ならびに広範 囲の用途を有するマーカータンパク質などのような有用な生成物の収量を増加さ せ得る。これらのタンパク質に対して惹起した抗体もまた診断用薬として有用で ある。

本発明は、ウィルス糖タンパク質、特に組換えシステムで細胞内で発現されたこ れらの糖タンパク質の生成に特に有用である。例えば、本発明は、単純ヘルペス ウィルス（ＨＳＶ）、水痘−帯状庖疹ウィルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バー ルウィルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウィルス（ＣＭｖ）ならび１．：ＤＶ６お よびＨＦＩＶ７のような他のヒトヘルペスウィルス由来のタンパク質を含むヘル ペスウィルスファミリー由来の広範囲なタンパク質の発現に用途を見出し得る。

次のようなしかし限定されない他のウィルス由来のタンパク質もまた、本発明の システムを用いて容易に発現され得る：Ａ型肝炎ウィルス（ＩＩＡＶ）、Ｂ型肝 炎ウィルス（ＨＢＶ＞、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）、デルタ肝炎ウィルス（Ｉ （ＤＶ）、およびＣ型肝炎ウィルスを含む肝炎ウィルスファミリー由来のタンパ ク質、ならびに、ＨＴＬｖ−１およびＨＴＬＶ−１１由来のようなレトロウィル スタンパク質およびｕＩｖ−ｉおよび旧Ｖ−２のようなヒト免疫不全ウィルス（ ＨＮ’）由来のタンパク質。例えば、サイトメガロウィルスのコードするタンパ ク質内容の総論については、Ｃｈｅｅら、Ｃｔａｍｅ　ａｌｏｖｉｒｕｓｅｓ（ Ｊ、に、ＭｃＤｏｕｇａｌｌｌｉ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ　１９９０ ）１２５−１６９頁；種々のＨＳＶ−１コードタンパク質の考察ニラいては、Ｍ ｃＧｅｏｃｈら、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、（１９８８）６９：１５３１−１５ ７４　；　ＥＢＶゲノム中のタンパク質コード配列の同定については、Ｂａｅｒ ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３１０：２０７−２１１　；　ＶＺＶの総論につ いては、Ｄａｖｉｓｏｎおよび５ｃｏｔｔＳＪ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、（１９８ ６）６７：１７５９−１８１６　、１（ＣＶゲノムの考察については、Ｈｏｕｇ ｈｔｏｎら、胎Σ山江邦２（１９９１）１４；３８１−３８８　；　ソして、Ｉ ＩＩＶゲノムノ考察ニツいテハ、５ａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒら、５ｃｉ ｅｎｃｅ（１９８５）２２７：４８４−４９２を参照のこと）。

上記のタンパク質は、目的のタンパク質が宿主細胞から効果的に分泌され得るよ うに、適合するニスコートと同時発現される。適合するニスコートは、電気泳動 および免疫沈降法のような公知の技術を用いて、推定のニスコートと目的のタン パク質との間の複合体の形成についてアッセイすることにより容易に同定される 。このような複合体の検出は、実施例に、および１（ｕｔｃｈｉｎｓｏｎら、Ｊ 、　Ｖｉｒｏｌ、　（１９９２）６６：２２４０−２２５０にさらに記載される 。

例トシテ、ＨＳＶ−１ｇＬ（ＵＬＩ　０ＲＦｉ：：＋−ドさレテいル）ハ、０Ｓ Ｖ−Ｉ　ｇＨ（ＵＬ２２０ＲＦにコードされている）と複合体を形成することが 見出されている（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　（１９９２）６ ６：２２４０−２２５０）。ｇｔｌおよびｇＬが同時発現された場合、それらは 、他のウィルスタンパク質の不在下で発現されたｇＨおよびｇＬとは異なり、細 胞表面に存在している。ＨＳＶ−１ｇＨおよび［１ＳＶ−１ｇＬに機能的におよ び／または構造的に相同なタンパク質は、ヘルペスウィルスファミリーを通して 見出された。例えば、ＥＢＶ　０ＲＦＢＫＲＦ２ハ、ｆｌｓＶ−１ｇＬ（７）ε ＢＹホーｔ−ｏグヲコードし、ＯＲＦ　ＢＸＬＦ２ハ、ｇｌ（のホモログ（ｇｐ ８５という）をコードする。Ｂａｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）η０：２０ ７−２１１　；　Ｈｅｉｎｅｍａｎら、１．　ＶｉｒｏＬ　（１９８８）６２： １１０１−１１０７゜同様に、ｖｚｖの遺伝子６０は、［ＩＳＶ　ＵＬＩのｖｚ ｖのホモログであり、ＶＺＶ３７と呼ばれるタンパク質をコードしている。Ｄａ ｖｉｓｏｎおよび５ｃｏｔｔ、　Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、（１９８６）６７： １７５９−１８１６、輩ｃＧｅｏｃｈら、Ｊ、Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　（１９ ８８）６９：１５３１−１５７４　ＨＣｒａｎａｇｅら、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　 （１９８８）６２：１４１６−１４２２゜同様ニ、ＣＭＶ　ｇｌｌ（ＵＬ７５１ ．：　：ｌ−）’　サｔＬ　ｒ　イル）は、ＨＳＶ−１ｇＨに対するホモログで ある（Ｐａｃｈｌら、ｈ圧動ｕ（１９８９）月ｉ９：４１８−４２５　；　Ｃｒ ａｎａｇｅら、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、（１９８８）６２：１４１６−１４２２；　 Ｃｈｅｅら、Ｃｔａｍｅ　ａｌｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｊ、に、ＭｃＤｏｕｇａｌｌ ！、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ　１９９０）１２５−１６９頁）。ＦＩＨ ＶもｇＨ（および他ノヘルヘスウィルスタンパク質）アナログをコードしている 。従って、他のヘルペスウィルス中に見出される糖タンパク質ホモログも、本発 明に含まれる。ニスコートを用いて簡便に発現される他のヘルペスウィルス糖タ ンパク質には、ＨＳＶ　ｇＢおよびｏｓｖｇｏ；ＣＭＶ　ｇＢ　、を含む種々の Ｈ３Ｖ糖タンパク質およびこれらのタンパク質に対するＨＦＩＶホモログが含ま れる。

特に重要なのが、ＣＭＶ　ＵＬｌ１５が、ＨＳＶ　ｇＬのホモログであるという 本発見である。本明細書にさらに記載したように、日５Ｖ−１ｇＬおよびｇｌ（ のように、ＵＬｌ１５およびＣＭＶ　ｇｌ（が同時発現された場合、この２つの タンパク質は、複合体を形成し、宿主細胞から分泌される。ＣＭＶ　ｇＬとの様 に、ＦＧＦレセプターはＣＭＶ　ｇＢともニスコート機能を提供することが見出 されており、他の相同なヘルペスウィルスタンパク質のニスコートとして機能し 得る。

上記に説明したように、肝炎ウィルス産物も、本発明のシステムを用いて首尾良 く発現される。例として、ＨＣＶゲノムは、Ｅｌ（Ｅとして知られる）およびＥ ２（Ｅ２／ＮＳＩとしてまた知られる）含むいくつかのウィルスタンパク質をコ ードする。（ＥｌおよびＥ２を含むＨＣＶタンパク質の考察については、Ｈｏｕ ｇｈｔｏｎら、肚凹包に訂（１９９１）１４：３８１−３８８、およびＨｃｖケ ノム配列ニツいテハ、ＥＰＯ公開第３８８．２３２号を参照のこと。これらのタ ンパク質は、組換えシステムで発現された場合、膜会合性アシアロ糖タンパク質 である。、ＨＣＶウィルスは、肝細胞上に見出されるアシアロ糖タンパク質レセ プターあるいは肝臓上皮細胞およびマクロファージ上に見出されるマンノースレ セプターのいずれかを通して感染の間に、宿主細胞に入り得る。（マンノースレ セプターおよびアシアロ糖タンパク質レセプターの考察については、Ｅｘｅｋｏ ｖｉｔｚら、ム邊姐」αＬ（１９９０）１７６：１７８５−１７９４　；　Ｋｕ ｒａｔａｇ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｎ、　（１９９０）２６５：１１２９５ −１１２９８　Ｈ５ｃｈｕｆｆｅｎｅｃｋｅｒら、Ｃｔｏ　ｅｎｅｔ、ｃｅｌｌ 、Ｇｅｎｅｔ、　（１９９１）５６：９９−１０２　；および５ａｓｔｒｙら、 Ｊ、　Ｉ＋＋＋ｒ＋ｕｎｏ１．　（１９９１）ｌｐ　；　６９２−６９７を参照 のこと）。アシアロ糖タンパク質レセプターのよう１．ｍ　（Ｄｒｉｃｋａｍｅ ｒら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｒｎ、　（１９８４）２５９ニア７０−７７８ 　；　５ｐｉｅｓｓら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ （１９８５）８２：６４６５−６４６９　；　ＭｃＰｈａｕｌおよびＢｅｒｇ、 　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ（１９８６）８３：８８６３−８８６７　；　ＭｃＰｈａｕ ｌおよびＢｅｒｇ、　Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ。

駆動１．（１９８７）　７：１８４１−１８４７）、マンノースレセプターはク ローン化されている（Ｔａｙｌｏｒら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅａ＋、　（１ ９９０）２６５　：１２１５６−１２１６２）。これらのレセプターは、Ｅｌお よびＥ２のようなＨＣＶタンパク質の組換え産生用のニスコートとして用途を見 出し得る。

ＨＩＶタンパク質の発現もまた、本発明の方法を用いて促進され得る。ＨＩＶ± 遺伝子は、ウィルスのエンベロープタンパク質（糖タンパク質ｇｐｔ６ｏ、ｇｐ １２０およびｇｐ４１を含む）をコードしている。上記に説明したように、ｇｐ １６０は、組換えシステムでは適切にプロセッシングあるいは輸送されない（ｌ ａｆｆａｒら、ＬＶｉｒｏｌ、　（１９９０）６Ａ：３１００−３１０３）。さ らに、１（ＩＶの細胞内レセプターであるＣＤ４は、タンパク質輸送で役割を果 たしているようである。さらに詳細には、小胞体の特異的な保持シグナルを含む ように改変されたＣＤ４変異体は、首尾良＜　ｇｐ１２０の分泌およびｇｐ１６ ０の表面発現をプＯ−７りする。ＢｕｏｎｏｃｏｒｅおよびＲｏｓｅ。

Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４５：６２５−６２８゜従って、ＣＤ４の、ＨＩＶ エンベロープタンパク質の発現を促進するためのニスコートとしての使用も本明 細書で熟考されている。

さらに、タンパク質およびそれと同時発現する適合するニスコートのさらなる例 は、上記の考察を考慮して当業者に容易であり得る。

Ａ、の“　−の 上記に説明したように、本発明で使用するタンパク質とニスコートは、組換え的 に産生じ得る。目的のタンパク質をコードするＤＮＡはゲノム、ｃＤＮＡ、また は合成りＮＡであり得る。引き続くクローニング用にＤＮＡを得るまたは合成す る方法は、当該分野で周知である。例えば、所望のタンパク質は、精製し、アミ ノ酸配列をエドマン分解の繰り返しサイクル、それに続業者が、かなり長いプロ ーブを調製すること、および／または、（ＨＰＬＣによるアミノ酸分析により決 定され得る。アミノ酸配列決定の他の方法も当該技術分野で公知である。いった んアミノ酸配列が決定されると、決定されたアミノ酸配列部分のコドンを含むオ リゴヌクレオチドプローブが調製され、そして目的のタンパク質をコードする遺 伝子のＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために用いられ得る。オリゴヌ クレオチドプローブおよびＤＮＡライブラリーの調製、ならびに核酸ハイブリダ イゼーションによるそれらのスクリーニングの基本的な戟略は、当業者に周知で ある。例えば、匠と回ユｕ皿：第１巻（前出）　；　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ 　Ｈｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、　（前出）；吐江坦匹ｎｏｔｉｄｅ　Ｓ　ｎｔｈ ｅｓｉｓ（前出）　；　Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓら、（前出）を参照のこと。

まず、ＤＮＡライブラリーを調製する。一旦ライブラリーが構築されると、ライ ブラリーをプローブするオリゴヌクレオチドが調製され、所望のタンパク質をコ ードする遺伝子を単離するのに用いられる。オリゴヌクレオチドは、任意の適切 な方法により合成される。選択された特定のヌクレオチド配列が、所望のタンパ ク質から公知のアミノ酸配列をコードするコドンに対応するように選択される。

遺伝子コードが縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）するため、タンパク質の特定の領 域をコードする可能なヌクレオチド配列の全てまたは合理的な数をカバーするよ うに、しばしばいくつかのオリゴヌクレオチドを合成する必要がある。従って、 その領域が、そのコドンが高度に縮重するアミノ酸を含まないことが、プローブ の基礎とする領域の選択には一般的に好ましい。特定の環境においては、当り（ 前出）参照のこと。基本的な要件は−ハイブＩ＋　＆メ４Ｊ−１Ｘｉ（特にこの 長い領域および／または冗長領域が目的のタンパク質の特徴が高度に現れている 場合に）対応する核酸配列中で高度の冗長さく　ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）を有す るであろうアミノ酸配列領域を包含することが望ましいことを見出し得る。１回 のハイブリダイゼーション実験において、この遺伝子の異なる領域の各々に対す る２つのプローブ（またはプローブのセット）を用いることも望ましい。自動化 されたオリゴヌクレオチド合成で、比較的簡単にプローブの大きなファミリーの 調製物が作られる。用いられたプローブの正確な長さは重要ではないが、一般的 に当該技術分野では、約１４塩基対から約２０塩基対のプローブが通常効果的で あると認められている。約２５塩基対から約６０塩基対のさらに長いプローブも 用いられる。

選択したオリゴヌクレオチドプローブは、標準手法を用いて放射性ヌクレオチド またはビオチンのようなマーカーで標識される。次いで、標準法に従って、ライ ブラリーから単離された５ｓＤＮ＾にハイブリダイズし得る一本鎖のプローブか らなる標識されたプローブのセットは、スクリーニング工程で用いられる。厳密 なまたは緩和なハイブリダイゼーション条件のいずれかが、プローブの長さ、お よびプローブがライブラリーとして同種由来であるか否か、あるいは進化的に近 縁かまたは離れた種であるか否かなどのようないくつかの因子に依存して適用し 得る。適切な条件の選択は、当該技術分野の技術範囲内である。一般的には、Ｎ ｕｃｌｅｉｃ＾ｃｉｄ　ｈ　ｂｒｉｄｉｚａｔｉョン条件が十分にコンであり、 その結果、選択的なハイブリダイゼーションが起こる；すなわちハイブリダイゼ ーションは、非特異結合に対するように、十分な程度の核酸相同性（例えば、少 なくとも約７５％）を有する。スクリーニングしたライブラリー由来のクローン が陽性ハイブリダイゼーションにより一旦同定されたら、特定のライブラリー挿 入物が所望のタンパク質の遺伝子を含むことを、制限酵素分析およびＤＮＡ配列 決定により確認し得る。

あるいは、目的のタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、クローニングよりむし ろ合成で調製され得る。ＤＮＡ配列は、特定のアミノ酸配列に対する適切なコド ンで設計し得る。一般的には、この配列が発現用のコドンである場合、目的の宿 主用の好ましいコドンを選択する。完全な配列が、標準法により調製された重複 するオリゴヌクレオチドから完全なコード配列にアセンブルされる。例えば、Ｅ ｄｇｅ、　Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）工：７５６　；Ｎａｍｂａｉｒら、５ｃｉ ｅｎｃｅ（１９８４）２２３：１２９９　；　Ｊａｙら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃ ｈｅｃ。

（１９８４）影ｉ９：６３１１を参照のこと。

Ｂ、　シスーム 一旦所望のタンパク質およびニスコートをコードする適切な配列が単離または合 成されると、種々の異なった発現システムで同時発現され得る；例えば、哺乳類 細胞、バキュロウィルス、バクテリア、および酵母を用いるシステム。同時発現 には、所望の産物をコードする２種またはそれ以上のプラスミドが用いられ得る 。あるいは、所望のタンパク質およびニスコートの両方をコードする単一の構築 物が用いられ得る。

単一の構築物はニスコートおよび所望のタンパク質を含む融合タンパク質をコー ドするキメラＤＮＡ分子からなり得るか、あるいは２つの別の産物をコードする ＤＮＡを含み得る。

１、ｒＩｆ４１シ　−ム 哺乳類の発現システムは、当該技術分野で公知であり、本発明で使用され得る。

哺乳類の発現システムは哺乳類のプロモーターを含み、このプロモーターは、哺 乳類のＲＮＡポリメラーゼと結合し、ｆｆ１ＲＮ＾にコード配列（例えば、構造 遺伝子）の下流（３゛）への転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列である。プロモ ーターは、転写開始領域（通常コード配列の５′末端に近隣に位置する）、およ びＴＡＴＡ　ｂｏｘ（通常、転写開始部位の２５〜３０塩基対（ｂｐ）上流に位 置する）を有する。ＴＡＴＡ　ｂｏｘは、正しい部位でＲＮ＾合成を開始するた めにＲＮ＾ポリメラーゼＩ＋を指示すると考えられている。哺乳類のプロモータ ーはまた、上流プロモーター因子を含有し、それは代表的にはＴＡＴＡ　ｂｏｘ のｔｏｏｂｐから２００ｂｐ上流に位置する。上流プロモーター因子は、転写が 開始される効率を決定し、そしてどちらかの方向に作用し得る（ＳａｌＩｌｂｒ ｏｏｋら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　 Ｍａｎｕａｌ、第２版、前出）。

