JPH07507997A - 遺伝子，腫瘍及びウイルス感染の治療，並びにプログラムされた細胞死（アポプトーシス）を予防するための方法及び組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 遺伝子、腫瘍及びウィルス感染の治療、並びにプログラムされた細胞死（アポブ ドーシス）を予防するための方法及び組成物 １豆辺１１ １−ＳＬ豆二豆１ 本発明は、プログラムされた細胞死をブロックし又は遅延させる方法、特定の細 胞への遺伝子治療の送達の方法、並びに癌及び他の腫瘍形成性疾患の治療の方法 、並びに腫瘍又はウィルス宿主細胞のプログラムされた細胞死を強化することに よるウィルス感染の治療に向けられている０本発明は又、プログラムされた細胞 死を阻止し又は増加させる候補物質についてのアッセイにも向けられている。

２、鼠」目り貞ｎ男 ａ、プログラムされこ　アポ　−シス 最近１０年間に、細胞が実際に内部でプログラムされてそれらのライフサイクル のある時点において死ぬという考えが科学界においてますます受け入れられるよ うになってきた。能動的細胞機構であるプログラムされた細胞死（又はアポブド ーシス）は、幾つかの重要な密接な関係を有する。第１に、かかる能動的プロセ スは、細胞数並びに細胞の生物学的活性を制御する更なる手段な提供することが 出来る。第２に、突然変異又はアポブドーシスを強化する細胞事象は、未熟細胞 死を生じ得る。第３に、特定の能動的細胞機構に依存するある型の細胞死は、少 なくとも潜在的に、抑制することが出来る。最後に、予めプログラムされた細胞 死の阻止は、異常型細胞の生存へと導くことが予想され、発癌に寄与することが 予想され得る。

一般に、アポブドーシスは、核濃縮及びＤＮＡのオリゴヌクレオソーム断片への 分解を含む明確な形態学的変化を含む、ある種の環境において、アポブドーシス が蛋白質合成の変化によって誘発され又は先行されることは明らかである。アポ ブドーシスは、細胞破壊のための非常に巧みなプロセスを提供するように見える が、そこでは、細胞は持具゛的認識及び食作用及びその後のバースティングによ って処分される。この方法で、細胞は、周囲の細胞にダメージを与えることなく 組織から除去され得る。こうして、プログラムされた細胞死は、形態発生、免疫 系におけるクローン選択、他の組織及び器官系における正常細胞の成熟及び死を 含む多くの生理学的プロセスにおいて重要であることを理解することが出来る。

細胞が環境の情報に応答してアポブドーシスを受け得ることも示された０例とし ては、未成熟胸腺細胞に対する糖質コルチコイドホルモン等の刺激の出現、或は 成熟リンパ球からのインターロイキン２の撤去又は造血前駆細胞からのコロニー 刺激因子の除去等の刺激の消失がある（総説としては、Ｗｉｌｌｉａｍｓ、　Ｃ ｅ１１．８５；　１０９７−１０９８゜Ｊｕｎｅ　２Ｂ、　１９９１を参照され たい）、更に、神経成長因子の確立された神経細胞培養物からの除去の応答は標 的除去に似ていることが最近示され且つこの応答に含まれる細胞機構が神経成長 因子除去に続く自殺プログラム又はプログラムされた細胞死の引き金であること が仮定された（　Ｊｏｈｎｓｏｎ等、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ、　ｏｆ　Ａ　ｉｎ　 、　１０：　５４９−５５２゜１９８９）−これらの著者は、「死カスケード」 又は「死プログラム」を提案しており、栄養因子奪取が新規なｍＲＮＡの転写及 びそれに続＜　ｍ　ＲＮ　Ａの、最終的に「キラー蛋白質」を生成するシーケン スにおいて作用する死関連蛋白質への翻訳を開始させることを想像している。か かる細胞内機構は、上述のアポブドーシスの特徴とよく適合するように見える（ 例えば、有害物質の放出及び組織の完全性の崩壊を伴わない特定の細胞の死）。

更に、著者等は、巨大分子合成のインヒビターが神経成長因子の不在下でニュー ロンの死を阻止したことを示している。

研究は、腫瘍細胞が人為的に誘発したアポブドーシスによって除去され得ること の可能性を探究することへと導かれた。ＡＰＯ−１モノクローナル抗体は、幾つ かのトランスフオームしたヒトＢ及びＴ細胞系統においてアポブドーシスを誘導 することが出来る。この抗体は、表面蛋白質に結合して正の死誘導信号を真似る か又は生存に必要な因子の活性をブロックすることによるかの何れかによって作 用することが出来よう、抗ＦＡＳ抗体も又同様の効果を有し、ＦＡＳ抗原の遺伝 子の最近のクローニング及び配列決定は、それが６３キロダルトンの膜貫通レセ プターであることを示した（Ｉｔｏｈ等、Ｃｅ１ｌ　６６：２３３−２４３　（ ＋９９１））　。

しかしながら、ＡＰＯ−１もＦＡＳも、排他的に細胞死の引き金として機能する ことは出来ないということに注意することは重要である０両者は、別の環境下で は全く異なる応答を活性化し得る細胞表面レセプターである。更に、これらの抗 原は、腫瘍細胞に限られず、それらの正常細胞における効果は確かに重要な問題 である（もはやこれらの抗原を示さない変異体の出現があり得る）。

ある範囲の細胞毒性剤（癌治療において用いられる幾つかを含む）により誘導さ れた細胞死も又、アポブドーシスの形成が見出された。事実、腫瘍細胞における アポブドーシスの不足は、細胞数の生理学的制御の回避のみならず、自然防御及 び臨床的治療の両者に対する抵抗への寄与において基本的に重要であり得よう。

ｂｃ　１−２遺伝子の発現はアポブドーシスによる死を阻止することが出来るこ とも示された。ｂＣｌ−２遺伝子は、濾胞性Ｂ細胞リンパ腫である最も普通のヒ トリンパ腫の高い割合において染色体１４と１８との間の転座のブレークポイン トから単離された。転座は、ｂｃｌ−２遺伝子と免疫グロブリン重鎮遺伝子座を 一緒に運び、Ｂ細胞において、異常に増加したｂｃｌ−２発現を生じる。続いて 、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ等（Ｃｅ１ｌ、　６５：１１０７−１１１５゜１９９１） は、エプスタイン−パールウィルスに感染した細胞における潜在的膜蛋白質１の 発現は、感染Ｂ細胞を、ｂｃｌ−２遺伝子の発現を誘導することによりプログラ ムされた細胞死から保護することを示した＊　５ｓｎｔｅａａｎ等（江旦、鉦： ８７９−８８．１９９１年１１月２９日）は、ｂｅ　１−２遺伝子の発現が、多 発型の７ポブトーシスを阻止し得るが胸腺細胞におけるネガティブ選択を阻止し 得ないことを示し、５ｔｒａｓｓｅｒ等（Ｃｅｌｌ、　６７：８８９−８９９． 　１９９１年１１月２９日）は、ｂＣｌ−２トランス遺伝子の発現は、Ｔ細胞死 を阻止し且つ胸腺の自己検閲を混乱させ得るということ゛を示した＊　Ｃｌｅｍ 等（Ｓｃｉｅｎｃｅ、　２４５：１３８８−１３９０．１９９１年１１月２９日 ）は、バクロウィルス遺伝子産物を昆虫細胞におけるアポブドーシスをブロック する原因として同定した。

ｂ、ヘルペス　イルス　びニューロとルレンスヘルペスウイルスのファミリーは 、多くの病気の原因因子であるので臨床的に大いに興味のある動物ウィルスを含 んでいる。エプスタイン−パールウィルスは、Ｂ細胞リンパ腫に関係し：サイト メガロウイルスは、ＡＩＤＳ患者に対して最大の感染脅威を与え；そして水痘− 帯状庖疹ウィルスは、水痘及び帯状庖疹が深刻な健康上の問題である世界のある 部分に大いに関係している。性的に伝染する単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）感 染の発病率の世界的な増加が、新生児ヘルペスの増加を伴って、過去ｌＯ年間に 起きた。活性な潰瘍性病変又は無症候性排泄患者に触れることは、感染因子の伝 染を生じ得る。

伝染は、粘膜表面及びすりむいた皮膚におけるウィルスへの露出により、ウィル スの浸入及び上皮及び真皮の細胞内でのウィルス複製の開始を与える。臨床的に 明らかな病変に加えて、特に知覚神経細胞内の潜在的感染が持続し得る０種々の 刺激がＨＳＶ感染の再活性化を引き起こし得る。従って、これは撲滅するのが困 雌な感染である。この災いは、治療様式の不足の故に、抑制されずに大いに広が った。

公知のヘルペスウィルスは、４つの重要な生物学的特性を共有しているらしい： １、すべてのヘルペスウィルスは、核酸代謝に関与する酵素（例えば、チミジン キナーゼ、チミジレートシンテターゼ、ｄＵＴＰアーゼ、リボヌクレオチドレダ クターゼ等）、ＤＮＡ合成に関与する酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ヘリ カーゼ、プライマーゼ）、及び、可能であれば、蛋白質のプロセッシングに関与 する酵素（例えば、プロティンキナーゼ）の大きい配列を、酵素の正確な配列が あるヘルペスウィルスと他のものとで幾分か変化し得るにもかかわらず、規定す る。

２、ウィルスＤＮＡの合成とキャプシドのアセンブリーの両者が核内で起きる。

ある種のヘルペスウィルスの場合には、ウィルスが細胞質を通過する際に脱エン ベロープされ及び再エンベロープ形成し得ることが要求された。これらの結論の 長所に関係なく、キャプシドのエンベロープ形成は、核膜を通過する際に必須で ある。

３、感染性の子孫ウィルスの生成は、常に、感染細胞の不可逆的破壊を伴ってい る。

４、現在まで調べられたすべてのヘルペスウィルスは、それらの天然の宿主内に 潜在し続けることが出来る。潜在性ウィルスを有する細胞において、ウィルスゲ ノムは、閉環状分子の形態を取り、ウィルス遺伝子の少数のサブセットのみが発 現している。

ヘルペスウィルスは又、それらの生物学的特性を大いに変化させる。幾つかは、 広い宿主細胞範囲を有して多゛　くの結果を引き起こし、感染したそれらの細胞 を急速に破壊する（例えば、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２等）、他（例えば、ＥＢＶ 、ＨＨＶ６）は、狭い宿主細胞範囲を有する。幾つかのヘルペスウィルス（例え ば、ＨＣＭ■）の増殖は、ゆっくりしているようである、すべてのヘルペスウィ ルスは特定の細胞セットにおいて潜在し続けるが、それらが潜在し続ける正確な 細胞はウィルスごとに異なる０例えば、潜在性Ｈ３Ｖは、知覚神経から回収され るが、潜在性ＥＢＶは、Ｂリンパ球から回収される。ヘルペスウィルスは、それ らが引き起こす病気の臨床的現れに関して異なっている。

単純ヘルペスウィルスｌ及び２　（ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２）は、ヒトが出会う 最も一般的な感染性因子のうちにある（　Ｃｏｒｅｙ及び５ｐｅａｒ、　Ｎ、　 Ｅｎ　、　Ｊ、　Ｍｅｄ、、　３１４：６８６−６９１．１９８６）　、これら のウィルスは、穏やかで有害な感染（再発性単純ヘルペスウィルス等）から重い 生命を脅かす病気（年長の子供及び成人の単純ヘルペス脳炎（Ｈ３Ｅ）又は新生 児の播種性感染等）に及ぶ広いスペクトルの病気を引き起こす、ヘルペス感染の 臨床的結果は、初期の珍断及び迅速な抗ウイルス治療の開始に依存している。し かしながら、幾つかの成功した治療にもかかわらず、真皮及び表皮の病変は再発 し、新生児のＨ３■感染及び脳の感染は高い罹患率及び死亡率と結び付いている 。現在可能なよりも一層早い診断は、治療の成功を改善するであろう、更に、改 善された治療が、非常に必要とされている。

外来の援助が、特に化学薬品の形態で、感染した個人に与えられてきた０例えば 、ヘルペスウィルス複製の化学的インヒビターは、種々のヌクレオシドアナログ 例えばアシクロバー（ａｃｙｃｌｏｖｉｒ　）　、５−フルロデオキシウリジン （ＦＵＤＲ）、５−ヨードデオキシウリジン、チミンアラビノシト等によって達 成された。

幾つかの保護が実験動物モデルにおいて、多特異的又は単−特異的抗Ｈ３Ｖ抗体 、Ｈ３Ｖプライムドリンパ球及び特定のウィルス抗原に対するクローン化Ｔ細胞 により提供された（　Ｃｏｒｅｙ及び５ｐｅａｒ、　Ｎ、　Ｅｎｇ、　Ｊ、　Ｍ ａｄ、。

出：６８６−６９１．１９８６）　、　Ｌかしながら、満足出来る治療は見出さ れていない。

単純ヘルペスウィルスのγ、３４．５遺伝子は、このウィルスのＬコンポーネン トに隣接するゲノムの逆方向反復領域内にマツプされる。この遺伝子の発見及び 特性決定は、幾つかの論文に報告された（Ｃｈｏｕ及びＲｏｉｚｍａｎ。

Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、　５７：６２９−６３５．１９８６．及びＪ、　Ｖｉｒｏ ｌ、、　６４：１０１４−１０２０．　１９９０；　Ａｃｋｅｒｍａｎｎ等、Ｊ 、Ｖｉｒｏｌ、、５８：８４３−８５０゜１９８６　）　、鍵となる特徴は、（ ｉ）この遺伝子が、２６３アミノ酸の長さの蛋白質をコードしていること；　（ ｉｔ）その蛋白質が、コード配列の中央に１０回反復するＡｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｒ ｏ３量体を含んでいること；　（ｉｉ＋）この蛋白質が、天然で塩基性であり、 多数のＡｒｇ及びＰｒｏアミノ酸からなること；　（ｉｖ）この遺伝子のプロモ ーターが、ウィルスの幾つかの必須のウィルス機能の働きもするゲノムの旦配列 中にマツプされること；（Ｖ）γ、３．４．５遺伝子の発現に必須のシス作用性 要素が、旦配列特にＤＲ２（２２回反復する１２塩基対配列）及びＵ−要素内に 含まれることである。この型のプロモーター構造は、この遺伝子にユニークであ り、他のウィルス遺伝子プロモーターと共通でない。

中枢神経系（ＣＮＳ）において、ウィルスを複製させ、増殖させ及び広げる能力 におけるγ、３４．５遺伝子の機能は、組換えウィルスのセットにより及びマウ スの脳における致命的脳炎を引き起こすそれらの能力を試験することにより示さ れた。この遺伝子を欠く突然変異ウィルスは、それ故、ＣＮＳ及び眼の中で増殖 し広がる能力を喪失し、それ故、非病原性である（　Ｃｈｏｕ等、５ｃｉｅｎｃ ｅ、　２５０：１２１２−１２６６、１９９０を参照されたい）。

γ１３４．５遺伝子は、神経細胞を、ニューロン細胞におけるプログラムされた 細胞死（アポブドーシス）の特徴的な方法における全蛋白質合成の停止から保護 することによって機能する。このプロモーターは、ストレス応答要素を含むよう であり、Ｕｖ照射にさらされること及び成長因子奪取によりトランス活性化され る。これらのデータは、γ１３４．５遺伝子が神経細胞中でストレス時にトラン ス活性化されてアポブドーシスを予防することを示唆している。

それ故、これらの発見の重要性は、γｒ　３４．５が生存能力を拡大し又は神経 細胞に保護を与え、その結果、この例では、ウィルスが複製して細胞から細胞へ と広がることにニューロとルレンスと定義する）が出来るという事実にある。こ の保護は、細胞が受ける他の毒性因子又は環境ストレスに対しても拡大し得るら しい、このニューロンの性質に関する重要な面は、ヒトの他の如何なる細胞とも 違って、脳、眼又はＣＮＳにおけるニューロンは再生せず、そのことが多くの神 経障害疾患の基礎を形成しているという事実である。細胞の生命を死又は退行か ら延命させる如何なる遺伝子又は薬剤も、神経退行の領域に重大な影響を有する ことが予想され得る。

γｌ　３４．５及び抗アポブドーシス因子の感染細胞における役割は、解明の初 期段階にある。最近の研究は、エプスタイン−パールウィルスが感染細胞の生存 能力を、潜在的膜蛋白質１　（ＬＭＰＩ）誘導されたｂｃｌ−２の上方制御を通 して増大させることを示唆した。その系においては、ＬＭＰ　１誘導されたｂｃ 　１−２上方制御がウィルス感染したＢ細胞に生理学的選択を回避して長生きの 記憶Ｂ細胞プールへの直接的アクセスを獲得する潜在能力を与えるということが 仮定される。しかしながら、ｂｃ　１−２発現は、ある種の状況例えばインター ロイキン２又はインターロイキン６の撤去においてアポブドーシスを抑制するこ とが出来ない、更に、ｂｅ　１−２発現の作用の細胞内機構は未知のままである 。

Ｃ，プロ　−ム　れこ　び　゛ 上述のことに照らして、ＣＮＳ細胞におけるγ。

３４．５の発現が保護の格別な特質をウィルス感染並びに天然の及びストレスで 誘導されたアポブドーシスに対してニューロンに加えたことは明らかである。こ の保護の格別の特質の評価は、中枢神経系（ＣＮＳ）異常の制御及び治療のため の新規且つ革新的な手段に利用することが出来る。特に、アルツハイマー病、パ ーキンソン病、ルーゲーリッグ病等（これらの病因はアポブドーシスの型に帰す ることが出来、これらの治療は現在非常に貧弱である）を含むＣＮＳ退行性疾患 の治療は、γ。

