JPH07508712A - コカインに対する触媒抗体並びにその使用および製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 コカインに対する触媒抗体並びにその使用および製造方法 この出願は、１９９２年４月３日に出願された米国出願番号０７／８６２．８０ １の一部継続出願であり、その内容は参照することによりこの出願に組み込まれ る。

発明の背景 この出願においては、刊行物が括弧内のアラビア数字によって参照される。これ らの刊行物の完全な引用は、実験の各シリーズの最後に見出すことができる。こ れらの刊行物の開示は、この発明が属する技術の状態をより完全に記述するため に、参照することによりこの発明に組み込まれる。

コカインは、１９８０年以降、３０．０００．０００人を越えるアメリカ人によ って使用されており、明白な耽溺性が少なくとも１、７００．０００人を苦しめ ている（１）。この興奮剤乱用の医学的および社会的影響はよく知られており、 急性精神疾患から心不全まで、および暴力行為からクラック中毒新生児（ｃｒａ ｃｋ−ａｄｄｉｃｔｅｄ　ｎｅｗｂｏｒｎｓ　）までの範囲に広がる（　２−４ ）。

コカイン誘発脱抑制およびハイリスク挙動の増加傾向は、今や後天性免疫不全症 候群（ＡＩＤＳ）の出現を伴う特別な危険性を提示している。興奮剤の高い強化 性は、こめ形態のヤク乱用を特に有害なものとし、種々の薬理学的もしくは非薬 理学的な処置の試みにもかかわらず、十分に成功した様式はない（５，６）。強 化能力は明らかにピーク血清濃度に関連しるように思われ、これは、コカインの 心理薬理学的および生理学的効果に対する耐性が一回投与の過程で発現するとい う観察に関連するかもしれない（ｌＯ）。コカインの喫煙可能形態であるクラッ クの手に負えない乱用は、一部は、静脈内注射に近い効率をもって肺を横切るそ の迅速な送達に対応するようである（１．　５）。薬物動力学はまた、クラック 喫煙に関連するトンチャン騒ぎ的な使用の傾向を説明する（１）。ピーク血清レ ベルまでの速度およびその強度を減少する薬剤は、主要な治療能力の他に試験さ れるこの仮説を認めるであろう。

治療の神経薬理学的試みは、コカインの作用を媒介するドーパミン作動性経路の ような受容体系に焦点を絞っている（１１）。コカインに対する直接アンタゴニ ストを利用することはできないが、デシプラミンのような薬剤は禁断症状を維持 する前触れを示す（１２，１３）。しかしながら、デシブラミン効果の発現まで 数週間の遅れがあり、この誘導期間中累犯性の顕著な可能性が残る（　５．　１ ４）。この期間にさえも有効な薬剤は重要な臨床用途を有しているが、現時点で はそのような薬剤は存在していない。受容体ベースの試みに代わる方法は、コカ インの投与かもはや強化挙動作用（＋ｅｉｎｌｏ＋ｃｉｎｇｂｅｈｘｖｉｏｒａ ｌ　５ｌｆｃｃｔ　）を持たないように、コカインの中枢神経系（ＣＮＳ）への 送達を妨げることであろう。循環からコカインが除去される見込みがないので、 この試みは循環剤によるコカインの結合が必要となる。

１９７０年代に、５ｃｈｕ＋ｌｅ＋とその同僚は、ＣＮＳ送達を妨げる可能性に 基づいて、ヤク乱用に対する免疫学的試みについて調査した。リーサスザルにヘ ロインを自己投与させて依存させ、その後アヘンに対して免疫した。ヘロインに 近付くにも関わらず、この動物はもはやそれを自己投与することはなかった。血 清抗アヘン抗体の力価は脳を髄液力価を遥かに凌いでおり、これは抗体の効果を 血清に局在させた。したがって、ヘロインと循環ヘロイン抗体との会合は、ヘロ インの作用を遮断するに十分迅速なものであるはずである。しかしながら、非常 に高い投与性のヘロインの連続投与が循環抗体のプールを消費し、動物が再びヘ ロインの自己投与を始めることがこの試みの限界である。したがって、この試み は、抗体が薬物と有効に結合し、その挙動を変えることで作用するが、抗体供給 が枯渇することで制限を受ける。抗体は、その標的を枯渇させるに従ってそれ自 身が“枯渇“することを避けるために、酵素の性質を必要とする。

近年、触媒抗体（ｃＮａｌｙｌｉｃ　ａｎｌｉｂｏｄｉｅｓ）の開発という刺激 的な報告がなされた（１６．　１７）。触媒抗体は結合するだけではなく、それ らの標的を代謝し、それによりさらに結合のための抗体を放出するという人工酵 素として作用する（１８−２５）。この驚くべき進歩の原理は、酵素によるカル ボン酸エステルの加水分解を考慮することにより説明される。図１にみられるよ うに、平面エステルの加水分解は、通常、四面体中間体を介して進行し、この中 間体は分解してアルコールおよび平面カルボン酸を生じる。反応速度は、出発エ ステルと遷移状態構造のピークとの間の活性化障壁（ΔＧ）の大きさに応じて変 化する。酵素活性部位は加水分解遷移状態構造を補うポケットを有し、酵素は、 種々の結合相互作用を介して、遷移状態を出発物質に対して安定化する。この差 別的な安定化はΔＧを減少させ、触媒作用に貢献する。遷移状態は原子の特定の 配置に相当し、臣ネルギー的にそれに最も近い定義可能な種、すなわち、エステ ル加水分解の場合には四面体中間体に似ているものと考えられる。遷移状態は不 安定で消滅し易いものであるが、幾何学的および電荷分布の点てこの種に似てい るリン酸モノエステルは安定であり、その類似性に基ついて、遷移状態アナログ として機能する。そのようなアナログが引き出される抗体は、雛形の加水分解遷 移状態を補う結合相互作用を発現する。この抗体は、雛形の２；！ｉ質に結合す ることにより、出発状態に対して遷移状態を安定にし、活性化障壁を低くして加 水分解を触媒する。この触媒抗体は、その標的に結合し、それを破壊することに より遊離して、さらなる標的に結合する。多くの文献の例が、エステルの加水分 解に触媒抗体を人工酵素として使用することを支持している（１６．　１７．２ ６−３３　）。酸化物構造に基づくアナログもまた、リン酸構造よりもむしろ、 触媒抗体の生成に用いることができる。

通常乱用されるヤクのうち、コカインがこの試みの最良の候補である。コカイン のエクゴニン核にはベンゾイルエステル基か結合しており、これは加水分解によ り実質的に不活性の生成物を生じる（３５．３６）。これは、ヒトにおける脱活 性化代謝経路の１つである（３５．　３６）。この反応の遷移状態は加水分解の 四面体中間体に似ており、適切に設計されたコカインベンゾイルエステルの加水 分解遷移状態のリン酸エステルアナログによって模倣することができる。このコ カインアナログによって引き出された抗体のサブポピユレーション（ｓｕｂｐｏ ｐｕ１２１ｉｏｎ　）は、コカインに非常に特異的なエステラーゼとして機能す る。したがって、２０年前に示唆された免疫学的試みの主要な障害、すなわち循 環抗体の消耗、は克服することができる。

１　＃Ｌ　１１’＆−３ この方式により産生される抗コカイン触媒抗体はコカインを破壊し、それ自身は 連続的な機能が利用できる。慢性コカイン乱用という問題にそのような試薬抗体 を適用することは、乱用者から薬物の強化作用を奪い、それにより適切な心理社 会的な窓を開き、再発防止に介在し、耽溺性の消滅を促進する。

抗アナログ抗体のサブポピユレーションのみが触媒活性を有するため、モノクロ ーナル抗体の産生および被検体の受動免疫が必要である０７．　３８）。モノク ローナル抗体は、臓器移植拒絶反応（３９）およびグラム陰性敗血症（４０）の 治療のための薬剤として確立されている。抗コカイン触媒モノクローナル抗体で の受動免疫は、臨床的な意味で実施可能であるように思われる。第２は有効性の 期間である。現在利用可能なモノクローナル薬剤は、これらの抗体が結合すると 抗体−抗原複合体が循環から除去されてしまうため、毎日投与されている。対照 的に、人工酵素として機能するモノクローナル抗体は長寿命に設計することがで きる（４１）−低クリアランス率となるように遺伝的に操作された抗体のＦＣ部 位、抗原性を減少させるためのマウスエピトープに代わるヒトの置換による“ヒ トイビされた抗体部位、およびホスト免疫応答によるクリアランス（４２，４３ ）。コカインに対する人工酵素の投与は数週間持続し、はとんど同意の記録がな い人々に重要な拡張された適用範囲が得られることが理想的である。

第３に、コカインに対する人工酵素の効率は、コカインの分解速度がＣＮＳへの 送達速度と一致し得るという動力学的議論に拠っている。抗コカイン触媒抗体に 対する動力学的要求を特定するために、コカイン送達の動力学的モデルが必要で ある。吸入されたクラックの一回投与量が、血管内体積の一循環（抗体の分布体 積）当り９０−１２０秒にわたって肺を介して吸収された場合、コカインと抗体 プールとの混合を想定することができる。コカインの分布体積は全体液（ｂｏｄ ｙ　ｖａｔｅ＋）の２倍を越える（４４）が、これは、コカインの他のコンパー トメントへの分離か抗体活性により減少するたけであるので、無視することがで きる。肺においてコカインと抗体が混合した瞬間から、コカインがＣＮＳ毛細管 に到達するまで約１５ないし２０秒が経過するが、最も厳正な基準ではその時に コカインが完全に分解していることが要求される。１００ｍ　ｇ（０，３６ｍｍ 　ｏ　１　）という大投与量かつ１５秒以内の完全な加水分解には、０．０２３ ｍｍ　ｏ　１　／秒の速度が必要となる。したがって、酵素触媒の産生量および 抗体固有の酵素ターンオーバー率（ｔｕ＋ｎｏｖｕ　ｒａｌｃ　）はこの値を越 えなければならない。

このモデルにおける仮定は一様に控え目であり、その規制を緩和した場合には、 それに従って酵素の能力に対する要求は減少する。したがって、２００ｍ　ｇの モノクローナル投与量（ｍｏｎｏｃｌｏｎｘｌ　ｄｏｓｅ）　（モノクローナル ＨＡ−ＩＡ　（４０）を１００ｍ　ｇ投与）で、必要とされるターンオーバー率 は毎秒２ないし２０のオーダーである。触媒酵素は毎秒２０−４０のエステラー ゼターンオーバー率を有することが報告されており、これらのエステラーゼは特 に敏感な標的エステルを指向するものではあるが、このオーダーの強度の活性は 可能である（２０．２９）。また、人工エステラーゼのＫ　値は、クラック吸引 によるコカインの肺静脈濃度などよりも少なく、２−１５μＭの少なさである（ ２０．　３１）。我々は、臨床的に有用な抗コカイン触媒抗体に対する動力学的 要求は達成可能であると結論した。上記基準により耽溺性の治療に適した抗体は 、急性の過剰投与の治療にも適している可能性があるというさらなる利点もある 。最後の懸念は、コカインの大量投与により酵素が飽和する可能性である。しか しながら、ピーク結成レベルへの到達がより緩やかなものであるならばコカイン の強化作用はさして重要なものではなく、クラ・ツクの大量投与（よ、事実上、 塩酸コカインの鼻腔少量投与に弱められる。しだ力くって、抗コカイン酵素抗体 （ｅｎＢｍｘｌｉｃ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）によって生じる保護は、有用であるた めに完全である必要はな（島。

本発明の概要 本発明は、以下の構造を有する化合物を提供する。

但し、夫々のＲ１、Ｒ２、Ｒ３、若しくはＲ４は独立に水素、若しくは低級アル キル基であるか；又はＲ工、Ｒ２、若しくはＲの１つのみが、アジド低級アルキ ル基、低級アルキルアミン、低級アルキルカルボン酸若しくは誘導体に結合した 低級アルキル基を含有する基であり、Ｒ工、Ｒ２、若しくはＲの残りの２つは各 々独立に水素若しくは低級アルキル基であり、Ｒ４は水素、低級アルキル基若し くは負電荷である。

本発明は、以下の構造を有する化合物を提供する。

本発明は、以下の構造を有する化合物を提供する。

本発明はまた、以下の構造を有する化合物を提供する。

８　覧 本発明はまた、以下の構造を有する化合物を提供する。

但し、Ｘはキャリアー蛋白の一級アミンである。

本発明は、更に、以下の構造を有する化合物を提供する。

但し、Ｘはキャリアー蛋白の一級アミンである。

本発明また、以下の構造を有する化合物を提供する。

但し、Ｘはキャリアー蛋白の一級アミンである。

本発明はまた、以下の構造を有する化合物を適用する。

但し、Ｒ″　は、Ｏ若しくはＣＨ２であり、Ｒは炭化水素鎖、又はキャリアー蛋 白に結合しうるアミン、エステル若しくは他の官能基が結合した一連の炭化水素 である。

本発明はまた、以下の構造を有する化合物を提供する。

但し、Ｒは炭化水素鎖、又はキャリアー蛋白に゛結合しうるアミン、エステル若 しくは他の官能基が結合した一連の炭化水素である。

本発明はまた、以下の構造を有する化合物を提供する。

但し、Ｒは炭化水素鎖又はキャリアー蛋白に結合しうるアミン、エステル若しく は他の官能基が結合した一連の炭化水素基である。

本発明はまた、以下の構造を有する化合物を提供する。

但し、Ｒは炭化水素鎖、又はキャリアー蛋白に結合しうるアミン、エステル若し くは他の官能基が結合した一連の炭化水素である。

本発明は更に、キャリアー蛋白に結合された上記化合物を提供する。

本発明はまた、上記化合物に対する抗体を提供する。

本発明は更に、上記化合物に対する抗体をコードする遺伝子を提供する。

本発明はまた、上記化合物に対するヒトキメラ抗体及びヒトモノクローナル抗体 を提供する。

本発明は更に、患者の血液中のコカインの濃度を減少させるための薬学的組成物 であって、患者におけるコカインの濃度を減少させるのに効果的な量の上記化合 物に対する抗体及び薬学的に許容しうる担体を含有する組成物を提供する。

図面の簡単な説明 図１：カルポン酸エステルの加水分解の動力学的モデル。平面的なエステルの加 水分解は、寿命の短い（ｅｖａｎｅ・５ｃｅｎｔ）の四面体中間体を経て進行し 、該四面体中間体は分解され、アルコール及び平面的なカルボン酸を与える。こ の反応の速度は、出発のエステルと、ピーク又は遷移状態構造のエネルギー状態 の差（ΔＧ）の大きさで変化する。効果的な触媒は、反応のΔＧを減少し、これ によって反応の速度が増加する。

図２：Ａ、コカインのベンゾイルエステルの加水分解。反応経路に従って形成さ れる仮定の四面体中間体が示されている。Ｂ、ベンゾイルエステルのホスフエー トモジエステルアナローグの一般的構造。１ａのＲ置換基は図３に示された連結 鎖（ｔｅｔｈｅｒ）に対応する。

図３：遷移状態アナローグ上１の合成。試薬と条件：ａ。

Ｉ−（ＣＨ）　Ｎ　（ＣＨ３）４ＮＯＨ，ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）　、 Ｃｌ叶　５０℃（収率９２％）　；　ｂ、ＰｈＰ（０）ＣＩ２゜テトラゾール（ ０，１当量）、ベンゼン、ジイソプロピルエチルアミン　室温ｂｔ）次いでＭｅ ａｌ（収率８０％）；ｃ、　Ｐ（ＣＨ）　テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）／ＣＨ ３０Ｈ／３Ｉ ＨＯ（９：９：２）　ｒｔ　（収率６２％）；　ｄ、　１４Ｃ−琥珀酸無水物（ ２，２ｍＣ１／ｍｍｏｌ）　、ＴＨＦ、ｒｔ　（ベンジルエステルとして精製し た。Ｈ２／Ｐｄ　ｏｎ　Ｃｄで再生成させた。

収率的５０％）；ｅ、ジシクロへキシルカルボジイミド。

Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、　ＤＭＦ、　ｒｔ（収率８５％）；ｆ、（ＣＨ） 　５ｉＢｒ、ＣＤＣｌ　ｒｔ　（不安定、収率的９０％）；ｇ、ウシ血清アルブ ミン（カップリング比１：６）若しくは卵白アルブミン（カップリング比１：１ ５）。３００ＭＨｚ　１Ｈ−ＮＭＲでトロパン核のＣ−２位でエピマー化は全く 観測されなかった。

図４　：ｍＡｂ３Ｂ９　（黒丸）及びｍＡｂ６Ａ１２（白丸）による３Ｈ，エユ 、−コカインの加水分解に対する（１／［Ｓ］）の関数としての（１／Ｖ）のラ インウェーパー−バークプロット。人工酵素（２μＭ）のリン酸緩衝食塩水を１ ００μＭから２０００μＭの間の５種類の濃度の３Ｈ−コカインでインキュベー トした。

１０分間隔で、アリコートを冷ＨＣＬ　（水溶液）で最終的にｐＨ２に酸性化し 、ＣＨ２Ｃｌ２で分配し、有機層をシンチレーションカウンティングでアッセイ した。最適ｐＨを各々の酵素に対して決定し、使用した：３Ｂ９　ｐＨ７，７及 び６Ａ１２　ｐＨ７゜０゜バックグラウンドの加水分解を、抗体を使用しない別 の同一の反応で決定し、観測された速度を補正した。触媒されない加水分解速度 を同様な条件下で決定した。アッセイは全く同一のものを３回行い、標準誤差範 囲をブラケットで示した（３Ｂ９　ｒ＝０．９９；　６Ａ１２　ｒ＝０．９８） 。

本発明の詳細な説明 本発明は以下の構造を有する化合物を提供する。

但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３又はＲ４は夫々独立に水素若しくは低級アルキル基であ るか；ＲＲ又はＲ３は低１゛　２１ 級アルキルアジド基、低級アルキルアミン、低級アルキルカルボン酸若しくは誘 導体に結合された低級アルキル基を含有する基であり、ＲＲ又はＲ３の残り１・ 　２・ の２つは、独立に粋を若しくは低級アルキルであり、Ｒ４は水素、低級アルキル 又は負電荷である。

本発明は更にこの化合物の例を提供する。該化合物の例は、以下のモノを含むが 、これに限定されない。

本発明は更に、ＲＲ又はＲ３の１つのみが以下の構造１ゝ　２ を有するものを提供する。

但し、Ａは低級アルキル基であり、Ｘはキャリアー蛋白の一級アミンである。

本発明は以下の構造を有する化合物を提供する。

但し、Ｘはキャリアー蛋白の一級アミンである。

本発明は更に、この化合物の合成法であって、以下の化合物を、 水酸化テトラエチルアンモニウムの存在下で、４−ヨード−〇−ブチルアジドで 選択的にアルキル化し、以下の化合物を得、 引き続きこの化合物に、ＬＨ−テトラゾールの存在下で当量のフェニルホスホニ ッタジクロリドとメタノールを加え、以下の化合物を得、 引き続き、この化合物をベンゼン中、トリフェニルホスフィンで還元し、以下の 化合物を得、 この化合物を琥珀酸無水物でアシル化し、以下の化合物を得、この化合物を、ジ シクロへキシルカルボジイミドと組み合わせてＮ−ヒドロキシフタルイミドでア シル化することによって以下の化合物に変換し、 この化合物を、選択的に以下の化合物に脱アルキル化し、この化合物を、キャリ アー蛋白の一級アミンに結合させることを具備した方法を提供する。

本発明は以下の化合物を提供する。

但し、Ｘはキャリアー蛋白の一級アミンである。

本発明は、以下の構造物から出発物し、下記の事項を具備した上記化合物を合成 する方法を提供する。

この酸を酸性メタノールでエステル化し、Ｄｉｂａｌで対応するアルコールに還 元する。このアルコールを、イミダゾール触媒下でｔ−ブチルジメチルシリルク ロリドで保護し、゛出発のこの化合物は、ｎ−ブチルリチウムで以下のリチウム 旦にトランスメタル化され、この化合物をジエチルク口口ホスフエ（Ｃ）のシリ ル基をテトラ−ｎ−プチルアンモニウムフルオリドで除去し、　（Ｂ）から６２ ％の収率で対応するアルコールを得る。このアルコールを、トシレートを経て臭 化物に変換し；ブロモトリメチルシラン、次いでメタノールでホスホネートエス テルをエチルからメチルへ変換し；臭素をアジドで置換し；最後にホスホネート エステルを以下の構造りを有するホスホリルクロリドに変換する。

これは約３０％の収率である。テトラゾール触媒法を用いてこの化合物（Ｄ）を 、下式のメチルエクゴニン次いでメタノールとカップリングさせ、カラムクロマ トゲラフィー後に３このアジド旦をトリフェニルホスフィンで対応するアミンに 還元し、１４Ｃでラベルした琥珀酸無水物とカップリングさせた。得られた酸を 、カラムクロマトグラフィーを容易に行えるようにそのベンジルエステルにＥか らの収率６５％で変換した。このベンジルエステルを触媒水素化で除去し、Ｎ− ヒドロキシフタルイミドを用いてＤＣＣでエステル化し、活性化した。最後に、 このホスホネートをブロモトリメチルシランで脱メチル化し、生成物を直接使用 して、ウシ血清アルブミン又は卵白アルブミンを含むキャリアー蛋白にカップリ ングした。

本発明は、以下の構造を有する化合物を提供する。

但し、Ｘはキャリアー蛋白の一級アミンである。

本発明はまた、以下の構造を有する化合物を提供する。

但し、Ｒは、 ＣＨ。

１゜ 若しくは他の芳香族置換基である。

本発明は更に、以下の構造を有する化合物を提供する。

但し、Ｒ″はＯ若しくはＣＨ２であり、Ｒは炭化水素鎖若しくはキャリアー蛋白 に結合しうるアミン、エステル又は他の官能基を結合させた一連の炭化水素であ る。

本発明はまた、以下の構造を有する化合物を提供する。

但し、Ｒは炭化水素鎖、又はキャリアー蛋白に結合しうるアミド、エステル又は 他の官能基を結合させた一連の炭化水素である。

本発明は以下の構造を有する化合物を提供する。

但し、Ｒは炭化水素鎖又はキャリアー蛋白に結合しうるアミドエステル若しくは 他の官能基を結合させた一連の炭化水素である。

本発明は以下の構造を有する化合物を提供する。

但し、Ｒは炭化水素鎖又はキャリアー蛋白に結合しうるアミドエステル若しくは 他の官能基を結合させた一連の炭化水素である。

本発明は以下の構造を有する化合物を提供する。

但し、Ｒは炭化水素鎖又はキャリアー蛋白に結合しうるアミドエステル若しくは 他の官能基を結合させた一連の炭化水素である。

本発明はまた、キャリアー蛋白に結合した上記化合物であって、該キャリアー蛋 白がウシ血清アルブミン、卵白アルブミン、キーホールリンベット（ｋｒｙｈｏ ｌｃ　ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン又はサイログロブリンであるものを提供する 。

ここで述べたように、キャリアー蛋白は当業者に周知である。免疫応答の誘導を 容易にさせうる何れの蛋白も本発明によってカバーされうろことを意味する。典 型的なキャリアー蛋白は、ウシ血清アルブミンのような上記のものである。

本発明は上記化合物に対する抗体を提供する。これらの抗体の１つの有用性は、 患者において形成されるコカインの中間体を検出することである。他の有用性と しては、薬学的な使用のために抗体に高い親和性を生成させる出発物質としてこ れらの抗体を提供することである。

本発明は更に、上記化合物に対する抗体であって、コカインベンゾイルエステル 基の加水分解の遷移状態の中間体に結合して、加水分解反応のΔＧを減少させる 抗体を提供する。

一般に、抗体は２つの分子から成り、各々の分子は、２種の異なったポリペプチ ドを有する。該ポリペプチドのより短い方が軽鎖であり、より長い方が重鎮であ る。

天然に存在する抗体分子又は組換え型の抗体分子のフラグメントは本発明の制限 の範囲内に含まれる。免疫反応活性を示すＦａｂ蛋白又はＦ（ａｂ）’　蛋白は 本発明の一部である。

化学的化合物に対する抗体を生成する方法は当業者に周知である。１つの方法は 、キャリアー蛋白に化合物を結合し、このような結合化合物で動物を免疫するこ とである。次に、動物から得られた血清を、該化合物に対して生産された抗体に 対して試験しうる。