哺乳類のウィルス遺伝子は、しばしば高発現され、広い宿主範囲を有する。それ ゆえに、哺乳類のウィルス遺伝子をコードする配列は特に有用なプロモーター配 列を提供する。例としては、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス哺乳類癌つィル スＬＴＲプロモーター、アデノウィルス後期主要プロモーター（＾ｄＭＬＰ）、 および単純ヘルペスウィルスプロモーターを含有する。

さらに、ウィルス遺伝子以外由来の配列（例えば、マウスメタロチオネイン遺伝 子）はまた、有用なプロモーター配列を提供する。発現は、プロモーターに依存 して構成性であるかあるいは調節される（誘導される）かのいずれかであり得、 そしてホルモン一応答性細胞中ではグルココルチコイドで誘導され得る。

エンハンサ−因子もまた用いられ得る。上記のプロモーター因子と結合したエン ハンサ−因子（エンハンサ−）の存在は、代表的には発現レベルを増大する。エ ンハンサ−は、同種のまたは異種のプロモーターに結合したとき、正規のＲＮ＾ 開始部位で始まる合成で、１０００倍に転写を促進し得る調節ＤＮＡ配列である 。エンハンサ−はまた、転写開始部位の上流または下流に位置するときに（正規 のまたは反対の方向に、あるいはプロモーターから１０００ヌクレオチドを超え る距離で）、活性であるＣＭａｎｉａｔｉｓら、５ｃｉｅｎｃｅ（１９８７）２ ３６：１２３７：　＾１ｂｅｒｔｓら、（１９８９）Ｍ吐弦吐肛」胆包肛」Ｌ止 虹並旦第２版）。ウィルス由来のエンハンサ−因子は、代表的には広い宿主範囲 を有するので、特に有用であり得る。例としては、ＳＶ４０初期遺伝子エンハン サー（Ｄｉｊｋｅｍａら、ＥＮＢＯＪ、　（１９８５）　４ニア６１）、および ラウス肉腫ウイルスノ長末端反復（ＬＴＲ）由来（Ｇｏｒａ＋ａｎら、Ｐｒｏｃ 、　Ｎａｔｌ、＾Ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ（１９８２ｂ）　７９：６７７７ ）、およびヒトサイトメガロウィルス由来（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅ１ｌ（１９ ８５）４１：５２１）のエンハンサ−／プロモーターを含有する。さらに、いく つかのエンハンサ−は調節可能で、ホルモンまたは金属イオンのような誘導物質 （Ｓａｓｓｏｎｅ−ＣｏｒｓｉおよびＢｏｒｅｌｌｉＳＴｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅ ｔ、（１９８６）ｊ：２１５；１１ａｎｉａｔｉｓら、５ｃｉｅｎｃｅ（１９８ ７）２３６：１２３７）の存在下でのみ活性化される。

所望のタンパク質およびニスコートはまた、哺乳類細胞中で外来タンパク質の分 泌をもたらすリーダー配列フラグメントを含む融合タンパク質として発現され得 る。好ましくは、それらは、インビボまたはインビトロのいずれかで切断され得 る、外来遺伝子とリーダーフラグメントとの間にコードされるプロセッシング部 位を有している。リーダー配列フラグメントは代表的には、細胞からのタンパク 質の分泌を指示する疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドをコードする。アデ ノウィルスの３つの分裂（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダーは、哺乳類細胞中で 外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列の例である。

代表的には、哺乳類細胞により認識される転写終止およびポリアデニル化配列は 、転写終止コドンの３°側に位置する調節領域であり、従ってこのようにプロモ ーター因子とともに、コード配列の横に配置する。成熟ｆｆ１ＲＮ　Ａの３°末 端は、部位特異的転写後切断およびポリアデニル化によって形成される（Ｂｉｔ ｎｓｔｉｅｌら、Ｃｅ１ｌ（１９８５）４１：３４９；　Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔお よびｆｈｉｔｅｌａｗ　（１９８８）　ｒ真核細胞ＲＮＡの転写の終結および３ ′末端プロセシング」Ｔｒａｎｓｃｒｉ　ｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｓ　１ｉｃｉｎ　 （Ｂ、Ｄ、　Ｈａｍｅｓおよびり、Ｍ、　Ｇｌｏｖｅｒｌｉｉ）ＨＰｒｏｕｄｆ ｏｏｔ、　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｒｌ、　Ｓｃｉ、（１９８９）１４：１ ０５）。これらの配列は、そのＤＮＡにコードされるポリペプチドに翻訳され得 るＩｎＲＮＡの転写を指示する。転写の終結／ポリアデニル化のシグナルの例に は、ＳＶ４０由来のそれらを含有する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）　ｒ 培養哺乳類細胞でのクローン化された遺伝子の発現」Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ ｏｎｉｎ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ）。

いくつかの遺伝子は、イントロン（いわゆる介在配列）が存在するときに、さら に効果的に発現され得る。しかし、いくつかのｃＤＮ＾は、スプライシングシグ ナル（いわゆるスプライスドナーおよびアクセプタ一部位）を欠くベクターから 効果的に発現されている（例えば、Ｇｏｔｈｉｎｇおよび５ａＩｎｂｒｏｏｋ、 　Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９３：６２０を参照のこと）。イントロンは、ス プライスドナーおよびアクセプタ一部位を含有する、コード配列内に介在する非 コード化配列である。それらは主要な転写物のポリアデニル化に続く「スプライ シング」と呼ばれるプロセスにより除かれる（Ｎｅｖｉｎｓ、　Ａｎｎ、　Ｒｅ ｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｆｆｌ、（１９８３）５２：４４１；　ＧｒｅｅｎＳＡｎｎ 、Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅｔ、（１９８６）２０：６７１；　Ｐａｄｇｅｔｔら、Ａｎ ｎ、Ｒｅｖ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　（１９８６）５５：１１１９；にｒａｉｎｅｒおよびＭａｎ ｉａｔｉｓ、　（１９８８）ｒＲＮｉへスプライシングｊ　Ｔｒａｎｓｃｒｉ　 ｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓ　１ｉｃｉｎ　（Ｂ、Ｄ、　Ｈａｉ＋ｅｓおよびり、１１ ．　Ｇｌｏｖｅｒ））。

代表的には、上記の成分（プロモーター、ポリアデニル化シグナル、および転写 終止配列を包含する）は、発現構築物にまとめられる。エンハンサ−１機能的な スプライスドナーおよびアクセプタ一部位を有するイントロン、ならびにリーダ ー配列はまた、もし望むなら発現構築物中に含有され得る。発現構築物は、しば しば哺乳類細胞またはバクテリアのような宿主中で安定に維持され得る染色体外 因子（例えば、プラスミド）のようなレプリコン内で維持される。哺乳類の複製 システムは、複製のためにトランスに作用する因子を必要とする動物ウィルス由 来のシステムを含む。例えば、ＳＶ４０のようなパポーバウイルスの複製システ ムを含有するプラスミド（ＧｌｕｚｎａｎＳ恒旦（１９８１）υ：１７５）、ま たはポリオーマウィルスは、適切なウィルスＴ抗原の存在下で、かなり高いコピ ー数に複製する。さらに哺乳類のレプリコンの例には、ウシパピローマウィルス およびＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウィルス由来のレプリコンが含まれる。さらに 、レプリコンは、２つの複製システムを有し得る。こうして、例えば、発現のた めには動物細胞中で、ならびにクローニングおよび増幅のためには原核細胞の宿 主中で維持され得る。そのような哺乳類−バクチリアシャトルベクターの例には 、ｐＭＴ２（Ｋａｕｆｍａｎら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、（１９８９ ）ｉ：９４６）、およびｐＨＥＢＯ（Ｓｈｉｍｉｚｕら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１． 　Ｂｉｏｌ、（１９８６）ｆｉ：１０７４）を含有する。

用いられる形質転換法は、形質転換される宿主に依存する。

異種のポリヌクレオチドを哺乳類に導入する方法は、当該技術分野で公知であり 、そしてデキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈澱法、ポ リブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーシ ョン、リポソーム内へのポリヌクレオチドのカプセル化、および核内へのＤＮＡ の直接マイクロインジェクションを包含する。

発現のための宿主として利用できる哺乳類細胞株は当該技術分野で公知であり、 アメリカンタイプカルチャーコレクション（＾ＴＣＣ）より入手可能な多くの不 死化細胞株を含有し、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ 細胞、ベビーハムスターの腎臓（Ｂ［ＩＫ）細胞、サルの腎臓細胞（ＣＯＳ）、 ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ　Ｇ２）、および多くの他の細胞株を含有す るが、これに限定されない。

ｉｉ、バ　ロ　ルスシスーム 所望のタンパク質およびニスコートをコードするポリヌクレオチドはまた、適切 な昆虫の発現ベクター中に挿入され得る。そしてそのベクター内の制御因子に、 作動可能に結合する。ベクターの構築には、当該技術分野で公知の技術を採用す る。

一般的に、発現システムの成分は、トランスファーベクター（通常バクテリアプ ラスミド）を含有し、それはバキュロウィルスゲノムのフラグメント、および発 現される異種の遺伝子の挿入に都合のよい制限部位の両方；トランスファーベク ター中のバキュロウィルス特異的フラグメントに相同な配列を有する野生型バキ ュロウィルス（このことで、バキュロウィルスゲノム中に異種の遺伝子の相同組 換えが起こり得る）；そして適切な昆虫宿主細胞および増殖培地を含む。

所望のタンパク質およびニスコートをコードするＤＮＡ配列を１種またはそれ以 上のトランスファーベクターに挿入後、ベクターおよび野生型ウィルスゲノムは 、ベクターおよびウィルスのゲノムが組換え得る、昆虫宿主細胞にトランスフェ クトされる。パッケージされた組換えウィルスが発現され、そして組換えプラー クが同定および精製される。バキュロウィルス／昆虫細胞発現システムのための 方法および材料は、キットの形で、特にＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、　Ｓａｎ　Ｄｉ ｅｇｏ　Ｃ＾（ｒ　ＭａｘＢａｃＪキット）より市販されている。これらの技術 は、当業者に一般的に公知であり、Ｓｕ＋ｎｍｅｒｓおよび５ｆｆｌｉｔｈＳＴ ｅｘａｓ　Ａ　ｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｅｘｅｒｉｆｆｌｅｎｔ　５ｔａｔｉｏ ｎ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　Ｎｏ、　１５５５（１９８７）（これ以後ｒ　Ｓｕｍａ ＋ｅｒｓおよびＳａ＋１ｔｈＪとする）に十分記載されている。

タンパク質およびニスコートをコードするＤＮＡ配列をバキュロウィルスゲノム に挿入する前に、上記の成分（プロモーター、リーダー（所望なら）、目的のコ ード配列、および転写終止配列を含む）が、代表的には、中間転移構築物（トラ ンスファーベクター）にアセンブルされる。この構築物は、単一の遺伝子および 作動可能に連結した調節因子、多重の遺伝子（各々が自分自身で作動可能に連結 した調節因子のセットを有する）：または、多重遺伝子（調節因子の同じセット により制御される）を含み得る。中間転移構築物は、しばしばバクテリアのよう な宿主中で安定に維持され得る染色体外因子（例えば、プラスミド）のようなレ プリコン中で維持される。このレプリコンは複製システムを有し、従ってクロー ニングおよび増幅に適切な宿主中で維持され得る。

現在、最も汎用されている、＾ｃＮＰＶに外来遺伝子を導入するためのトランス ファーベクターは、ｐＡｃ３７３である。当業者に公知の他の多くの他のベクタ ーも設計されている。これらは、例えば、ｐＶＬ９８５（ポリヘトリン開始コド ンを＾ＴＧがらＡＴＴに変え、そしてＡＴＴの３２塩基対下流にＢａｍ＋旧クロ ーニング部位を導入する；　ＬｕｃｋｏｖおよびＳｕｎ＋＋ｎｅｒｓ、　ｈ皿旦 ■（１９８９）１７：３１参照）を包含する。

プラスミドはまた、通常ポリへドリンボリアデニル化シグナル（Ｍｉｌｌｅｒら 、＾ｎｎ、　Ｒｅｖ、　１１ｉｃｒｏｂｉｏ１．（１９８８）Ｊ４：１７７）、 ならびにＥ、　ｃｏｌｉ中での選択および繁殖のための原核細胞のアンピシリン 耐性（■）遺伝子および複製起点を含有する。

バキュロウィルストランスファーベクターは通常、バキュロウィルスプロモータ ーを含有する。バキュロウィルスプロモーターは、バキュロウィルスＲＮＡポリ メラーゼに結合し、■ＲＮ＾にコード配列（例えば、構造遺伝子）の下流（５′ から３゛）への転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通 常コード配列の５°末端付近に位置する転写開始領域を有する。この転写開始領 域は代表的にはＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。バキュ ロウィルストランスファーベクターはまた、エンハンサ−と呼ばれる第２のドメ イン（存在するなら、通常、構造遺伝子末端から遠位にある）を有し得る。発現 は、制御されるか、構成的であり得る。

構造遺伝子（ウィルス感染サイクル中の後期に豊富に転写される）は、特に有用 なプロモーター配列を提供する。例としては、ウィルスのポリへドロンタンパク 質をコードする遺伝子（Ｆｒｉｅｓｅｎら、（１９８６）　ｒバキュロウィルス 遺伝子発現の制御」Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ　ｏｆ　Ｂａｃｕ ｌｏｖｉｒｕｓｅｓ（ｆａｌｔｅｒ　Ｄｏｅｒｆｌｅｒ！り　、　ＥＰＯ公開第 １２７．８３９号および第１５５．４７６号）；ならびにｐｉＯタンパク質をコ ードする遺伝子（Ｖｌａｋら、Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、（１９８８）６９ 　ニア６５）由来の配列を含有する。

適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、バキュロウィルスポリヘトリン遺伝 子（（：Ｂｒ１）ｏｎｅｌｌら、Ｇｅｎｅ（１９８８）７３：４０９）のような 分泌された昆虫またはバキュロウィルスタンパク質の遺伝子由来であり得る。あ るいは、哺乳類細胞翻訳後修飾（例えば、シグナルペプチド切断、タンパク質加 水分解切断、およびリン酸化）のシグナルが、昆虫細胞により認識され、分泌お よび核蓄積に必要なシグナルもまた無を椎動物細胞とを椎動物細胞との間で保存 されるようなので、非昆虫起源のリーダーも昆虫での分泌を与えるために用いら れ得る。それは例えば、ヒトα−インター７　エロン（Ｍａｅｄａら、Ｎａｔｕ ｒｅ（１９８５）３１５：５９２）：ヒトガストリンー遊離ペプチド（Ｌｅｂａ ｃｑＪｅｒｈｅｙｄｅｎら、肋ｃ、Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、（１９８８）旦：３ １２９）；ヒト［Ｌ−２（Ｓａ＋ｉｔｈら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’ｌ＾ｃａｄ、　 Ｓｃｉ、　ＬＩＳ＾（１９８５）８２二８４０４）；７ウスＩＬ−３（１！ｉｙ ａｊｉｍａら、Ｇｅｎｅ（１９８７）５８：２７３）；およびヒトグルコセレブ ロシダーゼ（Ｍａｒｔｉｎら、ＤＮＡ（１９８８）７：９９））をコードする遺 伝子由来のリーダーである。

組換えポリペプチドまたはポリタンパク質は、細胞内で発現される場合、通常、 ＡＴＧ開始シグナルの前に適切な翻訳開始シグナルを含有する。所望なら、Ｎ末 端のメチオニンがインビトロでの臭化シアンとのインキュベーションにより成熟 タンパク質から切断され得る。

所望のＤＮＡ配列の挿入後、昆虫細胞宿主は、トランスファーベクターの異種Ｄ ＮＡおよび野生型バキュロウィルスのゲノムＤＮＡと同時形質転換（通常同時ト ランスフェクションにより）される。構築物のプロモーターおよび転写終止配列 は、代表的にはバキュロウィルスゲノムの２〜５ｋｂセクシヨンを含有する。バ キュロウィルス中の所望の部位への異種ＤＮＡの導入方法は、当該技術分野で公 知である。（Ｓｕｍａ＋ｅｒｓおよび５Ｉｎｉｔｈ（前出）；Ｊｕら、（１９８ ７）；　Ｓａ＋ｉｔｈら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、（１９８３）３： ２１５６；ならびにＬｕｃｋｏｖおよびＳｕｍｍｅｒｓ　（１９８９）参照）。

例えば、挿入物が、２重交差相同組換えにより、ポリヘトリン遺伝子のような遺 伝子中に導入され得る；挿入物はまた、所望のバキュロウィルス遺伝子中に加工 された制限酵素部位中にも存在し得る。Ｍｉｌｌｅｒら、虹朋Ｙ旦■（１９８９ ）４：９１ｏＤＮＡ配列は、発現ベクター中のポリヘトリン遺伝子の代わりにク ローン化された場合、５°および３°の両方がポリヘトリン特異配列に隣接し、 そしてポリへドリンプロモーターの下流に位置する。

新たに形成したバキュロウィルス発現ベクターは、続いて感染性の組換えバキュ ロウィルスにパッケージされる。相同組換えは、低い頻度でおこる（約１％と約 ５％との間）；従って、同時トランスフェクション後に産生されたウィルスの大 部分は、まだ野生型ウィルスである。従って、この発現システムは野生型ウィル スから組換えウィルスを区別し得る目視スクリーニングをもたらす。ポリヘトリ ンタンパク質（天然ウィルスにより産生される）は、ウィルス感染後期に感染細 胞の核内に非常に高レベルで産生される。蓄積されたポリヘトリンタンパク質は 、包埋された粒子をも含む封入体を形成する。