３４．５遺伝子を遺伝子治療で用いるか又はγ。

３４．５によって発現された蛋白質を治療剤として用いることによって有意に改 善され得るであろう、これは、記載したようにニューロン細胞は有糸分裂後に再 生しないという事実のためにかかる細胞の死が関係している場合に特に重要であ る。限られたニューロン数しかないので、それらの保護及び維持のための利用し 得る方法及び薬剤を有することは重要である。γＩ　３４．５は又、γ＋　３４ ．５の効果を真似し及び生物学的に誘導されたプログラムされた細胞死のストレ スをブロックする物質のアッセイのために非常に有用な遺伝子である。

更に、ＨＳＶ−１ウイルス（適当に修飾して非病原性にしたもの）は、ニューロ ンへの遺伝子治療の送達のためのビヒクルとして働くことが出来る。ＨＳＶ−１ ウイルスは、世界のヒト集団の９０％の知覚神経節のニューロン内に存在する。

このウィルスは、逆向性軸索輸送を介してニューロン細胞体中にのぼる（感染部 位から神経向性プロセスによって軸索に到達する）、一度ニューロン細胞体内に 入れば、このウィルスは、何らかの形態のストレス（例＾ば、ＵＶ露出、第２の ウィルスの感染、外科手術又は軸素切断）がウィルス複製を誘導するまで休止し 続ける。記載したように、ＨＳＶ−１のベクターとしての利用は、安全な非病原 性のベクターとして働くための欠失変異体の構築を必要とする。かかるウィルス は、ニューロンの遺伝子治療のための優れたベクターとして作用するであろうし 又、その利用は、少数の遺伝子治療しか中枢神経系の血液脳関門を通過して遺伝 子を送達する手段を提供しないので、特に重要な開発となろう。

更に、他のウィルス例えばＨＳＶ−２、ピコルナウィルス、コロナウィルス、エ ウニアウイルス、トガウィルス、ラブドウィルス、レトロウィルス又はワクシニ アウィルスは、γｌ　３４．５遺伝子治療のためのベクターとして利用すること が出来る。ＨＳＶ−１ウイルスの利用に関して論じたように、これらのベクター もそのような方法で変化させて非病原性にすることが出来よう、適当に変異させ たウィルスの利用に加えて、トランスフェクトした多能性神経細胞系統の移植も 、血液脳関門を回避するγ、３４．５遺伝子のＣＮＳへの送達のための手段を提 供する。

更に、γ＋　３４．５遺伝子に特定の突然変異を有するＨＳＶ−１ウイルスの利 用は、ＣＮＳ及び身体の他のすべての部分における腫瘍形成性疾患の治療方法を 提供する。「γｌ　３４．５マイナス」ウィルスは、アポブドーシスを誘導する ことが出来、それ故、宿主細胞死を引き起こすが、このウィルスは複製して広が ることは出来ない、それ故、ＣＮＳ内の腫瘍を標的とする能力を与えたならば、 γ＋　３４．５マイナスウイルスは、今まで治療不可能であった型のＣＮＳ癌に 対する強力な治療剤であることが証明された。更に、標的腫瘍細胞内で抗アポブ ドーシス効果を有する遺伝子の発現を阻止し又はブロックするウィルス以外の物 質も又、腫瘍治療及びヘルペスウィルス感染の治療並びにニューロビルレンズが 宿主細胞のプログラムされた細胞死機構との干渉に依存する他のウィルスの感染 の治療における重要な開発として働き得る。

１豆Ω１至 この発明は、神経退行性疾患に関連した治療のためのニューロン細胞におけるプ ログラムされた細胞死即ちアポブドーシスの予防又は治療のための方法、並びに 癌及び他の１瘍形成性疾患及びヘルペスウィルス感染の治療方法に関するもので ある０本発明は又、γ＋３４．５遺伝子又はその蛋白質発現産物ＩＣＰ３４．５ の効果を調節し得る物質（即ち、これらの効果を強め又は阻止することの出来る 物質）の同定を可能にするアッセイ方法にも関係している。更に、本発明は又、 γｌ　３４．５発現又はＩＣＰ３４．５の活性の何れかを真似ることの出来る候 補物質を同定するためにデザインされたアッセイ方法にも関係する０本発明は又 、遺伝子を遺伝子治療のために細胞に送達する方法にも関係している。

本発明の詳細な説明のための具体例において、ニューロン細胞におけるプログラ ムされた細胞死を予防し又は治療する方法を説明するが、そこでは、γ、３４． ５遺伝子を含む非病原性ベクターを調製する。このベクターを、次いで、プログ ラムされた細胞死を現在受けているか又は受けそうなニューロン細胞に導入する 。当業者は、たとえ本発明がγｒ　３４．５遺伝子の送達に関して用いるために 特にデザインされたあるユニーク且つ新規なベクターの利用を構想していても、 幾つかのベクターがこの方法に用いるのに適していることを理解するであろう。

本発明により構想されたかかる１つのベクターは、修飾して非病原性にした）Ｉ ＳＶ−１ウィルス自体である。

軸索の内部輸送系を利用してニューロンの末梢神経の終末からニューロン細胞体 中まで移動するＨＳＶ−１ウイルスのユニークな能力の故に、本発明は、影響さ れるニューロンのシナプス末端の近くに注入した非病原性ＨＳＶ−１ウィルス、 或は末梢の傷又は病変領域又は他の適当な周辺位置における該ウィルスの利用を 提供する。

γ＋　３４．５遺伝子を含むＨＳＶ−１ウイルスは、次いで、異なる標的特異的 プロモーターの下で、逆向性軸素輸送によってニューロン細胞体内に輸送される であろう。

本発明は、ＨＳＶ−１ウイルスを非細胞毒性にするために該ウィルス中に導入す る特定のゲノムの修飾を構想している。これらの修飾は、ゲノムの欠失、特定の ゲノム配列の再配列、又はその他の特定の突然変異を含むことが出来よう、かか る修飾の一例は、Ｉ　ＣＰ４蛋白質をコードするα４遺伝子の修飾又は欠失を含 む、ＩＣＰ４を発現する遺伝子の欠失又は修飾は、ＨＳＶ−１ウイルスがウィル スＤＮＡ及び構造蛋白質合成に必要な遺伝子を発現することを出来なくする。し かしながら、適当なプロモーターの下に置かれたγｌ　３４．５遺伝子は発現し 、それ故、ニューロンにおいて、ストレス誘導されたニューロビルレンスの潜在 能力を伴わずに抗アポブドーシス効果を誘導する。修飾可能であろう他の遺伝子 はα０遺伝子を含む０本発明は又、例えば、レトロウィルス、ピコルナウィルス 、ワタシニアウイルス、）ＩＳＶ−２、コロナウィルス、エラニアウィルス、ト ガウィルス又はラブドウィルスベクターを含む他のベクターの利用をも構想して いる。再び、かかるウィルスのベクターとしての利用は、それらのベクターが安 全で非病原性であるように欠失変異体の構築を必要とする。

本発明がγｌ　３４．５遺伝子をプログラムされた細胞死を受けているか又は受 けそうなニューロン細胞中に導入することを構想する他の方法は、多能性神経細 胞系統の利用によるものである。かかる系統は、イン・ビトロで表現型を変える ことが示され又、マウスの中枢神経系に統合され且つそれらを植え付けた部位に 適した様式でニューロン又は節に分化することも示された（　５ｎｙｄｅｒ等、 Ｃｅ１ｌ、　６８：３３−５１．１９９２）　−γｒ　３４．５遺伝子を導入し た多能性神経細胞系統の、細胞がプログラムされた細胞死を受けているか又は受 けそうな中枢神経系への移植又は植付けは、プログラムされた細胞死の逆転及び 阻止へ導くことが予想される。

γｌ　３４．５のアポブドーシスを阻止する能力は、ヒトの医学においてのみな らず、基礎的な科学の研究においても恩恵となるであろうことが期待される。こ の関係において、本発明は又、細胞培養におけるニューロン細胞の生命を延長さ せることにおけるγＩ３４．５遺伝子の利用をも構想する。非細胞毒性ベクター の培養ニューロン細胞への導入は、抗アポブドーシス効果を有し、それ故、細胞 培養の生命を延長させるであろう、これは、更に、実験が行なわれる時間を延長 し、基礎研究を行なうコストを減らすことをも期待することが出来る。

γＩ　３４．５遺伝子を含むベクターを利用することに加えて、本発明は又、γ ｌ　３４．５遺伝子の発現の産物の利用を含む、ニューロン細胞におけるプログ ラムされた細胞死を予防し又は治療する方法をも開示する。γ。

３４．５により発現される蛋白質は、ＩＣＰ３４．５と呼ばれる＊　Ａｃｋｅｒ ｍａｎｎ等（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　、　５８：８４３−８５０゜１９８６）は、 ＩＣＰ３４．５がＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で見かけ分子量４３，５００ を有し、ＨＩＶ感染細胞の細胞質内に大いに蓄積するらしいことを報告し、多く （７）ＨＳＶ−１蛋白質と対照的に、ＩＣＰ３４．５は生理的溶液に可溶性であ ることが示された。

この方法の実施又はγｒ　３４．５遺伝子を細胞内に導入する方法の実施におい ては、γ、３４．５遺伝子又はその生物学的機能等偽物を遺伝子治療に用いるこ とが出来、精製した形態のＩＣＰ３４．５又はＩＣＰ３４．５蛋白質の生物学的 機能等価物を抗アポブドーシス剤として利用することが出来ることを想定してい る。ここで用いる場合、機能等価物とは、ある種の構造変化が起きているが、そ れにもかかわらず、ＩＣＰ３４．５の効果と同じ効果を明示する蛋白質であるか 又はそれらをコードする、蛋白質及びそれらのコード核酸配列をいうことを意図 している。

規定の機能活性の測定し得る消失を伴わずに蛋白質中である種のアミノ酸が他の アミノ酸に置換されるという事実に照らして、発明者は、測定可能な生物学的有 用性又は活性の消失を伴わずに、ＩＣＰ３４．５蛋白質の配列（即ち、γｌ　３ ４．５遺伝子のアンダーラインを付けたＤＮＡ）中に種々の変化が起こり得ると いうことを予想する。アミノ酸を、同様の水治療成績を有して、他のアミノ酸と 互いに置換することが出来る（にｙｔｅ等、ＬＭｏｌ、　Ｂｌｏｌ、、　１５７ ：１０５−１３２．１９８２を参照されたい、該文献を参考として本明細書中に 援用する）（米国特許第４．５５４，１０１号（参考として本明細書中に援用す る）に記載のように、類似の親水性値を有するアミノ酸であるので）。

それ故、アミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性例えばそ れらの疎水性、親水性、チャージ、寸法等に基づいている。上記の種々の性質を 考慮した典型的な置換は当業者に周知であり、アルギニンとリジン：グルタメー トとアルパルテート；セリンとスレオニン；グルタミンとアスパラギン；並びに バリン、ロイシン及びイソロイシンを含む。

本発明のこの具体例は、製薬組成物を形成するためにＩＣＰ３４．５又はその生 物学的機能等価物を製薬上許容し得るキャリアーと結合させることを含む方法を 説明する。（γ、３４．５又はＩＣＰ３４．５というときには、発明者は、γ、 ３４．５の効果を真似る任意の化学薬品を含む生物学的機能等価物を含むことを 意図しているということは後述の検討において理解されよう）、かかる組成物を 、次いで、プログラムされた細胞死を受けそうな又は受けているニューロンに投 与する。かかる組成物を、静脈注射、髄腔注射を用いて動物に投与することが出 来よう（ある状況では、経口、大脳内又は脳室内投与が適している）、更に、培 養中のニューロン細胞も又、それらが成長している培地に直接ＩＣＰ３４．５を 投与することにより、その投与の恩恵を受けることが出来よう。

ＩＣＰ３４．５を、ＩＣＰ３４．５をコードすること学的機能等価物）を用いて 調製することが出来る。かかる断片は、例えば、γ、３４．５断片を宿主細胞に トランスファーし、その宿主細胞をその断片の発現に適した条件下で培養して発 現を生じさせ、その後に、十分確立された蛋白質精製技術を用いてその蛋白質な 単離精製することを含む技術を用いて発現され得よう、核酸断片を宿主細胞に、 組換えベクターのトランスフェクション又はトランスフォーメーションによって トランスファーす本発明の特に重要な具体例は、γＩ　３４．５遺伝子の効果又 はＩＣＰ３４．５の効果を真似ることの出来る候補物質のアッセイ、並びにγ、 ３４．５の機能を強化するか又はＩＣＰ３４．５の保護機能を強化することの出 来る候補物質のアッセイに関するものである。更に、γｒ　３４．５発現又はＩ ＣＰ３４．５の活性を阻止することの出来る候補物質のアッセイ方法も又本発明 の具体例である。

典型的具体例において、抗アポブドーシス遺伝子の発現をブロックし又は抗アポ ブドーシス蛋白質例えばＩＣＰ３４．５の活性を阻止する候補物質を試験するア ッセイは、下記の流れに沿って進める。旦配列プロモーター及びγｌ　３４．５ のコード配列の部分を有する試験プラスミツト構築物を、１　ａｃＺレポーター 遺伝子又は任意の他のアッセイ可能なレポーター遺伝子と融合する。この構築物 を、次いで、適当な細胞系統例えば神経芽細胞腫又はＰＣＩ２細胞系統に、Ｇ４ １８選択により導入する。スクリーニング目的のためのクローン化連続細胞系統 を、次いで、確立する。Ｈ３Ｖ後期プロモーター（通常、細胞系統中では発現せ ず且つ通常アポブドーシスを誘導するストレス因子によっては発現が誘導されな い）を有する対照のプラスミツト構築物を同じ又は異なる指標遺伝子に融合する 。この構築物も又、連続クローン化細胞系統に導入して試験細胞系統に対する対 照として働くことが出来る０次いで、この抗アポブドーシス薬剤を加える。典型 的に旦配列プロモーター活性化の引き金を引きプログラムされた細胞死を引き起 こす環境ストレス例えばＵＶ傷害、ウィルス感染又は神経成長因子の奪取等を、 次いで、細胞に加える。対照用細胞において、ストレスは、それらの細胞に何ら の効果をも有さす、アッセイにおいて何らの検出可能な反応を生じないであろう 、試験細胞系統におけるストレスは、正の候補物質の不在下において、適当な反 応、典型的には色彩反応を生じるであろう、候補物質の存在下での試験細胞系統 へのストレスの導入は、候補物質がγｌ　３４．５遺伝子の発現と干渉するか又 はＩＣＰ３４．５の抗アポブドーシス活性と干渉する物質の能力と干渉すること を示す逆の色彩反応を生じるであろう。

同様に、本発明は、ＩＣＰ３４．５の活性を真似し若しくは強化するか又はγ、 ３４．５の発現を真似する候補物質のアッセイを説明するが、かかるアッセイは 、上記と類似の流れに沿って進める。ＩＣＰ３４．５及び蛍光標識した細胞性遺 伝子又は細胞の生存能力を知らせる容易に検出されるマーカーを与える任意の他 の標識を構成的に発現している試験細胞系統（例えば、神経芽細胞種細胞系統） を生成する。更に、適当な指標遺伝子例えば旦−１ａｃＺ指標遺伝子及び試験細 胞系統と同じ宿主指標遺伝子からなる対応ヌル細胞系統も又生成する。

又、同じ指標遺伝子及び同一宿主指標遺伝子からなる第３の細胞系統（例えば、 Ｖ８ｒＯ細胞系統）も又生成する。再び、プログラムされた細胞死を引き起こす 環境ストレスを、γ＋３４．５の不在下でこれらの細胞に加える。それらがγｌ 　３４．５発現の抗アポブドーシス効果又はＩＣＰ３４．５若しくはその生物学 的機能等飾物の抗アポブドーシス活性を真似るか強化するかどうかを決定するた めに候補物質も又加える。

本発明は又、遺伝子治療のための遺伝子の送達方法を具体化する。典型的具体例 において、この方法は、遺伝子治療に用いる遺伝子を上述のような突然変異した ウィルス即ち非病原性を付与されたＨＳＶ−１ウイルスと結合させることを含む 、この遺伝子及びウィルスを、次いで、製薬組成物を形成するために薬理学的に 許容し得るキャリアーと結合させる。この製薬組成物を、次いで、治療のための 遺伝子を含む突然変異したウィルス又はその遺伝子を含むＨＳＶ−１野生型ウイ ルスが適当な領域で細胞に取り込まれ得るような方法で投与する１例えば、ＨＳ Ｖ−１ウイルスを用いるときには、この組成物を、ウィルスがシナプス末端に取 り込まれて軸素まで逆向性様式で、軸索細胞体中へ逆向性軸索輸送により輸送さ れるようにシナプス末端が位置する領域に投与することが出来よう、明らかに、 末梢又は中枢神経系が遺伝子治療の標的とされた場合には、かかる方法のみが適 当なものである。