本発明は更に、上記化合物に対するモノクローナル抗体を提供する。モノクロー ナル抗体を生成する方法は当業者に周知である。

１つの態様では、モノクローナル抗体は、ＡＴＣＣアクセツションナンバー　を 有するハイブリドーマ、３Ｂ９によって産生される。このハイブリドーマ細胞系 、３Ｂ９は、特許手続上の微生物の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に 従って、１９９３年３月３１日に、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ 　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ）、１２３０１　ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉ ｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０８５２．　Ｕ、Ｓ、Ａ、に 寄託された。ハイブリドーマ細胞系３Ｂ９はＡＴＣＣアクセツションナンバー　 が与えられている。

他の態様では、モノクローナル抗体は、ＡＴＣＣアクセツションナンバー　を有 するハイブリドーマ、６Ａ１２によって産生される。このハイブリドーマ細胞系 、６Ａ１２は、１９９３年３月３１日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ ｔｕ−ｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ）、１２３０１　Ｐａｒｋｌａ ｗｎ　叶ｉｖｅ。

Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙ！ａｎｄ　２０８５２．　Ｕ、Ｓ、Ａ、に寄託さ れた。

ハイブリドーマ細胞系６Ａ１２はＡＴＣＣアクセツションナンバー　が与えられ ている。

所望の抗体を得る他の方法としては、抗体の重鎮と軽差をコードする遺伝子を単 離することである。両遺伝子は、所望の抗体を産生するホストベクターシステム に共に発現されうる。標準的な方法が、モノクローナル抗体の重鎮及び軽鎖をコ ードする遺伝子を得るために当分野で利用されている。

本発明は更に、上記化合物に対するモノクローナル抗体の軽鎖蛋白をコードする 単離された核酸分子を提供する。１つの態様では、該単離された核酸分子はＤＮ Ａである。他の態様では、単離された核酸分子はｃＤＮＡである。

本発明は更に、上記化合物に対するモノクローナル抗体の重鎮蛋白をコードする 単離された核酸分子を提供する。モノクローナル抗体の重鎮蛋白をコードするこ の単離された核酸分子の１つの態様では、該分子はＤＮＡである。更なる態様で は、該分子はｃＤＮＡである。

本発明は更に、モノクローナル抗体の軽鎖蛋白をコードする単離された核酸分子 であって、ＲＮＡ転写のプロモーターに使用可能に結合されたものを含んだベク ターを提供する。

本発明はまた、モノクローナル抗体の重鎮蛋白をコードする核酸分子であって、 ＲＮＡ転写のプロモーターに使用可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）結合されたものを 含有するベクターを提供する。

本発明はまた、上記ベクターを適切なホスト細胞に含有するホストベクターシス テムを提供する。このホストベクターシステムの適切なホストは細菌細胞、昆虫 細胞又は動物細胞である。他の適切なホスト細胞には、細菌細胞（例えばＥ、ｃ ｏｌｉ）　、酵母細胞、菌類細胞昆虫細胞及び動物細胞のような当分野で公知の ものがある。適切な動物細胞には、ベロー細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃｏｓ細胞、Ｃ ｖｌ細胞及び種々の一次動物細胞が含まれるが、これに限定されるものではない 。

特異的な抗体の親和性は、抗体分子のアミノ酸残基を変化することによって改善 しうる。部位特異的突然変異誘発が、これを達成するために行われうる。

加えて、抗体の゛親和性の改善は、抗アナローグ抗体（ａｎＬｉ−ａｎａｌｏｇ 　’ａｎＬｉｂｏｄｙ）の重鎖及び金属結合した軽鎖より成る複モ（、“１体を 生成することによって達成されうる。生成された新たなモノクローナル抗体の親 和性が試練され、よりよい親和性を有するモノクローナル抗体が選択される。

本発明は更に、上記化合物に対するヒトキメラ抗体を提供する。このようなヒト キメラ抗体を産生ずるための標準的方法が知られている。１つのアプローチとし ては、モノクローナル抗体の可変領域をヒトＦｃ領域と連結させることである。

本発明は更に、ヒトモノクローナル抗体を提供する。ヒトモノ・クローナル抗体 を作製する方法は当分野で公知である。

本発明はまた、患者の血液中のコカイーンの濃度を減少させるための薬学的組成 物であって、患者中のコカインの濃度を減少するのに効果的な量の上記抗体、及 び薬学的に許容しうる担体を含有する組成物を提供する。薬学的組成物の１つの 態様として、該抗体はヒトキメラ抗体である。

本発明の目的において、「薬学的に許容しうる担体」は、任意の標準的な薬学的 担体を意味する。適切な担体の例は、当分野で周知であり、ホスフェート緩衝食 塩水溶液、ポリツル”：Ｉ　（Ｐｏｌｙｓｏｒｂ）　８０を含有するホスフェー ト緩衝食塩水、水、エマルジョン（例えばオイル／水エマルジョン）、及び種々 のタイプの湿潤剤のような任意の標準的な薬学的ビヒクルが含まれるが、これら に限定されない。

本発明は更に、キャリアー蛋白がウシ血清アルブミン、ウシ血清卵白アルブミン 、キーホールリンペットヘモシアニン若しくはサイログロブリンであるものを提 供する。

本発明は更に、中間体であるコカインベンゾイルエステル基の加水分解遷移部位 （ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ−ｓｉｔｅ）に結合して加水分解反応のΔＧを減少させ る抗体を提供する。好ましくは、抗体はモノクローナル抗体である。

本発明は更に、患者の血液中のコカインの濃度を減少させる方法であって、コカ インの加水分解を触媒するのに効果的な量の抗体を患者に投与し、これによって 患者の血液中のコカインの濃度を減少させることを具備した方法を提供する。

好ましくは、該抗体は、静脈内的に投与される。しかし、該抗体を筋肉内的に投 与しうろことも考えられる。

本発明は、患者中の過量のコカインを処置するための薬学的組成物であって、患 者中のコカインの濃度を減少させるのに効果的な量の少なくとも１種の上記抗体 及び薬学的に許容しうる担体を含有する組成物を提供する。

本発明は更に、患者中の過量のコカインを処置するための方法であって、コカイ ンを触媒加水分解するのに効果的な量の少なくとも１種の上記抗体を患者に投与 し、これによって患者の過量のコカインを減少させることを具備した方法を提供 する。

本発明は、一定水準に達したコカインの濃度を減少することによって患者のコカ イン常習癖を治療するための薬学的組成物であって、患者の一定水準に達したコ カインの濃度を減少させるのに効果的な量の少なくとも１種の上記抗体を含有す る組成物を提供する。

本発明は、一定水準に達したコカインの濃度を減少することによって患者のコカ イン常習癖を治療するための方法であって、コカインの加水分解を触媒するのに 効果的な量の少なくとも１種の上記抗体を患者に投与し、これによって患者の一 定水準に達したコカインの濃度を減少させることを具備した方法を提供する。

本発明は更に、コカインのベンゾイルエステル結合に対して加水分解活性を有す る抗体を同定するための方法であって、（ａ）該抗体を、放射性標識されたベン ゾイル基を放出させうるような条件下において、反応混合物中でベンゾイル基を ラベルした放射性のコカインと接触すること；（ｂ）放出された放射性標識され たベンゾイル基を放射性のコカインと分離すること； （Ｃ）放出されたベンゾイル基の放射能を測定すること；及び （ｄ）ステップ（ｃ）で測定された放射能を、抗体を全く加えない場合の反応混 合物中で放出された放射能と比較する。

ステップ（ｃ’）でのより高い放射能は、コカインのベンゾイルエステル結合に 対する抗体の加水分解活性を指示している。

１つの態様では、ステップ（ｂ）には、コカインから放出された放射性標識され たベンゾイル基が有機層中に抽出され、コカインが水層に存ることをより顕著に するために反応混合物を酸性にし、更に有機溶媒で該混合物を抽出し、これによ って放出された放射性標識されたベンゾイル基を有機溶媒中に分離することを具 備する。

最後に、本発明は、コカインのベンゾイルエステル結合に対して加水分解活性を 有する抗体の、アナローブに対する特異性を決定する方法であって、（ａ）反応 混合物中において、コカインのベンゾイルエステル基の加水分解遷移状態に対す るアナローブと抗体とを、該抗体と該アナローブが結合し得るような条件下で接 触させること；（ｂ）ベンゾイル基を放射性標識したコカインを反応混合物中に 加え、ステップ（ａ）の条件では放出がされない場合には、放射性標識されたベ ンゾイル基の放出を可能にする条件に変え、コカインから放出された放射性標識 されたベンゾイル基を分離すること；（Ｃ）放出されたベンゾイル基の放射能を 測定すること；及び（ｄ）ステップ（ｃ）で測定された放射能を抗体を全く使用 しない反応混合物で放出されたものの放射能と比較し、同様の放射能であれば抗 体がアナローブに特異的であることを示している。

本発明は、以下の方法と材料の部で例示される。このセクションは、本発明を説 明し、本発明を理解させるが、このセクションの後の請求の範囲で説明されるよ うな本発明を何れの方法においても制限することを意図するものではなく、また そのように解釈すべきではない。

第−シリーズの実験 メチルエステル若しくはベンゾイルエステルの何れかでコカインを加水分解する と、相対的に生物学的に不活性な生成物が得られる。血清及び肝エステラーゼは 、両方とも代謝経路で利用され、１０％以下のコカイン量が変化せずに尿中に排 泄される。ベンゾイルエステルの加水分解に対するアナローブは、メチルエステ ルの小さなメチル基と対照的にその大きな疎水性のフェニル基が、抗体の相補的 結合部位と十分に結合性相互作用を有するように思われる。更に、これによって 活性酵素を誘導するようである。スキームＩＩにおいて、コカインのベンゾイル エステルの加水分解は、正四面体中間体１を経て起こり、この中間体には、ホス ホネートモノエステル２が モデルとなり得、第一の目標はホスホネートエステル結合の構築である。

エクゴニン及びフェニルホスホリンクジクロリドは、便利な商業的に利用しうる 出発物質であると思われるが、エクゴニンのような嵩高い、即ち立体的に障害さ れたアルコールに適用しうるホスホネートモノエステルの文献的な合成方法はな い。ホスホネートモノエステルは、通常混合ジエステルの形成において、合成の 期間中保護され、操作の最終段階で選択的な脱アルキル化によって再生される。

しかし、ホスホニックジクロリドに異なったアルコールを連続的に添加すること による簡単な調製法では、生成物の混合物が得られるので（４６）、混合ジエス テルは、ホスファイト中間体を経る多段階法（４５）で最もよく得ることができ る。メントールのような嵩高いアルコール（４７）は、ホスホニックジクロリド とはほとんど反応せず、メチルホスホニッククロリドを約５％与えるのみであり 、激しい条件下では、主生成物として対応するハロゲン化アルキルが得られる。

二級アルコールのアルコキシドはホスホニックジクロリド（４８）若しくはジメ チルホスホネート　（４９）と反応するが、収率は変化しうる（１５〜５５％） 。更にエクゴニン核は強塩基に対して不安定である。上記の全ての方法が、エク ゴニン及びエクゴニンアルキルエステルに対して試されたが、所望のホスホネー トエステルは微量しか得られなかった。反応種の性質を部分的に変え、副反応の 可能性を最小にするために、アシルクロリドのエステル化に使用されるものと同 様の触媒（５０）の存在下で、アルコールとホスホニックジクロリドとのカップ リングを検討した。イミダゾール及びピリジンは、両方とも反応の容易さ若しく は進行に全く影響しなかった。しかし、触媒量のＩＨ−テトラゾールが、ホスホ リル化の速度を増加し、アルコールのハロゲン化アルキルへの変換を起こさせな いようにするこが見出された。

模擬実験的な研究では、１当量のシクロヘキサノールと１当量のメタノールをフ ェニルホスホニックジクロリドに連続的に加え、３種類のホスホネートジエステ ル（４６）を十分な量得た。

アルキルホスホリルジクロリドは出発のジクロリドよりもかなり反応性が高いこ とが確かめられた。しかし、ＩＨ−テトラゾールの存在下で、混合ジエステルは 独占的に９０％の収率で得られた。両アルコールが一級である場合でも対照的な ジエステルは、無視できる量まで減少された。従って、ＩＨ−テトラゾールは、 おそらく核的な触媒作用によってホスホニックジクロリドの反応性を高めるが、 アルキルホスホニルクロリドの反応には、おそらく立体的な要求が増加するため に影響を与えるほどには触媒作用を示さない。結果として、テトラゾール触媒法 は、嵩高いアルコールの混合ホスホネートジエステルへの簡便で高収率なルート となる。次に、選択的なモノ脱アルキル化によって所望のホスホネートモノエス テル遷移状態アナローブを得る。全ての新規化合物は、１Ｈ−ＭＮＲ（２００Ｍ Ｈｚ）　、赤外スペクトル及び精密な質量分析を伴った質量分析によって十分に 分析された。

スキームＩＩで明記したコカイン加水分解のホスホスホネートエステルアナロー ブは単なる一般的構造である。典型的には、小さな分子は抗体応答を誘導しない ので、キャリアー蛋白に結合する部位が必要であった。結合の位置は、合成の容 易さ、及び加水分解が予想される位置から十分に離れることを基準にして選択さ れた。しかし、抗原性に関する結合位置の影響は、触媒活性にふれずには予言す ることができず、幾つかの他の方法が必要であると考えられる。我々の第一の目 的物は、コカインのメチルエステルカルボニルが、嵩高いが比較的穏和な条件で 容易に修飾されうるので、スキーム種々の合成スキームがあるが、アナローブ主 は、最終的にはスキーム５で概説したようにして得られる。容易に使用可能な出 発物質、エクゴニンは、水酸化テトラエチルアンモニウムの存在下で４−ヨード −ｎ−ブチルアジドで選択的にアルキル化され、９２％の収率でエクゴニンエス テル４を得る。

このように、この嵩高い二級アルコールは、混合ホスホニックジエステル合成に 供される。商業的に入手可能なフェニルホスホニックジクロリドは、アルコール 土とテトラゾール触媒下で完全に反応し、室温で一夜撹拌した後、反応混合物を メタノールでクエンチした（ｑｕｅｎｃｈｅｄ）。

混合ホスホネートジエステル旦は、溶出液としてメタノールを用いたシリカゲル クロマトグラフィーの後、８０％の収率で得られた。このようにして、ホスホニ ックジエステルとして保護された遷移状態アナローブの必須の核が得られた。

キャリアー蛋白に結合させるために、３段階で側鎖を完成さを、ジシクロへキシ ルカルボジイミドのカップリング作用を利用してＮ−ヒドロキシフタルイミドで アシル化することに完了するのに要求されることは、メチルホスホネートエステ ル基の選択的脱アルキル化、及びキャリアー蛋白の１０アミンに、得られたホス ホネートモノエステルをカップリングすることのみである。我々は、脱アルキル 化生成物主が不安定であることを見出した。しかし、キャリアー蛋白に結合され 、一旦安定化されると、分光法は、もはや構造が正しいことを評価するために使 用することができない。従って、別の方法で、脱アルキル化が分子を分解しない ことを示すために、ジエステル８の１つのアリコートをブロモトリメチルシラン で脱アルキル化し、ベンジルアミンでクエンチし、更に１つのアリコートをベン ジルアミンでクエンチし、次いで脱アルキル化した。両経路はシリカゲルの薄層 クロマトグラフィーで同じ生成物を与え、”Ｈ−ＮＭＲスペクトルで、で脱アル キル化法が満足のいくものであることが示唆された。従って、含有する反応混合 物をエバボレートし、０℃でｐＨ８のウシ血清アルブミンのホスフェートバッフ ァー溶液に取った。次に、反応混合物を、ゲル濾過クロマトグラフィーにかけ、 更−グのカップリング比は免疫化に対して適切であった。

６匹のＢａ１ｂ／ｃマウスを皮下、（３０μｇ）及び腹腔内（１２０μｇ）ルー トの両方によってアナローグーキャリアー主で免疫した。最初の免疫は、１：１ のフロイント完全アジュバントで行われ、追加抗原の注射剤が、２週間の間隔で 不完全アジュバントで投与された。動物は、追加抗原投与後、１４日に瀉血され 、血漿をクロットから分離し、−７８℃で保存した。血清をＥＬＩＳＡアッセイ するために、免疫化に使用された活性化コカインアナローブを、ウシ血清アル　 。

ブミンと交差免疫反応性を有さない卵白アルブミンとカップリングさせた。キャ リアーのカップリングに対するリガンドの影響は、１４Ｃ標識の取り込みを基準 にして６：１であった。プラスチック製の９６ウエルプレートを卵白アルブミン でコートし、アナローブ（４μｇ／ウェル）とカップリングさせ、血清の希釈物 でインキュベートした。セイヨウワサビのペルオキシダーゼにカップリングされ たヒツジ抗マウス１ｇＧを二次抗体及びインジケーターとして用いた。適切なネ ガティブな対照には、リガンドを用いない卵白アルブミン、非免疫試験血清、試 験血清の省略、及び二次抗体の省略が含まれる。

第三の追加抗原投与によって、数匹のマウスが１：３０００の抗体力価を発生さ せた。これらの１匹をハイブリドーマを調製するために選択し、尾静脈注射によ って追加抗原投与した（５０μｇ、アジュバントを用いなかった）。追加抗原投 与後、５日に動物を殺し、牌臓を取り出し、メツシュのスクリーンを通して細か く切り刻んだ。牌臓細胞の懸濁液を遠心し、再懸濁し、更に一部をトリプシン青 色色素を用いて評価した。８−アザグアニジンを含まない完全培地中でフュージ ョンする前に数日間保持されたミエローマ細胞を洗浄し、１：２の比率で牌臓細 胞と混合し、遠心した。ＰＥＧ　１５００を穏やかに加え、間隔をおいた後、血 清を含まないバッファーをアリコート中に加えた。この混合物を遠心し、再懸濁 し、ＨＡＴを含む完全培地中でフィーダーマクロファージ（ｆｅｅｄｅｒ　ｍａ ’ｃｒｏｐｈａｇｅｓ）にプレート化した。この培地を間隔をおいて交換し、１ ５日白目コロニーのインフリューエンド（ｉ　ｎｆ　１ｕｅｎ　ｔ　）を有して いる場合は、培地を抗アナローグ抗体に対してＥＬ　Ｉ　ＳＡでアッセイした。

１０個の陽性のコロニーが同定され、限界希釈までプレート化された。７種の単 クローンが得られ、サンプルを得、豆類型に分類した。

抗アナローグ単クローンは、ＥＬＩＳＡに関してマウス若しくはヒトからのアナ ローブを含まないアルブミンと反応しなかった。サンプルを液体Ｎ２中で凍結保 存した。第二のマウスで行った繰り返しのフュージョンでは、抗アナローグ抗体 に対して陽性な２３のコロニーが得られた。

コカインのベンゾイルエステル結合に対する加水分解活性に対し、モノクローナ ル抗体をスクリーニングするための簡単な方法が考案された。この結合でのコカ インの加水分解は、」１１ スキームＩＶ コカイン、メチルエクゴニン及び安息香酸を含有する人為的に構成された加水分 解混合物をＨＣＩ水溶液でｐＨ２に酸性化し、次いで混和しない有機溶媒ＣＨ２ Ｃｌ。を加え、水層に荷電したコカイン塩酸塩を、そして有機層に中性の安息香 酸を分配させた。１４Ｃ−安息香酸を混合物に加え、分配層のシンチレーション カウンティングを用いて分配の効果を評価し、９７％以上であると評価した。メ チルエクゴニンと１４Ｃ−安息香酸からジシクロへキシルカルボジイミドを用い たカップリングによって合成された１４Ｃ（芳香族性）−コカインを、同様の効 果を有する水層に分配した。１４Ｃ−（芳香族性）−コカインを市販のエステラ ーゼ（シグマ社製）とインキュベートした場合、反応は、反応混合物のアリコー トを酸性化し、分配し、カウントするという手順で進められる。エステラーゼが 存在しない場合、ｐＨ８，０のリン酸バッファー中、３７℃での自発的な加水分 解の程度は、１２時間後で５％以下であった。更に、メチルエステルが自発的に 加水分解すること、次いで、１４Ｃ−標識された生成物、即ちペンゾイルエクゴ ニンが塩酸塩として水層に分配され、１４Ｃ−安息香酸が含まれる有機層には現 れないことが記録された。従って、この副反応に関連した人為要素の可能性はな い。

酵素アッセイのための相当量のＩｇＧモノクローナル抗体を調製するために、我 々は悪性の腹水を調製した。各々の系列に対して、２×１０６のハイブリドーマ 細胞を、ブリスタンで予め処理されたマウス腹膜に置いた。十分な腹水が発生し た後、マウスを死亡させた。腹水を流し出し、抗体の産生を評価するために電気 泳動にかけた。不十分な応答を示したものに対しては、腹腔内の腫瘍を細かく刻 み、第二のマウスの腹膜に注射した。酵素スクリーニングにおいて、２５０ＩＪ ！の各々の腹水を、１ｍＭの１４Ｃ（芳香族）−コカインを含有する２５０μの ５０ｍＭＮａホスフェート、ｐＨ８を用いて３７℃でインキュベートした。８時 間後（抗体の量が未知であるので期間を延ばした）、各々から得られたアリコー トを酸性にし、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、抽出物を酸水溶液で洗浄した。各々のフ ラクションをシンチレーションカウンティングにかけた。腹水（ＩｃＩ−Ａ１２ ）の一つは陽性であり、代表的な実験を以下の表Ｉに示した。

ａｑ　Ｈ＋　２９０８．０　２２６２．０　２２２６．０　２８６．０洗浄　１ ７０．０　１９６．０　１９６．０　９４．０有機層　１８４．０　１９０．０ 　２１２．０　１４９６．０抗体を用いない対照とは対照的に、更に単クローン ８Ｂ８−Ｇ４及び９Ｇ２−Ｎ２を含有する反応混合物と対照的に、単クローンＩ 　Ｃ１−Ａ　１２を含有する反応では、安息香酸の遊離を伴うコカインの加水分 解の指標となる有機層にカウントが移動するという結果を与えた。Ｉｃｌ−Ａｌ ２を含有する腹水は、非出血性で、非感染性であり、更に８Ｂ８−Ｇ４及び９Ｇ ２−Ｎ２を含む腹水がエステラーゼ活性を示していないのでｍＡｂｌｃｌ−Ａ１ ２はコカインベンゾイルエステラーゼであると思われる。モノクローナル抗体の 精製が酵素活性を特徴づけるため、及びこれらの結果を確認するために必要であ る。

失販データは、この方法及び発生の可能性及びコカインに対する高い活性酵素抗 体の評価を支持している。人為的な酵素に対する速度論的な要求は、臨床での使 用はどに１ｎｖｉｖｏ試験に対して厳密である必要はないが、それにもかかわら ず、我々は、第一の触媒抗体は言うまでもなく、最初の２つのアナローブが十分 な能力を有することに信頼が置けなかった。更に、文献はこの警戒を支持してい る。

５、有機化学：遷移状態アナローブのデザインと合成最適な活性の触媒抗体を同 定することは、運の問題であり、従って、追加のアナローブが必要になりうる。

遷移状態アナローブに対して誘導される抗体は、キャリアー蛋白の結合位置に依 存して活性が変化する。そのため異なった位置にキャリアーを結合した追加のア ナローブを合成する必要がありうる。アナローブの構造の多様性によって、目的 物に対するより高いエステラーゼ活性を有する抗体が誘導され、可能性を試験す るためのフェニル置換された種々のコカインアナローブが合成されうる。更に、 分子内で精製される酸−塩基触媒作用を促進する新規な遷移状態アナローブも合 成されうる。

６、生化学：コカインに対する人工酵素の特徴化二種のアナローブ、及び合成さ れうる他のアナローブを用い、抗アナローグ抗体を生成させ、これらの酵素反応 の基本的な動力学的限界を決定するため、及びｉｎ　ｖｉｖｏ試験の候補を選択 するために、これらの酵素のＫｍ及びターンオーバー率を検討し、これらの人工 酵素の基質特異性を評価した。

（ｉ）抗体毒性を評価し、　（目）ステロタイピー（ｓｔｅｒｏ−ｔｙｐｙ）の ようなコカイン投与の直接的影響による触媒抗体の修飾に対する用量反応関係を 試験した。

８、遷移状態アナローブのデザインと合成先行文献及び上記データは、ホスホネ ートモノエステル遷移状態アナローブ３がコカインに対して加水分解活性を有し 、且つより触媒性の高い幾つかの抗体を与えるであろうことを示している。しか し、高活性の抗体が探査され、この探査の成功の確率には偶然の要素が含まれて いる。これは、抗体が全体の抗体−抗原結合親和性を基にしてアナローブに対し て誘導されるが、触媒活性は、遥かに高い特異性を持った結合相互作用系列を必 要とするという事実に因っている。ある抗体はよく結合しはするが、強力な触媒 能に必要な完全な相互作用系列を欠いている。また、遷移状態の安定化のみによ って作用する触媒抗体は、その加速率（Ｋ／Ｋ）が、ｃａｔ　ｕｎｃａｔ 抗体の相対的結合親和性（、に、／に１）　、即ち基質への結合に対する遷移状 態（又はＴ、Ｓ、アナローブ）への結合比率に限定される。従って、偶然の酸− 塩基又は共有結合触媒の不存在下で、Ｋ　／Ｋ　は低くなるであろうしく１０ｃ ａｔ　ｕｎｃａｔ ３〜１０４）、またＫＣａｔ及びＫＩｎは（望ましくなく）同じ方向に変化する だろう。我々の速度論的な明細に従って、我々は、追加の遷移状態アナローブを 合成し、使用することによって、高活性抗体を迅速に増強する可能性を増大させ るように試みることにした。これらのアナローブは、以下の３つの基準に従って 構築される：　（１）キャリアー蛋白への結合に他の部位を使用すること、（商 ）アナローブのアシル部分の化学修飾、（ｉｉｉ）分子内酸−塩基触媒作用を促 進しく遷移状態アナローブの新たな生成に対するモデルとして提供されうる新規 な遷移状態アナローブである。