これらの封入体（１５μｍまでの大きさ）は高屈折性であり、光学顕微鏡下で容 易に観察される、明るく光沢のある外見をしている。組換えウィルスに感染した 細胞は封入体を欠く。組換えウィルスを野生型ウィルスと区別するために、トラ ンスフェクション上清液を当業者に公知の方法により昆虫細胞の単層にプラーク を形成させた。すなわち、プラークを封入体の存在（野生型ウィルスを示す）ま たは不在（組換えウィルスを示す）について光学顕微鏡下でスクリーニングする 。ｒＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１ｏｇｙＪ第 ２巻（ＡｕｓｕｂｅｌらＭｉ）の１６．８（Ｓｕｐｐ、１０．　１９９０）：　 ＳｕｆｆｌｍｅｒｓおよびＳ＋＋＋１ｔｈ（前出）ＣＭｉｌｌｅｒら、（１９８ ９）。

組換えバキュロウィルス発現ベクターは、いくつかの昆虫細胞中への感染のため に設計された。例えば、組換えバキュロウィルスは以下について開発された：特 に、Ａｅｄｅｓ　ａｅ　ｔｉ。

＾ｕｔｏ　ｒａ　ｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、　肋仙ｒ」阻■、　Ｄｒｏｓ ｏ　ｈｉｌａ　Ｉｎｅｌａｎ邦１匹虹、　Ｓ　ｏｄｏ　ｔｅｒａ　ｆｒｕ　ｉ　 ｅｒｄａ、およびＴｒｉｃｈｏ　１ｕｓｉａ　ｎｌ（ＰＣＴ公開番号ＶＯ８９１ ０４６６９９；　Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、（１９８５）５ｉ ：１５３：　ｆｒｉｇｈｔＳＮａｔｕｒｅ（１９８６）３２１ニア１８；　Ｓｍ １ｔｈら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌＢｉｏ１．　（１９８３）３：２１５６；および 一般的にはＦｒａｓｅｒら、Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｃｅ１１．　Ｄｅｖ、　Ｂｉｏ ｌ、（１９８９）２５；２２５参照）。

細胞および細胞培地が、バキュロウィルス／発現システム中での異種ポリペプチ ドの直接発現および融合発現の両方について市販されている；細胞培養技術は一 般的に当業者に公知である。例えば、Ｓｕｎ＋ａ＋ｅｒｓおよびＳ＋ｎ１ｔｈ（ 前出）参照。

次いで感染昆虫細胞は、組換え産物の発現が可能な適切な栄養培地中で増殖され 得る。産物は、クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ、アフィニティークロマ トグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど）；電気泳動：密度勾配遠心 分離：溶媒抽出などのような方法で精製し得る。適切であれば、必要に応じて、 宿主の残渣（例えば、タンパク質、脂質、および多糖類）が少なくとも実質的に 存在しない生成物を提供するために、培地中へ共に分泌されたまたは昆虫細胞の 溶解物から生じた昆虫タンパク質を実質的に除くために生成物をさらに精製し得 る。

発現を得るために、感染細胞を組換えコード配列を発現し得る条件下でインキュ ベートする。これらの条件は選択した宿主細胞に依存して変化し得る。しかし、 上記条件は当該技術分野で公知である条件に基づいて、当業者に容易に確認され る。

ｌ１１．バ　−１　シスーム バクテリア発現技術は当該技術分野で公知である。バクテリア発現システムは、 バクテリアＲＮＡポリメラーゼに結合し得る任意のＤＮＡ配列であり、１ｎＲＮ ＾へのコード配列（例えば、構造遺伝子）の下流（３°）への転写を開始するバ クテリアプロモーターを含む。プロモーターは、通常コード配列の５°末端付近 に位置する転写開始領域を有する。この転写開始領域は、代表的には、ＲＮＡポ リメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。バクテリアプロモーターはまた 、オペレーターと呼ばれる第２のドメインを有し、それはＲＮ＾合成が始まるＲ ＮＡポリメラーゼ結合部位近傍に重複し得る。遺伝子リプレッサータンパク質が オペレーターに結合し得、それにより、特定の遺伝子の転写を阻害するので、オ ペレーターは、負に制御された（誘導し得る）転写を可能にする。構成的な発現 は、オペレーターのような負の制御因子の不在下でおこり得る。さらに、正の制 御は、もし存在すれば通常ＲＮＡポリメラーゼ結合配列付近（５′）のアクティ ベータータンパク質結合配列により達成され得る。遺伝子アクティベータータン パク質の例は、異化代謝物（ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ）アクティベータータンパク 質（ＣＡＰ）であり、それは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ（Ｅ、ｃｏｌ ｉ）のｌａｃオペロンの転写開始を助ける（Ｒａｉｂａｕｄら、Ａｎｎｕ、　Ｒ ｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、（１９８４）１８：１７３）。それゆえに制御された発現 は、正か負かのどちらかであり、それにより転写を増強するか、転写を抑制する かのどちらかである。

代謝経路酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。実 施例は、ガラクトース、ラクトース（１ａｃ）（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ（ １９７７）出：１０５６）、およびマルトースのような糖代謝酵素由来のプロモ ーター配列を含む。さらなる例は、トリプトファン（」）のような生合成酵素由 来のプロモーター配列を含む（Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃ、＾ａｉｄｓ　Ｒｅｓ 、（１９８０）１１；４０５７；Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎら、Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ 　Ｒｅｓ、（１９８１）９ニア３１；米国特許第４゜７３８、９２１号、ＥＰＯ 公開第０３６７７６号および第１２１７７５号）。ｂ−ラクタマーゼ（当）プロ モーターシステム（Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ　（１９８１）　ｒインターフェロンの クローニングおよびその他のミスティク（■１ｓｔａｋｅ）Ｊ　Ｉｎｔｅｒｆｅ ｒｏｎ　３　（１，Ｇｒｅｓｓｅｒ編））、バクテリオファージλＰＬ（Ｓｈｉ ｍａｔａｋｅら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：１２８）、およびＴ５（米 国特許第４．６８９．４０６号）プロモーターシステムもまた有用なプロモータ ー配列を提供する。

さらに、天然にはない合成プロモーターもまた、バクテリアプロモーターとして 機能する。例えば、１つのバクテリアまたはバクテリオファージプロモーターの 転写活性化配列は、他のバクテリアまたはバクテリオファージプロモーターのオ ペロン配列と繋がり、合成ハイブリッドプロモーターを創造し得る（米国特許第 ４．５５１．４３３号）。例えば、ｔａｃプロモーターは、」プロモーターと匡 オペロン配列（ｌａｃリプレッサーにより制御される）の両方からなるハイブリ ッド」−里プロモーターである（Ａｍａｎｎら、Ｇｅｎｅ（１９８３）２５：１ ６７；　ｄｅ　Ｂｏｅｒら、Ｐｒ。

モーターが、バクテリアＲＮＡポリメラーゼに結合し、転写を開始し得る非バク テリア起源の天然のプロモーターを含み得る。

非バクテリア起源の天然のプロモーターも、和合するＲＮＡポリメラーゼと結合 し、原核生物のいくつかの遺伝子の高レベルの発現を生じ得る。バクテリオファ ージＴ　Ｔ　ＲＮＡポリメラーゼ／プロモーターシステムは、結合プロモーター システムの例である（Ｓｔｕｄｉｅｒら、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、（１９８ ６）１８９：１１３；　Ｔａｂｏｒら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、（１９８５）８２：１０７４）。さらに、ハイブリッドプロモーターはま た、バクテリオファージプロモーターおよびｌ：、ｃｏｌｉオペレーター領域を 含み得る（ＥＰＯ公開第２６７、８５１号）。

機能的プロモーター配列に加えて、有効なリポソーム結合部位もまた、原核生物 中で異種遺伝子の発現に有用である。

）：、ｃｏｌｉ中で、リポソーム結合部位は、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ ＳＤ）配列と呼ばれ、開始コドン（ＡＴＧ）および開始コドンの３〜１１ヌクレ オチド上流に位置する３〜９ヌクレオチド長の配列を含む（Ｓｈｉｎｅら、Ｎａ ｔｕｒｅ（１９７５）２５４：３４）。

ＤＮＡ分子は、細胞内に発現され得る。プロモーター配列は、直接ＤＮＡ分子と 連結し得る。その場合、Ｎ末端の最初アミノ酸は常にメチオニン（、〜ＴＧ開始 コドンによりコードされる）である。

所望な９．　Ｎ末端のメチオニンは、インビトロで臭化シアンとインキュベーシ ョンすることにより、またはインビボまたはインビトロのいずれかでバクテリア のメチオニンＮ末端ペプチダーゼとインキュベーションすることにより、タンノ くり質から切り放され得る（ＥＰＯ公開第２１９．２３７号）。

融合タンパク質は、直接発現の代替となる。代表的には、内在性バクテリアタン パク質または他の安定なタンパク質のＮ末端部分をコードするＤＮＡ配列が、異 種コード配列の５°末端に融合する。発現に際し、この構築物は２つのアミノ酸 配列の融合をもたらす。例えば、バクテリオファージλ遺伝子は、異種遺伝子の ５°末端で連結され、バクテリア内で発現される。得られた融合タンパク質は、 好ましくは異種遺伝子からバクテリオファージタンパク質を切断するためのプロ セッシング酵素（Ｘａ因子）のための部位を保有する（Ｎａｇａｉら、Ｎａｔｕ ｒｅ（１９８４）３０９：８１０）、融合タンパク質はまた、囲遺伝子（Ｊｉａ ら、Ｇｅｎｅ（１９８７）６０：１９７）、江匹遺伝子（Ａｌｌｅｎら、Ｊ、Ｂ ｉｏｔｅｃｈｎ山（１９８７）５：９３；　Ｍａｋｏｆｆら、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉ ｃｒｏｂｉｏｌ、（１９８９）出：１１、およびｑ肛遺伝子（ＥＰＯ公開第３２ ４．６４７号）由来の配列で作られる。２つのアミノ酸配列の接合点でのＤＮＡ 配列が、切断部位をコードし得る、またはし得ない。別の例は、ユビキチン融合 タンパク質である。そのような融合タンパク質は、好ましくは、ユビキチンを異 種タンパク質から切断するためのプロセッシング酵素（例えば、ユビキチン特異 的プロセッシングプロテアーゼ）のための部位を保有するユビキチン領域で作ら れる。この方法により、天然の異種タンパク質が単離され得る（１１ｉＬＬｅｒ ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏ　（１９８９）７：６９８）。

あるいは、異種タンパク質はまた、バクテリア内での異種タンパク質の分泌をも たらすシグナルペプチド配列フラグメントを含む融合タンパク質をコードするキ メラＤＮＡ分子を作成することにより、細胞から分泌され得る（米国特許第４． ３３６．３３６号）。代表的には、シグナル配列フラグメントは、細胞からのタ ンパク質の分泌を指示する疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドをコードする 。タンパク質は、増殖培地中（グラム陽性細菌）か、または細胞の内膜と外膜と の間に位置するペリプラズム空間中（グラム陰性細菌）に分泌される。好ましく は、シグナルペプチドフラグメントと異種遺伝子との間にコードされ、インビボ またはインビトロのいずれかで切断され得るプロセッシング部位がある。

適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、分泌されたバクテリアタンパク質に 関する遺伝子由来であり得る。例えば、Ｅ。

Ｃ０１１外膜タンパク質遺伝子（ｏＭＡ）　（Ｍ　ａ　ｓ　ｕ　ｉら、（１９８ ３）　陰以ｍ膓ｅｎｔａｌ　Ｍａｎｉ　ｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘ 　ｒｅｓｓｉｏｎ；　Ｇｈｒａｙｅｂら、ＥＭＢＯ上（１９８４）旦：２４３７ ）、およびＥ、ｃｏｌｉアルカリフォスファターゼシグナル配列（劇）（Ｏｋａ ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、（１９８５）１３７＋７２ １２）。追加例として、種々のＢａｃｉｌｌｕｓ株由来のα−アミラーゼ遺伝子 のシグナル配列は、Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ由来の異種タンパク質を分泌するの に用いられ得る（ＰａＬｖａら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ（１９８２）７９：５５８２；ＥＰＯ公開第２４ ４．０４２号）。

代表的には、バクテリアにより認識される転写終止配列は、翻訳終止コドンの３ ′側に位置する制御領域であり、従って、プロモーターとともにコード配列に隣 接する。これらの配Ｆ１１は、ａ＋ＲＮＡの転写を指示し、ＤＮＡによりコード されるポリペプチドに翻訳され得る。転写終止配列は、しばしば転写の終止を助 けるステムループ構造を形成し得る約５０ヌクレオチドのＤＮＡ配列を含む。実 施例は、Ｅ、ｃｏｌｉの当遺伝子および他の生合成遺伝子のような強いプロモー ターをもつ遺伝子由来の転写終止配列を含む。

代表的には、上記の成分、プロモーター、シグナル配列（所望なら）、目的のコ ード配列、および転写終止配列を包含し、発現構築物に組み入れられる。発現構 築物は、しばしばバクテリアのような宿主中で安定に維持され得る染色体外因子 （例えばプラスミド）のようなレプリコン中で維持される。レプリコンは、複製 システムを有し、従って発現またはクローニングおよび増幅のいずれかのために 原核生物の宿主中で維持され得る。さらに、レプリコンは、高コピー数プラスミ ドまたは低コピー数プラスミドのいずれかであり得る。高コピー数プラスミドは 、一般的に約５から約２００（代表的には約ｌＯから約１５０）の範囲のコピー 数を有する。高コピー数プラスミドを含む宿主は、好ましくは、少なくとも約１ ０個、そしてさらに好ましくは少なくとも約２０個のプラスミドを含む。高コピ ー数ベクターまたは低コピー数ベクターのいずれかが、ベクターおよび異種タン パク質の宿主への影響に依存して選択され得る。

あるいは、発現構築物は、組み込みベクターでバクテリアゲノムに組み込まれ得 る。組み込みベクターは、代表的には、ベクターを組み込み得るバクテリア染色 体に相同な少なくとも１つの配列を含む。組み込みは、ベクター内の相同ＤＮＡ とバクテリア染色体と間の組換えによることが明らかである。例えば、種々のＢ ａｃｉｌｌｕｓ株由来のＤＮＡで構築される組み込みベクターが、Ｂａｃｉｌｌ ｕｓ染色体に組み込まれる（ＥＰＯ公開第１２７．３２８号）。

組み込みベクターはまた、バクテリオファージまたはトランスポゾン配列を包含 し得る。

一１的には、染色体外および組み込み発現構築物は、形質転換されるバクテリア 株を選択し得る選択的マーカーを含み得る。選択可能なマーカーはバクテリア宿 主で発現され、薬剤（例えば、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロ マイシン、カナマイシン（ネオマイシン）、およびテトラサイクリンなどの）耐 性のバクテリアを与える遺伝子を含み得る（Ｄａｖｉｅｓら、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ 、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、（１９８７）３２：４６９）。選択可能なマーカーは また、生合成遺伝子（例えば、ヒスチジン、トリプトファン、およびロイシン生 合成経路中の遺伝子）を含み得る。

あるいは、上記の成分のいくつかは、形質転換ベクター中に組み入れられ得る。

形質転換ベクターは、上記のように、代表的には、レプリコン中で維持されるか 、または組み込みベクター中で維持される選択可能なマーカーを含む。

発現ベクターおよび形質転換ベクター（染色体外レプリコンまたは組み込みベク ターのいずれか）は、多くのノくクチリアへの形質転換に開発されてきた。例え ば、発現ベクターは、特に、以下のバクテリアについて開発されている：　Ｂａ ｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ、　（Ｐａｌｖａら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ（１９８２）７９：５５８２；　ＥＰＯ公開第０３６． ２５９号および第０６３．９５３号、　ＰＣＴ公開Ｗ０８４１０４５４１）；　 Ｅ、ｃｏｌｉ（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：１２ ８；　Ａｍａｎｎら、Ｇｅｎｅ（１９８５）４０：１８３；　５ｔｕｄｉｅｒら 、Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、（１９８６）出：１１３．　ＥＰＯ公開第０３６． ７７６号、第１３６．８２９号、および第１３６゜９０７号）；　５ｔｒｅｐｔ ｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｒｅｍｏｒｉｓ（Ｐｏｗｅｌｌら、＾　１．　Ｅｎｖｉｒｏ ｎ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、（１９８８）５４：６５５）；　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ ｕｓ　ｌｉｖｉｄａｎｓ（Ｐｏｗｅｌｌら、Ａ　１．　Ｅｎｖｉｒｏｎ、　１１ ｉｃｒｏｂｉｏ１．（１９８８）５４：６５５）；および５ｔｒｅｐｔｏｆｆＩ ｙｃｅｓ　１ｉｖｉｄａｎｓ（米国特許第４．７４５．０５６号）。