本発明は又、癌又は他の腫瘍形成性疾患並びにヘルペス感染又はビルレンスが抗 アポブドーシス効果に依存するウィルスに関する他の感染の治療のための方法及 び組成物をも構想する。上述のアッセイ方法において同定されたＩＣＰ３４．５ の発現又は活性に対する阻害効果を有するとして同定された候補物質を用いて、 標的腫瘍細胞又はウィルス感染細胞における細胞死を誘導することが出来る。か かる物質を含む製薬組成物を、髄腔的注射、静脈注射又は直接の注射を用いて、 腫瘍又は感染領域に適当に導入することが出来る。

区ＪＬ９Σ！崖」ｄ笈コ 図１　ハ、ＨＳＶ−Ｉ　Ｆ株（配列番号１〜５）、１７ｓｙｎ十株（配列番号： 　６〜９）、ＭＧＨ−１０株（配列番号１０〜１５）、及びＣＶＧ−２株（配列 番号１６〜２０）のＩＣＰ３４．５の遺伝子領域（左パネル）及びこれらの株に おけるＩＣＰ３４．５　（配列番号２５〜３４）の予測されるオープンフレーム （右パネル）のＤＮＡ配列を示している。新たな塩基（Ａ、Ｃ，Ｇ又はＴの挿入 ）、新たなアミノ酸（３文字記号）、或は塩基又はアミノ酸の不在（−）により 示されない限り、ＨＳＶ−１（１７）ｓｙｎ＋、ＨＳＶ−１（ＭＧＨ−１０）及 びＨＳＶ−１（ＣＶＧ−２）株の配列は、ＨＳＶ−１（Ｆ）と同じであった。ア スタリスクは、９ヌクレオチド又は３アミノ酸の反復配列の始まりを示している 。直列反復１　（ＤＰＩ）は、旦配列荷隣接する２０塩基対の反復配列を示して いる。直列反復１の上流の配列は、旦配列内に含まれる。各行の末尾の数は、ヌ クレオチド１（左パネル）又はアミノ酸ｌ　（右パネル）からの相対的位置を示 す、ＨＳＶ−１（Ｆ）配列の開始コドン及び終止コドンにはアンダーラインを引 いである。

図２は、野生型株であ６ＨＳＶ−Ｉ　Ｆ株［ＨＳＶ−１（Ｆ）］及びそれに由来 する組換えウィルスのゲノムの配列配置を示す、最上部の行は、ＨＳＶ−１（Ｆ ）Δ３０５の配列配置である。方形は、逆方向反復ａｂ、ｂ’　ａ’　ｃ、及び ｃａを同定する。ＨＳＶ−（Ｆ）Ｃ配列は、これらの２つのゲノム末端に順方向 で存在し、ロング及びショートコンポーネント間の接合部に逆方向で存在する。

これらのｂ及びＣ配列は、それぞれ、約９及び６ｋｂｐ長である。ＴＫと印した 三角形は、ｔｋ遺伝子の位置及びＨＳＶ−１（Ｆ）Δ３０５から欠失したＢａｍ ＨＩ　Ｑ断片のＢｇｌＩＩ　〜５ａｃＩ配列の位置を同定する。上から２及び３ 行目は、ｂ配列がＩＣＰ３４．５及びＩＣＰＯを特定する遺伝子を含むこと及び ｂ配列が逆方向で反復しているのでこれらの遺伝子がゲノム当り２コピー存在す ることを示す、糖蛋白質Ｈ遺伝子の部分を含む旦２４−ｔｋ断片の構築は記載さ れた。

Ｃｈａｕ及びＲｏｉｚｍａｎ、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、５７：（１９８６）：　Ａｃ ｋｅｒｍａｎ等、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、５８：８４３　（１９８６）；　Ｃｈｏ ｕ及びＲｏｉｚｍａｎ、　Ｊ。

Ｖｉｒｏｌ、、　６４：１０１４　（＋９９０）、　７行目は、すべての３つの リーディングフレームにおける終止コドンを含むオリゴヌクレオチドの挿入の略 図を示す、Ｒ４００２及びＲ４００４の構築においてそれぞれ用いたプラスミツ ドｐＲＢ３６１５及びｐＲＢ２９７６は、ほかの場所に記載したものである（　 Ｃｈｏｕ及びＲｏｉｚ＋＋＋ａｎ、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、　５７：６２９（１ ９８６）及びＪ、　Ｖｉｒｏｌ、、　６４：１０１４　（１９９０））　、　ｐ 　Ｒ３３６１６を生成するために、プラスミツドｐＲＢ１４３をＢｓｔＥＩ　Ｉ 及び５ｔｕＩで消化してＴ４ポリメラーゼで平滑末端化し、そしてリガーゼで再 結合させた。アスタリスクは、合成オリゴマー（配列番号２１〜２２）との粘着 末端を形成するベクターのプラスミツトからのヌクレオチドを示す、ａ４エピト ープのＩＣＰ３４．５の第１のアミノ酸中への挿入（９行目）は、記載されたも のである（　Ｃｈｏｕ及びＲｏｉｚｍａｎ、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、　６４：１ ０１４（１９９０））が、但し、この例においては、配列をγ１３４．５遺伝子 の両コピー（配列番号２３．２４及び３４）に挿入した。ｔｋ遺伝子は、マウス で試験したすべての組換えウィルスにおいて復原された。ＨＳＶ−１（Ｆ）Ｒ（ ６行目）は、γｔ３４．５及びｔｋ遺伝子において欠失した配列の復原によって 、Ｒ３６１７から誘導した。Ｎ、Ｂｅ％Ｓ及びＳｔは、それぞれ、Ｎｃ。

１、ＢｓｔＥＩ　Ｉ、Ｓａｃ　Ｉ及び５ｊｕｌ制限エンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ 　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　）の略語である。括弧内の数は、マウスで 試験した各構築物のｔｋ”バージョンである。

図３は、電気泳動で分離したプラスミツト（野生型及び突然変異ウィルスＤＮＡ ）の消化物（固体支持体にトランスファーしてγ＋３４．５及びｔｋ遺伝子の存 在に対する標識プローブとパイプリダイズさせたもの）のオートラジオグラフィ ー像を示す、示したプラスミツド又はウィルスＤＮＡｆ７！：ＢａｍＨＩで又は 、レーン１０に示したＲ４００９の場合にはＢａｍＨＩとＳｐｅ　Ｉの両方で消 化した。これらのハイブリダイゼーションブローブは、γ＋３４．５のコード配 列（左パネル）内に完全に含まれるＮｃｏＩ−３ｐｈｌ断片及びＨＳＶ−１（Ｆ ）のＢａｍＨＩ　Ｑ断片（右パネル）であった、これらのプローブを、［α−■ Ｐ］デオキシシチジン三リン酸及びキット（Ｄｕ　Ｐｏｎｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎ ｏｌｏｇｙ　ＳｙｓｔｅｍＢ）中に与えられた試薬を用いて、全プラスミツドＤ ＮＡのニックトランスレーションにより標識した。ＢａｍＨＩ　（全レーン）又 はＢａｍＨＩと５ｐｅＩの両方（左パネル、レーン１０）で限定消化したＤＮＡ を、０．８％アガロースゲル上で、９０ｍＭ）リホスフェート緩衝液中で、４゜ Ｖで一晩、電気泳動により分離した０次いで、ＤＮＡを、ゲルをはさんだ２枚の ニトロセルロースシートに、重力によりトランスファーし、各プローブと一晩ハ イブリダイズさせた。Ｙｌ　３４．５は、ＢａｍＨＩ　Ｓ及びＳＰ断片中にマツ プされ、特徴的なバンドの梯子を、５００ｂｐ増加にて形成する。これらの梯子 は、ロング及びショートコンポーネント間の接合部のユニーク配列に隣接する反 復中の旦配列の変化する数の結果であるが、ＢａｍＨＩ　Ｓは、ロングコンポー ネントの末端のウィルスケツムの末端断片であり、ＢａｍＨＩ　Ｓ　Ｐは、末端 ＢａｍＨＩＳ断片とＢａｍＨＩ　Ｐ（ショートコンポーネントの末端ＢａｍＨＩ 断片）との融合により形成された断片である。ＢａｍＨＩ　Ｓ、ＳＰ及びＱ及び それらの欠失バージョンであるΔＢａｍＨＩ　Ｓ。

ΔＢａｍＨＩ　ＳＰ及びΔＢａｍＨＩ　Ｑ（ΔＱ）のバンドを、それぞれ、示し である。バンク１は、Ｒ４００２中のＢａｍＨＩ　ＳＰ断片への１．７ｋｂｐの α２７−ｔｋ挿入物を表し、それ故、この断片は、両標識プローブと反応した（ レーン４）、バンド２は、ＢａｍＨＩＳ断片への同じ挿入物を表す。

図４は、オートラジオグラフィー像（左パネル）及びＨＳＶ−１（Ｆ）及び組換 えウィルスに疑似感染（Ｍ）又は感染した細胞の溶解物の写真（右パネル）を示 す（変性ポリアクリルアミド（１０％）ゲル中で電気泳動により分離し、ニトロ セルロースシートに電気泳動によりトランスファーしてほかの場所で述べたウサ ギポリクローナル抗体Ｒ４で標識したもの）　、　Ａｃｋｅｒｍａｎ等、ムＶｉ ｒｏ１．．　５Ｂ：８４３　（１９８６）；Ｃｈｏｕ及びＲｏｉｚｍａｎ、Ｊ、 　Ｖｉｒｏｌ、。

６４：１０１４　（１９９０）、　Ｖ　ｅ　ｒ　ｏ細胞の重複培養を、感染させ 、感染の１２〜２４時間後に［！６Ｓ］メチオニン、（ＤｕＰｏｎｔ　Ｂｉｏｔ ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　５ｙｓｔｅ＋ｎｇ　）で標識し、等量の細胞溶解物を各ス ロットに載せた。この手順は、記載されたようにした（　Ａｃｋｅｒｍａｎ等、 Ｃｈｏｕ及びＲｏｉｚｍａｎ　）　、但し、結合した抗体を、Ｐｒｏｍｅｇａ、 　Ｉｎｃ、により供給されたアルカリホスファターゼ基質システムを用いて可視 化した。

感染細胞の蛋白質を、）Ｉｏｎｅｓｓ及びＲｏｉｚｍａｎ　（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ 、　。

１２・＋３４６　（１９７３））に従って番号で示した。Ｒ４００３により特定 されるキメラＩＣＰ３４．５は、エピトープの挿入により生じた増加した分子量 の故に、他のウィルスにより生成された蛋白質よりゆっくりと移動した。

図５は、ＨＳＶ−Ｉ　Ｆ株［Ｈ３ＶＯ１（Ｆ）］及び関連変異体のゲノム構造及 び配列配置の図式表示である。１行目：それぞれ、逆方向反復に隣接したユニー クな配列からなる、ＨＳＶ−Ｉ　ＤＮＡの２つの共有結合したコンポーネント、 Ｌ及びＳ（７，３１）　ｍ　ａ上及びｂ’　ａ’　で示されるしコンポーネント に隣接する反復配列は、それぞれ、９ｋｂの大きさであり、他方、Ｓコンポーネ ントに隣接する反復は、６．３ｋｂの大きさである（３１）、２行目：γｌ　３ ４．５及びα０遺伝子を含む逆方向反復配列１上及びｂ’　ａ’の部分の拡大、 ３行目：２行目に示した拡大部分の配列配置及び制限エンドヌクレアーゼ部位、 開いたボックスは、且配列に隣接す２７）、制限部位表示は、Ｎ−ＮｃｏＩ　； Ｂｅ−ＢｓｔＥＩ　Ｉ　；　Ｓ−５ａｃｌ　；５ｔ−３ｔｕＩである。４行目： 細線及び塗りつぶした方形は、γ、３４．５遺伝子の転写されるコード領域を表 す（４０Ｂ）、垂直の線は、Ｙｌ　３４．５及びαＯ遺伝子の転写開始部位の位 置を示す、Ｒ３６１６ウイルス組換え体において、γ、３４゜５の２８番目のア ミノ酸にあるＢｓｔＥＩ　Ｉから示した遺伝子の３°末端の５ｔｕＩの間のＩＫ ｂを欠失させた。ＨＳＶ−１（Ｆ）ＲＤＮＡにおいて、Ｒ３６１６中のＹｌ　３ ４．５遺伝子から欠失した配列を復原し、それ故、このウィルスは、野生型の表 現型を示すことが予想されよう、Ｒ４００９組換えウィルスＤＮＡは、ＢｓｔＥ ＩＩ部位にフレームの合った翻訳終止コドンを含む、上部の垂直の矢印は、終止 コドン挿入の部位を示している。

図６は、規定の３ＩＳ−メチオニンで９０分間標識した感染細胞の電気泳動で分 離した溶解物のオートラジオグラフィー像を示す、５Ｋ−Ｎ−ＳＨ神経芽細胞種 及びＶｅｒｏ細胞系統を疑似感染（Ｍ）させ又は３７℃で野生型又は突然変異ウ ィルスの５ｐｆｕに６ウエルデイツシユ（マサチューセッツ州、Ｃａｍｂｒ　ｉ ｄｇｅ在、Ｃｏａｔａｒ）中でさらした。露出後２時間で、これらの細胞を１％ 仔ウシ血清を補った混合物１９９に重ねた。細胞のウィルスへの露出後５．５及 び１１．５時間にて、重複感染させた６ウエル培養を、未標識メチオニンを欠く が５０μＣｉの３６８−メチオニン（イリノイ州、Ｄｏｗｎｅｒｓ　Ｇｒｏｖｅ 在、＾ｍａｒｓｈａｍ　Ｃｏ、製、比活性＞１．０ＯＯＣｉ／ミリモル）を補っ た１ｍｌの１９９ｖ培地に重ねた。標識培地中での９０分の後に、細胞を採集し 、ドデシル硫酸ナトリウムを含む緩衝液中にて可溶化し、Ｎ、Ｎ’　ジアリルタ ルタルジアミンで架橋した変性１２％ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動に かけ、ニトロセルロースシートへ電気泳動によりトランスファーして前記のよう にしてオートラジオグラフィーにかけた（１３）　、感染細胞蛋白質（ＩＣＰ） を、Ｈｏｎｅｓｓ及びＲｏｉｚｍａｎ、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、。

１２：＋３４７−１３６５　（＋９７３）　Ｇ、ｍ従ッテ示した。

図７は、変性ゲル中にて電気泳動で分離した標識したポリペプチドのオートラジ オグラフィー像及び抗体との反応性により可視化された蛋白質のバンドの写真を 示す、５Ｋ−Ｎ−ＳＨ神経芽細胞種及びＶｅｒｏ細胞を、図６の説明で記載した ように、１細胞当り５ｐｆｕのＲ３６１６又は親ＨＳＶ−１（Ｆ）Ｇ：、疑似感 染（Ｍ）させるか又は感染させた。これらの培養を、細胞をウィルスにさらして から１３時間後に採集する前に、１．５時間にわたって標識した。細胞抽出物の 調製、ポリペプチドの電気泳動、分離したポリペプチドのニトロセルロースシー トへの電気的トランスファー及びオートラジオグラフィーを、ほかの場所（Ａｃ ｋｅｒｍａｎ等、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、。

５２：１０Ｂ−１１８，１９８４）　Ｇ：記載されたヨウニシテ行なった。ニト ロセルロースシートを、Ｐｒｏｍｅｇａ、　Ｉｎｃ、（ウィスコンシン州、Ｍａ ｄ　１ｓｏｎ在）からのキットの補助を受けて、製造”者の支持に従って各抗体 と反応させた。α２７に対するモノクローナル抗体Ｈ１１４２及びＵＬ２６゜５ 遺伝子の産物に対するＲ７２５は、Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏのカリフォルニ ア大学のＬｅｎｏｒｅ　Ｐｅｒｅｉｒａより寛大にも贈られた一Ｕ＊１１蛋白質 に対するＭ２８モノクローナル抗体及びウィルス性チミジンキナーゼ（βｔｋ） に対するウサギポリクローナル抗体Ｒ１６１を、この研究室の特定のペプチド（ Ｍ、　Ｓａｒｍｉｅｎｔｏ及び９．１１０ｌ１０１ｚ、未発表の研究）に対して 作成した。ＩＣＰの表示は、前記の通りである。

図８は、ホスホノアセテート（、ＦＡＡ）の存在又は不在下での、５Ｋ−Ｎ−Ｓ Ｈ神経芽細胞種細胞系統への感染の間に発現されたウィルス蛋白質のオートラジ オグラフィー像を示す、二重の５Ｋ−Ｎ−ＳＨ神経芽細胞種細胞培養を、ホスホ ノアセテート（３００μｇ／ｍｌ；ミズーリ州、Ｓｔ　Ｌｏｕｉｓ在、Ｓｉｇｍ ａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）で処理する（感染の１．５時間前に開始して、 感染の終了まで続ける）か又は未処理のままで置いた。これらの培養を、５　ｐ 　ｆ　ｕ（７）ＨＳＶ　−１（Ｆ）　、Ｒ３６１６、Ｒ４００９及びＨＳＶ−１ （Ｆ）Ｒの何れかに疑似感染させるか又は５　ｐ　ｆ　ｕ／細胞でさらした。ウ ィルスへの露出の１１．５時間後に、これらの細胞を、図６の説明に記載したよ うにして、５０μＣ１の５ｓ３−メチオニンを含む培地に重ねた。ポリペプチド 抽出、Ｎ、Ｎ’　ジアリタルタルジアミンで架橋した１２％ポリアクリルアミド ゲル上での電気泳動、ニトロセルロースシートへの電気的トランスファー及びオ ートラジオグラフィーを、図６の説明に記載したようにして行なった。