（ｉ）アナローブ結合の代替部位 小分子上にキャリアー蛋白を結合する位置は、免疫原の抗原性及び誘導された抗 体の特異性に影響を及ぼす。触媒抗体を生成するための特別な関心事として、キ ャリアー蛋白に結合させるためにアナローブの上の位置を使用することによって 、実際の基質上の当該位置を横切って結合する抗体を誘導することが排除される 。例えば、コカインのメチルエステルは、スキームＶＩＩの１によって誘導され た抗体の深い結合ポケットを占めがたい傾向にある。

誘導された抗体の範囲を増大するために、代替結合部位を有するアナローブが構 築され、これにはコカイン芳香族環の４′位で結合した誘導体１０が含まれ、更 にコカイン窒素で結合したアナローブ、即ちアナローブ１上を構築しうる０これ ら新規アナローブの夫々は、加水分解のために必要な結合相互作用系列をもった 抗体を誘導する可能性のある異なった表面を露出する。アナローブ１０は、我々 のテトラゾール触媒法に従って、メチルエクゴニンと適切に機能化されたフェニ ルホスホニソタジクロリドから誘導される。官能基を適切に再構成することによ ってスキームＶＩＩＩに説明されたようなキャリアー結合アナローグが得られる 。遷移状態アナローブ１０は、スキームＶＩＩＩに示された経路で調製された。

即ち、商業的に入手可能な出発物質、ｐ−）ロモフェニル酢酸（ｐ−ｔｒｏｍｏ ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ）を酸性メタノールでエステル化し、ダイ バール（Ｄｉｂａｌ）で対応するアルコールに還元した。このアルコールを、イ ミダゾール触媒下でｔ−ブチルジメチルシリルクロリドで保護し、出発のアルコ ールから８６％の収率で八を得た。臭化物旦を、ｎ−ブチルリチウムでトランス メタル化し、ジエチルクロロホスホネートでホスホリル化し１．９−を得た。Ｃ ２のシリル基をテトラ−ｎ−プチルアンモニウムフルオリドで除去し、旦から６ ２％の収率で対応するアルコールを得た。このアルコールをトシレートを経由し て臭化物に変換した。即ち、ホスホネートエステルをブロモトリメチルシラン、 次いでメタノールによってエチルからメチルに変換し、臭素をアジドで置換し、 最後にホスホネートエステルをホスホリルクロリド旦に変換した（全収率は、約 ３０％）。テトラゾール触媒法を用いる場合は、塩化物りをメチルエクゴニンと カップリングし、次いでメタノールとカップリングして、カラムクロマトグラフ ィー後に３０％の収率で混合ジエステル旦を得た。旦のアジドをトリフェニルホ スフィンで対応するアミンに還元し、１４Ｃ標識した琥珀酸無水物にカップリン グさせた。得られた酸を、カラムクロマトグラフィーを容易に行えるようにベン ジルエステルに変換した。このベンジルエステルを触媒水素添加によって除去し 、このものをＮ−ヒドロキシフタルイミドを用い、ＤＣＣエステル化によって活 性化した。

入ヤー４ｗ 最後に、ホスホネートをブロモトリメチルシランで脱メチル化し、生成物を直接 使用し、ウシ血清アルブミン又は卵白アルブミンを含んだキャリアー蛋白に結合 した。放射性ラベルの取り込みの基準として、キャリアーに対するリガンドのカ ップリング比を約５対１にした。

アルコール基のホスフェートエステルへのテトラゾール触媒変換の前後何れかで 、ツルーＮ−メチルエクゴニン誘導体をＮ−アルキル化することによって、土工 に容易に変換される中間体を得る。立体障害の評価モデルを基にすれば、四級ア ンモニウム塩へのジアルキル化よりも、モノアルキル化の方が達成されるであろ うが、必要であれば、α−ハロアミンのような不活性なアルキル化剤が使用され うる。

アナローブ主、工１０−および土工（遷移状態アナローブを設計するための立証 された燐酸モノエステル戦略の全ての例）を用いれば、結果的に所望の高活性酵 素が得られると思われる。しかし、この研究を更に促進し、遷移状態アナローブ 設計への新規なアプローチを研究するために別の戦略が探求された。

いｉ）アシル修飾、基質稀釈度および「誘引およびスイッチ（ｂａｉｔ　ａｎｄ 　５ｗ１ｔｃｈ）　Ｊ戦略誘導された抗体における非共有結合的相互作用、並び におそらくは触媒活性を最大にするために、燐酸モノエステル遷移状態アナロー ブは、典型的には標的エステルの構造に近似させでてモデル化される。しかし、 触媒抗体によるエステル分解は、一つの例において、アシル化抗体の中間体（そ の加水分解が律速的である）を通って進行することが示されている（２０）。こ のような状況において、アナローブと基質との間の構造的な差異は、アシル抗体 中間体を不安定化することによって、全体のエステル加水分解速度を増大するこ とを可能とする。最近、基質を稀釈化して触媒効率を増大させるという一般的原 理が発表されており　（３２）、コカインのフェニル環は広範な修飾を導入する ための便利な部位である。

このフェニル基は、フラニル基のような複素環で置き換えてもよい。或いは、フ ェニル基をピリジニウム基で置換することによっても、一般的な塩基触媒を提供 するカルボキシル基が誘導されるであろう。このアプローチは、最近発表された アナローブ設計のための「誘引およびスイッチ」戦略（３０）に関する一つの変 形であろう。テトラゾール触媒法を用いるこれら可能性の幾つか（過剰な基質稀 釈がＫ　に及ぼす有害な影響が注目に値する）は、合成することができる。

（ｉｉｉ）分子内の一般的な酸／塩基触媒の誘導酵素は、歪み（ｓｔｒａｉｎ） 、エントロピー効果および酸／塩基触媒を含む幾つかの触媒複槽を共奏的に使用 することによって、高いターンオーバー率を達成する。燐酸エステルによって誘 導された触媒抗体は、これら全ての機構を利用することが可能であろう。しかし 、先に言及したように、該抗体は全体の結合親和性によって誘導され、従って強 力な触媒能のための適当な相互作用系統は存在しない。しかしながら、酸性基ま たは塩基性基を有する複雑な基質は、我々に対して、触媒能に関与するこれらの 基を特異的に制御できないというこの問題の解決法を示唆する。

スキー４ｒ 適切に誘導された触媒抗体は、その全体の結合特性によって、基質自体の酸性基 または塩基性基を、基質の加水分解のための一般的な酸／塩基触媒を提供するよ うに位置付けることができるであろうということが提案されている。例えば、コ カインのアミンは生理的ｐＨでプロトネートされてアンモニウムイオンになり、 また立体的な理由から、プロトンはベンゾイルエステルに向けて配向される。し かしながら、これも立体的な理由から、ベンゾイル基はアンモニウム基から遠く なるように配向し易い。にもかかわらず、１３−のような遷移状態アナローブに よって誘導された抗体は、その全体の結合によって、コカインのベンゾイル基を アンモニウム基に近接させ、分子内の一般的な酸／塩基触媒作用に好都合とする ことができるであろう。窒素のために炭素が置換されているアナローブについて は、対応する抗体結合ポケットはこの部位において疎水性であると思われ、この 環境はアンモニウム基の酸性度を増大し、その酸触媒における関与能力を増大す ると思われる。この戦略は、触媒抗体の誘導効率を増大することができ、また同 定された抗体触媒におけるターンオーバー率に寄与する。従って、−殻構造１３ ．１４および１５の幾つかの遷移状態アナローブの構築は、合理的に指示された 酸／塩基触媒の可能性を探求するためのものである。

これらのアナローブに対する多くのルートがありうる。多くの探査化学が必要で ありうることが予想できる。蛋白加水分解のために誘導された人工酵素の別の問 題に対して分子内酸−塩基触媒を導入することの有用性が期待できる。

９、人工酵素の特徴化 抗−アナローブ抗体が生成され、これらが悪性の腹水から多量に産生され、これ らが酵素活性に対してスクリーニングされ得る。活性酵素には速度論的な実験が され、ｉｎ　ｖｉｖ。

での適用を評価するために関連するパラメーター（Ｋ及びＫｃａｔを得た。方法 論的又は理論的に重要である付随的な目的には、触媒抗体の新規なスクリーニン グ法と、選択された酵素の触媒能の研究が含まれる。

！、酵素抗体の産生と同定 ネズミモノクローナル抗体であって、各々の遷移状態アナローブが先に開示され た方法に従って使用されうるものが産生された。即ち、ＢＡＬＢ／ｃマウス（６ ）をアジュバント中でＫＬＨ（１００μｇ）に結合されたリガンドで免疫し、２ 週間のインターバルで追加抗原投与し、夫々の追加抗原投与後１２〜１４日で採 血した。ＥＬ　Ｉ　ＳＡにより少なくとも１：１０００の抗−アナログ抗体を有 するマウスを殺し、牌臓を取り出し、細かく切り刻んだ。洗浄及び生存度の評価 をした後、牌臓細胞は、ＰＥＧ１５００を用いて適切に調製されたＮＳＩ細胞で 固定されうる。この細胞は、１０個の９６−ウェルプラスチックプレート上にプ レート化し得、ＥＬＩＳＡ試験媒体で抗−アナログ抗体が同定されうる。免疫化 でキャリアーにアナローブを結合するために使用した連結鎖（ｔｅＬｈｅｒ）に 対して結合活性を有する抗体を除去するために、ＥＬ　Ｉ　ＳＡで、キャリアー に結合した連結鎖のみを含む対照を加えた。抗−アナローブ抗体プロプユーザー を限界希釈法でクローニングした。抗−アナローブ単りローンを精製するには、 ブリスタン処理されたマウスの腹膜ヘハイブリドーマ細胞を注射して産生させた 後、沈殿及びクロマトグラフで精製をする必要がある。標準的なアプローチとし ては、このときに酵素活性が試験されるだろう。まず始めに、初期のスクリーニ ングアプローチを評価する基準を確立するために、抗−アナローグＩｇＧ抗体の 全てのハイブリドーマ細胞（ｓｅｃｒｅｔｏｒｓ）に対してこのアプローチが適 用される。即ち、各々の悪性腹水に対して、モノクローナル抗体産生を指示する 新しいバンドがゲル電気泳動で評価されうる。応答が腫瘍よりも低いときは、腫 瘍の塊を軽く切り刻み、マウスに再注射することになるだろう。応答が十分であ る場合は、■ｇＧモノクローナル抗体を以下のようにして精製する。（ａ）飽和 硫酸アンモニウムを滴下して沈殿させる。（ｂ）食塩溶出液のグラジェントを用 いＤＥＡＥ−ｓｅｐｈａｃｅ　ｌのアニオン交換クロマトグラフィーにかける。

（ｃ）ＩｇＧサブタイプに適切な条件でプロティンＧ−セファロースカラムで親 和性による精製をする。生成された抗体を、ｐＨ７，４リン酸塩反応緩衝液に対 して透析し、蛋白濃度をビシンコニックアシツド（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｃ　ａ ｃｉｄ）　（ＢＳＡ）アッセイで決定し、モル濃度をＩｇＧの分子量を１５０， ０００として計算した。抗体と１４Ｃ−コカインで構成される反応混合物のアリ コートを、先に説明したベンゾイル加水分解に対する我々のアッセイを用いて、 間欠的にアッセイした。１４０安息香酸を生成する抗体を、抗体を使用しない対 照に関して詳細に研究した。

く初期のスクリーニング法の開発〉 腹水が形成された直後に触媒抗体を同定すること及び抗体を精製することは、時 間を消費する。１つのアプローチとして、非酵素のクロマトグラフィーを避ける ために、腹水をエステラーゼ活性のアッセイに直接かけることである。先に述べ たように、腹水は本質的に、コカインエステラーゼ陽性ではないが、擬陽性であ ると認められる懸念があり、抗−アナローブ抗体が精製されるまで、擬陽性と擬 陽性の割合を評価することができない。第二のアプローチは、９６ウエルプレー トの個々のウェルから得られる単クローン上清をアッセイすることである。これ によって、腹水形成と非酵素クロマトグラフィーを不要にすることができる。ミ クロスケールの技術として、抗体を誘導するアナローブ（３）と同様の結合部位 と連結鎖を用いて、ａｆｆｉ−ｇｅｌビーズに１４Ｃ（芳香族）−コカインを結 合した。標識されたコカインを結合したビーズとハイブリドーマ培地を一夜イン キユベートし、次いで遊離された１４Ｃ安息香酸をシンチレーションカウンティ ングするために培地を機械的に分離することによって、抗−コカイン加水分解活 性の尺度が与えられる。どちらの初期スクリーニングにおいても、擬陽性が検出 された場合、フルオリド及びエセリン（ｅｓｅｒｉｎｅ）　、即ち天然のエステ ラーゼ阻害剤でアッセイを繰り返した。

■、速度論的研究 標準的方法によって活性酵素の定常状態速度論を検討し、先に説明したような臨 床的な使用に関連したパラメータＫ。

及びＫｃａｔ　（ターンオーバー率）を得た。全ての抗体で、飽和の速度論（ｓ ａｔｕｒａｔｉｏｎ　ｋｉｎｅｔｉｃｓ）及びアナローブによる阻害を測定した 。即ち、先に得られた精製モノクローナル抗体を、ｌ／２ｍｌの５００ｍＭＥＰ ＰＳｐＨ７，４，１００ｍｍＮａＣｌに０．１μＭ〜１０μＭの最終蛋白濃度ま で希釈した。共溶媒は前もって処理されず、温度は３７°±０゜１℃に保持した 。保存用エタノール溶液から得られた１４Ｃ−（芳香族）コカインを分割し、エ バボレートし、１／２ｃｃの同一のＥＰＰＳバッファーに取り、０時間において 、０．５ｍＭ〜５ｍＭの最終コカイン濃度で酵素を加えた。アリコートを間欠的 に除去し、ｐＨ２のＭＣＩに希釈することによってクエンチし、先に説明したよ うに１４０−安息香酸を分配し、シンチレーションカウントした。初期線形速度 が測定されうる（全基質のく５％加水分解）。観測された速度は、マイナーな自 発的加水分解速度に対して補正しうる。基質に対する初期速度を非線形最小二乗 法によってＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎ　ｔ　ｅｎ式で表される曲線に一致させ 、速度論的パラメーターＶｍａｘおよびＫｍを決定した。

〈触媒のメカニズムの解明〉 最も活性な酵素に対して、特にこれが新規なアナローブの１つに対して誘導され るものである場合には、触媒の詳細なメカニズムに理論的な興味がある。Ｆａｂ フラグメントに触媒活性を局在化しうる。Ｋ　のｐＨ依存性の分析、及びａｔｓ アミノ酸の特異的化学修飾の影響によって関与している酵素の官能基が判明しう る。１８ｏＨ２を用いるような標識の研究で正四面体中間体が確認されるであろ うし、Ｄ２０　／　ｐ　Ｈ依存性分析で多段階工程が示唆されうる。詳細なメカ ニズムの分析及び合理的に設計された部位一定方向性突然変異（ｓｉｔｅ−ｄｉ ｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）が、薬学的グレードの人工酵素を生成 するために必要でありうる。

ｉｉｉ、触媒抗体の特異性 触媒抗体の基質特異性は、一般に優れており、免疫調製の能力を反映する。しか し、メチルエクゴニン及びツルーＮ−メチルエクゴニンのような天然のコカイン の代謝物の影響、即ち基質として影響するのか、阻害剤として影響するのかが、 評価されなければならない。また最近、エタノールとコカインを一緒に誤用した 者において、エチルコカインが活性コカイン代謝物として同定された。主のよう なアナローブは、まさに基質としてのエチルコカインに適合した触媒抗体を誘導 するように思われる。しかし、完全なコカインのメチルエステルを有するアナロ ーブから誘導されるこの抗体は、予想したほど多くなく、１４Ｃ−エチルコカイ ンを合成し、人工酵素によって直接にその加水分解を研究する必要がある。

アナローブの合成及び速度論的分析は以下に示されるようなｉｎ　ｖｉｖｏで有 効な人工酵素が同定されるまで続けられた。

０、　２ｓｅｃ−１以下及び５０μＭより大きいＫｍを有するターンオーバー率 を有するコカインに対する触媒抗体は、概説されたように、まだ臨床的に有効で あり得、確実に一１二二試験の候補になるだろう。実際に、少なくとも最初に、 ｉｎ　ｖｉｖｏで全活性酵素を試験をした。コカインを代謝する能力が、抗体の 本質的な活性と存在する大量の抗体の両方の関数であるから、抗体の投与量を増 大することで、低活性は実質的な制限範囲内で補償されうる。実質的な制限には 、注射物の容積、蛋白の溶解性、及び溶液の濃度が含まれる。ホストの応答によ る抗体クリアランスの複雑化を防止するために、ｉｎ　ｖｉｖｏの研究は、Ｂａ １ｂ／Ｃマウスに限定され得るが、１つの例外として行った他の系では、たびた び血液を採集するアッセイが必要であった。この人工酵素アプローチは、コカイ ンがＣＮＳに分配される前のコカインの遮断を頼りにしているので、血清コカイ ンレベルの上昇の大きさと速度の鈍化は、効き目の最もよい尺度になると思われ る。このアプローチは、コカイン強化の種々の動物モデルの適正及び解釈に関す る議論のやかましい問題を巧みに避けることができる。コカイン投与の直接の影 響を変更するために人工抗体の能力を試験した。候補の人工酵素を、（ｉ）マウ スに対する抗体の直接の毒性の評価、（ロ）急性及び、うまくν）けば後期（ｌ ａｔｅ−ｔｅｒｍ）及び長期のコカイン投与の両方での、ｉｎ　ｖｉｖｏにおけ る血液のコカインレベルの調節、（ｉｉｉ）ステロタイピング（ｓｔｅｒｏｔｙ ｐｉｎｇ）の閾値及びパターンの変化にかけた。

ｉ、マウスにおける抗体毒性 この一連の実験では、雄及び雌の１５〜２０ｇのＢＡＬＢ／Ｃマウスを使用した 。固定用量の抗体製剤を静脈内的に注入された、ランダムに選ばれた４匹の雄及 び４匹の雌からなるグループで毒性試験を行った。２０ｍｇ／ｋｇの投与量で開 始し、毒性が観測された場合は、閾値を決定するために投与量を減少した。４匹 の雄及び４匹の雌からなる全部で３つのグループが、所定の投与量の抗体で試験 された。対照の動物には静脈内的に食塩水を与えた。全動物の大まかな様子と挙 動の変化を試験した。二重盲検法で、２名の観測者により１〜５に割り当てた。

く挙動の定性的な観察〉 １日に２回、午前１０時と午後３時に各々１５分間観察を行った。主観的に観測 されたパラメータの中には、下手、皮膚、震毛、眼、及び尾の状態、排泄物の頻 度と特徴、ノ１ンドリングに対する応答、かごの中での活動、体の緊張と震え、 あるとすれば、社会的相互作用、自発的な運動、身繕ν）の挙動、回転運動及び 他のステロタイプの徴が含まれる。定性的な観察は、体重、液体の摂取量、歩行 活動、あるとすれば発作活動、及びあるとすれば神経細胞の欠損を定量的に測定 することによって確認することができる。

収量を記録した。

見立盪監：　４−チャンネルの自動化された０ｐｔｏ・Ｖａｒｉ−ｍｅｘ　Ｍｉ ｎｉ（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、０ｈｉ ｏ）で動物を試験した。

日周活動二　個々の動物を、回転ドラム及び回転カウンターを備えた活動かごに ２４時間おいておいた。

神経系の欠損／運動障害（毒性用量の評価　二　半分の動物を回転された（ｒｏ ｔｏｒｏｄ）装置（Ｕｇｏ　Ｂａ５ｉｌｅ、Ｃｏｍｅ−ｒｉｏ、Ｉｔａｌｙ）か ら落とさせる抗体の投与量を５０％毒性またはＴＤ−５０と評価した。このよう な毒性は予想より速く現れない。

１１、血清コカインレベルに関する触媒抗体の影響血清コカインレベルに関する 抗−コカイン触媒抗体の効果を、２種類のアッセイで検討した。ラットのプロト コルは、初期時点で多数回のアッセイを可能にしうるが、ホスト対抗体反応の可 能性によって急性の抗体投与に限定されうる。マウスでのアッセイでは、血清コ カインプロフィールはそれほど詳細に得られない。血清サンプルは、標準的な方 法、即ち酸−塩基抽出及び基準と比較することによる定量的なガスクロマトグラ フィーによってコカインに対してアッセイされうる。

〈カニユーレを挿入されたラットモデル〉人工酵素の臨床効果は、コカインのピ ーク高さの変化、又は単純にピークの上昇速度に依存する。従って、よい時間分 解能（ｔｉｍｅ　ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）を与えるプロトコルが必要である。マ ウスは多数回の採血には適切でないが、中心静脈／右心カテーテルでの比は十分 であり、この方法が基準となっている　（５５）。従って、成長したＣＤ　Ｃ０ Ｂ５ラット、２００〜２２５ｇをジエチルエーテルで麻酔にかけた。上部頭蓋表 面と、シース（ｓｈｃａＬｈ）と中心カテーテルに対するアッタチメントを備え た金属プレートがエポキシ樹脂で徹底的に接着された。上部腹側胸郭の皮膚が切 開され、右外側の頚静脈を曝すために深く切り開いた。緩い結紮が静脈の回りに 施された。可撓性のプラスチックカテーテルは、金属プレートを開くことによっ て装着され、上部胸郭まで、皮膚下に掘り進められた。頚上部を縛って血行を止 めた後、頚内部をその結紮部間で切開した。カテーテルを右心に至るように頚部 に装着し、下方の結紮を、カテーテルが固定されるように縛った。ヘパリンでカ テーテルをフラッシュし、切開部を閉じた。動物を手術から回復させ、抗体を静 脈的な注射で投与し、１時間後にコカインを静脈的な注射（尾から）で投与した 。

４０μｅ〜１００μｅの血液サンプルを１５〜３０秒毎に採取し、希酸で処理し 更なる酵素活性を停止し、分析するまで氷上で保存した。対照動物の血清コカイ ンプロフィールと抗体で予め処置された動物の血清コカインプロフィールとを、 ピークレベルの差、ピークまでの上昇速度、及び５０＋％ピークレベルの持続時 間を得るために比較した。抗体の投与量及びコカインの投与量を独立に変化させ 、用量−反応関係をめた。

〈マウスモデル〉 カニユーレを挿入されたラットのアッセイは、コカインのピーク高さ、ピークま での時間、又は〉５０％ピークレベルの持続時間によって、抗体処理された動物 及び未処理の動物の間の違いで示されうる。もしそうであれば、次に時間分解能 がより低いマウスで同様の測定を行った。ＢＡＬＢ／Ｃマウス（雄及び雌、１５ 〜２５ｇ）をランダムに４匹の雄及び４匹の雌のグループに分け、半分の動物に 抗体を静脈内的に注射によって投与し、半分に食塩水を投与した。これら全てに 、抗体の投与の後１時間でコカインを一回皮下注射した。

各グループを、コカインを投与した後、３．６．９．１２、及び１５分でギロチ ンにかけ、コカインのアッセイをするために８朦から全血を採った。抗体とコカ インの投与の間の間隔を、酵素の効果の持続時間を決定するために増やした。

ｉｉｉ、ｉｎ　ｖｉｖｏでのコカイン毒性に関する抗体の効果血清コカインプロ フィールに変化が観測された場合、及び抗体自身が効果的な投与量で毒性をを示 さない場合は、はとんど無制限の挙動実験が可能である。まず最も簡単なもの、 即ちコカインの急性で直接的な効果のブロックから始めた。