バクテリア宿主に外来性のＤＮＡを導入する方法は、当該技術分野で周知であり 、代表的には、ＣａＣ１ｚまたは２価の陽イオンおよびＤＭＳＯのような他の試 薬を用いて処理されたバクテリアの形質転換を含む。ＤＮＡはまた、エレクトロ ポレーションによりバクテリア細胞に導入され得る。形質転換の手法は通常、形 質転換されるバクテリア種により多様である。例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓに関し ては、Ｍａｓｓｏｎら、ＦＩＪＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｌｅｔｔ、（１９８ ９）６０：２７３；　Ｐａ１ｖａら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ＵＳＡ（１９８２）７９：５５８２：ＥＰＯ公開第０３６．２５９号および第０ ６３．９５３号、　ＰＣＴ公開１０８４１０４５４１号；　ＣａｍｐｙＬｏｂａ ｃｔｅｒに関しては、Ｍｉｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、（１９８８）８５：８５６；　ｔａｎｇｏ、　Ｊ、　Ｂａ ｃｔｅｒｉｏｌ、（１９９０）１７２：９４９　；　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａに 関しては、Ｃｏｈｅｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＩＪＳＡ（＋９７３）６９：２１１０；　Ｄｏｗｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉ ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、（１９８８）１６：６１２７；　Ｋｕｓｈｎｅｒ（１ ９７８）　ｒｃｏｌＥｌ−由来プラスミドでＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ を形質転換する改良法ｊ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎ　１ｎｅｅｒｉｎ　：Ｐｒｏｃ ｅｅｄｉｎ　ｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓ　ｍ　ｏｓｉ ｕｍ　ｏｎ　ＧｅｎｅｔｉｃＥｎ　１ｎｅｅｒｉｎ　（）１．Ｌ　Ｂｏｙｅｒお よびＳ、Ｎ１ｃｏｓｉａｌｉ）；　Ｍａｎｄｅｌら、Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、 （１９７０）５３：１５９；　ＴａｋｅｔｏＳＢｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏ　ｈ　ｓ 、＾す、ａ（１９８８）９４９：３１８　；　ＬａｃｔｏｂａｃｉｌＬｕｓに関 しては、Ｃｈａｓｓｙら、ＥＥＭＳ　Ｖｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｌｅｔｔ、　（１ ９８７）１４：１７３　；　Ｐｓｅｕｄｏｇ＋ｏｎａｓに関しては、Ｆｉｅｄｌ ｅｒら、＾ｎａ１．　Ｂｉｏｃｈｅｗ＋、　（１９８８）ＬＺ！！：３８　；　 ５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓに関しては、Ａｕｇｕｓｔｉｎら、ＦＥＭＳ　Ｍ ｉｃｒｏｂｉｏＬ、　Ｌｅｔｔ、（１’Ｊ９０）６６：２０３　；　５ｔｒｅｐ ｔｏｃｏｃｃｕｓに関しては、Ｂａｒａｎｙら、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、（ １９８０）１４４：６９８；　ｆｌａｒｌａｎｄｅｒ（１９８７）　ｒ　ｘレク トロボレーシｇンによる５ｔｒｅ　ｔｏｃｏｃｃｕｓ　Ｌａｃｔｉｓの形質転換 Ｊ　５ｔｒｅ　ｔｏｃｏｃｃａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｊ、　Ｆｅｒｒｅｔｔｉ およびＲ，Ｃｕｒｔｉｓｓ　１１１編）Ｈｐｅｒｒｙら、Ｉｎｆｅｃ。

１ｉｍｕｎ、（１９８１）３２：１２９５：　Ｐｏｗｅｌｌら、＾　Ｌ、Ｅｎｖ ｉｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、（１９８８）５４：６５５；　Ｓｏｍｋｕｔｉ ら、Ｐｒｏｃ、４ｔｈ　Ｅｖｒ、Ｃｏｎ　、Ｂｉｏｔｅ佳皿知釘（１９８７）１ ：４１２を、参照のこと。

■−醪ＪＪＬ現 酵母発現システムも当業者に公知である。酵母プロモーターはそのようなシステ ムで用いられ、酵母ＲＮ＾ポリメラーゼに結合し、ｍＲＮＡへのコード配列（例 えば、構造遺伝子）の下流（３°）方向への転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列 である。プロモーターは、通常、コード配列の５°末端付近に位置する転写開始 領域を有する。この転写開始領域は代表的には、ＲＮ＾ポリメラーゼ結合部位（ 上記ｒＴＡＴＡ　ＢｏｘＪ　）および転写開始部位を含む。

酵母プロモーターもまた、上流アクティベーター配列（ＵＡＳ）（存在するなら 、通常構造遺伝子の遠位にある）と呼ばれる第２のドメインを有し得る。上記Ｕ ＡＳは制御された（誘導し得る）発現を可能にする。構成的な発現はＵＡＳの不 在下でおこる。制御された発現は、正または負であり得、それにより転写を増強 または抑制し得る。

酵母は、活性な代謝経路を有する発酵微生物であり、従って代謝経路の酵素をコ ードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、アルコ ールデヒドロゲナーゼ（＾Ｄｌｌ）（ＥＰＯ公開第２８４．０４４号）、エノラ ーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、グリセルアルデ ヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰまたはＧＡＰＤＨ）、ヘキソキナー ゼ、ホスホフルクトキナーゼ、３−ホスホグリセロリン酸ムターゼ、およびピル ビン酸キナーゼ（ＰＹにＸＥｐｏ公開第３２９．２０３号）を包含する。酵母Ｐ Ｈ０５遺伝子（酸性ホスファターゼをコードする）も、有用なプロモーター配列 を提供する（Ｍｙａｎｏｈａｒａら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、　ｔＪＳＡ（１９８３）８０：ｌ）。

さらに、天然に存在しない合成プロモーターも、酵母プロモーターとして機能す る。例えば、１つの酵母プロモーターのＵＡＳ配列は、他の酵母プロモーターの 転写活性化領域に繋がり、合成ハイブリッドプロモーターを作成し得る。そのよ うなハイブリッドプロモーターの例は、ＧＡＰ転写活性化領域に連結したＡＤＥ Ｉ制御配列を含む（米国特許第４．８７６、１９７号および米国特許第４．８８ ０．７３４号）。ハイブリッドプロモーターの他の例は、ＧＡＰまたはＰＹＫの ような解糖酵素遺伝子の転写活性化領域と結合するＡＤＨ２、ＧＡＬ４、Ｗ」、 またはＰＨ０５遺伝子のいずれかの制御配列からなるプロモーターを含む（ＥＰ Ｏ公開第１６４．５５６号）。

さらに、酵母プロモーターは、酵母ＲＮＡポリメラーゼに結合して転写を開始し 得る非酵母起源の天然のプロモーターを含み得る。そのようなプロモーターの例 は特に、Ｃｏｈｅｎら、Ｐｒｏｃ工Ｎａｔ１．　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ（１ ９８０）７７：１０７８；　）ｌｅｎｉｋｏｆｆら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８１） ２８３：８３５：　ｌｌｏｌｌｅｎｂｅｒｇら、Ｃｕｒｒ、Ｔｏ　ｉｃｓ　Ｍｉ ｃｒｏｂｉｏｌ、１＋ｎ＋ｎｕｎｏ１．（１９８１）９６：１１９；　［１ｏ１ １ｅｎｂｅｒｇら、（１９７９）　ｒ酵母５ａｃｃｈａｒｏｒｎｙｃｅｓ　ｃｅ ｒｅｖｉｓｉａｅ中のバクテリアの抗生物質耐性遺伝子の発現」通」旦１ｊ互」 汀−（団よりユ、」１ヱυ１１四１」リー引世−艶」旦Ｊ３工１−止凹葺憇匹（ Ｋ、Ｎ、　Ｔｉａ＋ｒ＋ｉｓおよびＡ、　Ｐｕｈｌｅｒ編）　；　ｌｌｅｒｃｅ ｒａｕ−Ｐｕｉｇａｌｏｎら、Ｇｅｎｅ（１９８０）１１：１６３；　Ｐａｎｔ ｈｉｅｒら、Ｃｕｒｒ、Ｇｅｎｅｔ、（Ｌ９８０）２：１０９）を含む。

ＤＮＡ分子は、酵母中で細胞内に発現され得る。プロモーター配列は、直接ＤＮ Ａ分子に連結し得る。その場合、組換えタンパク質のＮ末端の最初のアミノ酸は 常にメチオニン（＾ＴＧ開始コドンでコードされる）である。所望なら、Ｎ末端 のメチオニンは、インビトロで臭化シアンとインキュベーションすることにより 、タンパク質から切断され得る。

融合タンパク質は、哺乳動物、バキュロウィルス、およびバクテリア発現システ ムと同様、酵母発現システム用の代替である。代表的には、内因性酵母タンパク 質または他の安定なタンパク質のＮ末端部分をコードするＤＮＡ配列は、異種の コード配列の５°末端に融合される。発現に際し、この構築物は、２つのアミノ 酸配列の融合を提供し得る。例えば、酵母またはヒトのスーパーオキシドジスム ターゼ（Ｓ（１０）遺伝子は、異種遺伝子の５′末端に連結し、酵母で発現され 得る。２つのアミノ酸配列の融合部でのＤＮＡ配列は、切断部位をコードし得、 またはし得ない。例えば、ＥＰＯ公開第１９６．０５６号を参照のこと。

他の例は、ユビキチン融合タンパク質である。そのような融合タンパク質は、好 ましくは、異種タンパクからユビキチンを切断するプロセシング酵素（例えば、 ユビキチン特異的プロセシングプロテアーゼ）のための部位を保有するユビキチ ン領域で作られる。従ってこの方法により、天然の異種タンパク質が単離され得 る（例えば、ＰＣＴ公開１０８８１０２４０６６号参照のこと）。

あるいは、異種タンパク質はまた、異種タンパク質の酵母中での分泌をもたらす リーダー配列フラグメントを含む、融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分 子を作成することに、より、細胞から増殖培地中に分泌され得る。好ましくは、 リーダーフラグメントと異種遺伝子との間にコードされる、インビボまたはイン ビトロのいずれかで切断され得るプロセシング部位がある。リーダー配列フラグ メントは代表的には、細胞からのタンパク質の分泌を指示する疎水性アミノ酸を 含むシグナルペプチドをコードする。

適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、酵母インベルターゼ遺伝子（ＥＰＯ 公開第１２．８７３号；日本国特許公開束６２．０９６．０８６号）およびＡ− 因子遺伝子（米国特許第４．５８８．６８４号）のような分泌される酵母タンパ ク質の遺伝子由来であり得る。あるいは、非酵母起源のリーダー（例えば、イン ターフェロンリーダー）が存在し、酵母中での分泌をもたらす（ＥＰＯ公開第０ ６０．０５７号）。

分泌リーダーの好ましいクラスは、酵母のα−因子遺伝子フラグメントを使用す るリーダーであり、「プレ（ｐｒｅ）Ｊシグナル配列および「プロ（ｐｒｏ）Ｊ 領域の両方を含む。使用され得るα−因子フラグメントのタイプは、全長のプレ ープロα因子リーダー（約８３アミノ酸残基）および短縮型のα−因子リーダー （代表的には、約２５から約５０アミノ酸残基）を含む（米国特許第４．５４６ ．０８３号および米国特許第４．８７０．００８号、ＥＰＯ公開第３２４、２７ ４号）。分泌をもたらすα−因子リーダーフラグメントを用いる別のリーダーは 、第１の酵母のプレ配列で作られるが、第２の酵母のα−因子からのプロ領域を 有する、ハイブリッドα−因子リーダーを含む。例えば、ＰＣＴ公開Ｔｏ　８９ １０２４６３参照。

代表的には、酵母に認識される転写終止配列は、翻訳停止コドンの３゛側に位置 する制御領域であり、従ってプロモーターと共にコード配列に隣接する。これら の配列は、ＤＮＡによりコードされるポリペプチドに翻訳され得るａ＋ＲＮ＾の 転写を指示する。このような配列には、解糖系酵素をコードする配列と会合して 見出される配列が含まれる。

代表的には、上記の成分（プロモーター、リーダー（所望なら）、目的のコード 配列、および転写終止配列を含む）は、発現構築物に組み入れられる。発現構築 は、しばしば酵母またはバクテリアのような宿主中で安定に維持され得る染色体 外因子（例えば、プラスミド）のようなレプリコン中で維持される。レプリコン は、２つの複製システムを有し得る。従って、例えば発現に関しては酵母内で、 そしてクローニングおよび増幅に関しては原核細胞宿主中で維持され得る。その ような酵母−バクチリアシャトルベクターの例は、ＹＥｐ２４（Ｂｏｔｓｔｅｉ ｎら、Ｇｅｎｅ（１９７９）旦：１７−２４；　１）Ｃ１／１（Ｂｒａｋｅら、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ（１９８４）旦：４６４２−４６４６：および、ＹＲｐ１７（Ｓ ｔｉｎｃｈｃｏｃｂら、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、（１９Ｂ２）月劉：１５７ ）を含む。さらに、レプリコンは、高コピー数プラスミドまたは低コピー数プラ スミドのいずれかであり得る。高コピー数プラスミドは、一般に約５から約２０ ０、そして代表的には、約１０から約１５０の範囲のコピー数を有する。高コピ ー数プラスミドを含む宿主は、好ましくは少なくとも約ＩＯ１そしてさらに好ま しくは少なくとも約２０を有する。高コピー数ベクターまたは低コピー数ベクタ ーが、ベクターおよび異種タンパク質の宿主に対する影響に依存して、選択され 得る。例えばＢｒａｋｅら（前出）を参照のこと。

あるいは、発現構築が、組み込みベクターで酵母ゲノム中に組み込まれ得る。組 み込みベクターは、代表的には、ベクターが組み込まれ得る酵母染色体に相同な 少な（とも１つの配列を含み、好ましくは発現構築物に隣接する２つの相同配列 を含む。組み込みは、ベクター中の相同ＤＮＡと酵母染色体との間の組換えによ るようである（Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎシワエ４１工（ １９８３）１０１：２２８−２４５）。組み込ミヘクターハ、ヘクター内に組み 込みに適切な相同配列を選択することにより酵母中の特定の遺伝子座に指向させ 得る。０ｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら、（前出）を参照のこと。１つまたはそれ以上の 発現構築物が組み込まれ得、産生された組換えタンパク質のレベルにおそらく影 響し得る。（Ｒｉｎｅら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ（１ ９８３）８０：６７５０）。ベクター中に含まれる染色体配列は、全ベクターが 組み込まれる結果となるベクター中の単一セグメントとして、あるいは発現構築 物のみを安定に組み込み得る、染色体中の隣接したセグメントに相同で、ベクタ ー中の発現構築物に隣接する２つのセグメントのいずれかであり得る。

代表的には、染色体外および組み込み発現構築物は、形質転換された酵母株を選 択し得る選択可能なマーカーを含み得る。選択可能なマーカーは、酵母宿主中で 発現され得る生合成遺伝子を含み得る。例えば、ＡＤＥ２、刑、」匹、里、およ びＡ　Ｌ　Ｇ　７、ならびに酵母細胞中でツニカマイシンおよび６４１８のそれ ぞれに耐性をもたらすＧ４１８耐性遺伝子。さらに、適切な選択可能なマーカー もまた、金属のような毒性化合物の存在下で増殖する能力を酵母にもたらし得る 。例えば、ｇの存在により、酵母が銅イオンの存在下で増殖し得る（Ｂｕｔｔら 、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｒｅｖ、（１９８７）５１：３５１）。

あるいは、いくつかの上記成分は、形質転換ベクターに組み入れられ得る。形質 転換ベクターは代表的には選択可能なマーカーを含み、上記のようにレプリコン で維持されるか、または組み込みベクターのいずれかに開発される。

発現ベクターおよび形質転換ベクター（染色体外レプリコンまたは組み込みベク ター）が、多くの酵母中への形質転換用に開発されている。例えば、発現ベクタ ーは、特に次の酵母について開発されている：　Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａ ｎｓ（Ｋｕｒｔｚら、Ｍｏ１．　’Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　（１９８６）６２ ：１４２）　；　Ｃａｎｄｉｄａ　ｍａｌｔｏｓａ（Ｋｕｎｚｅら、Ｊ、Ｂａ５ ｉｃ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　（１９８５）２５：１４１）　；　Ｈａｎｓｅｎ ｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（Ｇｌｅｅｓｏｎら、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂ ｉｏｌ、（１９８６）１３２：３４５９）　；　Ｒｏｇｇｅｎｋａａ＋ｐら、Ｍ ｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ（１９８６）２０２：３０２）　；　Ｋｌｕｙｖ ｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｆｒａｇｉｌｉｓ（Ｄａｓら、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　 （１９８４）Ｌｉ！！：１１６５）　；　Ｋ１ｕｙｖｅｒｏｉ＋ｙｃｅｓ　１ａ ｃｔｉｓ（Ｄｅ　Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、（１９ ８３）ｌｊｌニア３７；　ｖａｎｄｅｎ　Ｂｅｒｇら、　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ ｌｏ　（１９９０）旦：１３５）；　Ｐｉｃｈｉａ　ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄ ｉｉ（Ｋｕｎｚｅら、Ｊ、Ｂａ５ｉｃ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、（１９８５）２５ ：１４１）　；　Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｃｒｅｇｇら、Ｍｏ１．　 Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、（１９８５）１：３３７６；米国特許第４．８３７．１ ４８号および米国特許第４．９２９．５５５号）　；　５ａｃｃｈａｒｏａ＋ｙ ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｈｉｎｎｅｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａ ｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ（１９７８）７５：１９２９：　Ｉｔｏら、Ｊ、　Ｂａｃｔ ｅｒｉｏｌ、　（１９８３）１５３：１６３）　；　５ｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａ ｒｏｎｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ（ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓ、ｅＳＮａｔｕｒｅ（ １９８１）３００ニア０６）　：およびＹａｒｒｏｗｉａ　ｌｉｐｏｌｙｔｉｃ ａ（Ｄａｖｉｄｏｗら、Ｃｕｒｒ、　Ｇｅｎｅｔ、　（１９８５）１０：３８０ ４７１　；Ｇａ１ｌｌａｒｄｉｎら、Ｃｕｒｒ、Ｇｅｎｅｔ、（１９８５）１旦 ：４９）。