図９は、ウィルス性ＤＮＡ及びＲＮＡの感染５Ｋ−Ｎ−３Ｈ神経芽細胞腫及びＶ ｅｒｏ細胞培養内の蓄積を示している。左パネル：疑似感染細胞又はＨＳＶ−１ （Ｆ）、Ｒ３６１６、Ｒ４００９又はＨＳＶ−１（Ｆ）Ｒウィルスを感染させた 細胞から抽出した全ＤＮＡの、電気泳動により分離したＢａｍＨＩ消化物を含む エチジウムプロミド染色したアガロースゲルの写真、右パネル：電気泳動により 分離してニトロセルロースシートにトランスファーしたＲＮＡのハイブリダイゼ ーション（α４７、Ｕ、１０及びＵｌｌｌオーブンリーディングフレームに対し てアンチセンスのＲＮＡ配列をプローブとして使用）、５Ｋ−Ｎ−５Ｈ神経芽細 胞種及びＶｅｒｏ細胞を、１細胞当り５ｐｆｕのＨＳＶ−１（Ｆ）又はＲ３６１ ６に疑似感染又は感染させた。全ＤＮＡを、感染後１７時間で、Ｋａｔｚ等、Ｊ 、　Ｖｉｒｏｌ、、　６４：４２８８−４２９５により公開された手順により細 胞から抽出し、ＢａｍＨＩで消化し、０．８％アガロースゲル上で４０Ｖで電気 泳動してエチジウムプロミドで染色して可視化した。ＲＮＡ分析のために、５Ｋ −Ｎ−ＳＨ神経芽細胞種及びＶｅｒＯ細胞を、前述のように、Ｒ３６１６及びＨ ＳＶ−１（Ｆ）に疑似感染又は感染させた。細胞をウィルスにさらしてから１３ 時間後に、Ｐｅｐｐｅｌ及びＢａｇｌｉｏｎｉ　（Ｂｉ。

匡吐旦二脛、旦ニア１１−７１２．１９９０　）の手順によってＲＮＡを抽出し た１次いで、それらのＲＮＡを、１．２％アガロースゲル上で電気泳動により分 離し、ニトロセルロースシートへ重力によりトランスファーし、ｐｒｏａ＋ｅｇ ａ。

Ｉｎｃ、からのキットを用いて、製造者の指示に従って、ｐＲＢ３９１０ｏｆ　 ｆＴ７プロモーターのイン・ビトロ転写により作成したアンチセンスＲＮＡをプ ローブとして探った。α４７、ｕｓｔｏ及びＵｌ１１転写物は、配列が重複し、 同じ３°コタ一ミナル配列を共有している。　ＭｃＧｅｏｃｈ等、Ｊ、　Ｇｅｎ 、　Ｖｉｒｏｌ、、　６４：１５３１−１５７４（１９８８）、　Ｕ、　１０転 写物は、少量であり、このアッセイでは検出されない。

・　ｔ ヱ１ 本発明は、ＨＳＶ−１γＩ３４．５遺伝子、その遺伝子により発現されるＩＣＰ ３４．５蛋白質、及びにューロンの）プログラムされた細胞死に対する治療とし て類似の様式で機能するその蛋白質の誘導体の利用に関するものである０本発明 は又、改変した、非病原性ＨＳＶ−１ウィルス（並びに、他のウィルス）の遺伝 子治療用ベクターとしての利用にも関係する０本発明の他の面は、抗アポブドー シス剤として作用し得る候補物質を検出するアッセイ、並びに、腫瘍細胞におけ るプログラムされた細胞死を誘導し得る候補物質を検出するためのアッセイに関 するものである。更に、本発明は又、癌及びその他の腫瘍形成性疾患の治療方法 にも関係する。最後に、本発明は又、　γ、３４゜５遺伝子又はＩＣＰ３４．５ を不活性化し、それによりＨＳＶ−１及びその他のウィルス感染を抑制し得る候 補物質の利用にも関係する。

野生型Ｈ３Ｖ−１ゲノム（１５０キロ塩基対）は、２つのコンポーネントＬ及び Ｓを有し、各々は、逆方向反復に隣接したユニーク配列を有している。Ｌコンポ ーネントのこれらの反復配列（１上及びｂ’　ａ’で示す）は、各９キロ塩基対 であり、他方、Ｓコンポーネントの反復配列（ａ’　ｃ’及びｃａで示す）は、 各６．５キロ塩基対である。　Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ等、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、　 １５：１４８７−１４９７　（１９７５）、共通（７）ａ配列（ＨＳＶ−Ｉ　Ｆ 株［）１ｓｖ−１（Ｆ）ｌにおいては、５００塩基対長）は、Ｓコンポーネント 末端に１コピー存在し、Ｌ及びＳコンポーネント間の接合部に同じ向きで１〜数 コピー存在する。

Ｌ及びＳコンポーネントは、ウィルス粒子又は感染細胞から抽出したＤＮＡが、 Ｌ及びＳコンポーネントの向きが異なるだけの４つの異性体からなるように、互 いに逆向きになっている。　Ｈａｙｗａｒｄ等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａ ｄ。

Ｓｃｉ、　ｔｌｓＡ、　７２：４２４３−４２４７　（＋９７５）　、　ａ配列 は、ケノム内のほかの場所への旦配列の挿入又は完全な内部の逆方向反復配列（ ｂ’　ａ’　ｃ’　）の欠失が、それぞれ、更なる逆転又はＬ及びＳコンポーネ ントの逆転する能力の喪失へと導くので、シス作用部位であるらしい、この皇紀 列は又、感染後のゲノムの環化、コンカテマーからのＨＳＶゲノムの開裂及びＤ ＮＡのキャプシド封入のためのシス作用部位をも含むことが示された。

ＨＳＶ−１ゲノムは、発現が調和して制御され、カスケード様式で順次的に指令 される少なくとも７３遺伝子を含む、α遺伝子が、最初に発現され、β、γ、及 びγ２遺伝子が続いて発現される。β、γ１及びγ、遺伝子間の区別は、作動時 のウィルスＤＮＡ合成のインヒビターの効果に基づいている。ウィルスＤＮＡ合 成のインヒビターによって、β遺伝子の発現は刺激され、γ１遺伝子の発現は僅 かに減じるが、γ２遺伝子の発現は、ウィルスＤＮＡ合成に厳重に必要である。

旦配列の機能の研究の過程で、Ｃｈｏｕ及びＲｏｉｚｎ＋ａｎ（Ｃｅｌ＋、　４ １：８０３−８１１．１９８５）は、ＨＳＶ−１１７）チミジンキナーゼ（ＴＫ ）遺伝子の５°非コ一ド転写配列に融合させた且配列からなるキメラ構造がトラ ンスファーした細胞中で誘導可能であり、ウィルスゲノムに挿入したときにはγ 、遺伝子として制御されるということに注目した。この観察は、逆方向反復のｂ 配列に最も近い旦配列の末端が、構造配列がＬコンポーネントに隣接するｂ配列 中に位置している遺伝子のプロモーター及び転写開始部位を含むことを示唆して いる。感染細胞から抽出して電気泳動で分離したＲＮＡに対する標識ＤＮＡプロ ーブのハイブリダイゼーション及びＳｌヌクレアーゼ分析を含む研究は、旦配列 から始まるＲＮＡ転写物の存在を確実にした。ヌクレオチド配列分析は、２６３ アミノ酸長の蛋白質をコードすることの出来るオーブンリーディングフレームの 存在を示した。Ｃｈｏｕ及びＲｏｉｚｍａｎ、　Ｊ。

Ｖｉｒｏｌ、、　６４：　１０１４−１０２０　（１９９０）。

前の研究は、Ｓコンポーネントの各逆方向反復が、その全長中に、α４で表され る遺伝子を含み、他方、Ｌコンポーネントのものは、その全長中に、α０で表さ れる遺伝子を含むということを示した０例えば、Ｍａｃｋｅｍ及びＲｏｉｚｍａ ｎ、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、　４４：９３４−９４７　（１９８２）を参照され たい、ヌクレオチド配列及びＲＮＡの分析に基づいて同定された推定の遺伝子も 又、ゲノム当り２コピー存在する。逆転、コンカテマーからのＤＮＡの開裂及び ＤＮＡのバッキングのためのシス作用部位を含む旦領域を有するこの遺伝子の領 域の重複の故に、遺伝子産物を同定し特性決定することは興味深いことであった 。この目的のために、このヌクレオチド配列は、蛋白質中に、１０回反復するア ミノ酸トリブレットＡｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｒ。

が存在することを予言するという観察が利用され、この配列に基づいて合成した 合成ペプチドに対する抗体は、見かけ分子量４３，５００のＨＳＶ−１蛋白質と 反応した。　Ａｃｋｅｒｍａｎ等、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、５８：８４３−８６０． 　１９８６　。

ＩＣＰ３４．５をコードするオーブンリーディングフレームの変異性の程度を、 ヒト宿主の外で限られた回数継代された３種類のＨＳＶ−１株のヌクレオチド配 列の比較により確立した。　Ｃｈｏｕ及びＲｏｉｚｍａｎ　（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ 、。

む：１０１４−１０２０．１９９０　）は、ＩＣＰ３４．５を特定する遺伝子は 、３種類の限られた継代の株すべてにおいて保存されているが、ＨＳＶ−１（１ ７）ｓｙｎ十株の報告された配列中では保存されていない２６３コドンを含むこ とを報告した（図１）、予言された反復配列Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏに対する抗 体が類似の反復配列を有する異質蛋白質ではなくてＩＣＰ３４．５と反応するこ とを確かめるために、他のＨＳＶ−１遺伝子の特徴であるエピトープをコードす る４５ヌクレオチドの短い配列をＩＣＰ３４．５コード領域の５°末端近くに挿 入した。この組換えウィルスは、妥当な遅い電気泳動移動度を有し、挿入したエ ピトープに対するモノクローナル抗体及びＡ　ｌ　ａ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ反復要素 に対するウサギ抗血清の両方と反応する蛋白質を発現した。

ニューロとルレンスと関連した遺伝子の同定の研究は、Ｈ３Ｖ−ＩＤＮＡのロン グコンポーネントの末端又は末端近くに位置するＤＮＡ配列に関係していた。そ れ故、Ｃｓｎｔｉｆａｎｔｏ−Ｆｆｔｚｇｅｒａｌｄ等（Ｊ、　Ｅｘ　、　Ｍｅ ｄ、、　１５５：４７５、１９８２　）は、ＤＮＡ断片によって、ビルレンスマ ーカーをビルレント株からＨ３Ｖ−１のアンチビルレント株へトランスファーし た。Ｈ３Ｖ−Ｉ　ＤＮＡのロングコンポーネントの一端に位置する遺伝子の欠失 は、プロトタイプＨＳＶワクチン株により示されたビルレンスの欠如に寄与した 。　Ｍｅｉｇｎｉｅｒ等、Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、、　１５８：６０２ （１９８８）　、他の研究において、Ｊａｖｉｅｒ等（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、　 ６５：１９７８．１９８７　）及びＴｈｏｍｐｓｏｎ等（■坦旦ｎ、　１７２　 ：　４３５゜＋９８９　）は、大部分ＨＳＶ−Ｉ　ＤＮＡＪ’らなるが、ロング コンポーネントの一端に位置するＨ３Ｖ−２配列を有するＨ３Ｖ−１ｘＨ３Ｖ− ２組換えウィルスは、ビルレントでなく、ビルレンスは、相同なＨ３Ｖ−１断片 を用いるレスキューによって復原され得るということを示した０丁ａｈａ等（Ｊ 、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、、　７０ニア０５．　１９８９）は、Ｈ３ｖ−２株 のロングコンポーネントの両端の１．５ｋｂｐが欠失している自発的欠失変異体 を記載した。親ウィルス集団における不均一性の故に、マーカーレスキューによ り得られた組換え体が欠失変異体より一層ビルレントで、あったにもかかわらず 、ビルレンスの消失は、特定の欠失に明らかに関係しているとは言えなかった。

何れの研究においても、特定の遺伝子又は遺伝子産物は突然変異遺伝子座に同定 されなかったし、何れの遺伝子もビルレンス表現型に特異的に結び付けられなか った。

、３４．　５’　云　の″ γ＋３４．５遺伝子の産物（ＩＣＰ３４．５）の役割を試験するために、一連の ４種類のウィルス（図２）をＰｏ５ｔ及びＲｏｉｚｍａｎの手順（Ｃｅｌｌ、　 ２５：２２７．１９８１、本明細書中に参考として援用する）によって、遺伝子 工学処理した。

ｌ）組換１ウイルスＲ４００２（図４、レ−：／３）は、ＩＣＰ３４．５フ一ド 配列の両コピー中のα２７遺伝子（α２７−ｔｋ）のプロモーターによって駆動 されるチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子の挿入を含んだ、それは、ウサギ皮膚細 胞を、ｔｋ遺伝子の部分を特異的に欠失したウィルスＨ３Ｖ−１（Ｆ）Δ３０５ の完全なりＮＡ及びＢａｍＨＩ　Ｓ断片に含まれるＹ、３４．５遺伝子に挿入し たα２７−ｔｋ遺伝子を含むプラスミツドｐＲＢ３６１５のＤＮＡでコトランス フェクトすることによって構築した。ｔｋ’である組換え体を、次いで、ヒトの １４３のチミジンキナーゼマイナス（ＴＫ−）細胞上で選択した。α２７−ｔｋ 遺伝子を含む断片は、ｔｋ遺伝子から下流を含む：５°非転写プロモーター、非 コード転写配列及び糖蛋白質Ｈ遺伝子の開始メチオニンコドン、α２７−ｔｋ断 片が挿入されたＢｓｔＥＩ　Ｉ部位は、γ＋３４．５オーブンリーデイングフレ ームのコドン２９の直上流にある。結果として、糖蛋白質Ｈの開始コドンは、フ レームを合わせて融合され、γ１３４．５遺伝子の切り詰めたオーブンリーディ ングフレームの開始コドンとなった（図２．３行目）、更なる研究のために選択 した組換え体Ｒ４００２は、γ１３４゜５遺伝子の両コピー中にα２７−ｔｋ遺 伝子挿入物を含むことが示され（図３、レーン４）、キメラγ１３４゜５遺伝子 の予言された切り詰めた産物のみを特定した（図４、右パネル、レーン３）、こ れらの及び以前の研究において検出された天然ＩＣＰ３４．５蛋白質の量は、一 般に、低かった。糖蛋白質Ｈの５°非コード転写領域及び開始コドンと切り詰め たγ、３４．５遺伝子との（フレームをあわせた）融合によって形成されたキメ ラ遺伝子は、天然遺伝子より遥かに有効に発現した。

２）γＩ　３４．５遺伝子の各コピー中のｌｋｂのＤＮＡを欠失している組換え ウィルスＲ３６１７（図２．５行目）は、ウサギ皮膚細胞を完全なＲ４００２Ｄ ＮＡ及びプラスミツドｐＲＢ３６１６のＤＮＡでコトランスフエクトすることに よって生成した。このプラスミツトにおいて、γ、３４．５のコード領域の大部 分を含む配列は、欠失している（図２．５行目）、このトランスフェクションの ｔｋ”子孫を、ブロモデオキシウリジン（Ｂ　ｒ　ｄ　Ｕ）を含む培地に重ねた １４３７に一細胞上にプレートした。この手順は、ｔｋ−ウィルスを選択し、ｔ ｋ遺伝子はγＩ３４．５遺伝子の両コピー中に存在するので、このトランスフェ クションの選択した子孫は、両コピー中の欠失を含むことが予想され得よう、Ｒ ３６１７と表示する選択したｔｋ−ウィルスを、γ、３４゜５遺伝子の両コピー 中の欠失の存在について分析した。

ニューロビルレンスのアッセイのために、Ｒ３６１７の天然のｔｋ−遺伝子中の 欠失（その起源をＨ５Ｖ−１（Ｆ）Δ３０５に帰する）を修復しなければならな かった。これは、ウサギ皮膚細胞を完全なＲ３６１７ＤＮＡ及びｔｋ遺伝子を含 むＢａｍＨＩ　Ｑ断片でコトランスフェクトすることによって行なった。１４３ ７に一細胞中でｔｋ’″表現型について選択したウィルスなＲ３６１６と表示し た。このウィルスは、野生型ＢａｍＨＩ　Ｑ断片（図３、右パネル、レーン６） を含み、ＩＣＰ３４．５を作らない（図４、右パネル）。

３）Ｒ３６１６の表現型が実際にγ＋３４．５遺伝子における欠失を反映するこ とを確かめるために、欠失した配列を、ウサギ皮膚細胞を、完全なＲ３６１７Ｄ ＮＡ、完全なｔｋ遺伝子を含むＨ３Ｖ−１（Ｆ）ＢａｍＨＩ　ＱＤＮＡ断片及び 完全なγ、３４．５遺伝子を含むＢａｍＨＩ　５ＰＤＮＡ断片でコトランスフェ クト（モル比、１：１：１０）することによって復原した０次いで、ｔｋ’″で あるウィルスを、ヒボキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培地に重 ねた１４３７に一細胞にて選択した。ｔｋ”候補を、次いで、野生型ｔｋ及びＹ ｌ　３４．５遺伝子の存在についてスクリーニングした。予想されるように、選 択したＨＳＶ−１ＣＦ）Ｒで表されるウィルス（図２．６行目）は、野生型末端 ロングコンポーネント断片を含み（図３、左パネル、レーン２．７及び８を比較 されたい）、ＩＣＰ３４．５を発現した（図４、右パネル、レーン６）。