即ち、選別され、上記のように抗体（血清コカインプロフィールを調節すること が示されている投与量で）若しくは食塩水で処理されたＢＡＬＢ／Ｃマウスに、 ５０％の未処理動物でステロタイビーを誘導することが予め示されている静脈内 のコカインの既知量（ｎｏｔｉｃｅ）を１時間後に投与した。コカインで誘導さ れる挙動に対する閾値におけるシフトが調べられた。

〈統計的分析〉 全ての値は、平均±ＳＤとして表した。１つの方法であるＡＮＯＶＡは、各組の データの全体で行われた。Ｆ−値が十分な差（ｐ＜ｏ、０５）を示した場合、対 を形成したステユと対照グループの間の十分な差が得られるだろう。

第一シリーズの実験及び先述のセクションの参照文献１、　Ｇａｗｉｎ、Ｆ−Ｈ ，、Ｅ、Ｈ，Ｅｌｌｉｎｗｏｏｃｌ、Ｊｒ、”ｃｏｃａｉｎａ　ａｎｄ　ｏｔｈ ｅｒｓｔｉｍｕｌａｎｔｓ：　入ｃｔｉｏｎｓ、ａｂｕｓａ　ａｎｄ　ｔｒａａ ｔｍａｎｔ”、Ｎｅｗ　Ｅｎｇ。

Ｊ、　Ｍｔｓｄ、　３１８：１１７３−１１８２　（１９８Ｂ）。

２、　Ｌ、Ｌ、口＝ａｇｌａｒ　ａｎｄ　Ｈ，ＭＡｒｋ、”Ｍｅｃｌｉｃａｌ　 ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆｃｏｃａｉｎｅ　―ｅ”、　Ｎ、Ｅｎｇｌ、 Ｊ、Ｍａｄ、３１５：１４９５−１５００（１９８６）。

３、　Ｊ、Ｍ、ＸｍｎｅＸ　ａｔ　ａｌ−、”入ｃｕｔａ　ｃａｒｄｉａｃ　＠ ｖｅｎｔｓ　ｔａｍｐｏｒａｌｌｙｒａｌａｔａｄ　ｔｏ　ｃｏｃａｉｎｓ　ａ ｂｕｓ＋ａ”、　Ｎ、　ｈｇｌ、　Ｊ、　Ｍａｄ。

３１５：工４３Ｂ−１４４３゜ ４、Ｌ、Ｍ、　’ＬａＩＬｋｏ　ａｔ　ａｌ、、　”Ｉａｔｒｏｇａｎｏｕｓ＋ 　ｃｏｃａｉｎｅ　ｐｓｙｃｈｏｇｉｓｓ−Ｎ−Ｘｎｑ、　Ｊ、Ｈａｄ、３０フ ：１１５コ、（１９８２）。

５、　Ｃ，Ｅ−Ｊｏｋｕｕｍｏｎ　ａｎｄ　Ｍ、組Ｆｉｓｃｈｍａｎ、−５ａ　 Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙｏｆ　ｃｏｃａｉｎｅ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｔｏ　ｉｔ ｓ　ａｂｕｇ＠”、Ｐｈａｒｘ、　Ｒｅｖ、　４１：３−５２　（１９８９’） 。

６、　Ｈ，Ｋｌａｂａｒ　ａｎｄ　Ｆ、Ｇａｗｉｎ、”Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍ ａｅｏｌｏｇｉｃａｌｔｒｉａｌｓ　ｉｎ　’ｃｏｃａｉｎｅ　ａｂｕｓｅ　ｔ ｒｅａｔｍｅｎｔ”、Ａｍ、　Ｊ、　ＤｒｕｑＡｌｃｏｈｏｌ　Ａｂｕｌｌ＠　 Ｌ２：２コ５−２４６　（１９８６）。

７、Ｊ、工、　Ｊａｖａｄ　ａｔ　ａｍ、、”Ｃｏｃａｉｎｅ　ｐｌａｇ！ＩＬ ａｅ口ｎｅａｎｔｒａｔｉｏｎ　：Ｒｅ１ａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｐｈｙｓｉｏｌｏ ｇｉｃａｌ　ａｎｄ　ｔｓｕｂう＠ｃｔｉｖｅ　＠ｆｆａｃｔｓ　ｉｎｈｕｍＪ ！Ｉｎｓ”、　５ｃｉｅｎｃｅ　２０２：２２７−２２８　（１９７Ｂ）。

８、　Ｍ−Ｄ、Ｗｉｌｇｏｎ、ａｔ　ａｌ、、”Ｐｓｙｃｈｏｍｏｔｏｒ　ｓｔ ｉｍｕｌａｎｔ　ｓｉｅｌｆ−ａｄｍｉｎｉｇｔｒａｔｉｏｎ　ａｓ　ａ　ｆｕ ｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｏｓａｇｅ　ｐａｒ　ｉｎプａｃｔｉｏｎｉｎ　ｔｈ＠ ｒｈａｇｕｓ　ｍｏｎｋｅｙ”、Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｘｕａｃｏｌｏｇｉｃ　 ２２：２７１−２８１　（１９７１）。

９、　Ｍ、Ｗ、ＦｉｇｄｌＭａｎｄ　Ｃ，Ｒ，Ｓｅｈｕｇｔａｒ、”Ｃｏｃａｉ ｎｅ　ｓａｌｆ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｈｕｍａｒｕ＋”、Ｆ ｅｄｅｒａｔｉｏｎ　肺ｃ、礁１：２４１−２４６　（１９８２）。

１０、Ｍ、１＋ｉ、　Ｆｉｓｃｈｍａｎ、　ａｔ　ａｌ、、　”Ａｃｕｔｅ　ｔ ｏｌａｒａｎｃａ　ｄａｖａｌｏｐｍａｎｔｔｏ　ｔｈｅ　ｅａｒｄｉｏｖａｓ ｃｕｌａｒ　ａｎｄ　ｇｕｂｊａｃｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆｃｏｃａｉ ｎｅ”、　Ｊ、Ｐｂａｒｒｎ　ｍｄ　Ｉ：ｘｐｅｒｉ、Ｔｈｅｘａｐｅｕ、２コ Ｓ：６７７−ＩＬ　Ｎ、Ｅ、　Ｇｏａｄｅｒｇ　ａｎｄ　Ｊ、Ｅ、　Ｓｍ１ｔｈ 、　”Ｃｏｒｔｉｃａｌ　ｄｏｐａｍｉｎａｒｇｉｃｉｎｖｏｌｖａｍｅｎｔ　 ｉｎ　ｃｏｃａｉｎｅ　ｒａｉｎｆａｒｃａｚａｎｔ”、　５ｃｉｅｎｃｅ２２ １ニア７３−７７５　（１９８３）。

ｘ２＋Ｆ、Ｈ−Ｇａｗｉｎ　ａｔ　ａｌ、、”Ｄｅｓｉｐｒａｍｉｎｅ　ｆａｃ ｉｌｉｔａｔｉｏｎ　ｏｆｉｎｉｔｉａｌ　ｃｏｃａｉｎｅ　ａｂｓｔｉｎｅｎ ｃｅ”、Ａｒｃｈ　Ｇａｎ、　Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ４１１ｉ：１７−１２１　 （１９８９）。

１３、Ｆ−Ｈ，Ｇａｗｉｎ　＠ｔ　ａｌ、、　”０ｕｔｐａｔｉａｎｔ　ｔｒｅ ａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　’ｃｒａｃｋ’ｃｏｃａｉｎｅ　ｓｍｏｋｉｎｇ　ｗｉｔ ｈ　ｆｌｕｐｅｎｔｈｉｘｏｌ　ｄ＠ｃａｎｏａｔｅ、”　Ａｒｃｈｃａｎ、Ｐ ｓｙｃｈｉａｔｒｙ　４ｇ＝３２２−３２５　（１９ａ９）。

１４＋ＭＪＪ、ＦｉｓｃｈｍＩ！Ｌｎ、ａｔ　ａｌ、、”Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ 　ｄａｓｉｐｒａｍｉｎｅｍａｉｎｔａｎａｎｃｅ　ｏｎ　ｃｏｃａｉｎｅ　ｓ ｅｌｆ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　ｂｙｈｕｍａｎｓ”、、７．Ｐｈａｒ ｍ、ａｎｄ　Ｅｘｐｅｒ、Ｔｈａｒａｐｅｕ−２５３＝７６０−７フ０（１９９ ０）。

１５、Ｋ、Ｆ、Ｂｏｎｅｓｅ　ａｔ　ａｌ、、Ｃｈａｎｇｅｓ　ｉｎ　ｈｅｒｏ ｉｎ　ｓａｌｆ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　ｂｙ　ａ　ｒｈｅｓｕｓ　ｍ ｏｎｋｅｙ　ａｆｔａｒ　ｍｏｒｐｈｉｎｅｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ”、Ｎａ ｔｕｒｅ　２５２ニア０８−　（１９）４）。

１６、　入、Ｔｒａｍｏｈｔａｎｏ　ｅｔ　ａｌ、、”Ｃａｔａｌｙｔｉｃ　ａ ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−ｂｙ　ａｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ”、　５Ｃ１ｅｎＣｅａ　 ２３４：１５７０−１５７４　（１９８６）。

ｌａ、Ｓ、Ｊ、　Ｂａｎｋｏｖｉｃ、　ａｔ　ａｌ−、”ｃａｔａｌｙｓｉｓ　 ｏｆ　ａ　ｇｔｅｒｏｓｐｅｃｉｆｉｃｂｉｍｏｌａｃｕｌａｒ　ａｍｉｄｅ　 ｓｙｎ廿ｔｅｓｉｓ　ｂｙ　ａｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ”、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、５ｃｉ−、５１５＝５３５５−５３５８　（１９８８）。

１９、Ｄ、Ｙ−，７ａｃｋｓｏｎ、ａｔ　ａｌ、、”ＡＪＩ　ａｎｔｉｂｏｄｙ −ｃａｔａｌｙｚｅｄ　ｃｌａｉｓｅｎｒａａｒｒａｎｇａｍｅｎｔ”、　Ｊ、 Ａｍ、Ｃｈｅｗ、Ｓｏｃ、１１０：４８４１−４８４２（１９８Ｂ）。

２０、Ｓ、Ｊ、　Ｂａｎｋｏｖｉｃ　＠ｔ　ａｌ、、”Ｔｈｅ　ａｎｚｙｍｉｃ 　ｎａｔｕｒｅ　ｏｆａｎｔｉｂｏｄｙ　ｃａｔａｌｙｓｉｓ：　Ｄｅｖｅｌｏ ｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｍｕｌｔｉｓｔａｐ　ｋｉｎｅｔｉｃｐｒｏｃａｓｇｉｎｇ ｌ′、　５ｃｉｅｎｃｅ　ｚｓｏ＝１１３５　（１９９０）。

２１、Ｋ−ｄ、Ｊａｎｄａ　＠ｔ　ａｌ−″工ｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎ　 ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｔｈａｔｃａｔａｌｙｚｅｓ　ｔｈｅ　咲−ｘｏｌｙｓｉｓ 　ｏｆ　ａｎ　ａｍｉｄｅ　ｂｏｎｄ”、５ｃｉｔａｎｃｅ２４１：１１８８− １１９１　（１９８Ｂ）。

２２、　Ｋ、Ｍ、５ｈｏｋａｔ、ｅｔ　ａｌ、、”入　ｎｅｗ　ｇｔｒａｔｅｇ ｙ　ｆｏｒ　ｔｈａｇａｎａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｔａｌｙｔｉｃ　ａｎｔ ｉｂｏｄｉｅｓ”、　Ｎａｔｕｒｅ　３３１１＝２６９−２７１　（１９８９） 。

２１　Ｂ、Ｌ＋　工ｖｅｒｓｏｎ　ａｎｄ　Ｒ，入、Ｌｅｒｎｅｒ、”Ｓｅｑｕ ａｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｐａｐｔｉｄｅ　ｃｌａａｖａｇａ　ｃａｔａｌｙ ｚｅｄ　ｂｙ　ａｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ”、５ｃｉｅｎｃ。

２４３：１１８４（１８Ｂ　（１９８９）。

２４＋Ｔ、Ｋｉｔａｚｕｍａ、ｅｔ、　ａｌ、、”Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｃａｔａ ｌｙｚｅｄ　ｄｏｕｂｌｅｇｔａｒｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｆｌｕｏｒｉ ｎａｔ＠ｃｉ　恥ｔａｒｉａ１ｇ”、Ｊ、Ａｍ。

Ｃｈｉａｒｎ　Ｓｏｃ、１１３：８５７３？８５７５　（１９９１）。

２５、　入、Ｇ、　Ｃｏｃｈｒａｎ、　ａｔ　ａｌ−、”Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｃ ａｔａｌｙｚａｄｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ”、Ｊ、Ａｎ 、Ｃｈａｉｎ、Ｓｏｃ、　１工３：６６７０−６６７２　（１９９１）。

２６、Ｋ、Ｄ−Ｊａｎｄａ、　ａｔ　ａｌ、　、　”Ｃａｔａｌｙｔｉｃ　ａｎ ｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｗｉｔｈ　ａｃｙｌ　−ｔｒａｎｓｆｏｒ　ｃａｐａｂｉｌ ｉｔｉａｓ：　Ｍａｃｈａｎｉｓｔｉｃ　ａｎｄ　ｋｉｎｅｔｉｃｉｎｖ＠ｓｔ ｉｇａｔｉｏｎｓ″、Ｊ、　λｎ、Ｃｈｅｗ、Ｓｏｃ、Ｌ１３＝２９１−１９７ （１９’ｌ）。

２７、入、Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ、ａｔ　ａｌ、、”Ｃｈａｍｉｅａｌ　ｒｅａ ｃｔｉｖｉｔｙ　ａｔ　ａｎａｎｔｉｂｏｄｙ　ｂｉｎｄｉｎｇ　５ｉｔａ　ａ ｌｉｃｉｔａｄ　ｂｙ　ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ　ｄｅｓｉｇｎｏｆ　ａ　ｇｙ ｎｔｈａｔｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ″、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、！；ｃｉ 。

８３：６７コ６−６７４０　（１９８６）。

２Ｂ、Ｋ、Ｄ、　Ｊａｒｓｄａ　ａｔ　ａｌ、　”Ｃａｔａｌｙｔｉｃ　ａｎｔ ｉｂｏｄｉｅｓ　ｗｉｔｈ　１土ｐａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　Ｒ，ｏｒ 　Ｓ　５ｕｂｓｔｒａｔａ　５ａｌａｃｔｉｖｉｔｙ”、　５ｃｉｅｎｃｅ２４ ４：４３７−４４０　（１９８９）。

２９、　入、　’ｌ’ｒａｍｏｎｔａｎｏ　＠ｔ　ａｌ、、　”Ａｎｔｉｂｏｄ ｙ　ｃａｔａｌｙｓｉｓａｐｐｒｏａｃｈｉｎｇ　ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　 ｏｆ　ｅｎｚｙｍｅｓ″、Ｊ、　）ａｎ、　Ｃｈｅｒｎ。

Ｓｏｃ、工１０：２２８２−２２８６　（１９８Ｂ）。

コ０．　Ｘ、Ｄ、　Ｊａｎｄａ　ｅｔ　ａｈ、　−人ｎｔｉｂｏｄｙ　ｂａｉｔ 　ａｎｄ　５ｗ１ｔｃｈｅａｔａ１ｙｓ＝ｓ＝λ５ｓｕｒｖｅｙ　ｏｆ　ａｎｔ ｉｇａｎｓ　ｃａｐａｂｌｅ　ｏｆ　ｉｎｄｕｃｉｎｇａｂｚｙｍｅｓ　ｗｉｔ ｈ　ａｃｙｌ−セ＝ａｎｓｆｅｒ　ｐｒｏｐａｒｔｉｅｓ”、　Ｊ、　Ｊ４ｘｎ 、　Ｃｈｅｗ。

Ｓｏｃ、工１３：５４２７−５４３４　（１９９１）。

３１、Ｅ、Ｂａｌｄｗｉｎ　ａｎｄ　Ｐ、Ｇ、５ｃｈｕｌｔｚ、”Ｇａｎａｒａ ｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｃａｔａｌｙｔｉｃ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｂｙ　５ｉｔｅ− ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎａｓｉｓ”５ｃｉｅｎｃｅ　２４５：１１０ ４−１１０７　（１９８９）。

コ２．　ＦＣ，Ｄ、　Ｊａｎｄａ、　ａｔ　ａｌ、、　”５ｕｂｓｔｒａｔａ　 ａｔｔａｎｕａｔｉｏｎ：　入ｎａｐｐｒｏａｃｈ　ｔｏ　ｉｍｐｒｏｖ＠ａｎ ｔｉｂｏｄｙ　ｃａｔａｌｙｓｉｓ”。

Ｔａｔｒａ山ａｄｒｏｎ　４７：２５０３−２５０６　（１９９１）。

コ３．　Ｒ，入、Ｆｕうｉｉ、ａｔ　ａｌ、、”Ｅｎａｎｔｉｏｆａｃｉａｌ　 ｐｒｏｔｏｎａｔｉｏｎ　ｂｙｃａｔａｌｙｔｉｃ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”、 　Ｊ、　Ａｒｎ、　Ｃｂｅｒｎ、　Ｓｏｃ、工Ｌ３：８５３Ｂ−８５２９（１９ ９１）。

３４、Ｒ，Ｄ、Ｓｐｅａｌｍａｎ、ａｔ　ａｌ、、”Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｃ ｏｃａｉｎｅ　ａｎｄｒｅｌａｔａｄ　ｒ３ｒｕｑｓ　ｉｎ　ｎｏｎｈｕｍａｎ 　ｐｒｉｍａｔｅｓ　エエ　ｓｔｉｍｕｌａｎｔａｆｆｅｃｔｓ　ｏｎ　５ｃｈ ｅｄｕｌｅ　−ｃｏｒ、：ｒｏｌ　ｂａｈａｖｉｏｒ”、Ｊ。

Ｐｈａｒｍｃｏｌ、Ｅｘｐ、Ｔｈｅｒ、２５１：１４２−１４９゜３５、Ｊ＋　 入ｍｂｒｅ、ａｔ　ａｍ、、”Ｕｒｉｎａｒｙ　ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅ ｃｇｏｎｉｎｅｍｅｔｈｙｌ　ａｓｔａｒ、ａ　ｍａｊｏｒ　ｍｅｔａｂｏｌｉ ｔａ　ｏｆ　ｃｏｃａｉｎｅ　ｉｎｈｕｍａｎｓ”、Ｊ、Ａｎａｌｙｔｉｃδｌ 　Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ　１Ｉ＝２３−２５　（１９８４）。

３６、　Ｊ、Ａｍｂｒａ、＠Ｔｈｅ　ｕｒｉｎａｒｙ　ａｘｃｒａｔｉｏｎ　ｏ ｆ　ｃｏｃａｉｎｅ　ａｎｄｍａｔａｂｏｌｉｔａｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎｓ：　 入　ｋｉｎｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆｐｕｂｌｉｓｈｅｄ　ｄａｔａ”、 　Ｊ、　Ａｎａｌ、　Ｔｏｘｉｃｏｌ、　９：２４１−２４５　（１９８５）。

コア、　Ｒ，入、Ｌａｒｎａｒ、ａｔ　ａｌ、、”Ａｔ　ｔｈｅ　ｃｒｏｓｓｒ ｏａｄｓ　ｏｆ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄ　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：　ｃａｔ ａｌｙｔｉｃ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”、！；ｃｉｅｎｃｅ２５２：４５７−４ ５８　（１９８７）。

３Ｂ、Ｐ、Ｇ、　５ｃｈｕｌｔｚ、Ｔｈｅ　１ｎｔｅｒｐｌａｙ　ｂｅｔｗｅｅ ｎ　ｃｈａｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄｂｉｏｌｏｇｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｄｅｓｉｇｎ 　ｏｆ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｃａｔａｌｙｓｔｓ″。

Ｅ；ｃｉｅｎｃｅ　２４０：４２６−４ココ　（１９８８）。

３９、　Ｃ，Ｂ、　Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ、　”工ｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉ ｏｎ　ｉｎ　ｏｒｇａｎｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ″、Ｎ、Ｅｎｇｌ、Ｊ 、Ｈｅｅｌ、３３２：１２２４−１２２６（１９９０）。

４０、Ｅ、Ｊ、Ｚｉｅｇｌａｒ、　ａｔ　ａｌ、、Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　 ｇｒａＪ！ｌ−ｎｅｇａｔｉｖｅｂａｃｔａｒａｍｉａ　ａｎｄ　５ｅｐｔｉｃ 　５ｈｏｃｋ　ｗｉｔｈ　ＨａＬＡ　ｈｕｍａｎｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔ ｉｂｏｄｙ　ａｇａｉｎｓｔ　ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ″、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇ＋１゜ Ｍａｄ、３２４：４２９−４３６　（１９９１）。

４１、Ｒ−Ｄ、Ｍａｙｆｏｒｔｈ　ａｎｄ　Ｊ、Ｗｕｉｎｔａｎｓ、Ｄａｓ１ｇ ｎｅｒ　ａｎｄｃａｔａｌｙｔｉｃ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”、　Ｎｅｗ　Ｅｎ ｇ、　、７．　Ｍａｄ、　３２３：１７３−４７８（１９９０）。

４２、Ｌ、Ｍ、　Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ　ａｔ　ａｌ、、　”Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ 　ｈｕｍａｎ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｆｏｒ　ｔｈｅｒａｐｙ”、Ｎａｔｕｒｅ 　３３２：３２コー３２７　（１９８Ｂ）。

４３、　Ｃ，０ｕｓｅｎ　ａｔ　ａｌ、、”入ｈｕｍａｎｉｚｅｄ　ａｎｔｉｂ ｏｄｙ　ｔｈａｔ　ｂｉｎｄｓ　切ｔｈａ　１ｎｔａｒｌａｕｋｉｎ　２　ｒｅ ｃｅｐｔｏｒ″、　Ｐｒｏｃ＋Ｎａｔ１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ｒＪＥ；Ａ　１１６：１００２９−１ｏｏ３コ　（１９８９）。

４４、Ｍ、Ｊ、Ｃｈｏｗ、ｅｔａｌ、、”Ｋｉｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　ｃｏｃａｉ ｎｅ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ、ａｎｄ　ｃｈｒｏｎ ｏｔｒｏｐｉｃ　ｅｆｆｅｃｔｓ”、Ｃ１１ｎ。

Ｐｂａｒａｃｏｌ、　Ｔｈｅｒ、　３８：３１Ｂ−３２４（１９８５）。

４５、Ｔ、Ｌ、Ｅｍｍｉｃｋ　ａｎｄ　Ｒ，Ｌ、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ、”ｔＪｎ ｓｙｍｍａｔｒｉｃａｌｓｅｃｏｎｄａｒｙ　ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ　ｏｘｉｄｅ ｓ、　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ、１ｓｏｔｏｐｉｃｅｘｃｈｔｓｎｑｅ、ａｎｄ　ｓ ｔｅｒｏｃａｈｍｉｃａｌ　５ｔｕｄｉｅｓ”、Ｊ、Ａｙｎ　Ｃｈｅｘｎ。

５Ｏｔ−９０：コ４５９　（１９６＋１）。

４６、Ｙ−Ｎｉｔｔａ　ａｎｄ　Ｙ、ん＝ａｋａｖａ、　”Ｔｈａ　５ｅｌｅｃ ｔｉｖｅ　ｄａａｌｋｙｌａｔｉｏｎ口ｆ　ｍａ＠ｄ　ｅｓ＋ｔｅｘｓ　ｏｆ　 ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ　ａｃｉｄ　ａｎｄ　ｐｈａｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ 　ａｃｉｄ　ｕｓｉｎｇ　ｃａｔｉｏｎ　ｅｘｃｈａｎｇｅ　ｒｅｓｉｎ”、Ｃ ｈｅｒｎ。

Ｐｈａｒｘｎ、Ｂｕｌｌ−３４：コ１２１　（１９８６）。

４７＋Ｒ，Ｊ＋Ｐ−Ｃｏｒｒｉｕ　ａｔ　ａｌ、、”Ｒｅｃａｎｔ　ｄａｖａｌ ｏｐｍｅｎｔｇ　ｉｎＭａｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　ｔｈ＠　ｅｇｔａｒｉｆｉｃａ ｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｒｏｔａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅｃａｒｂｏｑｌ　ｇｒ ｏｕｐ”、　Ｔａｔｒａｈｅｄｒｏｎ　３６：１６１７　（１９８０）　。

４Ｂ、Ｈ，Ｄｕｄｄｅｃｋ　ａｎｄ　Ｒ，Ｌａｃｈｔ、”５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　 ａｎｄ　ＮＭＲｓｐｅｃｔｒｏｇｃｏｐｉｃ　ｉｎｖｅｇｔｉｇａｔｉｏｎ　ｏ ｆ　ｐｈｅｎｙｌ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ”、”Ｐｈｏ ｆ１．　ａｎｄ　５ｕｌｆｕｒ−２９＝１６９　（１９８７）。