異種ＤＮＡを酵母宿主に導入する方法は、当該技術分野で周知であり、代表的に は、スフ二口プラストの形質転換または無傷の酵母細胞をアルカリ陽イオンで処 理する形質転換を含む。

形質転換手法は、通常、形質転換される酵母株で多様である。

例えば、Ｃａｎｄｉｄａに関しては、Ｋｕｒｔｚら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂ ｉｏｌ、（１９８６）旦：１４２；　にｕｎｚｅら、Ｊ、Ｂａ５ｉｃ　１ｌｉｃ ｒｏｂｉｏ１．　（１９８５）１１：１４１　；　Ｈａｎｓｅｎｕｌａに関して は、Ｇｌｅｅｓｏｎら、Ｊ、　Ｇｅｎ、　ＭｉｃｒｏｂｉｏＬ、（１９８６）１ ３２：３４５９；　Ｒｏｇｇｅｎｋａｎｐら、Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、 （１９８６）医ｌ：３０２；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｒ＋ｙｃｅｓに関しては、Ｄａｓ ら、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、（１９８４）Ｕ」：１Ｉ６５；　Ｄｅ　Ｌｏｕｖ ｅｎｃｏｕｒｔら、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、５４：１１６５；　Ｖａｎ　ｄｅ ｎ　Ｂｅｒｇら、（１９９０）　Ｂｉｏ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏ　（１９８３）旦： １３５　；　Ｐｉｃｈｉａに関しテハ、Ｃｒｅｇｇら、Ｍａｔ、　Ｃｅ１１．　 Ｂｉｏｌ、（１９８５）５：３３７６；　Ｋｕｎｚｅら、Ｊ、　Ｂａ５ｉｃ　Ｍ ｉｃｒｏｂｉｏｌ、（１９８５）２５：１４１；米国特許第４．８３７．１４８ 号および米国、特許第４．９２９．５５５号；　５ａｃｃｈａｒｏｆｆｌｙｃｅ ｓに関しては、Ｈｉｎｎｅｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ Ａ（１９７Ｂ）７５：１９２９：　Ｉｔｏら、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　（ １９８３）１５３：１６３　；　Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓに関 しては、ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ、　Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）３００ニア ０６　；　Ｙａｒｒｏｗｉａに関しては、Ｄａｖｉｄｏｖら、Ｃｕｒｒ、　Ｇｅ ｎｅｔ、（１９８５）１０：３９；　Ｇａ１Ｌ１ａｒｄｉｎら、Ｃｕｒｒ、　Ｇ ｅｎｅｔ、（１９８５）ＩＱ：４９を参照のこと。

Ｃ０のポ１ぺ　′の 一旦、発現され、そして分泌されると、目的のポリペプチドは、当該技術分野で 公知のいくつかの技術いずれを用いても収集した培地から精製し得る。従来の技 術は、アフィニティークロマトグラフィーおよび免疫沈降法を含む（例えば、Ｗ ｅｉｒおよびｆｌｏｓｓ、　（１９８５）を参照のこと）。例えば、ＣＭＶ　ｇ Ｈは、ネズミモノクローナル抗体ＩＧ６（ＲａｓｌｒＩｕｓｓｅｎら、ＰＮＡＳ （１９８４）８１：８７６８８０）を用いて、免疫沈降法またはアフィニティー カラムクロマトグラフィーのいずれかにより容易に精製し得る。アフィニティー クロマトグラフィーについては、リガンドはセルロース、ポリスチレン、ポリア クリルアミド、架橋デキストラン、ビーズ状アガロース、またはコントロールさ れたボアガラスのような固相支持体に、支持体上の官能基およびリガンド分子上 の官能基（すなわち反応性アミノ酸側鎖）と反応する二官能性の架橋結合剤を用 いて共有結合され得る。５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ　ｏｆ 　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　ＢｉｏｃｈｅｌｌＩｉｓｔｒ　、１巻、２０２頁など（１ ９７８）を参照のこと。得られたリガンドを有する固相は、目的のタンパク質を コードする遺伝子を用いて形質転換された細胞の破砕物または細胞の調製培地と 、還元条件、ｐＨ１イオン強度、温度（代表的には、生理学的な条件）、および 所望のポリペプチドを固定化されたリガンドに結合させ得る滞留時間、を用いて 接触させる。細胞は、超音波処理、溶解、または他の方法により破砕され得る。

固相は、インキュベーション後に破砕物から分離され、緩衝液で洗浄されて残存 する非結合の破砕物を取り除く。このタンパク質は、固相から、水素結合を解離 する溶出液をベッドに通過させることにより溶出される。ｐｏを約３未満に低下 させる塩基または２Ｍを超えるＮａＣ１溶液を通常溶出液に用いる。

モノクローナル抗体を用いる場合、目的のタンパク質に対して惹起した抗体の選 択によりこれらタンパク質が調製され得る。そのタンパク質に対するモノクロー ナル抗体は、最初１：ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、　Ｎａｔｕｒｅ（ １９７５）２５６：４９５−４９７に記載された体細胞融合技術により作られ得 る。この手法は、宿主動物（マウスミエローマが入手しやすいので、代表的には マウス）を目的のタンパク質で免疫することを含む。

抗体産生細胞（例えば、末梢血リンパ球、および肝臓細胞）を免疫宿主から採取 し、分子量２０００から５０００のポリエチレングリコールのような融合剤を含 む液体増殖培地中で適当な腫瘍性融合パートナ−と混合する。融合後、細胞を洗 浄して残り融合培地を取り除き、ＨＡＴ培地のような選択増殖培地（すなわち、 親腫瘍株が感受性である添加物を含む増殖培地）でインキュベーションする。ハ イブリッド細胞のみが、親の非腫瘍性細胞の選択培地での生存培養に至る能力、 および親の腫瘍細胞の選択培地中の不死化生存培養に至る能力を有す。生き残っ たハイブリッド細胞は増殖し得、その培養液はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ） 、細胞培養におけるウィルスの細胞障害効果（ＣＰＥ）の阻害を検出するミクロ 中和アッセイ、または抗ウィルス活性を検出する他のアッセイ（例えば、プラー ク減少）により、適切な抗体の存在をスクリーニングした。陽性の培養物を、標 識した感染細胞抽出物を陽性培養物を用いて免疫沈降すること、そして標識した タンパク質成分の存在について５ＤＳ−ＰＡＧＥにより、この沈澱物を分析する ことにより、所望のタンパク質を認識し、結合する能力についてスクリーニング し得る。そのタンパク質に特異的に結合する抗体を産生ずるハイブリッドを公知 の手法によりサブクローニングし得、インビボまたはインビトロで増殖させ得る 。抗体は、得られた培養培地または体液から、場合によっては、免疫グロブリン を単離する従来の手法により単離され得る。

本発明を行うための特定の実施態様の例を以下に示す。この実施例は、例示目的 のみで提供され、いかなる方法によっても本発明の範囲を限定する意図はない。

（以下余白） ＋１１．！ＬＪｉｉＪ 災１１し２ ＣＭｖＩＩのヌ　し　′　゛　び　ミ　゛ヒトＣＭＶの２種の主要ラボラトリ− 分離株は、＾Ｄ１６９（Ｒａｓ＋ｎｕｓｓｅｎ、Ｌ、ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 ＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ（１９８４）ＬＬ：８７６−８８０）およびＴｏｖｎ ｅ菌株（Ｐａｃｈｌ、　Ｃ，ら、ｈ胆厘■（１９８９）１６９　：４１８−４２ ６）である。いずれの菌株もｇＨをコードし、そしてこれらの糖タンパク質は、 実質的な配列類似性を有し、そして免疫学的に交差反応性である。ＣＭＶの他の 菌株は、ｇＨ配列の供給源として容易に用いられ得る。

Ｔｏｖｎｅ菌株のＣＭＶゲノムの３９１０　ｂｐ　Ｈｉｎｄｌｌｌ　〜Ｐｓｔｌ フラグメントは、２２２６　ｂｐのｇＨオープンリーディングフレームを有し、 そノ同定および単離は、Ｐａｃｈｌ、　Ｃ，、ら、■匹旦■（１９８９）■：　 ４１８−４２６に記載されており、そして図１および図２に示す。ｇＨ配列は、 ７４２アミノ酸（８４，３ｋＤ）であり、モして膜糖タンパク質の特徴を有して いる。

ヒトＣ１１Ｖ　ｇＨの免疫学的に等価なフラグメント、例えば、＾Ｄ１６９また はＴｏｗｎｅ菌株に由来するものは、ポリヌクレオチド配列の３°および／また は５°端部で短縮型タンパク質、モして／あるいは１個またはそれ以上の内部欠 損を有するタンｄり質をコードするポリヌクレオチド配列のアナログを作製し、 そしてこのアナログポリヌクレオチド配列を発現させ、そして得られるフラグメ ントが免疫学的にＣＭＶ抗体と反応するかまたはインビボでそのような抗体、特 に中和抗体の産生を誘導するかどうかを測定することにより同定され得る。例え ば、１３アミノ酸の疎水性ペプチド（残基Ｍｅｔｓａｏから＾１ａｊｉｚ）内で の欠損またはそれを含む欠損によって、ｇＨの分泌が促進され得る。

同様に、Ｃ末端トランスメンブレンおよび内部領域由来の３４個の残基（７０９ −７４２）内での欠損またはそれを含む欠損によって、分泌が促進され得る。最 後の２２および２３個のＣ末端残基の欠損について、以下、実施例で説明する。

これらのフラグメントは、それぞれ、推定ｇＨトランスメンブレンドメインの最 初の２アミノ酸または３アミノ酸のいずれかを保持する。

実ＪＬ汎」− １シスームこ・１　−　ヒ　Ｊの　ローニンこの実施例のために、ヒト０滅ｖウ イルスを、ダルベツコの改変イーグル（ＤＭＥ）培地（Ｇｉｂｃｏ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｉｅｓ、　Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ。

Ｎ、　Ｙ、　）で培養した、ヒト包皮線維芽（ＯＦ）細胞で増殖させた。これは ５ｐａｅｔｅおよびＭｏｃａｒｓｋｉ、　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、（１９８５）５６： １３５−１４３に記載されているが、培地には１０％のウシ胎児血清（Ｆｅ３） を追加した。ＣＯ３７細胞を、）ＩＦ細胞について記載されたと同様の培地で増 殖した。

プラスミドｐＲＬ１０８ａ（ＬａＦｅｍｉｎａおよび＋１ａｙｖａｒｄ（１９８ ０）のＡｎｉｍａｌ　Ｖｉｒｕｓ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　（Ｂ、　Ｎ、　Ｆｉｅｌ ｄｓ、　Ｒ，Ｊａｅｎｉｓｃｈ、およびＣ２Ｆ、　Ｆｏｘｌｉ）第２８巻、ｐｐ 、　３９−５５、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）は、プ ラスミドｐＢＲ３２２内にクローニングしたＣＭＶ（Ｔｏｖｎｅ）のＨｌｎｄｌ ｌｌ　Ｈフラグメントをコードする。ｇＨ遺伝子を、ＣＭＶ（Ｔｏｖｎｅ）Ｂｉ ｎｄｌｌｌ　Ｈフラグメント（ｐＲＬ１０８ａ）から、サブクローニングして５ ．１５ｋｂ　ＥｃｏＲＩ−Ｎｃｏｌフラグメントを得、そしてプラスミドｐＧＥ Ｍ２（Ｐｒｏｍｅｇａ、　Ｍａｄｉｓｏｎ、　Ｗｌ）内に挿入してプラスミドｐ ＸｇＨ５を生成させた。プラスミドｐＸｇｌ１５からｇＨ遺伝子をコードする２ ５７７　ｂｐ　５ｎａｌ−Ｔｔｈｌｌｌｌ　（部分的）フラグメントを単離して 、発現プラスミドｐｓＶｇｉ１２を構築した。このフラグメントを、Ｋ１ｅｎｏ ｗフラグメントで処理してプラントエンドとし、そして５ｖ４０ベースの発現プ ラスミドｐｓＶ７ｄ（Ｔｒｕｅｔｔｅら、ＤＮＡ（１９８Ｂ）４：３３３−３４ ９）のＳａｇａ　１部位内に連結して、プラスミドｐｓＶｇＨ２を生成させた。

ｇＨのＣ末端から最後の２２アミノ酸を削除することにより、ｇＨのトランスメ ンブレン領域のほとんどが欠損したｇＨ遺伝子を含む、短縮型ｇＨをコードする 発現プラスミドを構築した。

これらの構築物は、ｇＨトランスメンブレンドメインの最初の３アミノ酸（Ｌｅ ＬＩｙ＋ａ−Ｌｅｕｙ＋ｅ−Ｍｅｔｙ２ｏ）を保持している。コれら（７ＢＩＩ Ｊｉ物ノウチＩ）　２　ツ（ｐｓＶｇＨ６ａおよびｐｓＶｇＨ６ｂ）ｌ；！、ｇ Ｈノ３°末端部のポリリンカー配列が互いに異なる。ｐｓＶｇＨ６ａでは、付加 的なＩＯアミノ酸が、ポリリンカー領域でコードされ、３′からＭｅｔｙｚｏ　 （Ｇ１ｙｔｚ＋−３ｅｒｔｚｔ−Ａｒｇｙｔｘ−Ｇ１ｙｔ＊４−３ｅｒｙｔａ− Ｖａｌｔ＊ａ−ＡＳｐｔｔｔ−ＬｅＬＩｔｚａ４Ｓｐｔｔ＠−ＬｙＳｖｓｏ）で あり、そしてｐｓＶｇＨ６ｂでは、付加的な６アミノ酸がポリリンカーでコード され（Ｌｅｕｔ。−Ｇｌｕｔ□２−ＡＳｐｔｙｓ−ＰｒＯｙｔ４−３ｅｒｙｚｓ −Ｔｈｒ７２＠）である。プラスミドｐｓＶｇＨ６ａおよびｐｓＶｇＨ６ｂは、 ｐｓｖｇｕｚから２２６２　ｂｐ　ＥｃｏＲＩプラスＢｓｐｈｌ（部分的）フラ グメントを単離して構築した。次いで、このフラグメントを、ＥｃｏＲＩプラス ５ｒｎａ　Ｉ切断ｐｓＶ７ｄ　（ｐｓＶｇＨ６ａ用）またはＥｃｏＲｌプラスＸ ｂａｌ切断ｐｓＶ７ｄ　（ｐＳ’／ｇＨＢｂ用）に連結した。上記の短縮型ｇＨ 遺伝子を有する第３のプラスミドであるｐＣＭＡｄｇＨ６（図２、＾ＴＣＣ寄託 番号６９３０５）　ｉ；！、プラスミドｐｓＶｇｌ１６ｂ由来の２７７５　ｂｐ 　ＥｃｏＲＩ−３ａｌｌ　ｇｔ１７ラグメントをプラスミドｐｃＭＶＡｄｈｆｒ の５ａｌｌ部位にクローニングすることにより構築した（Ｓｐａｅｔｅら、Ｊ、 　Ｖｉｒｏｌ、　（１９９０）６４　：　２９２２−２９３１）。このｇＨフラ グメントは、トランスメンブレンおよび細胞質領域はないが（上記のように、ｐ ｓＶｇＨ６ｂのポリリンカーによりコードされた６個の追加のアミノ酸を含む） 、２２アミノ酸Ｃ末端短縮型ｇ１１をコードし、そして選択可能なｄｈｆｒ遺伝 子を含む。

プラスミドｐＣＭＡｄｇ＋Ｉ６を用いて、上記のように、チャイニーズハムスタ ー卵巣（ＣＯＯ）細胞株１７１をトランスフェクトした（Ｓｐａｅｔｅら、Ｐｒ ｏ　ｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｃｔｏｎｅ　ａｌｏｖｉｒｕｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ（１１ ，Ｐ、ＬａｎｄｉｎｉＪ、１９９Ｌ　ｐｐ、１３３−１３６）。簡潔には、ＣＩ Ｏ細胞株１７１は、ｐＣＭＡｄｇＨ６でトランスフェクトした親株ＣＲ−７の０ ．１μＭメトトレキセート増幅誘導体である。トランスフェクトした細胞由来の 培地を、標準的ＥＬＩＳ＾により分析して陽性クローンをスクリーニングした。

細胞株１７１の増殖により馴化した培地のＲＩＰ分析によれば、短縮型ｇ［（に 対しては陽性ではなかった。

Ｋ五勇ユ バ　ロ　イルスジステムに゛（る６　ヒ　Ｊの　口二二之ｌ 完全長ｇ）ｌ（ｇＨ２）をコードするバキュロウィルス−ｇＨトランスファーベ クターを、以下のように調製した。バキュロウィルスベクターｐＡｃ３７３（Ｓ ｆｆｌｉｔｈら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（１９８５） ８２：８４０４−８４０８）を、Ｂａｒｎ旧を用いて切断し、そしてプラスミド ｐｓｖｇｏｚ　（実施例２に記載）の２４９５　ｂｐ　Ｎｏｔｌ　〜Ｘｂａｌ　 ｇＨ７ラグメントを、このＢａｍ旧部位に充填しそして連結した。得られたプラ スミドである、目的のｐＡｃｇＨ２（図３を参照）は、ｇＨ構築物をコードし、 ここでは、転写はバキュロウィルスのポリヘトリン遺伝子プロモーターにより駆 動する。このＤＮＡプラスミドヲ野生型バキュロウィルスＤＮＡと混合し、混合 物を５ｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９細胞）から誘導した 細胞にトランスフェクトし、そして組換えプラークを単離し、そしてプラークを 精製した。数個の組換えウィルスクローンを用いて細胞を感染させ、感染後４〜 ６日目に細胞溶解物および馴化培地を、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロッティ ング法により分析した。完全長ｇＨ（ｐＡｃｇＨ２）の細胞外発現は、検出され なかった。