４）Ｒ３６１６の表現型が隠れたオーブンリーディングフレーム中の欠失を反映 している可能性を排除するために、ＩＣＰ３４．５コード領域の始めのすべての ３つのリーディングフレーム中に翻訳終止コドンを含むウィルス（Ｒ４０１０、 図２．７行目）を構築した。翻訳終止コドン及びその完全な配列を含む２０塩基 のオリゴヌクレオチド（図２）を、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｊｏｓｙｓｔｅｍｓ　３ ８００　Ｄ　ＮＡシンセサイザーにて作成し、等モル比で混合し、８０℃に加熱 し、そしてゆっくりと室温に冷却した。アニールしたＤＮＡを、ＨＳＶ−１（Ｆ ）ＢａｍＨＩ　Ｓ断片に、ＢｓｔＥＩＩ部位に挿入した。その結果のプラスミツ ドｐＲＢ４００９は、ＩＣＰ３４．５コ一ド配列の始めに挿入された終止コドン な含んだ、この２０ヌクレオチドオリゴマーＤＮＡ挿入は又、この挿入物の存在 の迅速な確認を可能にするＳｐｅ　Ｉ制限部位をも含んだ６組換えウィルスＲ４ ０１０を生成するために、ウサギ皮膚細胞を、Ｒ４００２の完全なりＮＡ及びｐ ＲＢ４００９プラスミツドＤＮＡでコトランスフエクトした。ｔｋ−である組換 え体を、ＢｒｄＵを含む培地中の１４３ＴＫ−細胞にて選択した。このウィルス のｔｋ”バージョン（Ｒ４００９と表示）を、完全なｔｋ−Ｒ４０１０ＤＮＡを ＨＳＶ−１（Ｆ）ＢａｍＨＩ　ＱＤＮＡ断片と共に用いるコトランスフエクショ ン及びｔｋ”子孫の選択により生成した。ニューロビルレンス研究のために選択 したウィルス、Ｒ４００９は、ＢａｍＨＩ　Ｓ　及びＳＰ断片の両方の５ｐｅＩ 制限工ンドヌクレアーゼ開裂部位を含み（図３、左パネル、レーン９及び１０） 、ＩＣＰ３４．５を発現しなかった（図４、右パネル、レーン７）。

５）Ｒ４００４（図２、最下行）は、１６アミノ酸をコードする配列の挿入によ り生成した組換えウィルスであった。この配列は、Ｉ　ＣＦ４と表示されるウィ ルス蛋白質と反応性のモノクローナル抗体Ｈ９４３のエピトープであることが示 された。　Ｈｕｂｅｎｔｈａｌ−Ｖｏｗｓ等、ムＶｉｒｏ＋、、　６２：４５４ 　（１９８Ｂ）、このウィルスを、完全なＲ４００２ＤＮＡ及び挿入物を含むプ ラスミツドｐＲＢ３９７６のＤＮＡでコトランスフエクトすることにより生成し 、選択したｔｋ−子孫を挿入物の存在について分析した。ニューロビルレンス研 究のために、そのｔｋ遺伝子を上述のようにして復原した（組換えウィルスＲ４ ００３）、このＤＮＡ配列を、フレームを合わせて、γ鵞３４．５遺伝子の開始 メチオニンコドンのＮｃｏ１部位に挿入した。この挿入物は、開始メチオニンコ ドンを再生し、ＩＣＰ３４．５のエピトープと残りの部分との間のメチオニンコ ドンを生成した。追加のアミノ酸の故に、この蛋白質は、変性ポリアクリルアミ ドゲル中で、一層ゆっくりと移動した（図４、右パネル、レーン４）。

すべての組換え体のプラークの形態及び寸法は、Ｖｅｒｏ、１４３ＴＫ−及びウ サギ皮膚細胞系統にプレートした場合に、野生型親ＨＳＶ−１（Ｆ）のものに類 似していた。ＨＳＶ−１（Ｆ）及びＲ４００３は、野生型ウィルスと同様に、Ｖ ｅｒｏ細胞複製培養において複製したが、Ｒ３６１６及びＲ４００９の収量は、 野生型の量の１／３〜１／４に減じた。ＩＣＰ３４．５は、培養細胞におけるＨ ＳＶ−１の生育に必須ではなかったが、表１に示す研究の結果は、γ、３４．５ の欠失又は翻訳の終止がウィルスのビルレンスに深い影響を有することを示して いる。それ故、最高濃度［１，２Ｘ１０’プラ一ク形成単位（ＰＦＵ）］のＲ３ ６１６を接種されたすべてのマウスは生き残った。Ｒ４００９の場合には、最高 濃度（〜１０’　ＰＦＵ）のウィルスの接種の結果、１０匹のマウスの内３匹の みが死亡した。他の欠失変異体と比較して、Ｒ３６１６及びＲ４００９は、今日 まで報告された最も低病原性のウィルスにランクされる。

Ｙｌ　３４．５遺伝子が復原されたウィルスは、族ウィルスのビルレンスを示し た。

表１ ＨＳＶ−１（Ｆ）　野生型組ウィルス４２０Ｒ３６１６Ｙｌ　３４．５中に１０ ００ｂｐの欠失　＞１．２００．０００ＨＳＶｉ　（Ｆ）　Ｒｙ　１３４．５及 びｔｋ１７）復原　１３０Ｒ４００９γ１３４．Ｓ中に終止コドン　＞１０．０ ００．００ＯＲ４００３ＭＨｚ末端に挿入された モノ　ローナル　エピトープ　４２００マウスの大脳内接種の後に死を引き起こ す野生型及び組換えウィルスの比較能力、ノースカロライナ州、Ｒａｌｅｉｇｈ 在、Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ＠ ｓからの２１日齢の雌のＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ／Ｃマウス（体重±１．８ｇ）で、ニュ ーロとルレンス研究を行な９た。ウィルスを、イーグルの塩類及び１０％ウシ胎 児血清、ペニシリン及びゲンタマイシンを含む最小必須培地にて稀釈した。マウ スに、２６ゲージ針を用いて、右大脳半球に、大脳内接種した。送達した容積は ０．０３ｍ１であり、各稀釈のウィルスを１０匹のマウスの群にて試験した。

これらの動物を、毎日、２１日間にわたって、死亡率をチェックした。ＬＤｓｏ を、英国、ケンブリッジ在、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｂｉｏｓｏｆｔの「投与量効果 分析」コンピュータープログラムの助けを借りて計算した。

野生型ウィルス及びすべての組換え体は、大脳細胞に取り付いて浸入するために 必要な同じ表面糖蛋白質を有する。大脳へのｌ０ＩＰＦＵの注射は、有意の数の 大脳細胞の感染及び死を生じるはずである。大脳内接種後の死は、ウィルスの複 製、細胞から細胞への拡大及び免疫系が作用する機会をもつ前の細胞破壊から生 じる。イーグル塩類及び１０％ウシ胎児血清を含む最小必須培地に懸濁させた大 脳組織の稀釈は、ＩＣＰ３４．５を作れないウィルスを接種されたこれらの動物 の大脳が、非常に少量のウィルスを含むことを示した。それ故、Ｒ３６１６及び Ｒ４００９ウイルスについては、回収率は、それぞれ、大脳組織１ｇ当り１２０ 及び１００ＰＦＵであった。接種物中のウィルス量（試験した最高濃度）を与え ても、回収された少量のウィルスが、接種物の生き残りを表すのか新たに複製さ れたウィルスを表すのかは、はっきりしない、対照的に、ＨＳＶ−１（Ｆ）Ｒ及 ヒＲ４００３を接種したマウスから回収されたウィルスの量は、それぞれ、６Ｘ １０’であった。これらの結果は、これらの２種類の組換えウィルスが死を引き 起こせないのは、突然変異ウィルスがＣＮＳにおいて複製することが出来ないこ との結果としてのニューロン組織におけるウィルスの乏しい広がりに関連してい るに違いなく、それらの宿主の範囲の減少を反映しているということを示してい る。

γ＋３４．５遺伝子産物の機能をめるためにデザインした研究の過程で、ニュー ロナルオリジンの細胞にγＩ　３４．５遺伝子を発現することができない突然変 異体を感染させると細胞蛋白質合成を停止することになるのに対し、非ニューロ ナルオリジンの細胞に野生型或は突然変異ウィルスを感染させると蛋白質合成及 び感染性後代の産生を持続することになることを見出した。

例１−γ＋　３４．５発現がプログラムされた細胞　由来はＡＴＣＣから得たＶ ｅｒｏ細胞を、子牛血清５％を含有するＤＭＥ培地で増殖させた。ヒト５Ｋ−Ｎ −ＳＨ神経芽細胞腫（ＮＢ）神経系統をＡＴＣＣ（ＨＴＢＩＩ）から得て牛胎児 血清１０％を含有するダルベツコの改変イーグル培地で増殖させた。

ウィルス　単純庖疹ウィルスｌ菌種Ｆ　［ＨＳＶ−１（Ｆ）］の単離は、Ｅｊｅ ｒｃｉｔｏ等（Ｊ、Ｇｅｎ。

Ｖｉｒｏｌ、、２：３５７〜３６４（１９６８））（本明細書中に援用する）に よって記載された０組み換えウイ／１．スＲ３６１６、Ｒ４００９及びＨＳＶ− １（Ｆ）（７）構成は、Ｃｈｏｕ等（Ｓｃ　ｉ　ｅｎｃｅ、２５０　：１２６２ 〜１２６６．１９９０年１１月３０日）　（本明細書中に援用する）によって報 告された１図５に例示する通りに、Ｒ３６１６はγ、３４．５遺伝子の両コピー においてＩ　Ｋｂｐ欠失を含有する０組み換えＲ４００９では、停止コードンを γ、３４．５遺伝子の両コピーに装入した０組み換えＲ３６１６におけるγＩ　 ３４．５遺伝子を回復して組み換えＨＳＶ−１（Ｆ）Ｒを生じた。

ウィルス感染　細胞を通常感染の多重度５においてウィルスに３７℃で２時間暴 露し、次いで取り出し、子牛血清１％を含有する１９９ｖ培地に取り換えた。感 染は３７℃で各々の実験について示す通りの時間の間続いた０次いで、細胞を新 たな蛋白質合成或はウィルス性ＤＮＡ及びＲＮＡの合成のいずれかについて標識 した。

ｓ＠３−メチオニン標識化　感染した後の示す時間で、″″ＳＳ−メチオニン活 性＞１．ＯＯＯＣｉｍモル、イリノイ、ダウナーズグローブ在Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏ、）５０μＣｉを、６つのウェル皿中の細胞にメチオニンを欠（１９９ｖ培 地１ｍｌに加えた。標識化を１．５時間続けて、細胞を収穫した。細胞エキスト ラクトの調製、Ｎ、Ｎ’　ジアリルタルタルジアミド（カリホ／Ｉ、−７、リッ チモンド在Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｉｅｓ）で架橋したポリアク リルアミドゲルを変性させる際の電気泳動による蛋白質の分離：ポリペプチドの ニトロセルロースシートへの転移：抗体によるオートラジオグラフィー及び免疫 プロットは、Ａｃｋｅｒｍａｎｎ等、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、５２：１０８〜１１８ 　（１９８４）（本明細書中に援用する）によって記載された。

、３４．５’　−ＨＳＶ−Ｉ　Ｆ　ウイ／Ｉ、スは　におい　Ａ ６、　ＣＮＳ＋１ｌｌｌａに由来するヒト細胞系統をスクリーンする過程で、５ Ｋ−Ｎ　ＳＨ神経芽細胞謹細胞系統が産生ずる突然変異ウィルスは、完全に許容 的なＶｅｒｏ細胞に比べて１００倍少ないことが明らかであった。

また、図６に示す通りに、Ｒ３６１６、Ｒ４００９で感染された５Ｋ−Ｎ−ＳＨ 神経芽細胞腫細胞は、７時間で収穫した細胞において蛋白質合成の減少を示しく 左ノ＼ネル）かつ感染した後１３時間までに５ｓ３−メチオニンを取り込むのを 止めた（右パネル）ことにも留意された。

その現象は、５Ｋ−Ｎ−ＳＨ神経芽細胞腫細胞だけで観測され、欠失された配列 の回復が感染した後１３時間でウィルス性蛋白質を発現するウィルス［ＨＳＶ− １（Ｆ）Ｒ］を生じ（図６、右パネル）かつ親の野生型表現型を示したのだから 、γ、３４．５遺伝子における突然変異に特異的に帰し得た。

α′　云　した′に、　１　が て、それらの発現は同調調節されかつ逐次カスケード様式で並べられるものを形 成する＃　Ｒｏｉｚｍａｎ及び５ｅａｒｓ、Ｆｉｅｌｄｓ’　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ 、第２版、Ｆｉｅｌｄｓ等、編集、１７９５〜１８４１（１９９０）参照、α遺 伝子はそれらを発現するために新たに蛋白質合成を必要とせず、ウィルス性ＤＮ Ａを合成するために必要とするβ遺伝子は機能的ａ及びβ蛋白質の事前合成並び にウィルス性蛋白質合成の開始を必要とする。突然変異ウィルスで感染された５ Ｋ−Ｎ−３Ｈ神経芽細胞腫細胞においてウィルス性遺伝子機能の発現が終結され た点をめるために、ポリアクリルアミドゲルを変性させる際に電気泳動分離され た感染された細胞リゼイトをニトロセルロースシートへ転移させ、α（α２７） 、αβ（ウィルス性チミジンキナーゼ）及び２種のたくさんある蛋白質への抗体 によって立証した。

Ｒｏｌｌｅｒ及びＲｏｉｚｍａｎ　（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、６５　：　５８７３〜 ５８７９ （１９９１））は、後者がＵＬ２６．５及びＵ纒１１遺伝子の産物であって、そ れらの最適レベルにおける発現がウィルス性ＤＮＡ合成を必要とするものである ことを示した０図７に示す通りに、突然変異ウィルスで感染された５Ｋ−Ｎ−Ｓ Ｈ神経芽細胞腫細胞は、ａ２７蛋白質を通常量（左パネル）、チミジンキナーゼ （β）蛋白質を減少した量（中央パネル）で産生じたが、検出し得るγ蛋白質を 産生じなかった（左及び右パネル）、対照して、野生型及び突然変異の両方のウ ィルスは、Ｖｅｒ。

細胞においてそれらの蛋白質の合成を複製する或は指図するそれらの能力に関し 、差異を認めることができなかった（図７）。

Ａ　るこめ　ジグ　ル　イルス　Ｄ ＮＡＡ　に　・Ｃる。　これらの実験は、蛋白質合成の停止が、遺伝子であって その発現がウィルス性ＤＮＡ合成に依存するものに関連付けられるかどうかをめ るためにデザインした。キーの実験の結果を図８に示す。

複製５Ｋ−Ｎ−３Ｈ及びＶｅｒｏ細胞培養にＨＳＶ−１（Ｆ）及び組み換えウィ ルスを感染させ、ウィルス性ＤＮＡ合成をブロックする薬剤であるホスホノアセ テートを抑制濃度で存在させ或は存在させないで保った。細胞を、感染させた後 １３時間で、５ｉ３−メチオニンによってパルス標識した。結果の顕著な特徴は 、Ｒ３６１６か或はＲ４００９のいずれかで感染された５Ｋ−Ｎ−３Ｈ細胞にお ける蛋白質合成が、ホスホノアセテートの存在では少なくとも１３時間持続され たが、その不存在では持続されなかったことであった。これらの結果は、突然変 異ウィルスで感染された５Ｋ−Ｎ−３Ｈ神経芽細胞腫細胞における蛋白質合成の 停止についてのシグナルが、ウィルス性ＤＮＡ合成或はそれを発現するためのウ ィルス性ＤＮＡ合成に依存するγ遺伝子と関連することを示した。

−と　Ａ　が　１ａｔｅ １、−と　ても、　３４．５　で感 れ一ヒト　χ　Ｇウィルス　ＤＮＡ されこ　ｍ　ＲＮ　Ａ　”　−ｅ　上に提示した証拠は、５Ｋ−Ｎ−３Ｈ神経芽 細胞腫細胞において、ウィルス性ＤＮＡ合成に関連する事象が蛋白質合成の停止 を誘発しかつ後期（γ）ウィルス性蛋白質が蓄積しないことを示した。従って、 本発明者等は、ウィルス性ＤＮＡをほとんど蓄積しない或は全く蓄積しないこと 及びウィルス性ＤＮＡ合成の不存在では、後期（γ）ウィルス性転写物（ｔｒａ ｎｓｃｒｉｐｔ）であって、それらの合成がウィルス性ＤＮＡ合成に依存するも のをほとんど蓄積しない或は全く蓄積しないことを予想した０本発明者等が驚い たことに、突然変異ウィルスで感染して１７時間した後に５Ｋ−Ｎ−ＳＨ神経芽 細胞腫細胞から回収されたウィルス性ＤＮＡの量は、野生型の親の或は修復され た［ＨＳＶ−１（Ｆ）Ｒ］ウィルスから得られる量に匹敵し得るものであった（ 図９、左パネル）、その上、５Ｋ−Ｎ−ＳＨ神経芽細胞腫細胞は証明できる量の Ｕｓ１１蛋白質を合成しなかったが、突然変異及び野生型ウィルスで感染された 細胞中に蓄積したｔｒａｉｔ遺伝子転写物の量は同様の大きさであった（図９、 右パネル）。