４９、Ｓ、Ｋａｄａ　＠ｔ　ａｌ、、”Ａ　ｓｙｍｍａセ＝ｉｃ　１ｎｄｕｃｔ ｉｏｎ　ｖｉａ　ａｃａｔａｌｙｔｉｃ　ａｎｔｉｂｏｄｙ”、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈ ｕｒｎ、Ｓｏｃ、Ｌ工３ニア７６：１（１９９１）。

５０、Ｗ、Ｐ、　Ｒ’ｅｅｖｅｇ　ａｎｄ　Ｍ、Ｌ、　Ｂａｈｒ、　”Ｐｈａｓ ｅ−ｔｒａｎｓｆｅｒｃａｔａｌｙｇｉｇ；　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　 ａｌｋｙｌ　ａｚｉｄａｇ−５ｙｎｔｈ、　８２３（１９７６）。

５１、Ｒ，入、　Ｄｅａｎ、　ａｔ　ａｌ、、　”Ｈｕｍａｎ　１ｉｖｅｒ　ｃ ｏｃａｉｎｅｅｓｔｅｒａｓｅｓ：ｅｔｈａｎｏｌ−ｍ＠ｄｉａｔｅｄ　ｆｏｒ ｍａｔｉｏｎ　ｏｆｅｔｈｙｌｃｏｃａｉｎｅ”、ＦＡＳＥＢ　Ｊ、５：２７３ ５−２７３９　（１９９１）。

５２、Ｄ、Ｗ、　Ｌａｎ由７Ｙ、　”Ｔｏｔａｌ　ｓｙｎ廿＋ａｓｉｓ　ｏｆ　 ８Ｓ、　１４−ｃａｄｒａｎ＠ｄｉｏｌ″、ＴａｔｒａｈｅｄｒＱｎ　３９：２ ７６１　（１９８２）。

５：１．　Ｄ、Ｗ、　ＬａＪｌｄｒｙ、　ｅｔ　ａｌ＋、”Ｅｐｉｔｈａｌｉａ ｌ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ　ｃｈａｎｎａｌ。

Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｌｉｇａｎｄｓ”、　 Ｊ、Ｇｅｎ。

Ｐｈｙｓｉｏｌ、　ｌ０＝７７９−７９８　（１９８７）。

５４−　Ｄ−Ｗ、　Ｌａｎｄｒｙ、　ａｔ　ａｌ、、　”Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉ ｏｎ　ａｎｄｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ　ｃｈａ ｎｎｅｌｓ　ｆｒｏｍ　ｋｉｄｎｅｙ　ａｎｄｔｒａｃｈｅａ”、５ｃｉｅｎｃ ｅ　２４４＝ＩＪ６９−１４７２　（１９８９）。

５５、Ｇ−５，Ｔａｎｎｅｎｂａｕｍ　ａｎｄ　Ｊ、Ｂ、Ｍａｒｔｉｎ、”Ｅｖ ｉｄａｎｃａ　ｆｏｒ　ａｎａｎｄｏｇａｎｏｕｇ　ｕｌｔｒａｄｉａｎ　ｒｈ ｙｔｈ！Ｉ１ｇｏｖｅｒｎｉｎｇ　ｇｒｏ硝＝ｈ　ｈｏｒｍｏｎｅ＊ａｅｒａｔ ｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｔ”、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｑｙ　９１１＝５６ ２−５７０（１９７６）。

５６、Ｍ、　Ｂｅｎｕｃｋ、　ａｔ　ａｌ、、”Ｐｈａｒａｃａｋｉｎｅｔｉｃ ｓ　ｏｆ　ｓｙｓｔａｍｉｃａｌｌｙａｄｍｉｎｉｓｔａｒｅｄ　ｃｏｃａｉｎ ｅ　ａｎｄ　ｌｏｃｏｍｏｔｏｒ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ　ｉｎｍｉｃｅ”、 Ｊ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、ムｐ、Ｔｈｅｒａｐ、２４３：１４４−１４９（１９ ８７）。

〈第ニジリーズの実験〉 抗体触媒されたコカインの分解 コカインのリン酸モノエステル遷移状態アナローグによる免疫化は、コカインベ ンゾイルエステル基の加水分解を触媒する能力を有するモノクローナル抗体を提 供した。放射線標識されたコカインの分解のアッセイは、活性酵素を同定した。

ベンゾイルエステルの加水分解により、コカインの興奮作用が欠けたフラグメン トである、エコゲニンメチルエステルおよび安息香酸が得られる。人工の酵素の ような受動的な免疫化は、強化を鈍くすることにより依存症の治療を提供するこ とができる。

コカインの常用癖は、流行の広がりの中で西部の全住民を悩ませている。コカイ ンの例外的な強化効果により、この興奮剤が悪用され、治療を妨害する（１）。

コカインは、この薬物の最高血中濃度、ピークに達するまでの速度および血清中 濃度の変化の度合いと関連して自己投与（ｓｅｌｆ’ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉ ｏｎ）を増大する（２）。この薬物は、血清から中枢神経系（ＣＮＳ）へ急速に 分配され、幾つかのモノアミンニューロトランスミツターのための再取り込みキ ャリアに特異的に結合する（３）。これらのシナプス前件のニューロトランスポ ーターの機能は、放出されたニューロトランスミツターの失活であるらしい（４ ）。コカインの強化効果を仲介するレセプターは、ドパミンの再取り込みを競合 阻害する結合部位に対応する（５）。この再取り込み阻害は、中脳辺縁皮質性経 路におけるドパミン作動性の神経伝達を強化し、最終的な結果として強化すると 仮定する。コカイン誘導性強化の直接的なアンタゴニストは目下存在せず、デジ ブラミンのような禁断促進剤は、数週間の誘導期間を有する（７）。

コカインレセプターの薬理学に基づいた治療学的アプローチに代わって、コカイ ンのレセプターへの送達を遮ることができる。アヘンに対する抗体が、アカゲザ ルでの薬物自己投与の範例においてヘロインの強化効果を拮抗することがわかっ ている（８）。しかしながら、少量のヘロイン投与でのヘロイン自己投与を無く すことに成功しているが、これらの抗体は、錯体形成による抗体循環の枯渇のた めに、多量の反復投与に対しては失敗している。

近頃の触媒抗体の開発（９）は、抗体枯渇の問題の可能性のある解決を提供して いる。次第に消えてゆく化学反応の遷移状態の構造の安定したアナローブによる 免疫化により、設計した反応を触媒する能力を有するモノクローナル抗体を得る ことができる（ｌＯ）。触媒抗体は結合し、非活性化された形質変換を触媒し、 再結合しない抗体を有する不活性生成物を放出する。全ての通常の悪用される物 質の中で、コカインは、触媒抗体のアプローチに対して最高の志願者である。

コカインのベンゾイルエステルの触媒抗体による加水分解により、コカインの興 奮活性または強化活性もちっとも残っていないフラグメントであるエコゲニンメ チルエステルおよび安息香酸が得られる。天然の酵素のそれに近づくエステラー ゼ活性を有する抗体が報告され（１２）、大きな疎水性の面を有するコカインの ベンゾイルエステル側基が、強力な結合および触媒活性を有する抗体を誘い出す のに特に適している。

ベンゾイルエステル開裂反応の遷移状態は、おそらくセカンドオーダーのエステ ル加水分解の四面中間体（１３）に類似し、幾何学によって安定して模倣するこ とができ、適当に設計されたリン酸モノエステルにより配置を満たすことができ る　（９，１４）（図２）。リン酸モノエステル官能基に基づく遷移状態アナロ ーブは、最も活性の高い人工のエステラーゼを生産する（１２）が、これらのア ナローブは触媒活性抗体を誘い出すことを特異体質で失敗し、アナローブ構築の ためのルールを経験的に定義しなければならない（１５）。近頃開示された、酵 素抗体を得ることの頻度を増加だめの戦略は、「誘引およびスイッチ（ｂａｉｔ 　ａｎｄ　５ｗ１ｔｃｈ）Ｊ　（１６）および基質希釈（１５）を含む。しかし ながら、これらのアプローチは、アナローブに関係のない追加の構成要素を取り 入れ、より高いＫ。値を有する酵素において概してアナローブと構造との間の不 一致を生ずる。

すなわち、出発点として、我々は、リン酸塩の置換および免疫原性コンシュディ トの調製のためのテター（ｔｅｔｈｅｒ）の取り入れによりコカインと異なる忠 実度の高いアナローブを構築することを選択する。テタ一部位を加水分解の予測 される部位（１ｏｃｕｓ）から距離を隔てかつその合成を容易にするために、メ チルエステル基を選択した。これらの考慮に基づいて、我々は、遷移状態アナロ ーブ±とを容易に入手可能なコカイン代謝物（−）−エクゴニンから合成した（ 図３）。

利用可能な方法（１８）が、そのベースが不安定でかつ立体障害であるためにア ルコール主（変換することができないので、我々は、ｌＨ−テトラゾール触媒に よる新規なリン酸エステルの合成方法（１７）を開発した。テトラゾールは、ｌ Ｏおよび２０アルコールをリン酸二塩化物ヘモノアディジョン（ｍｏｎｏａｄｄ 　ｉ　ｔ　１ｏｎ）するのを選択的に触媒して、温和な条件下で混合リン酸二エ ステルが得られる（ｐＪ３　、活性化されたエステル５のキャリア蛋白への結合 能力をモニターするために、Ｉ４０標識をテターに組み入れた（に〇、　Ｂ　Ｓ 　Ａコンシュゲイトとしたｌａによるマウスの免疫化は高い力価の抗血清を誘い 出し、モノクローナル抗体を標準のプロトコルにより調製した（１９）。各フュ ージョン操作により、アナローブ特異性の抗体を分泌する１０〜３０のハイブリ ドーマを得た。これらのハイブリドーマはＥＬＩＳＡにより決定した。全てのＩ ｇＧ抗アナローグ抗体をサブクローニングし、腹水中で繁殖させ、蛋白Ａカラム アフィニティークロマトグラフィーにより精製した（２０）。

単純な方法が、コカインのベンゾイルエステル結合に対する加水分解活性のため のモノクローナル抗体をスクリーニングするために案出された。我々は、”　Ｃ ｂａ＋ｍｙｌ−コカイン（２１）を合成し、これが酸性化により９４％の効率で 水層中に分配し、一方、１４Ｃ−安息香酸が有機層中に同様の効率で分配するこ とがわかった。放射線標識されたコカインのカルボキシエステル類（Ｓｉｇｍａ ）との反応は、陽性コントロールとして役立ち、我々はＨＰＬＣ分析により安息 香酸の生成を確認した（２２）。我々は、精製されたモノクローナル抗体に対し てスクリーニングを行い、２９のうち、上記バックグラウンド：３Ｂ９および６ Ａ１２の１４Ｃ−安息香酸を一貫して放出する２つの抗体をテストした（モノク ローロナルＩｃＩは最大活性のために高いｐＨを要求し、恐らくこれらの条件下 で不安定であるために、触媒性が矛盾して観察された。）。酵素は両方とも、５ ０μＭの遊離遷移状態アナローブｌｂにより完全に阻害され、血清エステラーゼ 阻害剤エゼリン（２３）１μＭにより影響されず、各抗体のＦａｂ部分は触媒活 性を保持した（２４）。

さらに特異的活性が高い３Ｈ’ｐｂｗｙ＋−コカイン（２５）（３２Ｃｉ／ｍｍ ｏりを用いて、我々はモノクローナル抗体の存在下および非存在下での加水分解 速度を、基質濃度の関数として決定した。５％未満の反応に対応する時間ポイン ト化たりの放射線標識された３Ｈ工、、１−安息香酸の放出が、初期速度を提供 した。我々は、各酵素について、ミカエルスーメンテン反応速度論に一致した飽 和行動および直線状のラインライ−バー・プルクプロットを観察した（図４）。

この定常状態のミカエルスーメンテンパラメーターおよび加速率（ｋｃ、、／に ０）を表１に示す。

表１ モノクローナル抗体３Ｂ９および６Ａ１２ならびにブチリルクロリンエステラー ゼ（ＢＣｈＥ）による３Ｈｐ　ｈ　ｃ　ｎ　ｙドコカインの加水分解の反応速度 論パラメーター Ｋ。、ミカエルス定数：　ｋ　ｃ　ａ　ｌ　：触媒速度定数；に０：自然速度（ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ　ｒａｔｅ）Ｈｐ４ｓ＋ｙｌ−安息香酸の放出速度は、 図４に示すアッセイにより決定した。ウマのＢＣｈＥ加水分解（ｐＨ７，４）の ためのパラメーターは公知の出典（２６）に由来する。

３Ｂ９　４９０±１１　０．１１±０．０１６Ａ１２　１０２０±５００　０． ０７２±０．０２ＢＣｈＥ　３８　１．２ コ力インエステラーゼｍＡｂ　３Ｂ９の活性は、ブチリルクロリンエステラーゼ （２６）、血清中の主なコカインエステラーゼに匹敵する。遷移状態アナローブ １ｂはｍＡｂ　３Ｂ９を２μＭ未満のに１で阻害し、酵素の１０２〜１０３の加 速率は、グラウンド状態（ｇｒｏｕｎｄ−５ｔａｔｅ）に対する遷移状態の相対 的な安定化（Ｋ、、／Ｋ　、）に対する大きさに対応する。

さらに強力な触媒メカニズムおよび１０５〜１０’の加速率を有する抗体は、ｌ ａおよびそのコンシュゲイトの反復スクリーニングにより同定できる（１４．２ ８）。

反復コカイン自己投与の抗体誘発消去（ａｎｔ　１ｂｏｄｙ−ｉｎｄｕｃｅｄｅ ｘｔｉｎｃｔｉｏｎ）　（２）の動物実験は、抗体枯渇のため前もって実行不可 能であるが、ｍＡｂ　３Ｂ９を使用することにより実行可能である。単にコカイ ンに結合した抗体は、最初の投与により枯渇する。ところが、ｍＡｂコカインは 、９分間で代謝回転し、代謝回転により再生する。１０〜１５分の標準最小投与 間隔は代謝回転のためであり、この最初の人工のコカインエステラーゼ′の控え 目の活性のために、抗体の化学量論量に近い量が必要である。１ｇ未満の臨床的 に実用上の投与量で有用な抗体の特徴を評価するために、我々は、１００ｍｇの 吸引されたクラックコカイン（ｃｒａｃｋ　ｃｏｃａｉｎｅ）の量、ｌＯμＭ〜 ３０μＭの最高肺静脈コカイン濃度（２９）および２０秒間の反応持続時間（肺 からＣＮＳへの毛細管の通過時間）を仮定した。この簡単なモデルは、コカイン の分配の容量、および、もし含めるならば反応速度論の所要量を少なくする生理 学的効果のための濃度の閾値を無視している。このような条件下で、ＣＮＳへの 顕著な分配が起こる前にコカインが不活化されるためには、コカインに対する触 媒抗体は、２５ｅｃ−’以上の代謝回転数および３０μＭ未満のに、を有しなけ ればならない。しかしながら、人工のエステラーゼにより妨害される保護は、有 用であるために完全である必要は無い。

それにもかかわらず、顕著にもっと少ない良く効く酵素は、コカインの上昇速度 および最高濃度を減少させることによりコカインの強化効果を減少できる。使用 の中止および禁断の維持を促進することにより、抗コカイン触媒抗体による受動 的な免疫化により、適切な精神患者社会の窓および再発予防の仲介を提供できる 。

ユ止ヱ工二工立去！立！ニス里旦互１Ｚ二上Ｌ　Ｆ、Ｈ，Ｇａｗｉｎ、Ｅ、Ｈ， Ｅｌｌｉｎｗｏｏｄ、　Ｊｒ、、Ｎｅｗ　Ｅｎｇ、　Ｊ、　Ｍａｄ。

コ”Ｌ　１１７コ　（１９８８）。

２、　Ｍ、Ｗ、Ｐｉｇｃｈｍａｎ、　Ｊ、Ｃ１１ｎ、ＰｓｙＣｈｉａｔｒｙ　４ ９（２，８ｕＰＰｌ）Ｋ７（１９８８）；　Ｊ、　Ｂｅｒｇｍａｎ、　ＢＪ、　 Ｍａｄｒａｓ、　Ｓ、Ｅ、　Ｊｏｈｎｓｏｎ、　Ｒ，Ｄ。

Ｓｐｅａｌｍａｎ、　ｊ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　Ｉ！ｘｐ、　Ｔｈｅｒ、　 ２５１．１５０　（１９８９）　；Ｃ，Ｅ、Ｊｏｈａｎｓｏｎ、ｉｎ　ＮＩＤＡ 　Ｒ＠Ｓ、ＭＯｎＯｑｒ、５Ｊ　Ｊ・Ｇｒａｂｏｗｓｋｉ、　ａｄ、（Ｕ、Ｓ、 　Ｇｏｖｔ、　Ｐｒ１ｎｔ、　Ｏｆｆ、、　Ｗａｓｈｉｎｇｔ口ｎ。

Ｄ、Ｃ，、１９８４）　ｐｐ５４−７１゜コ、　Ｎ−Ｅ、ｃｏａａｅｒｓ、Ｊ、 Ｅ、Ｓｍ１ｔｈ、５ｃｉｅｎｃｅ　２２Ｌ、７７コ　（１９８コ）・４、　Ｍ、 Ｊ、、Ｋｕｈａｒ、Ｍ、入、Ｚａｒｇｉｎ、ｊ、Ｎｅｕｒｏｃｈｔａｍ、３１． 　２５１（１９７５）；　Ａ、Ｓ、Ｈｏｒｎ　Ｐｒｏｇ、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ、 　３４．　コ８７　（１９９０）。

５、　Ｍ、Ｃ，Ｒｉｔｚ、Ｒ，Ｊ、Ｌａｍｂ、Ｓ、Ｒ，Ｇｏｌｄｂｅｒｇ、Ｍ− Ｊ、Ｋｕｈａｒ。

５ｃｉｅｎｃｅ　２コア、　１２１９　（１９８７）、コカイン感受性ドーパミ ントランスポーターは既にクローンされている。　Ｓ、Ｓｈｉｍａｄａ、ａｔ　 ａｌ。

５ｃｉｅｎｃｅ　２５４．　２５７６　（１９９１）；　Ｊ、Ｅ、Ｋ１１ｔ”／ 、Ｄ、Ｌ口ｒａｎｇ　。

Ｓ、Ｇ、　Ａｍａｒａ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２５４．５７８　（１９９１）。

６、　Ｍ、Ｊ、　Ｋｕｈａｒ、　Ｍ、Ｃ，Ｒｌｔｚ、　ＪｊＪ、　Ｂｏｊａ、　 Ｔｒｅｎｄｓ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ。

１４、２９９　（１９９１）。

７、　Ｆ、Ｈ，Ｇａｗｉｎ、ａｔ’　ａｌ、、Ａｒｃｈ、Ｇ４Ｉｎ、Ｐｓｙｃｈ ｉａｔｒｙ　１エフＩ（１９８９）；　Ｍ、Ｗ、　Ｆｉｓｃｈｍａｎ、　Ｒ，Ｗ 、　Ｆｏｌｔｉｎ、Ｇ、Ｎｅ５ｔａｄｔ。

Ｇ−Ｄ、Ｐｅｒｌｓｏｎ、Ｊ、　Ｐｈａｘｖａｃｏｌ、　Ｅｘｐ、Ｔｈｅｒ、２ ５３．　７６０゜（１９９０）　。

ｓ、　Ｋ、Ｆ、　Ｂｏｎｅｓｅ、　Ｂ、Ｈ，Ｗａｉｎｅｒ、　Ｆ、％４．　Ｆｉ ｔｃｈ、　Ｒ，Ｍ、　Ｒｏｔｈｂｅｒｇ。

Ｃ，Ｒ，５ｃｈｕｓｔｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ　２５２．７０８　（１９７４）。

９・　入、ＴｒａｍＯｎｔａｎＯ，Ｋ、Ｄ、Ｊａｎｄａ、Ｒ，Ａ、Ｌａｒｎｅｒ 、５ｃｉｅｎｃｅ２３４．１５６６　（１９８６）；　Ｓ、Ｊ、Ｐｏ１ｌａｃｋ 、Ｊ、Ｗ、Ｊａｃ口ｂｓ、Ｐ、Ｇ。

５ｃｈｕｌｔｚ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３４．　１５７０　（１９８６）。

１０、Ｒ，Ａ−Ｌｅｒｎｅｒ、Ｓ、Ｊ、Ｂａｎｋｏｖｉｃ、Ｐ、Ｇ＋５ｃｈｕｌ ｔｚ、５ｃｉｅｎｃｅ２５２、４５７　（１９８７）。

１１−　Ｒ，Ｄ、Ｓｐａａｌｍａｎ、Ｂ、に、Ｍａｄｒａｓ、Ｊ、Ｂｅｒｇｍａ ｎ、　Ｊ。

Ｃｈｅｍ−Ｓｏｃ、　１１０．　２２８２　（１９８Ｂ）；　λ入、Ｌｅｒｎｅ ｒ、Ｓ、Ｊ。

Ｂｅｎｋｏｖｉｃ、　Ｐ、Ｇ、　５ｃｈｕｌｔｚ、　５ｃｉｅｎｃｅ　ＩＳ２． 　６５９　（１９９１）。

１コ、　ＩＬ、Ｂｅｎｄｅｒ、Ｃｈｅｍ、Ｒｅｖ、　６Ｇ、５３　（１９６０） 。

１４．　Ｐ、Ｇ−５ｃｈｕｌｔｚ、５ｃｉｅｎｃｅ　２４０．４２６　（１９８ ８）。

１５、ＩＤ、Ｊａｎｄａ、５．Ｊ、Ｂａｎｋｏｖｉｃ、Ｄ、Ａ８ＭｃＬｅｏｄ、 Ｄ、Ｍ−５ｃｈｌｏ＠ｄｅｒ、　Ｒ＋λ＋　Ｌｅｒｎａｒ、　Ｔｅｔｒａｈｅｄ ｒｏｎ　４フ、　２５０３（１９９１）。

１６、Ｋ、Ｄ、　Ｊａｎｄａ、　Ｍ、工、　Ｗｅｉｎｈｏｕｓｅ、　Ｔ−Ｄａｎ ｏｎ、　Ｋ、Ａ、　Ｐａｃａｌｌｉ。

Ｄ、Ｍ、５ｃｈｌｏａｄｅｒ、　Ｊ、Ａｊｌｌ、Ｃｈｅｗ、Ｓｏｃ、　工１３． 　５４２７（１９９１）。

１７、Ｋ、　Ｚｈａｏ、　Ｄ、Ｗ、　Ｌａｎｄｒｙ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、 ４９．３６：Ｉ　（１９９３）。

ｌａ、Ｒ，Ｊ、Ｐ、　Ｃｏｒｒｉｕ、　Ｆ、　Ｌａｎｎｅａｕ、　Ｄ、　Ｌａｃ ｌｅｒｃｑ、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ３＋５．１６１７　（１９８０）；　Ｋ 、Ｄ、、　Ｊａｎｄａ、　Ｓ、Ｊ、、　Ｂａｎｋｏｖｉｃ、　Ｒ，λ。

Ｌｅｒｎａｒ、５ｃｉｅｎｃｅ　２４４．４３７　（１９８９）；　Ｓ、Ｊ、　 Ｐｏ１ｌａｃｋ、ＰＨ５ｉｕｎ、　Ｐ、Ｇ、　５ｃｈｕｌｔｚ、　Ｊ、　Ａｍ、 　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　工１３．５９６１（１９Ｂ９）；　ｓ、１に＠ｄａ、 Ｍ＋工、Ｗｅｉｎｈｏｕｓｅ、Ｋ、Ｄ、Ｊａｎｄａ、Ｒ，Ａ。

Ｌ４Ｉｒｎａｒ、ｓ、Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋｙ、Ｊ、ＡＩ！Ｉ−Ｃｈｌｌｍ−５ ＯＣ−ｔ　ｘｌｘ。

７７６　（１９９１）；　工、Ｐｕｊｉｉ、Ｒ，Ａ、Ｌｅｒｎｅｒ、Ｋ、Ｄ、Ｊ ａｎｄａ、Ｊ。

Ａｍ、Ｃｈｅｍ、’Ｓｏｃ、、工１コ、８５２８　（１９９１）。

１９．６匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを、アナローブキャリアｌａで皮下（３０μｇ ）および腹腔内（１２０μｇ）ルートの両方により免疫化した。初期免疫化は、 １：ｌフロイント完全アジュバントにより行い、ブースティングインジェクショ ンを不完全アジュバントともに２週間の間隔をおいて投与した。１４４日目、こ の動物を静脈切開（２００μＬ）してボストブーストし、血漿を血餅から分離し 、−７８℃で貯蔵した。

ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、プラスチック９６ウエルプレートをオブアルブミ ンに結合したエステルｉでコートし、希釈血清と共にインキュベートした。西洋 わさびペルオキシダーゼに結合したヤギ抗マウスＩｇＧを第２抗体およ阻害剤と して使用した。ネガティブコントロールは、リガンドのないオブアルブミン、非 免疫検定血清、この検定血清の省略および第２抗体の省略を含む。三番目のブー ストにより、幾つかのマウスをｌ　：３０００の抗体力価で展開した。これらの うちの一つを、尾静脈注射（５０μｇ、アジュバント無し）によりブースとした 。５日目にポストブーストし、牌臓を収穫し、ハイブリドーマを調製した。抗ア ナローグ抗体のためのＥＬＩＳＡにより陽性のコロニーをブレーティングして限 界希釈し、サブタイプした（ｍＡｂ　３Ｂ９および６Ａ１２を両方ともＩｇＧ＋ にサブタイプした。） セルラインの夫々について、２ｘ１０６ハイブリドーマ細胞を、ブリスタン（ｐ ｒｉｓｔａｎｅ）で前処理したマウス腹膜内においた。収穫した腹水を分離用蛋 白　Ａ　ＨＰＬＣカラム（ファルマシア）上でのアフィニティークロマトグラフ にかけた（ｍＡｂ　３Ｂ９および６Ａ１２の純度は５ＤＳ−ＰＡＧＥで９０％を 超えた。） ２１、＋４Ｃｂｅｎｚ。、ｌ−コカインを、メチルエステルおよび１４Ｃ−安息 香酸からアシルクロライドを介して合成した。比活性は１１１μｃ　ｉ／ｍｍｏ 　Ｉであった（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏｒｐ、）　。

２２、加水分解反応混合物を分析用逆相Ｃ目カラム（ＶＹＤＡＣ）、アセトニト リル−水（０，１％トリフルオロ酢酸）グラジェントおよび２２０ｎＭの検出器 セットを用いたＨＰＬＣ（Ｐｃｒｌｉｒ＋−Ｅｌｍｅｒ）により分析した。我々 は、コカインのメチルエステルがペンゾイルエクゴニンにｔ＋７２＝２０ｈ　（ ｐＨ７）で自然に加水分解することを確認した。すなわち、ペンゾイルエクゴニ ンは、詳細な反応速度論で用いられる早い反応時間（＜ｌｈ）ではベンゾイル− エステラーゼ基質として入手できず、放出された安息香酸はコカイン加水分解だ けに帰する。

２３、Ｄ、Ｊ、　Ｓｔｅｗａｒｔ、　Ｔ、工ｎａｂａ、　Ｂ、　Ｔａｎｇ、　Ｍ 、　Ｋａｌｏｗ、　ＬｉｆｅＳＣユ、２０．　１５５７（１９７７）。

２４、非公知データ ２５、３Ｈ１ｍ＋５ｙｌ−コカインは、高い比活性の重水素ガスを用い、Ｐｄ／ Ｃ触媒の存在下での４゛−ヨードコカインの触媒還元を介して合成した（Ｎｅｗ 　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）　ｏ　４　’　−ヨードコカインはエコゲ ニンメチルエステルおよび４−ヨードベンゾイルクロライドのＡｇＣＮ触媒の存 在下でのカップリングにより得られた。

２６、Ｓ、Ｊ、　Ｇａｔｌｅｙ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｐｈａｒｍａｃｏ ｌ、　４１．１２４９（１９９１）。

２７６１等量の１垣は３Ｂ９・触媒コカイン加水分解の速度を〜５０％まで減少 した。

２Ｂ、Ｒ，Ａ、　Ｌｅｒｎｅｒ、　Ａ、Ｓ　Ｋａｎｇ、　Ｊ、Ｄ、　Ｂａ１ｎ、 　Ｄ、Ｒ，Ｂｕｒｔｏｎ。

Ｃ，Ｆ、ｂａｒｂａｓ、　５ｉｃｅｎｃｅ　２５８．１３１３（１９９２）。

２９、これらの濃度は、末梢静脈濃度の１０倍より高く、見積もったＣＮＳコカ インレベルに相当する；Ｊ、Ｓ　ＦＯＷｌｅｒ。

ｅｔ　ａｌ、　！；ｙｎａｐｓｅ　４．３７１（１９Ｂ９）。

〈第三シリーズの実験〉 １．遷移状態アナローブの股言および合成光の文献および先の実験シリーズで得 られたデータは、リン酸モノエステル遷移状態アナローグ主（下記参照）が、コ カインに対する加水分解活性を有し且つより触媒性の高い幾つかの抗体を生じる であろうことを示している。しかし、高活性の抗体が探査され、この探査が成功 する確率には偶然の要素が含まれている。これは、アナローブに対する抗体が全 体の抗体／抗原・結合親和性に基づいて誘導されるのに対して、触媒活性は遥か に高い特異性をもった結合相互作用系列を必要とするという事実に由来している 。成る抗体は良く結合しはするが、強力な触媒能に必要な完全な相互作用系列を 欠いている。また、遷移状態の安定化のみによって作用する触媒抗体は、その加 速率（ｋ／ｋ）が、抗体の相ｃａｔ　ｕｎｃａｔ 射的結合親和性（−Ｋｍ／に１）、即ち基質への結合に対する遷移状態（または Ｔ、Ｓ、アナローブ）への結合比率に限定される（２６）。従って、偶然の酸／ 塩基触媒または共有結合触媒の不存在下においては、ｋ　／ｋ　は低くなるでｃ ａｔ　ｕｎｃａｔ あろうしくｌＯ３〜１０４）、またｋｃａｔおよびＫｍは（望ましくなく）同じ 方向に変化するであろう。我々の速度論的明細に従って、我々は、追加の遷移状 態アナローブを合成して用いることにより、高活性抗体を迅速に増強する可能性 を増大させるように試みることにした。これらのアナローブは下記の５つの基準 に従って構築される：（１）キャリア蛋白に結合する代替部位の使用；（市）該 アナローブのアシル部分における化学修飾；（ｉｉｉ）分子内の酸／塩基触媒を 促進し、且つ新世代アナローブのためのモデルとして働き得る新規な遷移状態ア ナローブ；（ｉｖ）第二の新規なりラスの共有結合触媒および第二世代遷移状態 アナローブ設計の他の例になり得ること；及び　（ｖ）オキサイド基のような、 燐酸エステル基に対する尾部利用の代替え（ａｎａｌ　ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ　ａ ｌｔｅｒｎａ−ｔｉｖｅ）。

（ｉ）アナローブ結合の代替部位 小分子上のキャリア蛋白への結合部位は、免疫原の抗原性および誘導された抗体 における特異性に影響する。触媒抗体を生成するための特別の関心は、キャリア 蛋白への結合のためにアナローブ上の部位を使用することによって、実際の基質 上の当該部位を横切って結合する抗体誘導が排除されることである。例えば、コ カインのメチルエステルは、３によって誘導された抗体における深い結合ポケッ トを占め難い傾細胞される抗体の範囲を増大するために、コカイン芳香環の４′ 位置における代替結合部位を有するアナローブが（例えば１２）構築されており 、またコカイン窒素で結合したアナローブ′（例えばユ）も合成することができ る。これら新規アナローブの夫々は、加水分解のために必要な結合相互作用系列 をもった抗体を誘導する可能性のある異なった表面を露ルエクゴニンは、テトラ ゾール触媒によってアルコール基を燐酸エステルに変化する前または後の何れで あっても、１８へ容易に転化される中間体を生じるものと期待される。立体障害 のモデル評価に基づけば、四級アンモニウム塩へ−のジアルキル化よりも、モノ アルキル化の方が達成されると思われるが、必要であれば、ａ−ハロアミドのよ うな不活性化アルキル化剤を用いることができる。

アナローブ１．ユおよび１旦（遷移状態アナローブを設計するための立証された 燐酸モノエステル戦略の全ての例）を用いれば、結果的に所望の高活性酵素が得 られると思われる。この研究を更に促進し、遷移状態アナローブ設計への新規な アプローチを研究するために別の戦略が探求された。

（ｉ　ｉ）アシル修飾、基質稀釈度および「誘引およびスイッチ（ｂａｉｔ　ａ ｎｄ　５ｗ１ｔｃｈ）Ｊ戦略誘導された抗体における非共有結合的相互作用、並 びにおそらくは触媒活性を最大にするために、燐酸モノエステル遷移状態アナロ ーブは、典型的には標的エステルの構造に近似させててモデル化される。しかし 、触媒抗体によるエステル分解は、一つの例において、アシル化抗体の中間体（ その加水分解が律速的である）を通って進行することが示されている（２０）。

このような状況において、アナローブと基質との間の構造的な差異は、アシル抗 体中間体を不安定化することによって、全体のエステル加水分解速度を増大する ことを可能とする。最近、基質を稀釈化して触媒効率を増大させるという一般的 原理が発表されており　（３２）、コカインのフェニル環は広範な修飾を導入す るための便利な部位である。

このフェニル基は、フラニル基のような複素環で置き換えてもよい。或いは、フ ェニル基をピリジニウム基で置換することによっても、一般的な塩基触媒を提供 するカルボキシル基が誘導されるであろう。このアプローチは、最近発表された アナローブ設計のための「誘引およびスイッチ」戦略（３０）に関する一つの変 形であろう。テトラゾール触媒法を用いるこれら可能性の幾つか（過剰な基質稀 釈がＫ　に及ぼす有害な影響が注目に値する）は、合成することができる。

アルキルエクゴニン及び必要な芳香族燐酸エステルの濃縮を介して進行するアシ ル修飾された遷移状態アナローブの構築は・主および１２の合成のようにして行 われる。２−ピリジル燐酸（Ｂ）、、（５４）と同様に、必要な２−フラニル燐 酸塩化物（人）は報告されている（５４）。

！ｌ　Ω （ｉｉｉ）分子内の一般的な酸／塩基触媒の誘導酵素は、歪み（ｓｔｒａｉｎ） 、エントロピー効果および酸／塩基触媒を含む幾つかの触媒機構を共奏的に使用 することによって、高いターンオーバー率を達成する。燐酸エステルによって誘 導された触゛媒抗体は、これら全ての機構を利用することが可能であ・ろう。し かし、先に言及したように、該抗体は全体の結合親和性によって誘導され、従っ て強力な触媒能のための適当な相互作用系統は存在しない。しかしながら、酸性 基または塩基性基を有する複雑な基質は、我々に対して、触媒能に関与するこれ らの基を特異的に制御できないというこの問題の解決法を示唆する。適切に誘導 された触媒抗体は、その全体の結合特性によって、基質自体の酸性基または塩基 性基を、基質の加水分解のための一般的な酸／塩基触媒を提供するように位置付 けることができるであろうということが提案されている。例えば、コカインのア きンは生理的ｐＨでプロトネートされてアンモニウムイオンになり、また立体的 な理由から、プロトンはベンゾイルエステルに向けて配向される。

１−か１−外力τち−３二名−シ、立伏ｆｔｂか程由値１ち一ペン・Ｉイル某は ア立体的に好ましくない吻 ンモニウム基から遠ぐなるように配向し易い。にもかかわらず、旦のような遷移 状態アナローブによって誘導された抗体は、その全体の結合によって、コカイン のベンゾイル基をロパンＮ（ルートＢ）またはＣ−３水酸基（ルートＣ）での結 合で始まり、適切な保護基の再構成を伴う段階的な構築に雨傘効果（５７）に起 因して、トロパン窒素でのｓｙｎ／ａｎｔｉ異性を気にする必要はなく、従って ２０及び２１の合成で記載した中間体の窒素における立体配置は任意的なもので あることに留意すべきである。

左上のためのツルーＮ−メチルエクゴニンのＮ−酸化（必要に応じてＣ−３水酸 基の保護／脱保護を伴う）によって、ヒドロキシルアミン誘導体が生じるであろ う。フェニル燐酸二塩化物との反応により、所望の生成物が生じる。アナローブ ２２は全合成を必要とし、２２のためのこのような合成は、関連化合物１土の全 合成との関係において以下に提案される。

（ｉｖ）分子内の共有結合的触媒の誘導分子内酸／塩基触媒の誘導に味方する上 記の議論との直接の類似によって、分子内共有結合的触媒を誘導する可能性が研 究される。こうして、２３のような遷移状態アナローブによって誘導される抗体 は、その全体の結合エネルギーによって、コカインのベンゾイル基をトロパン窒 素に近接させることができる。アンモニウム塩と平衡にあるのは遊離アミンであ り、このアミンはベンゾイルのカルボニル基を核攻撃することができる。三級ア ミンによるエステル加水分解の触媒については先例が存在しく５８．５９）、ま た分子内触媒はエントロピー駆動力を最大限にする。抗体が窒素の回りに疎水性 の結合ポケットを形成しく２２）、これによってアミンのｐＫａを低下させ、平 衡をコカインの核性遊離塩基側に移動させるならば、触媒作用を更に向上させる ことができる・この点において、２．３の窒素はもはや塩基性ではなく、その相 補的抗体結合部位は帯電しない傾向にあ６す、比較的疎水性テすることに留意す べきである。この分析に基づいて、二つのアナローブが提案される。

チルエクゴニン（ＮＩＤＡを介して入手可能）の縮合によって容易に入手するこ とができる。この化合物が不安定であることが示されたときは（Ｎ−Ｐ結合は不 安定なことがあり、これはｐＨ７，４のＤ２０中の連続３２Ｆ−−ｎｍｒで評価 でき持することを可能にする。

計の全炭素バージョンを構成している。これらアナローブは全合成を必要とし、 これには幾つかの合成上の障害がある。

即ち、Ｃ−８における置換基の立体配置が制御されなければならない；Ｃ−３に おける立体配置はＣ−８／Ｃ−３ブリツジの構築中に残存する；Ｃ−２における アクシャルの立体配Ｍ（熱力学的には不利であり、不安定である（６０））が制 御されなければならない。コカインの特にニレガントな合成（６１，６２）は、 電子循環的な閉環によってＣ−２およびＣ−３の立体化学を制御しており、電子 循環的解決が全炭素系における問題に対して提案されている。ジシクロペンタジ ェンＡは、二酸化セレン（６３）でアリル酸化され、これに続いてコリンズ試薬 （６４）と、ジアルキルフェニルホスフィン酸エステルのアルブゾフ型マイケル 付加（６６）によってＣを生じる。Ｒ＝ＣＨ３については、引き続＜３．３’− ジクロロアリルアルコールとのエステル交換、並びにアリルホスフィン酸エステ ルの直接付加の研究を試みることができる。ケトンの還元およびオレフィンへの 脱離（トシレートを経由するＥ２）に続いて、ヨウ化メチルで非共役アルキル化 （６７）Ｌ、燐に関して０位にある炭素を４級化する。アリルエステルの二ル− トは［３、３］シグマトロピー転移（６８）または塩素の脱離を受けるので、こ のアルキル化のステップでは、Ｃのメチルエステルが必要とされるであろう。化 合物りは重要な中間体であり、必要であれば別のルートを採用することができる 。例えば、Ｂに対してトリメチルホスファイトのマイケル付加を行い、ケトンを オレフィンに変換し、。位のメチル化を行い、次いでこのメチルホスホノクロリ デート誘導体に対するフェニルリチウムの付加を行う。Ｄを１７０℃に加熱する と、逆ディールス・アルダ−反応に続いて分子内ディールス・アルダ−反応が起 こり、Ｃ１，Ｃ２，Ｃ４およびＣ７での立体化学を制御されたＥを生じると思わ れる。

このルートは、ノーペル賞受賞者のＲ，Ｂ、　Ｗｏｏｄｗａｒｄとの共同研究に なるＤｒ、Ｄｏｎａｌｄ　Ｗ、Ｌａｎｄｒｙ　の博士論文のための、二環系セス キテルペン（セドランジオール（（ｅｄｒａｎｅｄｉｏｌ））の合成に用いられ るルートに類似している。

この　ｇｅｍ−ジクロライドのＡｇ＋　触媒による加溶媒分解と、オレフィンの 接触水素化によって、Ｆを生じさせることができる。一連のニトロメタン付加／ 接触ニトロ還元／ジアゾ化を用いた位置選択的な環拡大によって、ケトンＧを生 成させることができる。α位は橋頭にあるのでβ脱離は起こりそうにないが、別 の方法としてはシアン化トリメチルシリル付加（７０）を行うことができる。モ デルは、立体障害の小さい２面からのニトロメタンの付加は、環拡大のための適 切な位置化学（３−ケト）をもたらすであろうことを示唆している。

また、α面から付加し易い関連化合物は、４−ケト位置異性体（７０）を優勢に （７５：２５）生しることを示唆している。

最後の手段として、４−ケト異性体を３−ケト異性体に変換する便法を用いるこ とができる。障害の少ない面からケトン基を還元することによって、Ｃ−３での 望ましい立体化学をもったアルコールＨを生じさせることができる。Ｃ−３位の ＯＨ基を保護し、ホスフィネートを開環し、Ｃ−２位のヒドロキシメチルを保護 しくまたはＣ−２位の立体化学の不安定性に応じてそれをエステルに酸化し）、 燐の位置でＣ−３位の水酸基と再エステル化することによって、キャリア蛋白へ の結合に適した目的化合物２４を生成させることができる。

なお、２４はラセミ体混合物として合成され得るが、分割は必要とされない。何 故なら、誘導された抗体は天然の（−）３Ｈ−コカインに対する加水分解活性に ついてスクリーニングすることができ、非天然の立体配置を認識する抗体は陰性 の結果を生じ得るからである（２８）。

２２は、２４について提案されたルートに類似したアプローチによって合成する ことができる。フェニルホスフィン酸エステルの代わりに炭素エステルを用いる ことにより、最終的には、Ｈに対応し且つカーチス、ホフマン又はシュミットの アシルナイトレン転移（７１）に適した中間体（Ｈ−２）を生じさせ、その官能 基の再構成によって２２を得る。

（Ｖ）燐酸エステル基の代替に基づくアナローブエステラーゼ活性を有する触媒 抗体は、燐酸エステル基に基づいた遷移状態アナローブを用いることにより、最 も頻繁に誘導されている。しかし、一つの例として、燐酸エステル基の有用な代 替物が知られている。下記の一般構造を有するＡ−オキサイド基に基づいたコカ イン遷移状態アナローブを合成すればよい。

低級アルキルカルボン酸または誘導体に結合した低級アルキ第三ンリーズの実験 の参照文献および脚注１．　Ｇａｗｉｎ、　Ｆ−Ｈ，ａｎｄ　Ｅ、Ｈ，Ｅｌｌｉ ｎｗｏｏｄ、’　Ｊｒ、Ｃｏｃａｉｎａ　ａｎｄｏｔｈａｒ　ｓｔｉｍｕｌａｎ ｔｓ：　Ａｃｔｉｏｎｓ、　ａｂｕｓａ　ａｎｄ　ｔｒｅａｔｘｅｎｔ、Ｎｅｗ Ｅｎｇ、　、ｒ、　Ｍｅｄ、　３１Ｂ＝１１７３−１１８２．１９８Ｂ。

２、Ｃｒｅｇｌａｒ、　Ｌ−Ｌ、　ａｎｄ　Ｈ，Ｍａｒｋ、Ｍｅｄｉｃａｌ　ｃ ｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆＣｏｃａｉｎ（！　＆ｂｕＩ！Ｉ１１．　Ｎ、 Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｌｉ！（１，３１５＝１４９５−４５００゜１９８６゜ 〕、　工５ｎｔｒ、、ｒ、Ｍ−、Ｎ、入、　ＥＳｔ（ｊ、エエエ、Ｐ、Ｄ、Ｔｈ ｏｍｐｓｏｎ、Ｍ、Ｒ。

Ｃｏ５ｔａｎｚｏ−Ｎｏｒｄｉｎ、Ｒ，Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ、Ｇ、Ｍｉｌｌ ｅｒ、Ｇ。

Ｋａｔｓａｓ、に、５Ｗｅａｎｅｙ　ａｎｄ　Ｗ、Ｑ、５ｔｕｒｎｅｒ、　入ｃ ｕｔｅ　ｃａｒｄｉａｃｅｖｅｎｔｓ　ｔａｍｐｏｒａｌｌｙ　ｒｅｌａｔｅｄ 　ｔｏ　ｃｏｃａｉｎａ　ａｂｕｓｅ、Ｎ。

Ｅｎｇｌ、Ｊ、’　Ｍａｄ、　３１５：１４３Ｂ−１４４３，１９８４゜４、Ｌ ｅｓｋｏ、　Ｌ、Ｍ、、　Ｍ、Ｗ、　Ｆｉｓｃｈｍａｎ、　Ｊ、Ｌ、　Ｊａｖａ ’ｉｄ　ａｎｄ　Ｊ、Ｍ。

Ｄａｖｉｓ、工ａｔｒｏｇｅｎｏｕｓ　ｃｏｃａｉｎｅ　ｐｓｙｃｈｏｓｉｓ、 Ｎ、　Ｅｎｇｌ、　、：ｒ。

Ｍｅｃｌ　：３０７＝１１５３．　１９８２゜５、Ｊｏｈａｒｌｓｏｎ、　Ｃ， −Ｅ、　ａｎｄ　Ｍ−Ｗ、　Ｆｉｓｃｈｍａｎ、　Ｔｈｅ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ｏｇｙｏｆ　ｃｏｃａｉｎｅ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｔｏ　ｉｔｓ　ａｂｕｓｅ、Ｐ ｈａｒｍ、Ｒｅｖ、４１：３−５２．１９８９゜ ６　Ｋｌｅｂａｒ、Ｈ，ａｎｄ　Ｆ、Ｇａｗｉｎ、Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃ ｏｌｏｇｉｃａｌｔｒｉａｌｓ　ｉｎ　ｃｏｃａｉｎｅ　ａｂｕｓｅ　ｔｒｅａ ｔｍｅｎｔ、　Ａｍ、Ｊ−Ｄｒｕｇλ１ｃｏｈｏｌλｂｕｓｅ　１２＝２：＋５ −２４６，１９８６゜７、Ｊａｖａｄ、　Ｊ−工、　ａｎｄ　Ｍ−Ｗ、　Ｆｉｓ ｃｈｍａｎ、　Ｃ−Ｒ，５ｃｈｕｓｔｅｒ、　Ｈ。

Ｏａ）ｃｉｒｍｅｎｊｉａｎ、Ｊ−Ｍ、Ｄａｖｉｓ、　Ｃｏｃａｉｎｅ　ｐｌａ ｓｍａＣ口ｎｅｅｎｔｒａｔｉｏｎ：Ｒｅ１ａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｐｈｙｓｉｏｌ ｏｇｉｃａｌ　ａｎｄｓｕｂｊｅｃｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｉｎ　ｈｕｍａ ｎｓ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２０２＝２２７−２２８゜１９７１Ｂ＋ ８、１＋１ｉｌｓｏｎ、Ｍ−Ｄ、、Ｍ−Ｈｉｔｏｍｉａｎｄ　Ｃ，Ｒ，５ｃｈｕ ｓｔｅｒ。

Ｐｇｙｃｈｏｍｏｔｏｒ　ｓｔｉｍｕｌａｎｔ　ｓｅｌｆ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒ ａｔｉｏｎ　ａｓ　ａｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｏｓａｇａ　ｐｅｒ　１ｎｊ ｅｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈａ　ｒｈｅｓｕｓｍ＋ｏｎｌｃｅｙ、Ｐｓｙｃｈｏｐ ｈａｒｎａｃｏｌｏｇｉｃ　２２：２７１−２８１．１９７１９、　Ｆｉｓｃｈ ｍａｎ、Ｍ、Ｗ、ａｎｄ　Ｃ，Ｒ，５ｃｈｕｓｔｅｒ、　Ｃｏｃａｉｎｅ　ｓｅ ｌｆ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｈｕｍａｎｓ、　Ｆ＠ｄｅｒａｔ ｉｏｎ　Ｐｒｏｃ、４１：２４１−２４６．１９８２゜ １０、Ｆｉｓｃｈｍａｎ、　Ｍ、Ｗ、、　Ｃ，Ｒ，５ｃｈｕｓｔｅｒ、　Ｊ、　 Ｊａｖａｉｃｉ、　Ｙ、　Ｈａｔａｎ。

ａｎｄ　Ｊ、Ｄａｖｉｓ、　入ｃｕｔｅ　ｔｏｌａｒａｎｃａ　ｄａｖａｌｏｐ ｍｅｎｔ　ｔｏ　ｔｈｅｃａｒｄｉｏｖａｓｅｕｌａｒ　ａｎｄ　ａｔ山うａｃ ｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｃｏｃａｉｎａ。

Ｊ、Ｐｈａｒｍ　ａｎｄ　Ｅｘｐｅｒｉ、Ｔｈｅｒａｐｅｕ、２コ５：６７７− ６８２．　１９Ｂ５゜１１、Ｇｏｅｄｅｒｓ’Ｎ、Ｅ、　ａｎｄ　Ｊ、Ｅ、　Ｓ ｍ１ｔｈ、Ｃｏｒｔｉｃａｌ　ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃｉｎｖｏｌｖａｍｅｎ ｔ　ｉｎ　ｃｏｃａｉｎｅ　ｒａｉｎｆｏｒｃｅｍｅｎｔ、　５ｃｉｅｎｃｅ２ ２１ニア７３−７７５．　１９８：ｌ。

１２、Ｇａｗｉｎ、　Ｆ、Ｈ，、Ｉ（、Ｄ−Ｋｌａｂｅｒ、　Ｒ，Ｂｙｃｋ、　 Ｂ、Ｊ、　Ｒｏｕｎｓａｖｉｌｌｅ。

Ｔ、Ｒ−Ｋｏｓｔｅｎ　ａｎｄ　Ｒ，１，Ｊａｔｌｏｗ、　Ｃ，Ｍｏｒｇａｎ、 　Ｄａｓｉｐｒａｍｉｎｅｆａｃｉｌｉｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　１ｎｉｔｉａｌ　 ｃｏｃａｉｎｅ　ａｂｓｔｉｎｅｎｃｅ、ＡｒｃｈＧｅｎ、Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ ｙ　４６：１１７−１２１．１９８９゜１３、　Ｇａｗｉｎ、　Ｆ、Ｈ，、Ｄ＋ 　入１１ｅｎ　ａｎｄ　Ｂ、　Ｈｕｍｂｌｅｓｔｏｎｅ。

０ｕｔｐａｔｉｅｎｔ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　’ｃｒａｃｋ’　ｃｏｃａ ｉｎａ　ｓｍｏｋｉｎｇ　ｗｉｔｈｆｌｕｐｅｎｔｈｉｘｏｌ　ｄａｃａｎｏａ ｔａ、　Ａｒｃｈ　Ｇｅｎ、Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ４６：：１２２−：１２５． 　１９８９＋１４、Ｆｉｓｃｈｍａｎ、Ｍ、Ｗ、、Ｒ−Ｗ、Ｆｏｌｔｉｎ、Ｇ、 Ｎｅ５ｔａｄｔ　ａｎｄ　Ｇ、Ｄ。

Ｐｅａｒｌｓｏｎ、　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｄｅｓｉｐｒａｍｉｎｅ　ｍａｉ ｎｔｅｎａｎｃｅ　ｏｎｃｏｃａｉｎｅ　ｓｅｌｆ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉ ｏｎ　ｂｙ　ｈｕｍａｎｓ、Ｊ、Ｐｈａｒｍ。

ａｎｄ　Ｅｘｐｅｒ、Ｔｈｅｒａｐｅｕ、２５コニ７６０−７７０．　１９９０ ゜１５、Ｂｏｎｅｓｅ、　Ｋ、Ｆ、、　Ｂ−Ｈ，Ｗａｉｎｅｒ、　Ｆ、Ｗ、　Ｐ ｉｔｃｈ、　Ｒ−Ｍ、　Ｒｏピ山ｅｒｇａｎｄ　Ｃ，Ｒ，Ｓｃｈｕｇｔａｒ＋ｃ ｈａｎｇａｓ　ｉｎ、ｈａｒｏｉｎ　ｓｅｌｆ−ａｄｍｉｎｉｇｔｒａｔｉｏｎ 　ｂｙ、ａ　ｒｈａｓｕｓ　ｗｏｎ）ｃｅｙ　ａｆｔｅｒ　ｍｏｒｐｈｉｎｅむ ＝田ｎ１ｚａｔｉｏｎ、Ｎａｔｕｒａ　２５２＝７０８−７１０，１９７４゜１ ６、Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ、　入、、　ＩＤ、　Ｊａｎｄａ　ａｎｄ　Ｒ，Ａ、 　Ｌｅｒｎｅｒ。

Ｃａｔａｌｙｔｉｃ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、５ｃｉｅｎｃｅ　２３４：１５６ ６−１５７０．１９８６゜１７・Ｐ口１ｌａｄｃ、Ｓ、Ｊ、、Ｊ、Ｗ、Ｊａｃｏ ｂｓ　ａｎｄ　Ｐ、Ｇ、５ｃｈｕｌｔｚ。

Ｓｅｌ＠ｃｔｉｖｅ　ｃｈａｍｉｃａｌ　ｃａｔａｌｙｓｉｓ　ｂｙ　ａｎ　ａ ｎｔｉｂｏｄｙ。

５ｃｉｅｎｃｅ　２３４：１５７０−１５１４．１９８６゜１Ｂ、Ｂｅｎｋｏｖ ｉｃ、Ｓ、Ｊ、、入、Ｄ、Ｎａｐｐｅｒ　ａｎｄ　Ｒ，入、Ｌａｒｎｅｒ。

Ｃａｔａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａ　５ｔｅｒｏｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｂｉｍｏｌａｃ ｕｌａｒ　ａｍｉｄａｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｂｙ　ａｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｐ ｒｏｃ−Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

Ｂ５：５３５５−５３５８．’　１９８Ｂ。

１．９．　Ｊａｃｋｓｏｎ、　Ｄ、Ｙ、ｔ　Ｊ−％４．　Ｊａｃｏｂｓ、　Ｒ， Ｓｕｇａｓａｗａｒｅ、　Ｓ、Ｈ−Ｒｅｉｃｈ、Ｐ、入−Ｂ＆ｒｔｌｅｔｔ　ａ ｎｄ　Ｐ、Ｇ、５ｃｈｕｌｔｚ、Ａｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ 　ｃｌａｉｓａｎ　ｒａａｒｒａｎｇａｍａｎｔ、Ｊ、Ａｍ＋Ｃｈａｍ、Ｓ口Ｃ 。

１１０：４８４１−４８４２，１９８Ｂ。

２０、Ｂｅｎｋｏｖｉｃ、Ｓ、Ｊ、、Ｊ、入、Ａｄａｍｓ、Ｃ−Ｃ，Ｂｏｒｄｅ ｒｓ、Ｊｒ、、に、Ｄ。

Ｊａｎｄａ　ａｎｄ　Ｒ，入、Ｌａｒｎｅｒ、　Ｔｈｅ　ａｎｚｙｍｉｃ　ｎａ ｔｕｒｅ　ｏｆａｎｔｉｂｏｄｙ　ｃａｔａｌｙｓｉｓ＝　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅ ｎｔ　ｏｆ　ｍｕｌｔｉｓｔａｐ　ｋｉｎｅｔｉｃｐｒｏｃａｓｓｉｎｇ、５ｃ ｉｅｎｃｅ　２５０：１１３５．　１９９０゜２１、Ｊａｎｄａ、Ｋ−Ｄ−、Ｄ 、５ｃｈｌｏｅｄｅｒ、Ｓ、Ｊ−Ｂｅｎｋｏｖｉｃ　ａｎｄ　Ｒ，λ。

Ｌａｒｎｅｒ、　工ｎｄｕｃｔ土ｏｎ　ｏｆ　ａｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｔｈａ ｔ　ｃａｔａｌｙｚｅｓ　ｔｈｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａｎ　ａｍｉｄ ｅ　ｂｏｎｄ、５ｃｉａｎｃａ　２４１：１１ＢＢ−１１９１゜１９８８゜ ２２、　５ｈｏｋａｔ、　Ｋ−Ｍ、、　ＣＪ、　Ｌｅｕｍａｎｎ、　Ｒ，Ｓｕｇ ａｓａｗａｒａ　ａｎｄ　Ｐ、Ｇ。

５ｃｈｕｌｔｚ、　λ　ｎｅｗ　ｓｔｒａｔｅｇｙ　ｆ口ｒ　廿ｓａ　ｇａｎａ ｒａｔｉｏｎ　ｏｆｃａｔａｌｙｔｉｃ　ａｎｔｉｂｏｄｉａｓ、Ｎａｔｕｒｅ 　３３８：２６９−２７１．１９Ｂ９゜２３、工ｖｅｒｇｏｎ、Ｂ、Ｌ、ａｎｄ 　Ｒ，λｌ１ａｒｎａｒ　−５ｅｑｕ＠ｎＣ＠−５ｐａＣＬｆ　ＩＣｐｅｐｔｉ ｄｅ　ｃｌｅａｖａｇｅ　ｃａｔａｌｙｚａｄ　ｂｙ　ａｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ 、５ｃｉｅｎｃｅ２４コニ１１８４−１１８８．　１９８９・２４、Ｋｉｔａｚ ｕｍｅ、　Ｔ、、　Ｊ、Ｔ、　Ｌｉｎ、　Ｔ、　Ｙａｍａｍｏｔｏ　ａｎｄ　Ｔ 、　Ｙａｍａｚａｋｉ。

Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｃａｔａｌｙｚａｄ　ｄｏｕｂｌｅ　ｇｔａｒｏｇｅｌｅｃ ｔｉｏｎ　１ｎｆｌｕｏｒｉｎａｔｔｄ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ、Ｊ、Ａ！＋１． Ｃｈｅｘｎ、Ｓｏｃ、１１３：８５７３−８５７５．１９９１゜ ２５、Ｃｏｃｈｒａｎ、入、Ｇ、、Ｔ、Ｐｈａｍ、Ｒ，Ｓｕｇａｓａｖａｒａ　 ａｎｄ　Ｐ、Ｇ。

５ｃｈｕｌｔｚ、　Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｃａｔａｌｙｚ＠ｄ　ｂｉｏｍｏｌｅｃ ｕｌａｒ　ｉｍｉｎｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ、　Ｊ、Ａｍ、Ｃｈａｍ、５ｏｃ−１ １３＝６６７０−６６７２．　１９９１゜２６、Ｊａｎｄａ、Ｘ、Ｄ、、Ｊ−人 、Ａｓｈｌｅｙ、Ｔ、Ｍ、Ｊｏｎ＠ｓ、Ｄ、入、ＭｃＬｅｏｄ。

Ｄ−Ｍ、５ｃｈｌｏｅｄａｒ、Ｍ、工、Ｗａｉｎｈｏｕｇａ、Ｒ，入、Ｌａｒｎ ａｒ、Ｒ，Ａ。

Ｇｉｂｂｓ、Ｐ、入−Ｂｅｎｋｏｖｉｃ、Ｒ−Ｈ１ｌ上ｏｒｓｔ　ａｎｄ　Ｓ、 ７．Ｂｉｎ）ｃｏｖｉｃ。

Ｃａｔａｌｙｔｉｃ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｗｉｔｈ　ａｃｙｌ−ｔｒａｎｓ ｆｏｒｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ；：　Ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ　ａｎｄ　ｋｉ ｎｅｔｉｃｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ、　Ｊ、Ａｍ、Ｃｈａｍ、Ｓｏｃ、１ １３：２９１−４９７゜１９９１゜ ２７、Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ、　入−、Ｋ、Ｄ、　Ｊａｎｄａ　ａｎｄ　Ｒ−λ 、し：ｒｎｅｒ。

Ｃｈａｍｉｃａｌ　ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｔ　ａｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｂ ｉｎｄｉｎｇ　５ｉｔｅｅｌｉｃｉｔａｄ　ｂｙ　ｍａｃｈａｎｉｓｔｉｃ　ｄ ｅｓｉｇｎ　ｏｆ　ａ　ｓｙｎｔｈｅｔｉｃａｎｔｉｇｅｎ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ｌ、入ｃａｄ、Ｓｃｉ、８３：６７３６−６７４０．１９８６゜２Ｂ、Ｊａｎｄ ａ、Ｋ、Ｄ、、Ｓ−Ｊ、ＢａｒＬｋｏｖｉｃ　ａｎｄ　Ｒ−λ、Ｌｅｒｎｅｒ。

Ｃａｔａｌｙｔｉｃ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｗｉｔｈ　１ｉｐａｓｅ　ａｃｔ ｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　ＲＯｒＳ　５ｕｂｓｔｒａｔｅ　５ａｌｅｃｔｉｖｉｔｙ 、５ｃｉｅｎｃｅ　２４４＝４３７−４４０．　１９８９゜２９．　Ｔｒａｍｏ ｎｔａｎｏ、入、、　Ａ、入、Ａｍｍａｎｎ　ａｎｄ　Ｒ，入、Ｌｅｒｎｅｒ。

Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｃａｔａｌｙｓｉｓ　ａｐｐｒｏａｃｈｉｎｇ　ｔｈｅ　ａ ｃｔｉｖｉｔｙ　ロｆｅｎｚｙｍｅｓ、Ｊ、λｍ、Ｃｈｅｗ、Ｓｏｃ、１１０： ２２８２−２２８６，１９８Ｂ。

３０、Ｊａｎｄａ、　Ｋ−Ｄ、、　Ｍ−工、　Ｗｅｉｎｈｏｕｓｅ、　Ｔ、　Ｄ ａｎｏｎ、　Ｋ、に、　Ｐａｃｅｌｌｉａｎｄ　Ｄ−Ｍ、５ｃｈｌｏ＠ｄａｒ、 　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｂａｉｔ　ａｎｄ　５ｗ１ｔｃｈｃａｔａｌｙｓｉｓ：　 Ａ　５ｕｒｖｅｙ　ｏｆ　ａｎｔｉｇｅｎｓ　ｃａｐａｂｌｅ　ｏｆ　ｉｎｄｕ ｃｉｎｇａｂｚｙｍｅｓ　ｗｉｔｈ　ａｃｙｌ−ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｐｒｏｐａ ｒｔｉａｓ、Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈａｍ。

Ｓｏｃ、１１３：５４２７−５４：１４．１９９１３１、　Ｂａｌｄｗｉｎ、　 Ｅ、　ａｎｄ　Ｐ、Ｇ、５ｃｈｕｌｔｚ、　Ｇａｎａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｃ ａｔａｌｙｔｉｃ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｂｙ　５ｉｔｅ−ｄ支ｒｅｃｔｅｄ　ｍ ｕｔａｇｅｎａｓｉｓ。

５ｃｉｅｎｃｅ　２４５：１１０４−１１０７．１９８９゜コ２．　Ｊａｎｄａ 、　：に、Ｄ、、　Ｓ、Ｊ、　Ｂｅｎｋｏｖｉｃ、　Ｄ、Ａ、　ＭｃＬｅｏｄ、 　Ｄ、Ｍ。

５ｃｈｌｏｅｄｅｒ　ａｎｄ’Ｒ，入、Ｌｅｒｎｅｒ、５ｕｂｓｔｒａｔａ　ａ ｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ：Ａｎ　ａｐｐｒｏａｃｈ　ｔｏ　ｉｍｐｒｏｖｅ　ａｎ ｔｉｂｏｄｙ　ｃａｔａｌｙｓｉｓ−Ｔｅｔｒａｈａｄｒｏｎ　４７：２５０３ −２５０６．　１９９１゜３コ、　Ｆｕｇｉｉ、　工０．　Ｒ０入、　Ｌｅｒｎ ａｒ　ａｎｄ　Ｋ、Ｄ−Ｊａｎｄａ。

Ｅｎａｎｔｉｏｆａｃｉａｌ　ｐｒｏｔｏｎａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｃａｔａｌｙｔ ｉｃ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ。

Ｊ−Ａｍ−Ｃｈａｍ、　Ｓａｃ、１１３：８５］Ｂ−８５２９，１９９Ｌ：１４ ．　Ｓｐｅａｌｍａｎ、　Ｒ，Ｄ、、　Ｂ−に、　Ｍａｄｒａｓ　ａｎｄ　Ｊ、 　Ｂｅｒｇｍａｎ、Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆ　ｃｏｃａｉｎｅ　ａｎｄ　ｒｅｌａｔ ｅｄ　ｄｒｕｇｓ　ｉｎ　ｎｏｎｈｕｍａｎ　ｐｒｉｍａｔｅｓエエｓｔｉｍｕ ｌａｎｔ　ａｆｆｅｃｔｓ　ｏｎ　５ｃｈｅｄｕｌｅ　−ｃｏｎｔｒｏｌ　ｂａ ｈａｖｉｏｒ。

Ｊ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　Ｅｘｐ、　Ｔｈｅｒ−２５１：１４２−１４９．　 １９８９゜コ５．　入ｍｂｒｅ、Ｊ−、Ｍ、　Ｆｉｓｃｈｍａｎ　ａｎｄ　Ｔ、 −工、Ｒｕｏ、　Ｕｒｉｎａｒｙｅｘｃｒｅｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｃｇｏｎｉｎｅ 　ｍｅｔｈｙｌ　ｅｓｔｅｒ、ａ　ｍａうｏｒｍｅｔａｂｏｌｉｔａ　ｏｆ　ｃ ｏｃａｉｎｅ　ｉｎ　ｈｕｍａｎｓ＋　Ｊ、Ａｎａｌ＋　Ｔｏｘｉｃｏｌ。

８：２：３−２５，１９８４゜ ３６、Ａｍｂｒａ、Ｊ、　Ｔｈｅ　ｕｒｉｎａｒｙ　ａｘｃｒｅｔｉｏｎ　ｏｆ 　ｃｏｃａｉｎｅ　ａｒｒｄｍａｔａｂｏｌｉｔａｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎｓ：　 Ａ　ｋｉｎｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ロｆｐｕｂｌｉｓｈｅｄ　ｄａｔａ、、 ｒ、　Ａｎａｌ、　Ｔｏｘ：１ｃｏｌ−９：２４１−２４５．１９Ｂ５゜３１、 ′ＬＩｅｒｎａｒ、Ｒ，入、、Ｓ、Ｊ、Ｂａｎｋｏｖｉｃ　ａｎｄ　Ｐ、Ｇ、５ ｃｈｕｌｔｚ、　λを廿ｔｅ　ｃｒｏｓｓｒｏａｄｓ　ｏｆ　ｃｈａｍｉｓｔｒ ｙ　ａｎｄ　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｃａｔａｌｙｔｉｃ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅ ｓ、５ｃｉａｎｃａ　２５２：４５７−４５８．　１９８７゜３Ｂ、５ｃｈｕｌ ｔｚ、Ｐ、Ｇ、Ｔｈｅ　１ｎｔｅｒｐｌａｙ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ　ａｎｄｂｉｏｌｏｇｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｄｅｓｉｇｎ　ｏｆ　ｅｎｚｙｍ ａｔｉｃ　ｃａｔａｌｙｓｔｓ。

５ｃｉａｎｃａ　２４０：４２６−４ココ、１９８Ｂ。

：１９．　Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ、Ｃ，Ｂ、　釦ｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ 　ｉｎ　ｏｒｇａｎｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、　Ｎ、Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍ ａｄ、３コ２＝１２２４−ｉ２２６゜Ｓセｒａｕｂｅ、Ｊ、Ｃ，５ａｄｏｆｆ、 Ｇ、Ｅ、Ｆｏｕｌｋｅ、Ｃ−Ｈ，Ｗａｒｔａｌ、Ｍ、Ｐ。

Ｆｉｎ）ｃ、　Ｒ，Ｐ、　Ｄａｌｌｉｎｇｅｒ、　Ｎ、Ｎ　Ｔｅｎｇ　ｅｔ　ａ ｌ、Ｔｒａａｔｍｅｎｔ　ｏｆｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｂａｃｔｅｒｅｍ ｉａ　ａｎｄ　５ｅｐｔｉｃ　５ｈｏｃｋ　ｗｉｔｈ　Ｈａ−ｕｈｕｍａｎ　ｍ ｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ａｇａｉｎｓｔ　＠ｎｄｏｔｏｘｉｎ −ＮｅｗＥｎｇ、Ｊ、Ｍａｄ、　コ２４：４２９−４：３６．　１９９１゜４１ 、Ｍａｙｆｏｒｔｈ、Ｒ，Ｄ、ａｎｄ　Ｊ、Ｗｕｉｎｔａｎｓ−Ｄｅｓｉｇｎｅ ｒ　ａｎｄｃａｔａｌｙｔｉｃ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｎｅｗ　Ｅｎｇ−Ｊ、 　Ｍｅｄ、３２３＝１７３−１７８゜１９９０゜ ４２、Ｒａｉｃｈｍａｎｎ、Ｌ、、Ｍ−Ｃ１ａｒｋ、Ｈ，Ｗａｌｄｍａｎｎ　ａ ｎｄ　Ｇ、Ｗｉｎｔｅｒ。

Ｐ、！ｓｈａｐｉｎｇ　ｈｕｍａｎ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅｒ ａｐｙ、　Ｎａｔｕｒｅココ２：３２３−３２７．　１９８Ｂ。

ｈｕｍａｎｉｚａｄ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｔｈａｔ　ｂｉｎｄｓ　ｔｏ　ｔｈｅ 　１ｎｔｅｒｌａｕｋｉｎ　２ｒｅｃｅｐｔｏｒ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、入ｃ ａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８６：１Ｏ０２９−１００３３，１９８９゜ ４４、　Ｃｈｏｗ、Ｍ−Ｊ、、Ｊ−Ｊ、Ａｍｂｒｅ、Ｔ、工、Ｒｕｏ、Ａ、Ｊ、 入ｔｋｉｎｓｏｎ。

Ｊｒ、、Ｄ、Ｊ、Ｂｏｗｓｈａｒ　ａｎｄ　Ｍ、Ｗ、Ｆｉｓｃｈｍａｎ、Ｋｉｎ ａｔｉｃｓ　ｏｆｃｏｃａｉｎａ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ａｌｉｍｉｎａ ｔｉｏｎ、ａｎｄ　ｃｈｒｏｎｏｔｒｏｐｉｃｅｆｆｅｃｔｓ’、Ｃ１１ｎ、Ｐ ｈａｒｍａｃｏｌ、Ｔｈａｒ、３Ｂ＝３１８−３２４．１９８５゜４５、カー１ ｃｋ＝、Ｔ、Ｌ、ａｎｄ　Ｒ，Ｌ、し比ｓｉｎｇｅｒ、　Ｕｎｓｙｍｍｅｔｒｉ ｃａｌｓｅｃｏｎｄａｒｙ　ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ　ｏｘｉｄｅｓ、５ｙｎｔｈａ ｔｉｃ、ｉｓｏｔｏｐｉｃｅｘｃｈａｎｇｅ、ａｎｄ　ｓｔｅｒｅｏｃｈａｍｉ ｃａｌ　５ｔｕｄｉｅｓ、　Ｊ、　Ａｍ＋Ｃｈｅｗ。

Ｓａｃ、９０：３４５９−３４６５，１９６Ｂ。

４６、Ｎ１ｔｔａ、　Ｙ−ａｎｄ　Ｙ、　Ａｒａｋａｗａ、　Ｔｈｅ　５ｅｌｅ ｃｔｉｖｅｄｅａｌｋｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍ１ｘｅｄ　ｅｓｔｅｒｓ　ｏｆ 　ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ　ａｃｉｄ　ａｎｄｐｈｅｎｙｌ　ｐｈｏｓｐｈｏｎｉ 、ｃ　ａｃｉｄ　ｕｓｉｎｇ　ｃａｔｉｏｎ　ｅｘｃｈａｎｇｅ　ｒｅｓｉｎ。

口ｚｅｘｒ、Ｐｈａｒｍ、Ｂｕ１１．３４＝３１２１−３１２９，１９８６゜４ ７、Ｃｏｒｒｉｕ、Ｒ−＋：ｒ、Ｐ、、Ｇ、Ｆ、Ｌａｎｎａａｕ　ａｎｄ　Ｄ、 Ｌａｃｌｅｒｃｑ。

Ｒｅｃｅｎｔ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍａｔｈｃ戯ｓ　ｆｏｒ　ｔ ｈｅｅｓｔａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ廿ｈ ｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌ　ｇｒｏｕｐ。

Ｔｅｔｒａｈａｄｒｏｎ　３６：１６１７−１６３０，１９８０゜４Ｂ−Ｄｕｄ ｄａｃｋ、Ｈ，ａｎｄ　Ｒ，し＝ｃｈｔ−Ｓｉｌｉｃｏｎ−Ｐｈｏｓｐｈｏｒｕ ｓａｎａｌｏｇｉｅｓ、　Ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｘｔｅｒｎａ ｌ　ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｅｓ　ｔ。

ａＣｔｉｖａｔｅｄ　ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ　ｏｆ　ｒａｃａｍｉｚａｔｉｏｎ　 ａｎｄ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｏｆ　ｃｈｌｏｒｐｈｏｓｐｈｏｎｏ　ｄｅｒｉ ｖａｔｉｖｅｓ、　Ｐｈｏｓ、ａｎｄ　５ｕｌｆｕｒ。