ｐＡＣｇＨ２を含む組換えバキュロウィルスに感染したＳｆ９細胞におけるｇＨ の細胞外発現をまた、モノクローナルＩＧ６またはヒト血清を用いる放射免疫沈 降法（ＲＩＰ）により分析した。ｇｏ特異的なバンドは、バキュロウィルス−ｐ ＡｃｇＨ２（完全長ｇＨ）培地のＲＩＰからは検出されず、このことにより細胞 外発現が達成されなかったことが示された。

完全長ｇＨが細胞内で発現したかどうかを試験するために、Ｓｆ９細胞を１１１ ０１５で、ｇＨ２（完全長ｇ＋１）で感染させた。感染後５日目に、この細胞を 、ｇＨに対するモノクローナル抗体を、１吹拭体として染色した。細胞をヤギＦ （ａｂ’　）’抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ複合体と共にインキュベートし、パラ ホルムアルデヒドで処理し、そしてコールタ−ＥＰＩＣ３−Ｃフロー血球計算器 で、細胞表面におけるｇＨ発現について分析した。陽性コントロールとして、細 胞を短縮型ｇＨ（以下に記載）で感染させ、パラホルムアルデヒドで固定し、そ して細胞内ｇｅ１発現を可視化するために、１吹拭体処理の前に、界面活性剤で 透過性とした。細胞内染色が、完全長および短縮型ｇ）ｌの両方で観察された。

このように、完全長ｇＨおよび短縮型ｇＨは、細胞内で発現される。

大ＪＬ医」− バ　ロウイルスシスームに′番　−ヒ　ＣＭｖＨの　ロ二ｊニ乙グ ｇｌ（のフラグメントをコードし、Ｃ末端ドメインのないバキュロウィルス−ｇ ｔｌ）ランスファーベクターを調製した。バキ、０ウイルスベクターｐＡｃ３７ ３（Ｓａ＋ｉｔｈら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ。

Ｓｃｉ、　（１９８５）８２：８４０４−８４０８）を、Ｂａｍ旧を用いて切断 し、そしてｐｃ１１６−Ｈ６由来の２１７８　ｂｐ　Ｎｏｔｌ　〜５ａｌｌフラ グメントを、このＢａｍ旧部位内に充填しそして連結した。ｐＣＭ６−〇６は、 ｐｓｖｇｎ６ｂ由来のＥｃｏＲＩ／５ａｉｌ　ｇＨフラグメント（実施例２に記 載）を哺乳類細胞発現ベクターｐ（ＪＶ６ｃのＥｃｏＲＩ／５ａｉｌ切断部位に 連結することにより構築されたものである（Ｃｈａｐｍａｎら、Ｎｕｃ、＾ｃｉ ｄｓ　Ｒｅｓ。

（１９９１）１９：３９７９−３９８６）。得られたプラスミドは、ｐＡｃｇＨ ６（＾ＴＣＣ寄託番号６８３７３、図４を参照）と命名したが、ｇｌ（構築物を コードし、ここでは、転写はバキュロウィルスのポリヘトリン遺伝子プロモータ ーにより駆動する。この短縮型ｇＨ上セグメントは、はとんどのｇｔｌのトラン スメンブレン領域が、ｇＨのＣ末端から最後の２３アミノ酸を削除することによ り欠損されて０た。このフラグメントは、ｇＨ）ランスメンブレン領域の最初の ２アミノ酸（Ｌｅｕｙ＋５−Ｌｅｕｙ＋＊、図１）のみを保持してＩｌ）る。

このプラスミドを野生型バキュロウィルスのＤＮＡと混合し、５ｐｏｄｏｐｔｅ ｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞に同時にトランスフェクトし、組換えプラーク を単離し、そしてプラークを精製した。数個の組換えウィルスクローンを用いて 細胞を感染させ、感染後４〜６日目に細胞溶解物および馴化培地を、ＥＬＩＳＡ およびウェスタンブロッティング法により分析しｔこ。

ｐＡＣｇＨ６を含む全てのクローンをＥＬＩＳ＾分析して、培養培地でｇＨ反応 性が示され、このことにより、このシステムで１よ、短縮型ｇＨは細胞外で発現 されることが示された。細胞溶解物のＥＬＩＳＡ分析では、短縮型ｇＨの細胞内 存在は検出されな力飄ったが、ＲＩＰ分析は短縮型ｇＨに対して陽性であり、こ のことにより、短縮型ｇｌ（は、少ないが検出可能な量細胞内に存在すること力 く示された。

支五五１ ＦＧＦレセプ　−の　ローニン　゛　び　・客Ａ、オリゴヌ　レオチドム オリゴヌクレオチドアダプター、プローブ、および配列決定用プライマーを、Ａ ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｎｓ（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡ）モデ ル３８０＾および３８０Ｂ合成装置を用いてホスホアミダイト法により合成し、 ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製し、そして５ＥＰ−ＰＡＫ　Ｃ，ａ カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ、　Ｍｉｌｆｏｒｄ、　Ｍ＾）で脱塩した。ｃＤＮ ＾ライブラリーをスクリーニングするために用いたオリゴヌクレオチドプローブ は、発表されているｆ１ｇ核酸配列のヌクレオチドｌ−３０（５Ｉ−ＡＴＭＣＧ ＧＡＣＣＴｗｒＧＴｌ−３０（５Ｉ−ＡＴ′ｒゴー−３°）　およびヌクレオチ ド１８４０−１８６９　＋５’−ＧＣＧＧＣＧＴＴｒＧＡＧＴ−ＣＣＧＣＣＡＴ ＴＧＧＣＡＡＧＣＴＧ−３’　ｌ　に対して相補的であった（Ｒｕｔａら、籟並 肚匣（ｉ９ＢＢ）３：９−１５）。ＦＧＦレセプター（ｆ１ｇ５）ｃＤＮＡの細 胞外領域を増幅するために用いた２つのＰＣＲプライマーは、リポソーム結合部 位およびｆ１ｇ５のアミノ酸１〜６を含むセンスプライマーであるＰ　４　（Ｓ 　−ＣＣＡＡＣＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＡＣＴＧＧＧＡＴＧＴＧＧＡＧご園 鮎ＧＴ−ＧＣ−３’）、および、ｆ１ｇ５のアミノ酸３６９−３７４を含みそし て停止コドンが直接結合したアンチセンスプライマーであるＰ３（５Ｉ−ＧＴＭ ＧＣＧＧＣＣＧＣＧ　ＧＡＴＣＣＴＴＡＣＴＡＣＴＣＣＡＧＧＴＡＣＡＧＧＧＧ ＣＧＡ−３’　）からな９ていた。いずれのプライマーもＢａｍ旧部位を含み、 ｐＡｃ３７３内へのクローニングを促進する。２つのさらなるＰＣＲプライマー を用いて、種々の組織の２つおよび３つの免疫グロブリン様ドメインＦＧＦレセ プターを同定した。これらは、ｆ１ｇ５のアミノ酸１４−２１をコードするセン スプライ７−ＰＩ（５°−ＣＣＡＴＴｒＧ−ＧＡＴＣＣＧＴＣＡＣＡＧＣＣＡＣ ＡＣＴＣＴＧＣＡＣＣＧＣＴ　−３’　ｌ、および、ｆ１ｇ５のアミノ酸１５４ −１６１の相補体をコードするアンチセンスプライマーＰ２（（５’　−ＣＣＡ ＴＴｒＧＴＣＧＡＣＴｒＣＣＡＴＣＴｒ’ｒＴＣＴＧＧＧＧＡＴＧＴＣＣＡ−３ ’　）　テアッた。これらのプライマーは、Ｂａ１Ｉｌｌｌおよび５ａ１１部位 を含み、Ｖ１３配列決定用プラスミド内へのクローニングを促進する。

ＲＮ八を、グアニジンチオシアネート法により単離したが（Ｊ。

Ｍ、　Ｃｈｉｒｇｖｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅａ＋、　（１９７９）１８：５２９４ −５２９９）、修正を加えた（Ｇ、Ｊ、Ｆｒｅｅ＋＋＋ａｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａ ｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）（１９８３）８０：４０９４−４０９８）。

ポリ（Ａ）”ＲＮ八を、オリゴ（ｄＴ）セルロースでの１回の分画により精製し た（Ｈ，ＡｖｉｖおよびＰ、　Ｌｅｄｅｒ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ 、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）（１９７２）６９：１４０８−１４１２）。λＺＡＰ中のＨ ｅｐ　Ｇ２ライブラリーの構築およびスクリーニングは、記載されている（Ｚａ ｐｆら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、（１９９０）２６５：１４８９２−１４ ８９８）。プローブを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび［γ−”Ｐ］−Ａ ＴＰを用いて標識し、比活性１〜２×１ＯａＣｐｒｎ／Ｉｎｇとした（Ｓａｃｂ ｒｏｏｋら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：＾Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒ　１ｊａｎｕａｌ、第２版（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｆｌａｒ’ｂｏ ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ ）。

Ｈｅｐ　Ｇ２　ｃＤＮ＾ＤＮＡラリーからの約６００．０００の組換えファージ を２枚のニドｏセルロースフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、　ＨＡＴＦ　１３ ７）上で、２つの１１ｇオリゴヌクレオチドプローブを用いてスクリーニングし た。次いで、両方のプローブにハイブリダイズしたプラークの領域を精製した。

Ｃ，プラスミドの　サブ　ローニン　′　び定 推定ｆｉｇ　ｃＤＮ＾ＤＮＡ−トを含むブルースクリプト５Ｋ（−）プラスミド を、供給業者（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によって記載されたＭ１３救助プラスミ ドＤＮＡを、アルカリ溶解法により単離した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９ ）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、Ｃ１ｏｎｉｎ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔａｒ　Ｍａｎｕ ａｌ、　第２版（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ。

ＮＹ））。推定ｆｉｇ配列を含むｃＤＮ＾ＤＮＡ−トを、ＢｇｉｌｌまたはＥｃ ｏＲＩ切断により、ブルースクリプト５Ｋ（−）ベクターから切り出し、そして アガロースゲル電気泳動法により分画した。インサートをゲルから切り出し、モ してｌＯａ＋Ｍのトリス−塩酸（ｐＨ７゜５）、１ａ＋ＭのＥＤＴ＾（ＴＥ）中 で緩やかに振とうしながら１６時間静かに（ｐａｓｓｉｖｅＬｙ）溶出し、ｅｌ ｕｔｉｐ−Ｄカラム（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ）で精製 し、そしてＭ１３配列決定ベクター内にサブクローニングした（Ｙａｎｉｓｃｈ −Ｐｅｒｒｏｎら、Ｇｅｎｅ（１９８５）３３二１０３−１１９）。ｐｃＲ増幅 ＤＮＡを、同様に精製した。ＤＮＡ配列決定を、旧３プライマーおよび特異的内 部プライマーを用いて、ジデオキシチェーンターミネーションにより行った（Ｓ ａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪＳ＾（１９ ７７）７４：５４６３−５４６７）。不明瞭な領域を、７−ジアザ−２′〜デオ キシグアノシン−５°−３リン酸ＣＢａｒｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｉｑｕｅｓ（１ ９８６）４　：４２８−４３２）および５ｅｑｕｅｎａｓｅ（ＵＳ　Ｂｉｏｃｈ ｅｍｉｃａｌｓ）を用いて解明した。

ｃＤ　Ｎ　、４にコードされた完全長ＦＧＦレセプターを単離するために、λＺ ＡＰ−ヒト肝癌細胞株（Ｈｅｐ　Ｇ２）　ｃＤＮＡライブラリー由来の６゜Ｏ， ０００の組換え体を、部分的ｆｉｇ　ｃＤＮＡの５°−および３′一端部由来の オリゴヌクレオチドプローブでスクリーニングした（Ｒｕｔａら、部組■匹（１ ９８８）　３　：　９−１５　）。両方のプローブにハイブリダイズする６個の クローンを同定した。ｃＤＮＡインサートのＢｇｌｌ＋制限エンドヌクレアーゼ 切断およびゲル分析により、６個のクローンのうち３個は、完全なコード化配列 を含むことが示唆された。１．６．１．１，０．６、および０．５５Ｋｂの４つ のＢｇｌｌ＋フラグメントならびに２．７および１．２にｂの２つのＥｃｏＲＩ フラグメントを、最長のｃＤＮ＾ＤＮＡンであるｆｌｇｓにおいて同定したく図 ５）。ＢｇｉｌｌおよびＥｃｏＲ１部位はｃＤＮＡライブラリーの作成に用いた フランキングアダプター中にもまた存在した。ｆｌｇｓ　ｃＤＮＡのＢｇｌｌ［ およびＥｃｏＲ１フラグメントを単離し、Ｍ１３　ｍｐ１９内にクローニングし 、そして配列決定した。詳細な配列決定方法を図５に示す。ｆ１ｇ５ｃＤＮ＾は 、８２０アミノ酸のタンパク質をコードし、そして５゛−および３゛−未翻訳領 域の６７１および７５３ヌクレオチドにそれぞれ隣接（ｆｌａｎｋ）する。コー ドされたタンパク質により、シグナルペプチド、３つの細胞外免疫グロブリン様 ドメイン、酸性アミノ酸に富んだ領域、トランスメンブレンドメイン、および分 裂細胞内チロシンキナーゼドメインを含む構造が明らかになった。これらのドメ インは、以前、ニワトリ（Ｌｅｅら、５ｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４５：５７ −６０）、マウス（Ｒｅｉｄら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　ＡＣａｄ、　Ｓｃｉ 、　ＵＳＡ（１９９０）８７：１５９６−１６００）で同定され、そして最も最 近では、数種のヒトＦＧＦレセプターが、ｃＤＮ＾ＤＮＡら推定された（Ｉｓａ ｃｃｈｉら、Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、（１９９０）１８：１９０６；Ｊｏ ｈｎｓｏｎら、１ｄｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、（１９９０）１０：４７２ ８−４７３６）。コードされたレセプターはまた、細胞外領域に８つの、そして 細胞質チロシンキナーゼドメインに１つのコンセンサスＮ結合グリコジル化部位 を含む。

ｆｌｇｓ　ｃＤＮＡによりコードされたアミノ酸配列を図６（上列）に示す。比 較のために、５つの他のすでに同定されたヒトＦＧＦレセプターを示しくｌ５ａ ｃｃｈｉら、前出ＨＪｏｈｎｓｏｎら・前出）・そして最大のアミノ酸配列の同 一性を示すように並べである。

ＰＣＲプライマーに対応する領域と同様に、同定された構造ドメインを、ｆ１ｇ ５配列の上に示しである。Ａｌａｚ＋の後ろの、推定シグナルペプチダーゼ開裂 部位（ｖｏｎ　）Ｉｅｉｊｎｅ、　Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

（１９８６）Ｌ４：４６８３−４６９０）を（↓）で示す。アミノ酸の変化また は欠損を四角で囲っである。６つのＦＧＦレセプター間の、３つの最も顕著な差 異は、以下の通りである・１）ＦＧＦレセプター３−６（ａａｘ＋−＋＋・）の Ｎ末端付近の大きな欠損、これは、完全な第１免疫グロブリン様ドメインの全体 に及ぶ；　ｉｉ）レセプター５および６の短縮型、これらのレセプターのカルボ キシル末端アミノ酸（それぞれａａｉｘ＋−５ｏｏおよびａａ＊２ｓ−ｓａｔ） において他のＦＧＦレセプターと異なり、トランスメンブレンおよび細胞質ドメ インが結果的に欠損している：および１ｉｉ）ＦＧＦレセプター１．３、および ５のアミノ酸１４８および１４９の欠損。ＦＧＦレセプター−３（ａａ　＋。１ ）およびＦＧＦレセプター−２（ａａｔ＋））における差異も、注目される。部 分的ｆ１ｇ配列は示されていないが、ＦＧＦレセブター−■の１９８位に対応す るＮ末端アミノ酸を有する。従って、この部分的ｆｉｇ配列は、ＦＧＦレセプタ ー１．２．３、または４のｃＤＮ＾によりコードされ得る。しかし、ｆ１ｇ配列 は、チロシンキナーゼドメインａａ＠ｔｏ−ｅｔａにおいて、ＦＧＦレセプター １４と異なることに注意することは重要である。この差異は、この領域を挟む３ 個の核酸の欠失により限定フレームシフトを起こしたことによる。

Ｄ、肌」１ ＰＣＲキットの供給業者（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）の指示に従 って、増幅反応を行った。ＰＣＲプライマーおよびテンプレートは、それぞれ最 終濃度１＋ｎｌｌおよび０．１〜０．５％ｇ＃＋Ｌであった。ｆ１ｇ５をコード するｃＤＮ＾をテンプレートＤＮＡとして用いて、ｐＡｃ３７３にＥＣ−ＦＧＦ レセプターを構築した。発現研究のために、上記の方法（Ｚａｐｆら、前出）で 、ｍＲＮＡからテンプレートＤＮＡを逆転写した。

Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｎｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　ＤＮ＾サーマルサイクル装置を用いて 、３０サイクルのＰＣＲ反応を行った。各サイクルは、９４℃、１分の変性工程 ；５５°Ｃ１２分のア二一リング工程；および７２℃、３分の延伸工程からなっ ていた。最終サイクルの延伸工程は、７分であった。

Ｅ、　−ＥＣ−ＦＧＦレセプ　−ウイルスのＦＧＦレセプターの細胞外ドメイン をコードするＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントを、Ｂａｍ旧で切断し、ゲル精製し 、そしてＢａＩｎ旧で切断して仔つシ腸ホスポターゼで処理したｐＡｃ３７３に 連結した。

組換えプラスミドを、制限エンドヌクレアーゼ切断し、アガロースゲル電気泳動 にかけて、ＥＣ−ＦＧＦレセプターｃＤＮＡが正しい方向に挿入されたかどうか を分析した。

組換えプラスミドを、リン酸カルシウムトランスフェクション法（Ｓｕｍｉｅｒ ｓおよびＳ＋ｎ１ｔｈ、前出）を用いて、野生型ＡｃＭＮＰＶウィルス性ＤＮＡ とともに、Ｓｆ９細胞にコトランスフェクトした。

組換えウィルスを、置換合成法によりｊｔｐ標識したｆ１ｇ５　ｃＤＮ＾とハイ ブリダイズさせて、第１回目のプラークスクリーニングで同定した（Ｓａｍｂｒ ｏｏｋら、前出）。次いで、さらに２回の封入体（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）陰性フ ェノタイプについて視覚的スクリーニングにより、組換えウィルスを精製した。

ＰＣＲ増幅したｆ１ｇ５　ｃＤＮ＾のアミノ酸１−３７４をコードするＤＮＡを 、バキュロウィルストランスファーベクターｐＡｃ３７３のＢａｒｎ旧部位に連 結することにより、ＥＣ−ＦＧＦレセプターを発現する組換えバキュロウィルス を構築した。ＰＣＲプライマーは、ＢａＩＩ旧部位を含み、クローニングを促進 した。さらに、５°センスプライマー（Ｐ４）は、開始コドンのすぐ上流に、ｆ １ｇ５　ｃＤＮＡ配列の−１〜−５ヌクレオチドを含んでいるが、それはリポソ ーム結合部位と推定される（Ｋｏｚａｋ、　Ｍ、、　Ｎｕｃ、　＾ｃｉｄｓ　Ｒ ｅｓ、（１９８４）ｄ二８５７−８７２３９）。３゛−アンチセンスプライマー （Ｐ３）は、アミノ酸３７４の直後に２つの停止コドンＴＡＧおよびＴＡＡを含 んでいた。リン酸カルシウム法（Ｓｕｆｆｌｍｅｒｓおよび５ＩＩＩｉｔｈ、前 出）による、Ｓｆ９細胞の＾ｃＭＮＰＶウィルス性ＤＮＡオヨび組換１１１Ｗｉ 物（ｐＡＣ３７３−ＥＣ−ＦＧＦ　Ｌ／　セブター）とのコトランスフエクシコ ンにより、組換えバキュロウィルスを生成させ、次いで、これをプラークハイブ リダイゼーションおよび視覚的スクリーニングにより精製した。

実ＪＬ外」− ＦＧＦレセプ　−　ム　・・七　′　び　−セＡ、・　レセプ　−　・・セイ ＥＣ−ＦＧＦレセプターが、レセプターへの放射性ヨウ素化塩基性ＦＧＦの結合 に及ぼす影響を、当該分野で記載された放射性レセプターアッセイを用いて調べ た。簡潔に述べると、ベビーハムスター腎細胞を、５％のウシ血清および抗生物 質を添加したへペス（Ｈｅｐｅｓ）（２５＋ｎＭ）！衝化ＤＭＥＭ中に保存し、 モして２４ウエルデイシユで一面に生育する位まで増殖した。この細胞を、リン 酸緩衝化生理食塩水で２度洗浄し、そして０．１％のゼラチンを含有する３００ μＬのＤＭＥＭ中で、所定のペプチド濃度および１　ｎｇ（１００，０００ｃｐ ｍ）の標識した塩基性ＦＧＦと共に、３時間４℃でインキュベートした。培地を 吸引し、そして細胞を０．５＋ｏＬのＰＢＳで２回、および、２ＭのＮａＣ１を 含有するＰＢＳ　０．５ｉＩＬで２回洗浄した。アフィニティーの高いレセプタ ーに結合した＋ｔ＠ｒ−ＦＧＦＯ量を、ＰＢＳ（ｐＨ８，４）中の０．１％Ｔｒ ｉｔｏｎ”Ｘ−１００で処理して得られた細胞溶解物の放射活性を定量すること により測定した。

Ｂ、糸　裂　ア・・セイ ペプチドが有糸分裂誘発に及ぼす影響を、上記のように、５ｗ１ｓｓ　３Ｔ３線 維芽細胞を用いて測定した。簡潔に述べると、２ｏ、　ｏｏｏ細胞／ウェルで、 ９６マイクロウエルにプレートし、そして１０％０％ウシ胎清および抗生物質を 含有する、へペス（２５％Ｍ）緩衝化ＤＭＥＩＩ中で、２日間増殖させた。３日 目に、細胞を添加物を有さないＤＭＥＭで２回洗浄し、そして細胞を０．５％ウ シ胎児血清中で２日間、さらにインキュベートすることにより同調培養した。ア ッセイのときには、試験物質（塩基性ＦＧＦ、　ＥＣ−ＦＧＦＲｌまたは両方と も）を含む０．１％のＢＳ＾を添加したＤＭＥＭ１０μＬを直接、細胞に添加し た。１８時間後、１μＣｉの１トチミジンを細胞に添加し、そしてペプチド添加 して２４時間後、培地を吸引し、細胞をＰＢＳで洗浄し、そしてタンパク質を５ ０％のトリクロロ酢酸で沈澱させた。３回洗浄後、細胞をＩ　Ｎ　ＮａＯＨで１ 晩溶解し、そしてＤＮＡに取り込まれた放射活性量を、シンチレーションカウン ターにより測定した。

Ｃ９胞　殖　・・セイ ＥＣ−ＦＧＦレセプターの、塩基性ＦＧＦで刺激した副腎細管内皮（＾ＣＥ）細 胞の増殖を阻害する能力を試験した。レセプター調製物のアリコートをＡＣＥ細 胞に添加し、そして４日後にコールタ−粒子計数器を用いて細胞数を算定した。

比較の目的で、２％ｇ／ｊ＋１の組換えヒト塩基性ＦＧＦは、細胞増殖を２７． ５００±２．１００細胞／ウエルから１３３．３００±１．８００細胞／ウエル に増大した。

Ｄ、レセプター依　チロシンリン酸 ５ｗ１ｓｓ　３Ｔ３細胞を３７℃で５分間、添加物なしで、あるいは、塩基性Ｆ ＧＦ（１５ｎｇ＃＋Ｌ）、ＥＣ−ＦＧＦレセプター（１０ｆｆ１ｇ＃＋Ｌ）、ま たは塩基性ＦＧＦ（１５ｎｇ＃＋Ｌ）およびＥＣ−ＦＧＦ（ｌｏｍｇ／ｎＬ）と 共に添加して、処理した。次いで、細胞を２．５　Ｘ　Ｌａｅｆｆｌｉｌｉの緩 衝液中で集め、タンパク質を８％ポリアクリルアミド５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で 分離し、そしてチロシンリン酸化タンパク質の存在を、特異的な抗−ホスホチロ シン抗体を用いるウェスタンブロッティング法により調べた。

ＥＣ−ＦＧＦレセプターのＦＧＦ結合特性を、可溶性結合アッセイ（Ｒｏｂｉｎ ｓｏｎら、Ｊ、１ｍｍｕｎｏ１．　１１ｅｔｈ、（１９９０）１３２：６３−７ １）ニより記載されたアッセイから改変した）を用いて測定した。コンカナバリ ンＡをコートしたプラスチックウェルに付着したＥＣ−ＦＧＦレセプターを、’ 　”　’　１−ｂＦＧＦと共に、モしてｂ　ＦＧＦの濃度を増加させながら、イ ンキュベートした。”’［−ＦＧＦ結合のスキャッチャード分析により、Ｋ、は ５ｎ１１未満であることが示された。

完全に正確なに、測定は、１２’［−ＦＧＦの非特異的結合のために不可能であ った。アッセイに含まれる数種のブロッキング剤（例えば、ＢＳＡ、ゼラチン、 および硫酸ヘパリン）は、Ｉ！１Ｉ−ＦＧＦが低濃度のときには、＋２’１−Ｆ ＧＦの非特異的結合をブロックする効果がなかった。

ＥＣ−ＦＧＦレセプターの生物学的活性を、さらに数種のアッセイシステムで試 験した。第１に、ＥＣ−ＦＧＦレセプターを培養物の内皮細胞へ添加すると、塩 基性ＦＧＦの増殖効果を阻害することが示された。この細胞タイプが塩基性ＦＧ Ｆを合成することは公知であるため、組換えレセプターは、基本的に内皮細胞増 殖を阻害し得ると考えられた。予測通り、発現したＥＣ−ＦＧＦレセプターは、 基本的に細胞増殖を阻害し得る。この効果の特異性を、共に塩基性ＦＧＦを合成 しない種々の細胞タイプとＥＣ−ＦＧＦレセプターとをインキュベートすること により研究した。

ＢＨＫ細胞、Ａ４３１細胞、またはＣＨＯ細胞では効果は観察されなかった。し かし、期待通り、ＥＣ−ＦＧＦレセプターを３Ｔ３細胞へ添加すると、塩基性Ｆ ＧＦに対する有糸分裂応答を阻害した。さらに、ＥＣ−ＦＧＦレセプターは、メ ラノーマ細胞（既に、塩基性ＦＧＦのオートクリン（ａｕｔｏｃｒｉｎｅ）産生 に依存することが示された細胞タイプ）の成長を阻害することを観察した。

ＦＧＦ／ＥＣ−ＦＧＦレセプター複合体が塩基性ＦＧＦを認識しないことを確認 するために、２種の実験を行った。第１に、放射性レセプターアッセイを行って いる間に、Ｂ）Ｉに細胞に対してＥＣ−ＦＧＦレセプター調製物を添加すること により、′！６Ｉ−塩基性ＦＧＦが、そのレセプターへの結合を妨げたことは、 それが塩基性ＦＧＦに結合することを示している。＋２６Ｉ−塩基性ＦＧＦの低 アフィニティーレセプターへの結合もまた阻害された。第２に、塩基性ＦＧＦは 、ＥＣ−ＦＧＦレセプターの存在下でインキュベートしたとき、その細胞膜レセ プターまたはＣｏｕｇｈｌｉｎら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅａ＋、（１９８８ ）２６３：９８８−９９３によって同定された特徴的な９０　ｋＤａ基質のいず れのチロシンリン酸化も活性化し得なかった。

実］ｌ舛１− ＵＬｌ１５の　ローニン 八−ユ匹上μｓ プラスミドｐＵＬ１１５（ＡＴＣｃ寄屁番号６９０３６）は、ＵＬｌ１５０ＲＦ を含むステージングベクターである。このプラスミドを以下のように構築した。

プラスミドｐＲＬ１０３（Ａｎｉｎａｌ　Ｖｉｒｕｓ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｂ。

Ｎ、　ｆｉｅｌｄｓ、Ｒ，Ｊａｅｎｉｓｃｈ、およびＣ，Ｆ、　Ｆａｘ！！　） 第２８巻、ｐｐ。

３９−５５、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　ＹｏｒｋのＬａＦｅｍ １ｎａおよびＷａｙｗａｒｄ（１９８０））は、ｐＢＲ３２２の）Ｉｉｎｄｌｌ ＋にクローニングされたＣＭＶ　Ｔｏｗｎｅ株ＨｉｎｄｌｌＩＣフラグメントを 含む。プラスミドｐＲＬ１０３を、制限酵素Ｂａｒｌ旧およびＢｓｔＥＩＴで切 断し、そして１０５３　ｂｐフラグメントを１％アガロースゲルから単離しそし て精製した。この１０５３　ｂｐフラグメントを、Ｎａｒｌで切断し、そしてＵ Ｌ１１５０ＲＦを含む９５７　ｂｐ　Ｂａｍ旧ハａｒ１７ラグメントを単離した 。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔｌｌ　ＫＳ　＋／−ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ）を、Ｂａｆｆ１旧およびＡｃｃｌで切断し、そして２９１５　ｂｐベクターを ９５７　ｂｐ　Ｂａｍ旧／Ｎａｒ１７ラグメントに連結してｐＵＬ１１５を作製 した。この連結により、ＡｃｃｌおよびＮａｒｒ部位がなくなったが、Ｂａｎ旧 部位は保持された。

Ｂ、ＶＬＵＬ１１５ プラスミドｐＶＬｔｌＬ１１５は、ＵＬ１１５０ＲＦを組み込んでいるバキュロ ウィルス発現ベクターであり、そして以下のように構築された。ｐＵＬ１１５ス テージングベクターをＢａｆｆ１ｌ１１およびＫｐｎｌで切断し、そして９８１ 　ｂｐフラグメントをゲル単離し、そして精製した。プラスミドｐＶＬ１３９２ （？ｅｂｂおよびＳｕ＋ｎ＋ｎｅｒｓＳＪ、Ｍｅｔｈ、　Ｃｅ１ｌ！Ｊｏ１．　 Ｂｉｏｌ、（１９９０）２：１７３−１８８）を、Ｂａｆｆ１旧およびＰｓｔｌ で切断して９２４９　ｂｐベクターフラグメントを得た。次いで、９８１　ｂｐ および９２４９　ｂｐフラグメントを、Ｋｌｅｎｏｗの存在下で連結してｐＶＬ ＵＬ１１５を作製した。得られた連結物のＢａａ＋１１１部位を修復（ｒｅｓｔ 。

ｒｅ）ｌ、、そしてＰｓｔｌおよびにｐｎ１部位を壊して１０，２３０　ｂｐプ ラスミドを生成した。

Ｃ−餅並以■ プラスミドｐＭｃＵＬ１１５は、哺乳類細胞発現ベクターであり、ＵＬｌ１５遺 伝子の転写を駆動するために用いられるｉｌｃＭＶ即時型初期プロモーターを有 する。このプラスミドを以下のように構築した。ｐＵＬ１１５を＾５ｐ７１８お よびＸｂａｌで切断してＵＬ１１５をｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターから除去し た。次いで、ｐｍｃｓｒベクターを＾５ｐ７１８およびＸｂａｌで切断した。、 次いで、＾５ｐ７１８−Ｘｂａｌ　ＵＬ１１５フラグメントを、直接ｐｉｃｓｒ 　Ａｓｐ７１８−Ｘｂａ１部位に連結して、両部位を修復した。得られたプラス ミドをｐＭｃＵＬ１１５と名付けた。

Ｄ、バ側月１訓些 プラスミドｐＭｃＵＬｌ１５ｎｅｏは、ＰＳＶ２ｎｅｏを基礎とする哺乳類細胞 発現ベクターであり、これは、その発現がＭＣＭＶ即時型初期プロモーターおよ びネオマオシン選択可能マーカーにより促進されるＵＬ１１５０ＲＦを含む。こ のプラスミドを、以下のように構築した。ｐＭｃＵＬ１１５を５ｆｉｌおよびＸ ｂａｌで切断し、そして２．３ｋｂフラグメントを単離し、ゲルで精製し、そし て遺伝子洗浄した（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）。ベクターｐｓＶ２ｎｅｏ（Ｓｏｕｔ ｈｅｒｎおよびＢｅｒｇｌＪ。

Ｍｏ１ｅｃ、　ａｎｄ＾　、　Ｇｅｎ、（１９８２）ｉ：３２７−３４１）をＥ ｃｏＲＩおよびＢａＩＩＩＨＩで切断し、そして４．５ｋｂフラグメントをゲル 精製し、単離し、そして遺伝子洗浄した。４．５ｋｂベクターおよび２．３　ｋ ｂ　ＭＣＵＬＩ１５フラグメントをＫｌｅｎｏｗで処理してプラントエンド連結 できるようにした。ベクターをホスファターゼ処理し、フェノールクロロホルム 抽出し、そしてエタノール沈澱した。４．５ｋｂベクターおよび２．３　ｋｂ　 ＭＣＭＶ−ＵＬｌ１５ののプラントエンド連結により、ｐＨｃＵＬｌ１５ｎｅｏ が生じた。