これらの結果の有意性は３つの観測から生じる。第一に、感染された細胞では、 蛋白質合成は調節カスケードを反映し：α蛋白質合成はβでかつ後にγ蛋白質合 成に替えられる。現在までに試験されたγｌ　３４．５突然変異体で感染された ５Ｋ−Ｎ−３Ｈ神経芽細胞腫細胞と異なるすべての細胞では、一群の蛋白質の合 成におけるブロックは全蛋白質合成の停止に至らない０例えば、ＰＡＡのような りＮＡ合成の抑制剤で処理した細胞では、それらの合成がウィルス性ＤＮＡ合成 に依存するサブクラスのγ蛋白質は産生されない、しかし、これらの細胞では、 β蛋白質合成は、未処理の感染された細胞におけるそれらの合成時間を越えて続 く、γＩ　３４．５ヌル突然変異体で感染された５Ｋ−Ｎ−３Ｈ細胞に関する研 究でなされた顕著な観測は、（ｉ）すべての蛋白質合成が完全に停止し、（ｉｆ ）ウィルス性ＤＮＡが作成され、（ｉｆｆ）たとえ蛋白質合成が停止したとして も、Ｕ。

１１ｍＲＮＡによって例証される後期γｍＲＮＡが作成されたことである。ウィ ルス性複製についてのこれらの表現は前に報告されておらず、この報告に記載さ れるものと異なる細胞（例えば、Ｖｅｒｏ、ＨＥｐ−２、ハムスター乳児肝臓、 １４３１上−及びウサギスキン細胞系統及びヒト胎児肺細胞株）の野生型ウィル ス或は任意の突然変異ウィルス感染により感染された細胞を特性表示するもので はない。

第二に、突然変異の修復は野生型表現型を回復するので、γ、３４．５遺伝子の 機能は５Ｋ−Ｎ−ＳＨ細胞での蛋白質合成におけるこのブロックに打ち勝つこと であ最後に、蛋白質合成の停止をウィルス性ＤＮＡ複製の開始に関連付けること は、感染した後に作成される産物が停止の原因となる可能性を排除しないが、デ ータは、蛋白質合成の停止が細胞の蛋白質合成機と相互作用する既知のウィルス 性遺伝子産物により特異的に引き起こされるという仮定を強く支持する０例えば 、ｖｈｓと表示されるＨＳＶ−１遺伝子の産物が、感染した後に細胞蛋白質合成 を停止することができるということは確立されする間に細胞の中に導入される。

それは感染において初期にｍＲＮＡを不安定にし、それの作用は感染した後に作 成されるウィルス性遺伝子産物に依存しない、上述した実験では、野生型及び突 然変異ウィルスの蛋白質合成が、ホスホノアセテートで処理した細胞では、感染 した後１３時間で識別することができなかった、故に、突然変異ウィルスの表現 型はｖｈｓ遺伝子産物に帰することができない、この結論は、５Ｋ−Ｎ−３Ｈ細 胞におけるウィルス性蛋白質合成が、野生型ウィルスによる感染の多重度を１０ ０ｐｆｕ／細胞程に大きな値に増大させることによって影響されなかったという 観測により強められる（データは示さない）、蛋白質合成を停止する遺伝情報に ついての一層ありそうな源は細胞それ自体である。

ニューロナルオリジンの細胞から成長因子を奪取するニットに関連される慣用の ＴＡＴＡＡボックス或はリスと、プログラムされた細胞死になり、これは、初め 蛋白質合成を停止し、次いでＤＮＡを切断することによって表われることが報告 された。リンパ球におけるアポトシスは、ＤＮＡの分解により表わされる。その 他のヘルペスウィルスの場合、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウィルスで感染された Ｂリンパ球では、ウィルス性ＬＭＰ−１遺伝子の産物がプログラムされたリンパ 球児を排除する宿主遺伝子Ｂｃ　ｌ−２を含むことが示された（Ｈｅｎｄｅｒｓ ｏｎ等、Ｃｅ１ｌ　６５：１１０７〜１９９１）　、これより、ニューロナル細 胞におけるウィルス性ＤＮＡ合成の開始が蛋白質合成の停止によってプログラム された細胞死を誘発すること及びＨＳＶ−１γ、３４．５遺伝子がこのリスポン スな排除することは明らかである。

ニューロナルストレスへのリスポンスな排除するＨＳＶ−１遺伝子の発生は驚く べきことではない、ニューロン、特に感覚ニューロンの感染は、ＨＳＶ−１を潜 伏のままにしかつヒト固体群において生き残るのを可能にさせるウィルス性繁殖 ライフスタイルの本質的な特徴である０本発明者等が提案する通りに、γ＋３４ ．５遺伝子の機能が細胞死を排除することであるならば、ＨＳＶは通常神経細胞 を感染させるので、遺伝子の標的はリンパ球よりもむしろニューロンになろう。

γ＋３４゜５遺伝子はいくつかの異常な特徴を有する。遺伝子は、よ＜ＴＡＴＡ Ａ−転写性の一層小さいユγｌ　３４．５を発現させるために必須のプロモータ ーポンスエレメントを欠く、遺伝子の発現を可能にする配列は長さ１２ｂｐであ るが、この実験室で使用する野生型株では３回程多く反復させる。どこが他で報 告された種々のアッセイは、非ニューロナル誘導の細胞においてＷｑＵｌノ　− ｈ’　ｌ　／　ｒ　ｖｍ　％　、二―：ＥＩＬａ／ｊ　ｌ　７　’６Ｑ／　ノ　 ｍ１Ｍ１／＋ａ＋　Ｈ＋　＋及びＤＲ４並びに特有のＵ、配列の３つのエレメン ト内に含有される。ゲル遅延アッセイは、ウィルスの主要な調節蛋白質をコード 化するα４遺伝子の産物を。

ムされた細胞死を受ける或は受けようとするニューロナル細胞に導入するための ベクターとして提案する。

また、本発明のこの実施態様は、レトロウィルス性ベクター及びワクシニアウィ ルスであって、それらのゲノムをウィルスを非病原性にさせるように別の方法で 処理したものを含む別のウィルス性或はファージベクターを使用して実施し得る ことももくろむ、そのようなウィルス性突然変異を生じる方法は米国特許第４， ７６９，３３１号に詳細に記載されており、同特許を本明細書中に援用する。そ の上、また、本発明のこの実施態様は、任意の遺伝子であって、その発現が遺伝 子治療において有利なものを使用して実施し得、かつ非ＨＳＶウィルスの使用が 非神経システムにおいて遺伝子治療を可能にすることももくろむ。

単純庖疹ウィルスはヒトＣＮＳ組織について天然の向性を有する。ウィルスは、 野生型条件下で、神経システムにおいて複製及び繁殖することができかつニュー ロ毒性である。ウィルスは、また、ニューロンにおいて潜在感染を確立すること ができかつ時折再活性化されることができる。遺伝子をニューロンの中に送達す るベクターを樹立するには、提案したＨＳＶベクターの構成体は下記の基準を満 足しなければならない；１．そのようなベクターはＣＮＳ及び脳組織について天 然の向性な有すべきである。２．そのようなベクターは非病原性、すなわち完全 に無毒性であるべきでありかつ再活性化して感染を引き起こし得るべきでない、 ３．そのようなベクターは、ニューロ退化を受ける細胞における細胞死を防ぐた めに、γｌ　３４．５の構成発現からなるべきである。

４．３においてそのように提案したそのようなベクターは、遺伝子治療のために 更に外来の遺伝子を装入するのに適している。

１１五互五進 ａ４遺伝子において突然変異性病巣を有するＨＳＶベクターを構築する。提案し たウィルスは、もはやＣＮＳにおける潜在感染から複製、繁殖及び再活性化する ことができない、ウィルスは、ａ４遺伝子の不存在において、ニューロンにおい て潜在感染を樹立することができる。このウィルスは、α４発現性細胞系統を含 有するプラスミドによるウィルス性ＤＮＡのコートランスフェクションによって 得ることができる。α４発現性細胞系統及びウィルスは前に報告された。ＤｅＬ ｕｃａ等、Ｊ。

Ｖｉ　ｒｏ　１．．５６　：　５５８〜５７０　（１９８５）。

加えて、構成発現プロモーター下でγｌ　３４．５遺伝子を有するそのよりなＨ ３Ｖベクターもまたもくろむ。

この構成発現プロモーターはＨＳＶ　ＬＡＴプロモーター、レトロウィルスのＬ ＴＲプロモーター或は天然の遺伝子発現のために特異的な任意の他の外来のプロ モーターにすることができる。適当に導入したそのようなウィルス性ベクターは 、アポブドーシスを受けるニューロナル細胞における細胞死を防ぐのに適してい る。

その上、ウィルス性ゲノム上の中性値に装入した外来の遺伝子を有するそのより なＨ３Ｖベクターは、外来の遺伝子を標的ニューロンに送達しかつＣＮＳ遺伝子 治療するために適している。上記の組み換えウィルスを産生ずるための手順は、 Ｐｏ５ｔ及びＲｏ　ｉ　ｚｍａｎ（Ｃｅｌｌ、２５　：　２２７．１９９１）（ 本明細書中に援用する）により発表されたものである。また、米国特許第４，７ ６９，３３１号（本明細書中に援用する）も参照。

突然変異させたＨＳＶ−１ウイルスを使用するのが適している場合では、ウィル スを緩衝生理食塩水のような製薬上許容し得るキャリヤーと組み合わせ、末梢神 経末端であって、それらの軸索がアポブドーシスを受ける或は受けようとする神 経細胞体から始まるものの部位に注入することができる。医学分野の当業者なら ば認める通りに、ウィルスの投与量は、取り分け、治療を必要とする細胞を標的 にするベクターの能力（その程度に、遺伝子は標的細胞において発現される）及 び発現された蛋白質の活性を含むいくつかの要因に応じて変わることになる。ホ スフェート緩衝塩或はスキムミルク中にウィルスおよそ１０４〜１０’を含有す る接種材料は、マウスにおいて好結果を生じた。そのように注入したウィルスは 、末梢神経末端の中に吸収され、次いで逆向性軸索輸送によりニューロナル細胞 体に輸送される。そのような末梢注入が有用でない或は適していない場合には、 ウィルスの局在髄腔内或は心室内注入、もしくは直接微小注射を利用することが できる。

適当に変えた非Ｈ３Ｖウィルス、すなわちウィルスを非病原性にさせるような方 法で処理したゲノムを有するウィルスを同様にして使用することができる。逆向 性軸索輸送により細胞体に送達するための直接微小注射或は末梢注入はウィルス 性送達についての任意選択になる。

最後に、また、生物学的機能的等価遺伝子を、本例に記載する任意のベクターに おいて遺伝子治療用に利用し得ることにも留意すべきである。

例３−γｌ　３４．５遺伝子をＣＮＳに送達るため　又　二 ＣＮＳ及び脳組織へのウィルス性ベクター送達システムに加えて、最近生体外通 過させた細胞系統を使用しかつこれらの細胞を動物に戻して植えつける別のベク ターシステムが開発された。これらの手順は、胎児或は生後のＣＮＳオリジンの 細胞を採取し、それらを生体外で不滅にしかつ変換しそして細胞をマウス脳の中 に戻して移植することを伴う、これらの細胞は、植えつけた後に、通常の脳細胞 発達の移動パターン及び環境キューに従い、非腫瘍形成性の、細胞構造的に適し た方法で分化する。この研究は、顕著には５ｎｙｄｅｒ等、Ｃｅ１ｌ、６８：３ ３〜５１．１９９２及びＲａｎｆｒａｎｚ等。

Ｃｅ１ｌ、６６：７１３〜７２９．１９９１のいくつかの論文において例証され た。適当に改正した技術を利用して、γ＋　３４．５遺伝子を単独で或は関心の あるその他の遺伝子と組み合わせて細胞の中に導入して植えつけることが可能で ある。このような手順は遺伝子をその天然の部位に送達するのを可能にする。こ れらのニューロンにおけるγ、３４．５遺伝子の適した発現は、神経退化におけ る細胞死を防ぎかつ遺伝子治療に適した外来遺伝子を運ぶ細胞を保存することに なる。

１１反ｕ１１ 小脳細胞系統の増殖　小脳細胞系統は、Ｒｙｄｅｒ等（Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｂｉｏ ｌ、　２１　二　３５６　〜３７５　．１９９０）により記載される通りにして 産生する。系統を、ポリーＬ−リシン（ＰＬＬ）（Ｓ　ｉ　ｇｍａ）（１０％ｇ ｍｌ）被覆された組織培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上の牛胎児血清（Ｇｉｂｃｏ） １０％、馬血清（Ｇｉｂ−ｃｏ）５％及びグルタミン２ｍＭを補ったダルベツコ の改変イーグル培地で増殖させる。系統を標準の調湿した３７℃のＣＯ＊５％− 空気インキュベーター内に保ち、これらに集約的培養からの状態ｔｌ！Ｉ節した 培地半分及びフレッシュ培地半分を週１回供給するかもしくは週１回或は週２回 分けて（１：１０〜１：２０）フレッシュ培地にするかのいずれかにする。

γｌ　３４．５遺伝子による小脳始原系統の形質導入関心のある細胞系統の現世 の１　’：　１０スプリツトを６０ｍｍ組織培養プレートにプレートする。プレ ートして２４〜４８時間した後に、細胞を、γ＋３４．５遺伝子を単独で或は遺 伝子治療に適したその他の遺伝子と組み合わせて導入するために、−ｍｙｃ遺伝 子（１０＠〜１０７コロニー形成性ユニツト［ｃｆｕｌ／ｍｌ）＋８ｕｇ／ｍ＋ ポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）を含有する複製−機能不全（ｉｎｃｏｍｐｅ ｔｅｎｔ）レトロウィルス性ＢＡＧ、並びにネオマイシン０４１８マーカーと共 に１〜４時間インキュベートする０次いで、細胞をフレッシュ供給培地において 、細胞が少なくとも２つの倍加を受けたように見えるまで、およそ３日間培養す る０次いで、培養をトリプシン化しくｔｒｙｐｓｉ−ｎｉｚｅｄ）、低い密度（ １００ｍｍ組織培養皿上の細胞５０〜５０００）で播種する。およそ２週間した 後に、プラスチッククローニングシリンダー内のトリプシンに短時間暴露するこ とによって、良く分離されたコロニーが単離される。コロニーを２４−ウェルＰ ＬＬ被覆したＣｏ５ｔａｒプレートにおいて平板培養する。これらの培養を、集 密において、６０ｍｍＡ１ｍ培養皿に通過させ、消費させる。各々のサブクロー ンからの代表的な皿を、Ｘ−ｇｅ１組織化学を用いて組織培養皿において直接染 色する（Ｐｒｉｃｅ等、１９６７；Ｃｅｐｋｏ、１９８９ａ、１９８９ｂ参照） 、青色細胞のパーセンテージを顕微鏡下でめる。青色細胞を最も高いパーセンテ ージ（理想的には〉９０％：少なくとも〉５０％）で有するサブクローンを保ち 、特性表示し、移植するために使用する。

ウィルス感染についてのテスト　ヘルパーウィルスの存在を、Ｇｏｆｆ等（１９ ８１）によって記載される通りにして細胞系統の上澄み中の逆転写酵素活性を測 定することによりかつＮＩＨ３Ｔ３細胞を感染させてＸ−ｇａｌ’コロニーの０ ４１８耐性コロニーを産生ずる能力をテストする（Ｃｅｐｋｏ、１９８９ａ、１ ９８９ｂに詳述されている）ことによって、アッセイする。移植用に用いる小脳 細胞系統はすべて、これらの方法によって判断される通りに、ヘルパーウィルス が存在しない。

神経細胞系統の一次小脳組織との共培養（ｃｏｃｕ−１ｔｕｒｅ）　新生マウス 小脳の一次の解離された培養をＲｙｄｅｒ等（１９９０）の通りにして調製し、 ＰＬＬ被覆した８チヤンバーＬａｂ　Ｔｅｋガラス或はプラスチックスライド（ Ｍｉｌｅｓ）当り細胞２×１０’〜４Ｘ１０’の密度で播種する。細胞が沈降し た後（通常２４時間）、関心のある神経細胞系統のほぼ融合性の１０ｃｍ皿１０ ％を、トリプシン化した後に、スライドに播種する。共培養を、８或は１４日の 共培養まで、Ｃ０ｚ５０％−空気の調湿したインキュベーターにおいて、隔日に 再供給して増殖させる。

移植用細胞系統の調製　ドナー細胞のほぼ融合性であるが、依然活性に増殖する 皿からの細胞をホスフェート緩衝塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、トリプシン化し 、血清含有培地において広い孔径のピペットで穏やかに研和しくトリプシンを不 活性にするため）、穏やかにペレット化しく円筒形遠心機において１時間１１０ ０ｒｐ）、かつＰＢＳＳｍｌ中に再懸濁させる。フレッシュＰＢＳをペレット化 しかつ再懸濁させることによる洗浄を２回反復し、細胞を最終的に容積の減少し たＰＢＳ中に再懸濁させて高い細胞濃度（細胞少なくとも１×１０・／１μｌ） を生じる。トリパンブルー（０゜０５％　Ｗ／Ｖ）を加えて接種材料を局限する 。懸濁体を、穏やかではあるが、良く研和させ続け、氷上に保った後に移植して 凝集を最少にする。