２９：１６９−１７８，１９８７゜ ４９−　Ｋｅｄａ、Ｓ、、Ｍ、工、ｗｅｉｎｈｏｕｓｅ、に、Ｄ、Ｊａｎｄａ、 Ｒ，Ａ、Ｌｅｒｎｅｒａｎｄ　Ｓ、、Ｔ、Ｄａｎｉｓｈａｆｓｋｙ、Ａｓｙｍｍ ｅｔｒｉｃ　１ｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｖｉａ　ａｃａｔａｌｙｔｉｃ　ａｎｔｉｂ ｏｄｙ、Ｊ、Ａｍ、　、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、　１１３ニア７６３−７７６４．１ ９９１゜ ５０、Ｒｅｅｖｅｓ、Ｗ、Ｐ、ａｎｄ　Ｍ、Ｌ、Ｂａｈｒ、　Ｐｈａｓｅ−ｔｒ ａｎｓｆｅｒｃａｔａｌｙｓｉｓ；　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｌｋｙ ｌ　ａｚｉｄａｓ、　５ｙｎｔｈ、８２３゜１９７６゜ ５１、Ｂｕｄｄ、　Ｒ，Ｄ、Ｃｏｃａｉｎｅ　ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｅ　ａｓｓ ａｙ　−５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｖｓｒａａｃｔｉｖｉｔｙ、Ｃ１１ｎ、　Ｔｏｘ 、　１Ｂ＝７７：ｌ−７８２，１９８１゜５２、Ｓｔａｗａｒｔ、Ｄ、Ｊ、、Ｔ −工ｎａｂａ、Ｂ、Ｔａｎｇ、ａｎｄ　Ｍ、）Ｃａｌｏｗ。

Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｃｏｃａｉｎｅ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｐｌａｓｍ ａ　ｂｙｃｈｏｌｉｎａｓｔｅｒａｓ＠、Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ、２０：１５５７− １５６４，１９７７゜５１　Ｋａｍｐ、Ｒ，）！、、Ｗ、入、Ｔｈｏｍａｓ、Ｍ 、Ｇｏｒｄｏｎ、Ｃ，Ｅ、Ｇｒｉｆｆｉｎ。

Ｐｒｏｔｏｎ　ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　５ｐｅｄゴａ　ｏｆ　 ｓｏｍｅ　ｔｒｉｓ−（ｈｅｔｅｒｏａｒｙｌ）　ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ、ｏｘｉ ｄｅｓ　ａｎｄ　（ｈａｔａｒｏａｒｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ、Ｊ、　 Ｃｈｅｊ！１．　Ｓｏｃ＋Ｂ：５６５−５６７、　１９６９゜５４、Ｓｈｅｉｎ ）ｃｍａｎ、λ、に、、Ｏ，Ｓａｍｏｃｌａｎｋ、Ｓ−Ｎ、Ｂａｒａｎｏｖ、　 −Ｒａａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅｔｅｒｏａｔｏｍａｔｉｃ　ｃａｔｉｏｎｓ　 ｗｉｔｈｔｒｉａｌｋｙｌｐｈｏｓｐｈｉｔｅｓ、　Ｊ、Ｇｅｎ、Ｃｈａｍ、Ｕ ＳＳＲ４０：６７１−６７８゜１９７０゜ ５５、　５ａｃｈｌｅｂａｎ、Ｒ，入、Ｊ、Ｈ，Ｂｕｒｎｓ、Ｇ、Ｍ、Ｂｒｏｗ ｎ、　５ｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆ　ａ　１ｏｒｉａｔ　ｅｔｈｅｒ　ｈａｖｉｎｇ 　ａ　ｐｈｏｓｐｈｅｎｉｃ　ａｃｉｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｇｒｏｕｐ　ａ ｎｄ廿ｔｅ　ｃｒｙｓｔａｌ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｉｔ’８Ｎａ”　ｃ ｏｍｐｌａｘ：　ｓｏｄｉｕｍ　５ｙｎ−［（Ｄｉｅｂａｎｚｏ−１４−ｃｒｏ ｗｎ−４−ｏｒｙｍｅｔｈｙｌｌ　ｐｈｅｎｙｌｐｈｏｎｐｈｉｎａｔｅ　ｄｉ ｈｙ由ｒａｔｅ　ｄｉｅｔｈａｎｄａｔｅ。

Ｏｒｇ、　Ｃｈａｍ　２７（１０）二１７８９−１７９０．　１９８８；　Ｃｏ １１ｉｎ、Ｄ−ｆｆ、。

Ｐ、Ｆ、Ｐｒｙｇａｌａ　Ｊ、Ｍ、Ｓｗａｎ、Ａｕ５ｔ、Ｊ、Ｃｈｅｗ、３７（ ５）＝１００９−１０２１．１９８４゜ ５６、Ｂｏｖｅｎ、入、Ｎｏ、入、Ｎ−Ｃｈａｋｈｌｏｖ、Ｅ、Ｎ、Ｔｓｖａｔ Ｊｃｏｖ、入ｓｉｍｐｌｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｄｉｍａｒｉｃ　２．２ −ｄｉｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ　１，３，２−ｂａｎｚｏｘａｚｉｐｈｏｇｐｈ ｏｌｅｇ　ｆｒｏｍ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ、、、、ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ。

Ｔｅｔｒａｈａｄ、Ｌｅｔｔ−３１＝５３６１−５３６４，１９９０゜５７、Ｍ ａｒｃｈ、Ｊ、　工ｎ　”　、ＥｄｉｔｏｒｓＤ、Ｎ、Ｈｕｎｇ、ａｔ　ａｌ、 ＭｃＧｒａｗ　Ｈ工１１　Ｂｏｏｋ　Ｃｏ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ＮＹ。

ｐ、７５．　１９６Ｂ。

５Ｂ、Ｂａｎｄａｒ、Ｍ、Ｌ＋、Ｂ、Ｗ＋’Ｉ’ｕｒｎｑｕａｓｔ、　Ｇｅｎｅ ｒａｌ　ｂａｓｉｃｃａｔａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａｓｔｅｒ　ｈｙｄｒｏｌｙｓ ｉｓ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｔｏ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　 ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ、　Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｔｍ、Ｓａｃ、７９：Ｌ６５６−１６ ６２．１９５７゜ ５９、Ｂａｎｄｔｒ、　Ｍ、Ｌ、　Ｍａｃｈａｎｉｇｍｓ　ｏｆ　ｃａｔａｌｙ ｓｉｓ　ｏｆｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｉｃ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｒｂｏ ｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄ６０、Ｃａｒｒｏｌｌ、Ｆ、工、、入、Ｈ，Ｌｅｗｉｎ、 Ｐ、入ｂｒａｈａｍ、Ｌ　Ｐａｒｈａｍ。

Ｊ−Ｗ、Ｂｏｊａ、ａｎｄ　Ｍ、＋：ｒ、Ｋｕｈａｒ、５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａ ｎｄ　ｌｉｇａｎｄｂｉｎｄｉｎｇ　ｏｆ　ｃｏｃａｉｎｅ　ｉｓｏｍｅｒｓ　 ａｔ　ｔｈｅ　ｃｏｃａｉｎｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ。

Ｊ、Ｍａｄ、Ｃｈａｍ、３４（コ）＝８８３−８８６．　１９９１；　Ｌｅｗｉ ｎ、Ａ、Ｈ，、Ｔ。

Ｎａｓｇｒｅｅ、　ａｎｄ　Ｆ、工＋Ｃａｒｒｏ１．　Ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ 　５ｙｎｔｈａｓｉｓ口ｆ（＋）−ｃｏｃａｉｎｅ、、：ｒ、　Ｈｅｔａｒｏｅ ｙｌｉｃ　Ｃｈｅｘｎ、２４：１９−２１．　１９８７゜入ｎｄ　ｒｅｆｅｒｅ ｎｃｅｓ　ｔｈｅｒｅｉｎ。

６１、Ｔｕｆａｒｉｅｌｌｏ、　Ｊ、；１．、　Ｊ、Ｊ、　Ｔｅｇｅｌｅｒ、　 ｓ、ｃ、　Ｗｏｎｇ、　ａｎｄ　ｓ、λ。

入１１．　Ａ　５ｔｅｒｏｓｐｅｃｉｆｉｃ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　け− ）−ｃｏｃａｉｎｅ。

Ｔａｔｒａｈａｄ、Ｌａｔｔ、２０＝１７３３−１７３６，１９７Ｂ。

６２、Ｔｕｆａｒｉｅｌｌｏ、Ｊ−Ｊ、、Ｇ、Ｂ−Ｍｕｌｌｅｎ、Ｊ、Ｊ、Ｔｅ ｇｅｌｅｒ、ＥＪ。

Ｔｒｙｂｕｌｓｋｉ、ｓ＋Ｃ，ｖｏｎｇ　ａｎｄ　Ｓ、　Ａ、Ａｌｉ、５ｙｎｔ ｈａｓｉｓ　１ｎｔｈｅ　ｔｒｏｐａｎａ　ｃｌａｓｓ　ｏｆ　ａｌｋａｌｏｉ ｄｓ　ｐｓａｕｄｏｔ＝ｚｐｉｎａ　ａｎｄ　ｄｌ−ｃｏｃａｉｎｅ、　：ｆ、 Ａｍ、Ｃｈａｍ、５ｏｃ−１０１（９）＝２４３５−４２．　１９７９゜６３、 Ｗｏｏｄ％ｊａｒｄ、　Ｒ，Ｂ、、　Ｔ、Ｊ、　Ｋａｔｚ、Ｔｈｅ　ｍａｃｈａ ｎｉｓｍ　ｏｆ　ｔｈｅＤｉａｌｇ−人ｄｌａｒ　ｒｅａｃｔｉｏｎ、　Ｔａｔ ｒａｈａｄｒｏｎ、５ニア０−８９．　１９５９゜６４、Ｒａｔｃｌｉｆｆａ、 　Ｒ，、ａｎｄ　Ｒ，Ｒｏｄａｈｏｓｔ、工ｍｐｒｏｖｅｄ　ｐｒｏｃｅｄｕｒ ｅｆ口ｒ　ｏｘｉｄａｔｉｏｎｓ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｃｈｒｏｍｉｕｍ　ｔｒ ｉｏｘｉｄｅ−ｐｙｒｉｄｉｎｅｃｏｍｐｌｅｘ、　Ｊ、Ｏｒｑ、Ｃｈｅｗ、コ ５：４０００−４００２．　１９７０゜６５、　Ｂａｒｔｏｎ、Ｄ−ａｎｄ　Ｏ ，Ｄａｖｉｄ、　Ｘｎ　ｅ　Ｓ’Ｖｅ二―エユ、　Ｅｄｓ、　ｏ、　Ｂａｒｔｏ ｎ　ａｎｄ　Ｗ、Ｄ、　０１ｌｉｓ、　ＰｅｒｇａｍｏｎＰｒａｓｓ　ｐ、１２ １２．　１９７９゜６６、Ｖａｎ　Ｂｅｒｇ、Ｇ、’ＰＬ、、Ｄ、Ｈ，Ｊ、Ｍ、 Ｐｌａｔｅｎｂｕｒｇ　ａｎｄ　Ｈ，Ｐ・Ｂｅｎ５ｃｈｏｐ、Ｓｔａｒｅｏｃｈ ａｍｉｓｔｒｙ　ａｔ　ａ　Ｍｉｃｈａｅｌ±ｓ−Ａｒｂｕｚｇｖｃｏｎｆｉｇ ｕｒａｔｉｏｎ、Ｃｈａｍ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　６０６−６０７．１９７Ｌ６７ 、Ｈｅｒｒｍａｎ、　、ｒ、Ｈ，、Ｇ、Ｒ，Ｋｉｅｃｚｙｋｏｗｓｋｉ、　Ｒ， Ｈ，Ｓｃｈｌｏｓｓｉｎｇｅｒ。

Ｄｅｃｏｎｊｕｇａｔｉｖｅ　ａｌｋｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｎｏｌ ａｔｅ　ａｎｉｏｎｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ　ｅｔｈｙｌ　ｔｏ　ｃｒｏｔｏ ｎａｔａ−Ｔａｔｒａｈａｄ−Ｌｅｔｔ、　ｐ−２４３３−２４３６，１９７コ 。

６８、　１ｒｅ１ａｎｄ、Ｒ−Ｅ、、Ｒ，Ｈ，Ｍｕｅｌｌｅｒ、入、に、Ｗｉｌ ｌａｒ、Ｔｈｅ　ｅｓｔｅｒｅｎｏｌａｔｅ　ｃｌａｉｓｅｎ　ｒ＠ａｒｒａｎ ｇｅｍａｎｔ　ｓｔ＠ｒｅｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌｔｈｒｏｕｇｈ 　５ｔｅｒａｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｅｎｏｌｉｔａ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｊ ＋　Ａｍ。

Ｃｈａｍ、Ｓｏｃ、９ｇ＝２８６１３−２８７７．１９７６゜６９、Ｌａｎｄｒ ｙ、Ｄ−Ｗ、　Ｔｏｔａｌ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　８Ｓ、１４−ｃｒｅｄ ｒａｎｅｄｉｏｌ、　Ｔａｔｒａｈｅｄｒｏｎ、コ９：３２７６、　１９８２゜ ７０、Ｂｒｅｉ゛ヒｈｏｌｌｅ、Ｅ、Ｇ、ａｎｄ　入、ｃ、Ｆａｌｌｉｓ、Ｔｏ ｔａｌ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆ　ｃｅｄｒｏｌ　ａｎｄ　ｃｅｄｒｅｎａ　ｖ ｉａ　ａｎ　ｉｎｔｒａｍｏｌａｃｕｌａｒ　Ｄｉａｌｇ−人ユｄｅｒ　ｒａａ ｃｔｉｏｎ、　：ｆ、Ｏｒｇ、Ｃｈａ！！１．　４コニ１９６４−６８．　１９ ７Ｂ。

ｐｒｏｈｉｂｉｔｉｎｇ　ｔｈ＠−ｖａｌｄｅｎ　１ｎｖｅｒｓｉｏｎ　ｒａｐ ｌａｃｅｎｔｎｔｒｅａｃｔｉｏｎｓ　ｉｎ　１−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ　ｌ −ａｐｏｃａｍｐｈａｎｅｓ＋、？、Ａｍ。

Ｃｈａｍ、Ｓｏｃ、６１：３１８４−３１９２．　１９３９゜７２、Ｄｅａｎ、 　Ｒ，λ、、　Ｃ−Ｄ、　Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ、　Ｒ−Ｈ，Ｂ、　Ｓａｍｐｌｅ 、　ａｎｄＷ、Ｆ。

Ｂｏｓｒｏｎ、　Ｈｕｍａｎ　１ｉｖｅｒ　ｃｏｃａｉｎｅ　ｅｓｔｅｒａｓｅ ｓ：　ｅｔｈａｎｏｌ−ｍａｄｉａｔ＠ｄ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｔｈ ｙｌｃｏｃａｉｎａ、　ＦＡＳＥＢ　Ｊ。

５：２７コ５−２７３９．　１９９１゜＋ 田 日ＧＵＲＥ４ 補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成６年１０月３Ｂ　鵞〉

Claims (43)

【特許請求の範囲】
1. １．下記構造を有する化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▲ 但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、又はＲ４は独立に水素又は低級アルキル基であるか； 又は、 Ｒ１、Ｒ２、若しくはＲ３の１つのみが、低級アルキルアジド基、低級アルキル アミン、低級アルキルカルボン酸若しくは誘導体に結合した低級アルキル基を含 有する基であり、Ｒ１、Ｒ２、若しくはＲ３の残りの２つは各々独立に水素若し くは低級アルキル基であり、Ｒ４は水素、低級アルキル基若しくは負電荷である 。
2. ２．下記の構造を有する請求の範囲第１項に記載の化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▲
3. ３．下記構造を有する請求の範囲第１項に記載の化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▲
4. ４．下記構造を有する請求の範囲第１項に記載の化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▲
5. ５．蛋白に結合する請求の範囲第１項に記載の化合物であって、Ｒ１、Ｒ２、又 はＲ３の１つだけが以下の構造を有する化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▲ 但し、 Ａは低級アルキル基であり、Ｘはキャリアー蛋白の一級アミンである。
6. ６．以下の構造を有する化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▲ 但し、Ｘはキャリアー蛋白の１級アミンである。
7. ７．以下の構造を有する化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▲ 但し、Ｘはキャリアー蛋白の１級アミンである。
8. ８．以下の構造を有する化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▲ 但し、Ｘはキャリアー蛋白の１級アミンである。
9. ９．以下の構造を有する化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▲ 但し、Ｒは、 ▲数式、化学式、表等があります▲ 又は他の芳香族置換体。
10. １０．°下記構造を有する化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▲但し、Ｒ′はＯ又はＣＨ２であり、Ｒは炭化 水素鎖、又はキャリアー蛋白に結合しうるアミン、エステル若しくは他の官能基 が結合した一連の炭化水素である。
11. １１．下記構造を有する化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▲ 但し、Ｒは炭化水素鎖、又はキャリアー蛋白に結合しうるアミン、エステル若し くは他の官能基が結合した一連の炭化水素である。
12. １２．下記構造を有する化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▲ 但し、Ｒは炭化水素鎖、又はキャリアー蛋白に結合しうるアミン、エステル若し くは他の官能基が結合した一連の炭化水素である。
13. １３．下記構造を有する化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▲ 但し、Ｒは炭化水素鎖、又はキャリアー蛋白に結合しうるアミン、エステル若し くは他の官能基が結合した一連の炭化水素である。
14. １４．下記構造を有する化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▲ 但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、又はＲ４は独立に水素又は低は低級アルキル基である か； 又は、 Ｒ１、Ｒ２、若しくはＲ３の１つのみが、低級アルキルアジド基、低級アルキル アミン、低級アルキルカルボン酸若しくは誘導体に結合した低級アルキル基を含 有する基であり、Ｒ１、Ｒ２、若しくはＲ３の残りの２つは各々独立に水素若し くは低級アルキル基であり、Ｒ４は水素、低級アルキル基若しくは負電荷である 。
15. １５．キャリアー蛋白に結合された請求の範囲１０〜１４に記載の化合物。
16. １６．請求の範囲第５〜１５の何れかに記載の化合物であって、キャリアー蛋白 がウシ血清アルブミン、ウシ卵白アルブミン、キーホールリンペット（ｋｅｙｈ ｏｌｅｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン又はサイログロブリンである化合物。
17. １７．請求の範囲第１〜１４に記載の化合物に対する抗体。
18. １８．請求の範囲第１７項に記載の抗体であって、コカインベンゾイル基の加水 分解遷移状態の中間体に結合する能力及び加水分解反応のΔＧを減少する能力の あるもの。
19. １９．請求の範囲第１６項又は第１７項に記載の抗体であって、該抗体がモノク ローナル抗体であるもの。
20. ２０．３Ｂ９（ＡＴＣＣアクセッションナンバー）と称される請求の範囲第１９ 項に記載のモノクローナル抗体。
21. ２１．６Ａ１２（ＡＴＣＣアクセッションナンバー）と称される請求の範囲第１ ９項に記載のモノクローナル抗体。
22. ２２．請求の範囲第１７項に記載のモノクローナル抗体の軽鎖蛋白をコードする 単離された核酸分子。
23. ２３．請求の範囲第２２項に記載のＤＮＡ分子。
24. ２４．請求の範囲第２３項に記載のｃＤＮＡ分子。
25. ２５．請求の範囲第１７項に記載のモノクローナル抗体の重鎖蛋白をコードする 単離された核酸分子。
26. ２６．請求の範囲第２５項に記載のＤＮＡ分子。
27. ２７．請求の範囲第２６項に記載のｃＤＮＡ分子。
28. ２８．ＲＮＡ転写プロモーターに使用可能に結合された請求の範囲第２４項に記 載の核酸分子を含有するベクター。
29. ２９．ＲＮＡ転写プロモーターに使用可能に結合された請求の範囲第２７項に記 載の核酸分子を含有するベクター。
30. ３０．適切なホスト細胞に請求の範囲第２８項及び第２９項の遺伝子転位ベクタ ーを含有するホストベクターシステム。
31. ３１．請求の範囲第３０項に記載のホストベクターシステムであって、該適切な ホスト細胞が、細菌細胞、酵母細胞又は動物細胞であるもの。
32. ３２．請求の範囲第１７項に記載のヒトキメラ抗体。
33. ３３．請求の範囲第１７項に記載のヒトモノクローナル抗体。
34. ３４．患者の血液中のコカインの濃度を減少するための薬学的組成物であって、 患者中のコカインの濃度を減少するのに効果的な量の請求の範囲第１７項、第１ ８項、第１９項、第２０項、第２１項、第３２項又は第３３項に記載の抗体、及 び薬学的に許容しうる担体を含有する組成物。
35. ３５．患者の血液中のコカインの濃度を減少する方法であって、コカインの加水 分解を触媒するのに効果的な量の請求の範囲第１７項、第１８項、第１９項、第 ２０項、第２１項、第３２項又は第３３項に記載の抗体を患者に投与し、これに よって患者の血液中のコカインの濃度を減少するすること具備した方法。
36. ３６．患者中の過量のコカインを処置するための薬学的組成物であって、患者中 のコカインの濃度を減少するのに効果的な量の請求の範囲第１７項、第１８項、 第１９項、第２０項、第２１項、第３２項又は第３３項に記載の抗体、及び薬学 的に許容しうる担体を含有する組成物。
37. ３７．患者中の過量のコカインを処置するための方法であって、コカインの加水 分解を触媒するのに効果的な量の請求の範囲第１７項、第１８項、第１９項、第 ２０項、第２１項、第３２項又は第３３項に記載の抗体を患者に投与し、これに よって患者の過量のコカインを減少することを具備した方法。
38. ３８．一定水準に達したコカインの濃度を減少することによって患者のコカイン 常習癖を治療するための薬学的組成物であって、患者の一定水準に達したコカイ ンの濃度を減少させるのに効果的な量の請求の範囲第１７項、第１８項、第１９ 項、第２０項、第２１項、第３２項又は第３３項に記載の抗体を含有する組成物 。
39. ３９．一定の水準に達したコカインの濃度を減少することによって患者のコカイ ン常習癖を治療するための方法であって、コカインの加水分解を触媒するのに効 果的な量の請求の範囲第１７項、第１８項、第１９項、第２０項、第２１項、第 ３２項又は第３３項に記載の抗体を患者に投与し、これによって患者中の一定水 準に達したコカインの濃度を減少させるすることを具備した方法。
40. ４０．請求の範囲第３５項、第３７項、文は第３９項に記載の方法であって、該 抗体が静脈内的に投与される方法。
41. ４１．コカインのベンゾイルエステル結合に対して加水分解活性を有する抗体を 同定するための方法であって、（ａ）該抗体を、放射性標識されたベンゾイル基 を放出させることを可能にする条件下において、反応混合物中でベンゾイル基を ラベルした放射性のコカインと接触すること； （ｂ）放出された放射性標識されたベンゾイル基を放射性のコカインから分離す ること； （ｃ）放出されたベンゾイル基の放射能を測定すること；及び （ｄ）ステップ（ｃ）で測定された放射能を、抗体を全く加えない場合の反応混 合物中で放出された放射能と比較し、ステップ（ｃ）でのより高い放射能が、コ カインのベンゾイルエステル結合に対する抗体の加水分解活性を指示しているこ とを具備した方法。
42. ４２．請求の範囲第４１項に記載の方法であって、ステップ（ｂ）が、コカイン から放出された放射性標識されたベンゾイル基が有機層中に抽出され、コカイン が水層にいることをより顕著にするために反応混合物を酸性にし、更に有機溶媒 で該混合物を抽出し、これによって放出された放射性標識されたベンゾイル基を 有機溶媒中に分離することを具備する方法。
43. ４３．コカインのベンゾイルエステル結合に対して加水分解活性を有する抗体の 、アナローダに対する特異性を決定する方法であって、 （ａ）反応混合物中において、コカインのベンゾイルエステル基の加水分解遷移 状態に対するアナローダと抗体とを、該抗体と該アナローダが結合することを可 能にする条件下で接触させること； （ｂ）ベンゾイル基を放射性標識したコカインを反応混合物中に加え、ステップ （ａ）の条件では放出がされない場合には、放射性標識されたベンゾイル基の放 出を可能にする条件に変え、コカインから放出された放射性標識されたベンゾイ ル基を分離すること；（ｃ）放出されたベンゾイル基の放射能を測定すること； 及び （ｄ）ステップ（ｃ）で測定された放射能を抗体を全く使用しない反応混合物で 放出された放射能と比較し、同様の放射能が、抗体がアナローダに特異的である ことを指示する ことを具備した方法。