冥】Ｌ医」− ′　−バ　ロ　ルスベ　−ニ゛＋　（ＪＶ　ｆｌ　ＵＬＩ妙ｍ 完全長（ｇｌ（２）およびＣ末端短縮型ｇＨ（ｇＨ６）を発現する組換えバキュ ロウィルスベクターを、それぞれ実施例３および４に記載されているように作製 した。ｔｌＬ１１５０ＲＦの遺伝子産生物を発現する組換えバキュロウィルス（ ｒＢＶ）ベクターを、実施例３および４で記載したように、野生型バキュロウィ ルスＤＮＡとトランスファーベクターｐＶＬＵＬｌ　１５（実施例７Ｂ）とのコ トランスフエクシコンにより作製した。短縮型ｇＨを発現する組換えバキュロウ ィルスベクターｒＢＶｇ［（６とｒＢＶＵＬｌ　１５とを用いて、ＳＦ９細胞に コインフエクシコンした。細胞をＭＯＩ　Ｌで感染またはコインフエクシコンし 、［”Ｓ］システィンで標識し、そして溶解物および上清を、ネズミのモノクロ ーナル抗体（ＭＡｂ）１４−４ｂ（Ｕｒｂａｎら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　（１９９ ２）６６：１３０３−１３１１）を用いる放射免疫沈降法により、発現を検討し た。この抗体は、ＣＭＶ　ｇＨに特異的な、立体依存性中和抗体である。結果は 、ｒＢＶＵＬ１１５およびｒＢＶｇＨ６する顕著な（ｐｒｏｉｉｎａｎｔ）タン パク質を沈澱または、モノクローナル抗体を用いて、ｇＨと共沈降させた。溶解 物または上清をＵＬｌ１５由来のペプチドに対して生じ、ウサギ抗血清を用いて ウェスタンブロッティング分析した結果、ａｔ、ｔｔｓ遺伝子産生物と特異的に 反応した。従って、このことは、ＣＩＩＶ　ｇＨ／ＵＬ１１５複合体の存在を証 拠づけた。

実ｆｆｉ 乳：”＋　ＣＭＶ　Ｈ″　ＵＬ１１５の６実施例７Ｄに記載のプラスミドｐＭｃ ＵＬ１１５ｎｅｏを、安定なｇＨ分泌細胞株１７１（実施例２）または予めｇｏ 発現プラスミドｐＭＣＧＲＰ２ｇＥＩでトランスフェクトしたＧＲｆ’２ｇｔ（ にトランスフエフ２トシて新たなｇ）１分泌細胞株を作製した。ｐｃＭｇ［１６ から採取したｇＨをコードする２１６６　ｂｐ　Ｎｏｔｌ／Ｘｂａｌフラグメン トを、Ｎｏｔｌ／Ｘｂａｌで切断した哺乳類細胞発現ベクターｐＭＣＯＲＰ２Ｓ Ｒ，これはｐＭｃＭＶＡｄｈｒｆの誘導物である（Ｓｐａｅｔｅら、Ｊ、　Ｖｉ ｒｏｌ、（１９９０）６４：２９２２−２９３１）、に連結することによりプラ スミドｐＭｃＧＲＰ２ｇＨを作製した。プラスミドベクターｐｓＶ２ｎｅｏを、 細胞株１７１およびコントロールとしてＧＲＰ２ｇ）ｌにトランスフェクトした 。クローンをネオマイシン耐性で選択し、そして各トランスフェクション系列か ら９６りローンを選択し、そしてＥＬＩＳＡでアッセイを行った。最大量のｇＨ を分泌するクローンを、６ウエルプレートに広げ、モしてＥＬＩＳＡにより再ア ッセイを行った。次いで、選択した細胞株を、ＭＡｂ　１４−４ｂを用いた放射 免疫沈降法によりアッセイを行った（Ｕｒｂａｎら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　（１９ ９２）１３６：１３０３−１３１１）。図８に示すように、ＲＩＰにより検出可 能なレベルでｇＨを分泌する細胞株は、ＵＬｌ１５０ＲＦの遺伝子産生物を発現 する細胞株でもある。共沈降ｕｔ、ｔｔ５／ｇ）Ｉ複合体を非還元条件下でさら に特徴付けると、ＵＬ１１５およびｇ）Ｉは、ジスルフィド結合により結合する ことが明らかになった。

犬１１引」 −ＣＭＶ　Ｈノミ’　ＦＧＦレセｆ）’７３実施例２に記載のＣＨＯ細胞株１７ １を、可溶性型のＦＧＦ、を発現するように設計されたプラスミドｐＦＧＦｒｔ ｐａｎｅｏ＃３でトランスフェクトした。ヒトＣｖ■即時型初期プロモーター、 ｔｐａルミリーダーよびＣ末端短縮型ＦＧＦをコードする、ｐＦＧＦ、ｔｐａ由 来の３　ｋｂｐＳＦｉ１／Ｈｉｎｄｌｌ１７ラグメントをＥｃｏＲＩ／Ｂａｍ旧 切断ｐｓＶ２ｎｅｏに連結すルコとにより、プラスミドｐＦＧＦｒｔｐａｎｅｏ ＃３を作製した（ＳｏｕｔｌｌｅｒｎおよびＢｅｒｇ、　Ｊ、Ｍｏ１ｅｃ、　ａ ｎｄ　Ａ　、　Ｇｅｎ、（１９８２）ｌ：３２７−３４１）。

このフラグメントをＫｌｅｎｏｗフラグメントで処理して連結に先立って端部を プラントエンドとした。プラスミドｐＦＧＦ、ｔｐａは、Ｃ末端短縮型ＦＧＦ、 をコードするｌ　ｋｂｐのＮｈｏｌ／ＨｉｎｄｌｌｌフラグメントのＰＣＲ生成 物を、Ｎｈｏｌ／Ｉ（ｉｎｄｌｌ＋で切断した哺乳類細胞発現ベクターｐｃ１１ Ｖ６ａ　１２０　（Ｃｈａｐｍａｎら、Ｎｕｃ、＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、（１９９ １）Ｉｔ：３９７９−３９８６）に連結することにより構築した。短縮型ＦＧＦ 、をコードするフラグメントを、以下のプライマ一対を用いて作製した： ５’　ＧＧＡ　ＴＣＣＧＣＴ　ＡＧＣＡＧＧ　ＣＣＧ　ＴＣＣＣＣＧ　ＡＣＣＴ ＴＧ　３’Ｓ’　ＧＧＡ　ＴＣＣＡＡＧ　ＣＴＴ　ＴＴＡ　ＣＴＣＣＡＧ　ＧＴ Ａ　ＣＡＧ　ＧＧＧ　ＣＧＡ　３’＊プラスミドＰＢ５　ｆ１ｇ５を、テンプレ ートとして用いた。

トランスフェクトした細胞をネオマイシン耐性で選別し、そして耐性クローンを 採取し、そしてＥＬｒＳＡによりｇＨ分泌レベルをアッセイした。細胞株！７１ −３−１６は、そのような選択された細胞株の１つの代表である（図８、レーン ２）。選別したｇＨ分泌細胞株の放射免疫沈降法により、５日間曝露した後のオ ートラジオグラフにおいてｇＨ特異的バンドが示された。しかし、ＲＩＰに先立 つ、３０℃での細胞株の増殖により、ｇＨの分泌が増大し、２５０μＣｉ／＋ｎ ｌ［”　Ｓ　］メチオニン中で４時間細胞を標識した後、２４時間で、オートラ ジオグラフに検出可能バンドが見られ得るようになった。実施例６ａに記載のよ うに、抗−ＦＧＦ、抗体およびＦＧＦ、競合アッセイを用いた放射免疫沈降法に より、共沈澱した６０　ｋＤａ分子は、Ｃ末端短縮型ＦＧＦ、であることが示さ れた。このように、ｇＨの分泌は、短縮型ＦＧＦ　、の同時発現により促進され る。

Ｋ五匠■ レセプ　−／「ガン゛口　の レセプター／リガンド同時発現方法の普遍性を試験するために、硫酸ヘパランプ ロテオグリカンをコードする発現プラスミドでトランスフェクトした細胞株につ いて、ｇＨ分泌効果をアッセイした。硫酸ヘパランプロテオグリカンの発現で選 別した１５９クローンを、ＥＬＩＳ＾でｇＦ１分泌レベルで６０のベクターコン トロール株と比較した。選別したいずれのクローンからもｇＨ分泌のレベルに差 異はなく、このことにより、同時発現方法の成功に関与する特異性があることが 示された。

従って、ニスコートを用いて細胞表面タンパク質発現を増大させる方法を説明す る。本発明の好ましい実施態様をある程度詳細に説明してきたが、添付の請求の 範囲により定義されるような本発明の意図および範囲を逸脱しないで明白な改変 が行われ得ることは理解される。

８　に　ｔ−の。

以下の菌株の生物学的に純粋な培養物の寄託を、１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ 　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄのアメリカンタイプ カルチャーコレクションに行った。受託番号は、生存試験で確認し、そして必要 手数料を支払った後、付与された。この培養物は、３７　ＣＦＲ１，１４および ３５　ＵＳＣＩ２２のもとで与えられることが長官により決定される者に、特許 出願が係属中、入手可能である。公衆への培養物の入手可能性に関する制限は全 て、本出願を基礎とした特許の認可の際に取り消される。さらに、指定された寄 託は、寄託日から３０年間、または最後の寄託請求から５年間；または米国特許 の実施期間のいずれかのより長い期間、維持される。培養物が生存不可能となる か、または不注意により破壊されたとき、あるいはプラスミドに含有される菌株 の場合、プラスミドが損失したときには、同一の分類学的な特徴を有する記載の 生存培養物と置換される。

これらの寄託は、単に当業者のために提供されており、そして寄託が３５　ＵＳ Ｃｆｉ　１１２下で必要であることを承認するものではない。これらのプラスミ ドの核酸配列およびそれらによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を、 本明細書中で参考として援用し、そしてこれらの配列は、本明細書中の記載との いかなる矛盾が生じた場合にも支配的である。寄託された材料の作製、使用、ま たは販売のためには契約が必要であり得、そしてそのような契約は、ここでは与 えられない。

１膣　寛丘旦豆 ■匹１号 ｐＡＣｇＨ６ｆ　Ｅ、ｃｏｌｉ　）ＨＢＩＯＩ　１：Ｆ１’＋＋て）　７／２” ７／９０ＰＵＰ、１１５　（ｓ、　ｃｏｘｉＨＢ１ｏ１＋ニド・０　７／２３／ ９２ｐＣＭＡｄｇＨ６（Ｅ、ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ　＋Ｊ）’・・て）　７／２ ３／９２コー　１試　５≦　二８　ミ昆　畳呂　：叩　；号　袈８００　＞（５ Ｌｌυ　くｏ　←←　切に　ＬＩＬＩ　＞口　←にＬＩＣＪ　Ｌｌ（Ｊ　ＬＪＦ −１０１ｗ　、−Ｊｄ、ＬＩＣＪ　ｅｔｊ　Ｏ（Ｌｌ←＞１：１′　メく　■Φ 　ＬＩＣＪ　づ←　飄に　−く　−Ｕ　：υ←←　←Ｌ−＋　ψに　−Ｕ　＞Ｏ ←←　（５（Ｊ　山Ｏ←にＬｌ（Ｊ　ＩＪＬＩ　Φυ　」じ　口じ　−ヒ　ロじ 　Ｏく　−υＪ：ｃＪ　：ＩＪ　−←　ω←　−く　：ω　−く　し０　：υ← く　←＜−＜　Σ＜　ａＵ　←（ＬＩＬＪ　へし　←に＝足　−七　、！８１謔 　：×：足　＝８１日　！２＜りｖｈ　＜じ　＝○　クク＜に　り←　〉じ　Ｏ υコＣＪ　ｅｌｊ　ｅＬｌ　０１（Ｊ　ｆｆｌじ　コヒ　Φ←　−←　ＯＯ口← 　−く　ロく　ニド　Φ←　ａｌｌ−二←　ｒ、Ｕ　−υ、ｊＬ”−（５ＣＪ　 ＜に　ｌ←　−Ｕ　−口　−←　←く　乙υ＋１１ｃＪ　ＬＩＬｌ　ａ（Ｊ　ａ ｌＬＩ　Ｑｌ（Ｊ　−←　ω←　コに　ラく−＋＜　＞ｔｃ　ｐ）−１，４←　 −に　−ｔ−＋　Ｊ：Ｆ−１１１１Ｆ−１ｕ。

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ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＰＴ、　Ｓ Ｅ）、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　Ｍ Ｌ、　ＭＲ，ＮＥ、ＳＮ。

ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＢＹ。

ＣＡ、ＣＨ，ＣＺ、ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ， ＫＺ、ＬＫ、ＬＵ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＮＺ、ＰＬ、ＰＴ、Ｒ○、 　ＲＵ。

ＳＤ、ＳＥ、ＳＫ、ＵＡ、ＶＮ Ｉ

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．タンパク質を組換え的に産生する方法であって、宿主細胞中で該タンパク質 をコードする第１の遺伝子をエスコートをコードする第２の遺伝子と、該タンパ ク質が該宿主細胞から分泌される条件下で、同時発現することを含む、方法。
2. ２．前記タンパク質がウイルスタンパク質である、請求項１に記載の方法。
3. ３．前記ウイルスタンパク質が免疫学的反応性のヘルペスウイルスのポリペプチ ドを含む、請求項２に記載の方法。
4. ４．前記ヘルペスウイルスポリペプチドが、免疫学的反応性のサイトメガロウイ ルス糖タンパク質Ｈポリペプチドである、請求項３に記載の方法。
5. ５．前記サイトメガロウイルス糖タンパク質Ｈポリペプチドが、天然のヒトサイ トメガロウイルス糖タンパク質Ｈ中に存在するトランスメンブレン結合ドメイン の全部または一部を欠損している短縮型のヒトサイトメガロウイルス糖タンパク 質Ｈである、請求項４に記載の方法。
6. ６．サイトメガロウイルス糖タンパク質Ｈのアミノ酸配列のＣ末端から約２２ア ミノ酸が欠失している、請求項５に記載の方法。
7. ７．サイトメガロウイルス糖タンパク質Ｈのアミノ酸配列のＣ末端から約２３ア ミノ酸が欠失している、請求項５に記載の方法。
8. ８．前記エスコートがフィブロブラスト増殖因子のレセプターポリペプチドであ る、請求項５に記載の方法。
9. ９．前記フィブロブラスト増殖因子のレセプターポリペプチドが、可溶性のフィ ブロブラスト増殖因子のレセプターである、請求項８に記載の方法。
10. １０．前記エスコートがＵＬ１１５ポリペプチドである、請求項５に記載の方法 。
11. １１．免疫学的に反応性の短縮型サイトメガロウイルス糖タンパク質Ｈを組換え 的に産生する方法であって、該短縮型糖タンパク質Ｈが、天然のヒトサイトメガ ロウイルス糖タンパク質Ｈ中に存在するトランスメンブレン結合ドメインの全部 または一部を欠損し、該方法が、宿主細胞中で該短縮製糖タンパク質Ｈをコード する第１の遺伝子を可溶性のフィブロブラスト増殖因子レセプターをコードする 第２の遺伝子と、該短縮型糖タンパク質Ｈが該宿主細胞中から分泌される条件下 で、同時発現することを含む、方法。
12. １２．免疫学的に反応性の短縮型サイトメガロウイルス糖タンパク質Ｈを租換え 的に産生する方法であって、該短縮型糖タンパク質Ｈが、天然のヒトサイトメガ ロウイルス糖タンパク質Ｈ中に存在するトランスメンブレン結合ドメインの全部 または一部を欠損し、該方法が、宿主細胞中で該短縮型糖タンパク質Ｈをコード する第１の遺伝子をＵＬ１１５ポリペプチドをコードする第２の遺伝子と、該短 縮型糖タンパク質Ｈが該宿主細胞中から分泌される条件下で、同時発現すること を含む、方法。
13. １３．免疫学的に反応性の組換えヘルペスウイルスポリペプチドおよびエスコー トを含む複合体。
14. １４．前記ヘルペスウイルスポリペプチドが免疫学的反応性のサイトメガロウイ ルス糖タンパク質Ｈポリペプチドであり、前記エスコートがフィブロブラスト増 殖因子のレセプターポリペプチドである、請求項１３に記載の複合体。
15. １５．前記糖タンパク質Ｈポリペプチドが、天然のヒトサイトメガロウイルス糖 タンパク質Ｈ中に存在するトランスメンブレン結合ドメインの全部または一部を 欠損している短縮型ヒトサイトメガロウイルス糖タンパク質Ｈであり、前記フィ ブロブラスト増殖因子のレセプターポリペプチドが可溶性フィブロブラスト増殖 因子のレセプターである、請求項１４に記載の複合体。
16. １６．前記サイトメガロウイルス糖タンパク質Ｈのアミノ酸配列のＣ末端から約 ２２アミノ酸が欠失している、請求項１５に記載の複合体。
17. １７．前記サイトメガロウイルス糖タンパク質Ｈのアミノ酸配列のＣ末端から約 ２３アミノ酸が欠失している、請求項１５に記載の複合体。
18. １８．前記ヘルペスウイルスポリペプチドが、免疫学的反応性のサイトメガロウ イルス糖タンパク質Ｈポリペプチドであり、そして前記エスコートがＵＬ１１５ ポリペプチドである、請求項１３に記載の複合体。
19. １９．前記糖タンパク質Ｈポリペプチドが、全長の糖タンパク質Ｈである、請求 項１８に記載の複合体。
20. ２０．前記糖タンパク質Ｈポリペプチドが、天然のヒトサイトメガロウイルス糖 タンパク質Ｈ中に存在するトランスメンブレン結合ドメインの全部または一部を 欠損している短縮型ヒトサイトメガロウイルス糖タンパク質Ｈである、請求項１ ８に記載の複合体。
21. ２１．前記サイトメガロウイルス糖タンパク質Ｈのアミノ酸配列のＣ末端から約 ２２アミノ酸が欠失している、請求項２０に記載の複合体。
22. ２２．前記サイトメガロウイルス糖タンパク質Ｈのアミノ酸配列のＣ末端から約 ２３アミノ酸が欠失している、請求項２０に記載の複合体。