生後の小脳への注入　新生児のＣＤ−１或はＣＦ−１マウスを冷凍麻酔し、頭を 徹照することによって局限する。細胞を、斜角を付けた３３ゲージ針を有するＨ ａｍｉｌｔｏｎ　１０μｍ注射器か或はＦｌａ−ｍｉｎｇ　Ｂｒｏｗｎ　Ｍｉｃ ｒｏｐｉｐｅｔｔｅＰｕｌｌｅｒによりポロシリレート毛管チュービング（メイ ン、ブランズウィック在ＦＨＣ）から下記のパラメータ：熱７５０、引張力Ｏ１ 速度６０、時間Ｏを用いて生成された内直径０．７５ｍｍ及び外直径１．０ｍｍ を有する引板ガラスマイクロピペット（Ｍｏｄｅｉｐ−８７，５ｕｔｔｅｒ　Ｉ ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）のいずれかによって投与する。最良の結果はガラスマイ クロピペットにより達成される。チップを皮膚及び頭蓋骨を通して小脳の各々の 半球及び主部の中に装入し、そこで細胞懸濁液を注入した（通常１〜２μｌ／注 入）、典盟約には、下記の状態が存在すべきである；細胞１×１０フ／懸濁液１ ｍｌ　；細胞×１０６〜２ｘ１０＠／注入；各々の小脳半球において及び生部に おいて１注入０重要なことに、凝集を少なくしかつ細胞を懸濁させ続けるために 、細胞懸濁液を氷上にずっと保ち、各々の注入の前に穏やかに研和する。

ＢＡＧウィルスの注入を細胞懸濁液について記載した通りにして行なった。ＢＡ Ｇウィルス株（８ｘｌＯ’Ｇ４１８耐性ｃ　ｆ　ｕ　／　ｍ　１　）は、トリパ ンブルーに加えて、ポリブレンを８μｇ　／　ｍ　ｌ含有していた。

例４−プログラムされた細胞死 アポブドーシス　のＩＣＰ３４．５による例２及び３において例示するために記 載した遺伝子治療法の代替として、プログラムされた細胞死を受ける或は受けよ うとするニューロナル細胞を、また、γ＋３４．５遺伝子、すなわちＩＣＰ３４ ．５によって発現した蛋白質を用いて治療することもできる。別法として、生物 学的機能的等価蛋白質をかかる治療において使用することができる。

例えば、ＩＣＰ３４．５を蛋白質を発現する細胞から単離し、Ａｃｋｅｒｍａｎ 等（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、５８：８４３〜８５０．１９８６、本明細書中に援用す る）によって記載される慣用のクロマトグラフィー精製及びイムノアフィニティ ー精製法を用いて精製する０次に、精製した蛋白質を、緩衝生理食塩水或は精製 蒸留水のような製薬上適したキャリヤーと組み合わせる。製薬組成物は、投与す るために、適する通りに下記のいくつかの方法の内の一つで注入することができ る：　（ｉ）髄腔内注入；（ｉｆ）心室内注入；（ｆｉｔ）プログラムされた細 胞死を受ける或は受けようとするニューロンを含有する領域への直接注入或は当 業者により理解されるその他の任意の適した投与方法、そのような治療は切断さ れた抹消神経を外科修復する際に特に適しており、蛋白質を治療剤として使用す ることは、本明細書に鑑みて、医学分野における現行の技術レベルの十分範囲内 である。

例５−プログラムされた細胞死 アポブドーシス　′−めの　のアφセ ヱ 単純庖疹ウィルスのγＩ　３４．５遺伝子はウィルスを中枢神経システム及び脳 において複製し、繁殖し及び広がるのを可能にし、それでウィルスは宿主に対し てニューロ毒性になる。その遺伝子を欠いた組み換えウィルスは、宿主のＣＮＳ を浸透させるこの能力を失って、完全に無毒性になる。培養においてこの無毒性 表現型の性質を調べる際に、その遺伝子を欠いた突然変異ウィルスはプログラム された細胞死を特性表示する全トランスレーション停止表現型を示した。宿主細 胞によって与えられるプログラムされた細胞死のこの機構は、ウィルスが繁殖し かつ広がる能力を大きく低減させた。従って、ウィルスにおけるγｌ　３４．５ の機能は、細胞のプログラムされた死を不活性化しく抗アポブドーシス）、従９ てトランスレーションを回復しかつウィルスを宿主において完全なポテンシャル に複製させるのを可能にすることである。

γｌ　３４．５のこの抗アポブドーシス作用を更に調べ、神経細胞をアポブドー シスに至る他の環境ストレスから保護するそれの能力を見出した。これらの環境 ストレスはＵＶ、神経成長因子奪取及びニューロナル細胞分化を含む０本例は、 γ、３４．５遺伝子及びγ、３４゜５の生体内機能に良く似た製薬剤及び薬剤に ついてスクリーンするそれの保護機能を用いてニューロ退化を予防することを記 載する。このようなスクリーニング手順は、γ＋３４．５を発現する細胞系統及 び遺伝子を持たないヌル細胞系統の構築並びにリポータ−遺伝子を誘発すること によりストレス処理した後の細胞の生存度の測定を構成する。これは蛍光インジ ケーターを付けた宿主遺伝子プロモーター或は生存度を信号で知らせるその他の 任意の容易にアッセイし得るマーカーにすることができる。

惣ＪＬ叉μじ覧活 γ、３４．５を構成発現しかつ蛍光を付けた（例えば、１　ａｃＺに融合された 旦配列プロモーター）細胞性遺伝子、或は生存度を信号で知らせる容易にアッセ イし得るマーカーになる任意の標識を含有するテスト神経芽細胞腫細胞系統を樹 立する。また、旦−１ａｃＺインジケーター遺伝子及び同じ宿主インジケーター 遺伝子からなる神経芽細胞腫ヌル細胞系統を、ａ−１ａｃＺインジケーター遺伝 子及び同じ宿主インジケーター遺伝子からなるＶｅｒｏ細胞系統と共に樹立する ０次いで、通常、（１）ａ配列プロモーター活性化を誘発し；　（２）ストレス 処理した後に生存度が信号で知らされる通りにγ、３４．５によって与えられる 保護を誘発し；及び（３）γｌ　３４．５の不存在において細胞プログラムされ た死を誘発することになる環境ストレスをかける。ポジティブ候補を評価するた めのアッセイの提案スキームを表２に概略形態で示す。

衣−ｌ 実験フローチャート：プログラム化された細胞死をることがで　る　についての アセイ 細胞系統　作用　予想 Ａ、神経芽細胞腫細胞は　第二プロモーターを　ストレスの後数時間してりγ１ ３４．５及び第二誘　誘導することによ　ポーター遺伝子を誘導する導性プロモ ーター−リ、ストレスが生じ　ことによって測定される通インジケーター遺伝　 た　つの生存度 子を構造発現する Ｂ、　旦−１ａｃＺ及び第二誘導　第二プロモーターを　１．　アポブトシスは ストレ性プロモーターを発　誘導することによ　スに関係される：　！−１ａｃ Ｚが現する神経芽細胞腫　リ、ストレスが生じ　銹導される：第二ブロモー細胞 　た　ターは銹導止れない ２、毒性：二−１ａｃＺ及び第二 誘導性プロモーターを誘導 しない Ｃ，ａ−１ａｃＺ及び第二誘導　銹導することによ　１．　ニー１ａｃＺは誘導 されない性プロモーター遺伝　リ、ストレスが生じ　２．誘導性第二プロモータ 子を発現するｖｅｒｏ　た　−の発現から、毒性因子が細胞　除かれるのがめら れる 例６−癌或は腫瘍形成性疾患を治療する及びＨＳＶ感染をおさえるためにプログ ラムされた細胞死アポブドーシス　゛　るの　のアφセ 腫瘍細胞において細胞死を誘発させるために、抗アポブドーシス遺伝子の発現或 は遺伝子によって発現された蛋白質の活性をブロックするのが望ましい、それ故 に、腫瘍細胞において細胞死を誘発させる候補物質についてスクリーニングを可 能にすることになる手順を開発するのが望ましい、加えて、ＨＳＶ−１のγ１３ ４．５遺伝子の発現はニューロナル細胞においてアポブドーシスを防ぐのが示さ れ、それでウィルスはＣＮＳにおいて複製、繁殖し及び広がることができる（す なわち、それでウィルスはニューロ毒性になることができる）ので、γ、３４． ５発現をブロックする或はＩＣＰ３４．５の作用を抑制することができる物質は 、アポブドーシスを感染されたニューロンにおいて生じさせることによって、Ｈ ＳＶニューロ毒性（或は同様の機構によるその他のウィルスの毒性）を抑制する ものと予期することができる。

γｌ　３４．５によって与えられる保護はその他の細胞を環境ストレスから保護 するのに拡張することができることが見出され、実際、遺伝子は一般化された抗 アポブドーシス作用を有する。遺伝子γｌ　３４．５についてのプロモーターは ＨＳＶの且配列中にあり、ストレスの時に、プロモーターは活性化される。Ａ配 列プロモーターはアポブドーシスリスボンシブエレメントを含有し、抗アポブド ーシス遺伝子の発現を伝達する細胞性因子（特に、転写因子）は性質がアポブト チックであると仮定することができる。従って、これらの細胞性因子は、抗アポ ブドーシス遺伝子を誘発するそれらの能力を不活性にする薬剤或は剤についてス クリーンするための本アッセイの目標物になる。アッセイは旦配列プロモーター 並びにアポブドーシスを、抗アポブドーシス遺伝子の発現をブロックすることが でき、従って細胞をプログラムされた細胞死で死なせることができる治療剤及び 薬剤についてスクリーンするインジケーターアッセイとして誘発させる条件によ るその誘発性を使用することを伴う。

旦配列及びγｌ　３４．５の２８番目のアミノ酸までのコード化配列を持つテス トプラスミド構造を１　ａｃＺリポータ−遺伝子或はその他の任意の容易にアッ セイし得るリポータ−遺伝子に融合させる。その構造を０４１８選択により神経 芽細胞腫或はＰＣＩ２細胞系統の中に導入し、スクリーンするためのクローンか つ連続した細胞系統を閘室する０通常細胞系統において発現されず、更にアポブ ドーシス誘発性ストレスによって発現するように誘発されないプロモーターであ るＨ３Ｖ後期プロモーターを持つ対照プラスミド構造を同じインジケーター遺伝 子に融合させる。この構造をまた連続したクローン細胞系統の中にも導入してテ スト細胞系統についての対照として働らかせる０次いで、旦配列プロモーター活 性化を誘発しかつプログラムされた細胞死を引き起こす環境ストレスを規定する 。これらの状態は、取り分け、ＵＶ障害、ウィルス感染、神経成長因子奪取及び 抗体の細胞表面レセプターに与える影響を含む０次いで、候補物質或は製薬１適 した薬剤及び剤を、ストレスの時に旦配列プロモーター活性化をブロックするそ れらの能力についてアッセイでテストする。

本発明のアッセイは、抗アポブドーシス遺伝子の発現を誘発する種々の細胞性因 子に目標を定めた製薬１適した薬剤及び剤をスクリーンしかつ同定するのを可能 にする。これらの剤は、本質的な細胞性因子を不活性にすることにより、細胞プ ログラムされた死を起きさせることができるべきである。このようなポジティブ 候補を、次いで、腫瘍細胞において、ヘルペスウィルスで感染されたニューロン において、或はウィルスであって、それの毒性が抗アポブドーシス作用に依存す るもので感染された細胞においてプログラムされた細胞死を誘発するために、適 当に投与する（静脈内、くも膜下、或は直接注入により、もしくは経口投与によ り）、蛋白質及びその他の化学療法物質を抗腫瘍治療において用いることは当分 野において良く知られており、従って、腫瘍形成性疾患（例えば、癌）或はヘル ペス感染を治療するための候補物質の使用及び投与量は、本明細書に鑑みて、医 学分野の現在の状態の技術の十分範囲内である。米国特許第４．４５７，９１６ 号：同第４．５２９，５９４号；同第４，４４７．３５５号；及び同第４，４７ ７゜２４５号（これらはすべて本明細書中に援用する）参照、これらのポジティ ブ候補は、また、細胞プログラムされた死に至る経路において中間体の身元を確 認するのにも用いることができる。

惣１１支−Ｌ法 コラーゲンを被覆した９６ウ工ル培養皿においてＷ５細胞系統を樹立する。プロ モーター融合エレメントを含有する対照細胞系統もまたかかる９６ウ工ル皿にお いて樹立する。テスト候補物質を、９６ウ工ル皿において生じさせたテスト及び 対照の両方の細胞系統を収容する個々のウェルにおける媒体に加える０次いで、 細胞なＵＶ或はその他のストレスに短時間曝す、ストレス誘発して８時間した後 に、細胞をＰＢＳ−Ａで２回洗浄し、ＰＢＳ中にホルムアルデヒド２％（Ｖ／Ｖ ）及びグルタルアルデヒド０．２％を含有する０、５ｍｌを用いて室温で５分間 固定させる。細胞を再びＰＢＳですすぎ、次いでＰＢＳ中２ｍｌの５ｍＭフェロ シアン化カリウム、５ｍＭフェロシアン化カリウム、２　ｍ　Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｃ１ ｍ及び１ｍｇ／ｍｔのＸ−ｇａｌ（ジメチルスルホキシド中の４０　ｍ　ｇ　／ 　ｍ　１株溶液から希釈した）で染色する。

３７℃で２〜３日間インキュベートした後に、β−ガラクトシダーゼを発現する 細胞が青色に染色された。

１　ａｃＺリポータ−遺伝子に関して上記した構造をＰＣ１２細胞系統に導入し た。新しい細胞系統Ｗ５をＧ４１８選択によってクローン樹立した０次いで、Ｗ ５細胞系統を上記３に挙げた最適以下の（ｓｕｂ−ｏｐｔｉｍａｌ）条件下で旦 配列プロモーターの活性化についてテストした。結果は下記の通りである：　（ ａ）上記の細胞は、ＵＶに２分間簡潔に暴露した場合、ＵＶ暴露して６〜ｌＯ時 間後に固定された細胞なＸ−ｇａｌで染色する際に、青色に変わる。（ｂ）上記 の細胞は、ＨＳＶ−１（Ｆ）ウィルスに感染の多重度５で暴露した場合、感染し て８時間後に染色する際に、また青色に変わる。（Ｃ）上記の細胞は、神経成長 因子（ラット、７ｓ）を媒体に導入して分化プロセスを可能にする場合に、明る い青色に変わる。（ｄ）分化が完了した後に、神経成長因子を媒体から取り出す と、細胞は一層暗い青色に変わり、細胞は生存について神経成長因子に依存する ようになった。（ｅ）血清（牛胎児血清Ｏ％）が不足した細胞及び牛胎児血清１ ０％において充分に供給したものでは、発色の差はほとんど或は全く見られない 。

（ｆ）上記の実験を、毒性誘発される細胞死よりもむしろ抗アポブドーシス遺伝 子発現を真に抑制するために調節する対照プロモーター融合エレメントに関して 、反復する。従って、この手順により、細胞において細胞死を誘発することがで きるポジティブ候補は下記の表現型を与えることになる：　（ｉ）この物質の不 存在においてストレスをテスト細胞系統に導入すると青色の細胞を生じることに なる。（ｉｉ）同じ物質の存在においてストレスをテスト細胞系統に導入すると 白色細胞を生じることになる。（ｉｉｉ）ストレスをこの推定、物質を有する或 は有しない対照細胞系統に導入しても細胞の色に影響を及ぼさない。

本発明を、発明者等が発明を実施するための最良モードと考える特定の実施態様 に関して開示した。しかし、種々の分野の当業者は、本明細書中に挙げる開示に 鑑みて、発明の意図する範囲から逸脱しないで変更をなすことができることを認 めるものと思う０本明細書中に記載する例示の実施態様並びにその他の変更及び 実施態様は、本発明及び添付の請求の範囲の範囲及び精神の内に入ることを意図 する。

Ａｃｋｅｒｍａｎｎ等　、、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、　５２：　１ｏ８−１１８ 　（１９８４）Ｃｈｏｕ及びＲｏｉｚｍａｎ　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、、　６４＋ 　１０１４−１０２０．１９９０Ｃｈｏｕ等、、　５ｃｉｑｎｅｅ、　２５０： 　１２１２−１２６６、１９９０Ｃ１ａｗ　等　、ｓｃｉ＠ｎｃａ、２４５＝　 １３８８−１３９０．　Ｎｏｖｅｍｂｅｒ　２９．　１９９１Ｈｏｎｅｓｓ及び 　Ｒｏｉｚｍａｎ　（、ｆｆ、Ｖｉｒｏｌ、、）２：　ｌコ４６　（１９７コ） Ｎｏｎｅｓｓ及び　Ｒｏｉｚｍａｎ、Ｊ、ＶｉｒｏＪ、、１２：　１３４７−１ コロ５　（１９）３）Ｈｕｂｅｎｔｈａｉ−Ｖｏｓｓ等　、、　Ｊ、　Ｖｉｒｏ ｌ、、　６２：　４５４　（１９８Ｂ）■ｔｏｈ　等　、、Ｃｅ１ｌ　６６：　 ２３３−２４３　（１９９１）Ｋａｔｚ　等　、、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、６４：　 ４２８ｇ−４２９５Ｋｙｔｅ等　−、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　１５７： 　１０５−１３２．１９８２Ｌｏｒｄ　等　、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒ ｅｓ、ＩＢ：　２８２コ、１９９０Ｍａｃｋｅｎ＋及びＲｏｉｚｍａｎ、　Ｊ、 　Ｖｉｒｏｌ、、　４４：　９３４−９４７　（１９８２）ＭｃＧｅｏｃｈ　等 　、、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、、６４：　１５コ１−１５７４　（１９８Ｂ） Ｐｏｓｔ及びＲｏｉｚｍａｎ　Ｃｅ１ｌ、　２５：　２２７．１９８１Ｒａｎｆ ｒａｎＺ　等　、、Ｃａ１１．　６６：　７１コー７２９．　１９９１Ｒｏｉｚ ｍａｎ　及ヒ５ｅａｒｓ、　Ｆｉｅｌｄｓ’　Ｖｉｒｏｌｏａｖ、第２版、ｒ　 Ｆｉｅｌｄｓ　１４．。

編集、　１７９ｓ−ｘｓ４ｘ　（１９９Ｇ）Ｒｏｌｌｅｒ及びＲｏｉｚｍａｎ　 Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、　６５：　５８７１−５８７９　（１９９１）Ｒｙｄｅｒ 　等　、、Ｊ、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ、２１：　３５６−３７５．　１９９０Ｓｅ ｎｔｍａｎ等　、　Ｃａ１ｌ、　６７：　８７９−８８．１９９１年１１月２９ 日５ｎｙｄｅｒ等　、、　Ｃｅ１ｌ、　６１ｊ：　３３−５１．１９９２Ｓｔｒ ａｓｓｅｒ等　、　Ｃｅ１ｌ、　６７：　８８９−８９９，１９９１年１１月２ ９日Ｔａｈａ等　、　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、、　７０：　７０５．１９ ８９Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ等　、、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、　１５：　１４ａ７− １ａ９７（１９７５）％４ｉ１１ｉａｍｓ、Ｃｅ１１．８５：　１０９７−１０ ９８配列リスチング （１）一般的情報： （＋）出願人：　Ｒｏｉｚｍａｎ、　ＢｅｒｎａｒｄＣｈｏｕ、　Ｊｏａｎｙ （ｉ　ｉ）発明の名称ニブログラム化された細胞死（アポブトシス）の遺伝子治 療、腫瘍治療、ウィルス性感染治療及び予防方法及び組成物（ｉｉｉ）配列の数 ＝３５ （ｉｖ）通信住所： （Ｂ）通り：　３２１　Ｎｏｒｔｈ　Ｃ１ａｒｋ　５ｔｒｅｅｔ（Ｃ）市ニジカ ゴ （ＤＪ州：イリノイ （Ｅ１国：ＵＳＡ （Ｆ）郵便番号：　６０６１０ （Ｖｌ　コンピューター読取可能な形態（Ａ）媒体タイプ：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：　ＩＢＭ　ＰＣコンパティプル（Ｃ）オヘレーティング シスｆ　Ａ　：　ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェア：　Ｐａｔｅ ｎｔｌｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　＃１．０゜Ｖｅｒｓｉｏｎ　１１．２５ （ｖｉ）現在の出曝データ： （Ａ）出願番号：　ＵＳ　０７／８６１，２３３（Ｂ）出願日：　１９９２年３ 月３１日（Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先行出願データ： （Ａ）出願番号：無し くＢ）出願日：無し くｖｉｉｉ）代理人／エージェント情報：（＾）氏名：　Ｃｏｏｌｌｅｙ、　Ｒ ｏｎａｌｄ　Ｂ（Ｂ）登録番号：　２７．１８７ （Ｃ）参照／ドラケラト番号：　ａｒｃｄ０４９（ｉＸ）通信情報： （Ａ）電話：　（３１２１７４４−００９０（Ｂ）テレファクス：　（３１２） ２４５−４９６１（２）配列番号＝１についての情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長　さ：１７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｘｉ）配　列：配列番 号＝１： ＴＴＴ思ＧＴＣＧＣ父魚Ｃ１７ （２）配列番号二２についての情報； （ｉｌ配列特性・ （Ａ）長　さ：１３３塩基対 （Ｂｌ型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｘｉ）配　列：配列番 号＝２＝ ＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣ１３３ （２）配列番号：３についての情報＝ （ｉ）配列特性： （Ａ）長　さ＝２９１塩基対 ＦＢ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍ　ｊｃ）（ｘｉ）配　列：配列番号 ＝３： （２）配列番号−４についての情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長　さ：５９５塩基対 （Ｂｌ型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種類：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｘｉ）配　列；配列番号 ：４： （２）配列番号：５についての情報； （ｉ３配列特性： （＾）長　さ＋２９１１−基対 ＣＢｌ型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列のｆ！　Ｍ　：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｘｉ）配　列：配 列番号＝５＝ ＣＴＴＣＣＧＧ（ＪＪｋ　Ｔ丁ＣＣＣＧＣＧＧＣＣＣＴ丁ＡＡＴ（ＩＡ　ＣｋＡ ＣＣＣＣＤＧＴ　＾丁τｅｃｃｃｃｃｃ　？　２９１（２）配列番号：６につい ての情報： （ｉ）配列特性： （＾）長　さ・１５０塩基対 （Ｂｌ型：核酸 （Ｃ）　Ｉの数ニー重鎖 （０）トポロジー：直鎮状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｘ　ｉ）配　列；配列 番号−６； （２）配列番号＝７についての情報＝ （ｉ）配列特性； （＾）長　さ＝５０３塩基対 （Ｂ）型−核酸 （Ｃ１鎖の数ニー重鎖 （０）トポロジー；直鎖状 （ｉｎ配列の種！ｉ　：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｘｉ）配　列：配列番 号＝７： （２）配列番号：８についての情報： （ｉ）配列特性： （Ａｌ長　さ：３６８塩基対 （Ｂｌ型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （０）トポロジー：直鎖状 （ｉｉｌ配列のｆｌ類：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）ｆｘｉ）配　列：配列番 号＝８： ｃｃｃＡｃｃｃｃｃａ　ＴＧＣＣＣＧＧＧＣＣｃｒｃｃｃｃｃｃｃｃ　ＧＡＧＣ ＣＧＧＣＣＣＧＧＣＧｋＡＣＴＣＧ　にＴＣＴＡＡＣＧＴ丁@２４０ Ａｃ）、ＣＣＣＸ、ＡＧＧ　ＣＪＡＣＣＴＧＧＧＴ　ｃ！？ｅＣＣ１ｌ！Ａ　Ｃ ＣτＣＣαχ心＾ＧＣＴＣＣＩ：；Ｃ入ＣｅＡ＾ａｃｃｃｃ■bτ　３００ （２）配列番号＝９についての情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長　さ＝２７１塩基対 ＩＢｌ型：核酸 （Ｃ）鎖の数−一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉｌ配列の種類：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｘｉ）配　列：配列番 号：９： （２）配列番号＝ｌＯについての情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長　さ・ＩＩ塩基対 （８１型、核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）　トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｘｉ）配　列：配列番 号：　１０： ＴＴＴＡＡＭ；ＴＣＡ　Ｃ１１ （２）配列番号：１１についての情報：（ｉ）配列特性： （＾）長　さ＝２５６塩基対 （Ｂｌ型・核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類・ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｘｉｌ配　列：配列番号： １１： （２）配列番号＝１２についての情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長　さ：１５４塩基対 （Ｂｌ型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｘｉ）配　列：配列番 号＝１２＝ （２）配列番号：１３についての情報＝（ｉｌ配列特性： （Ａｌ長　さ：２１２塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：口Ｎ＾（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｘｉ）配　列：配列番号： １３： ＣＧＣＧＡＣＣＣＣＣＣ，ＣＣｋＣＣＣＣＣＧ　ＣＧｋＣＣＣＣＣＧＣＧＡ　２ １２（２）配列番号：１４についての情報：（ｉ）配列特性。

（Ａ）長　さ：３５６塩基対 （Ｂｌ型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎮状 （ｉ　ｉ）配列の種類二〇Ｎ＾（ｇｅｎｏｍｉｃ）（×１）配　列：配列番号： １４： （２）配列番号＝１５についての情報：（ｉ）配列特性・ （Ａ）長　さ　２９１塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｘｉ）配　列：配列番 号：１５： （２）配列番号：１６についての情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長　さ：１０塩基対 （Ｂｌ型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｘｉ）配　列：配列番 号＝１６： τ↑丁八入入ＧＣへＣ （２）配列番号＝１７についての情報・（ｉ）配列特性： （＾）長　さ＝４３１塩基対 （Ｂｌ型：核酸 ｆｃ）　１ｍの数ニー重鎖 （０）トポロジー・直鎖状 ｆｉ　ｉ）配列の種類二〇Ｎ＾（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｘｉ）配　列：配列番号： １７： （２）配列番号：１８についての情報。

（ｉ）配列特性： （Ａ）長　さ：２１２塩基対 （Ｂ）型二核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｘｉ）配　列：配列番号、 １８： （２）配列番号：１９についての情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長　さ＝３５６塩基対 ｆＢｌ型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （０）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｘｉ）配　列：配列番号 ＝１９： （２）配列番号：２０についての情報：（１）配列特性： （＾）長　さ：２９１塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ１鎖の数、−重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｘｉ）配　列、配列番 号：２０： （２）配列番号＝２１についての情報：（ｉ）配列特性・ （Ａｌ長　さ＝２０塩基対 ｆＢｌ　型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （０）トポロジー・直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｘｉ）配　列：配列番号 ：２１・ ＧＴＡＡＣＣ？ＡＣ，Ａ　ＣｒｋＧ丁ＣＴ＾ＧＣ２０（２）配列番号＝２２につ いての情報：（ｉｌ配列特性： （Ａ）長　さ＝２０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｘｉ）配　列：配列番号 ：２２： ＧＡＴＣＴＧＡＴ（Ｊ　ＣＡＴｃａＣＡＴ’ＴＯ（２）配列番号：２３について の情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長　さ、５８塩基対 （Ｂｌ型：核酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｘｉ）配　列：配列番 号、２３： ＣＣｃ、ＧＡＣｋＴＧ　Ｇ緑国ｋＧＴｋｃ　ＧｋＣＣＡＣＸ：ＣＡＧＣＣＧｋＣ Ｇ蕉ＣＧＧＣＧｋＣＣＤＧ　Ｇ億かω”（２）配列番号：２４についての情報： （ｉ）配列特性： （Ａｌ長　さ：５１塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー木調 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （爾）配列の種類：ＯＮ＾（ｇｅｎｏｍｉｃ）（２）配列番号＝２５についての 情報：（ｉ）配列特性二 （＾）長　さ：６アミノ酸 （Ｂｌ型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー木調 （０）トポロジー二直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：ペプチド （ｘｉ）配　列：配列番号：２５： Ｍｅｔ　ＡＬａ　ｈｘｑ　Ａｒｇ　入ｒｑ　Ａｒｇｌ　５ （２）配列番号：２６につしλての情報；（ｉ）配列特性： （＾）長　さ＝２５８アミノ酸 （Ｂｌ型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー木調 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配９りの種類：ペプチド （ｘ　ｉ）配　列；配列番号−２６− Ｈｌｓ　ｋｔｑ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　入ｒｑ　入ｒｇ　Ｐｒｏ　八ｒｑ　Ｐｒｏ　 Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｔｈｅ　Ｏｌｙ　ＡＬａ　Ｖａ１５１　１　Ｓ　１０ 　ｉｓ １’ｒｏ　Ｔｈｒ　ＡＬａ　Ｇｉｎ　５＊ｒ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　丁ｈｒ　Ｓａｒ 　テｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｓａｒ　（ｌＬｕ　Ｐｒｏ　Ａkａ ２０　２％　コ０ ｖＩ１１　人ｒｇ　Ｓｅｒ　入１ａ　Ｐｒｏ　ＡＬａ　八１ａ　ＡＬａ　Ｉｉ’ ｒｏ　Ｐｒｏ　ｉ’ｒｏ　Ｉ’ｒｏ　Ｉ’ｒｏ　ＡＬａ　Ｓ奄秩@Ｇｕｙ Ｐｒｏ　ｉ’ｒｏ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　ＣＴａ　Ｓ・ｒ　ＬａＩＪ　Ｌｅｕ　Ｌｅ ｕ　ｋｘｑ　Ｇｌｎ　丁ｒｐ　Ｌｓｕ　Ｈｌｓ　Ｖａｌ　Ｐ秩B Ｓｏ　５５　６０ ＾１ａ　Ｇｌｕ　Ｓａｒ　ＡＬａ　Ｓａｒ　ｈａｐ　八−ｐ　ｈａｐ　＆＠Ｐ　 入ｓｐ　ｈａｐ　八−ｐ　Ｔｒｐ　Ｐｃｏ　ＭＰ　ｔｈａｔ６５　）ＯフＳ　ａ Ｏ Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　ｃｌｕ　Ｐｒｏ　ＡＬａ　Ｐｒｏ　（ｌｕ　ＡＬａ　 Ａｒｇ　Ｐｒｏ　丁ｈ【　ＡＬａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｐｅａｋｒｑ　ＦＴＯＡｒ ｇ　Ｓａｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　ｌ１ｒｏ　Ｇ ｌｙＧｌｙ　Ｇｌｙ＾ｌａ　Ａｓｎｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｈｌｓｐｒｏ　Ｐｒｏ　ｓ ａｒ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　ｐｈ＊　ｋｔｑ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　ｈＸｑ　Ｉ Ｊｕ＾１ａ１１５　１２ｏ　１２５ Ｌ＠ｕ　八ｒｑ　Ｌｅｕ　ｋｒｑ　Ｖａｌ　丁ｈｒ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　ＨＬｍ　 Ｌｅｕ　ＡＬａ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｒ９　Ｌ＠Ｉｕ＾ｘｑ１コ０　１１％　１ ４０ Ａｒｑ　ＡＬａ　Ｇｕｙ　Ｇｌｙ　ｃｌｕ　ＧＬｙ　＾１ｍ　！’ｒＯＧＬ％Ｉ 　Ｐｔｏ　ｉ’ｒｏ　ＡＬａ　テｈｒ　Ｐｔｏ　＾１龜テｈ■ Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　ＡＬａ　Ｔｈｅ　Ｐｒｏ　入Ｌａ　Ｔｈｒ　 Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｔｈｅ　Ｐｔｏ　ＡＬａ　Ｔｈｒ　ｆｌｒモ■ １６５　１）０　１１Ｓ ＾１ａ　Ｔｈｒ　Ｐｅａ　Ａｌａ　Ｔｈｘ　Ｐｒｏ　ＡＬａ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　 ＡＬａ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　入ｔｑ　Ｐｈ・　８嗜ｒ　Ｐｔ。

１１１０　１ａ５　１９０ ＨＬｍ　Ｖａｌ　入ｒｇ　Ｖａｌ　ｈｘｑ　ＨＬｍ　ｔａｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　 テｇｐ　ＡＩＪＩ　Ｓｉｒ　＾１ｍ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｌａ■ １９Ｓ　２００　２０５ ＾１＆＾ｒ９　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｍｅｔ　Ｔｒｐ＾ｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ａｒ ｇ＾１１＾−ｐ　Ａｒｇ＾１鳳ｈｘｑ　ｆ’ｈ（２１０２１５２２Ｃ ＾ｒ９　人ｒ９　ｈｘｑ　ＶａＬ　ＡＬａ　ＧＬｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　 Ｖａｔ　Ｘｌ＠　ＧＬｙ　Ｐｒｏ　Ｄｙｅ　Ｌｅｕ　Ｃ１２２５２コ０　２３５ 　２４ （２）配列番号：２７についての情報：（ｉ）配列特性・ （Ａｌ長　さ・６アミノ酸 （Ｂ）型　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー木調 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 （１１）配列の種類；ペプチド （ｘｉ）配　列：配列番号：２７゜ Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｒｇ＾ｘ９（２）　配ＦｌＩｔ号、２８に ついての情報：（ｉ）配列特性： （Ａｌ長　さ、１６９アミノ酸 （Ｂｌ型二アミノ酸 ＜Ｃ）鎖の数；一本箱 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配ダ・ｊの種類・ペプチド （ｘｉ）配　列；配列番号−２８： ＭＬｓ　人ｘｑ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｒ９　Ａｒ９　Ｐｒｏ　ｋｒｑ　ＰｔＯＰ ｒｏ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　０１７　ＡＬａ　Ｖａｌｌ　５　１０　１ｓ Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　ＡＬａ　Ｇｉｎ　ｓ＠ｒ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｓａｒ　 Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　＆＠ｃ　ＧＬｕ　Ｐｒｏ　１ｌａ２０　２％　３０ Ｖａｌ　入ｒｇ　Ｓａｒ　ＡＬａ　Ｐｒａ　＾１ａ＾１ａ＾ｌａ　ｌ’ｒｏ　Ｐ ｒｏ　Ｐｒｏ　Ｉ’ｒｏ　ｌ１ｒｏ　入１ａ　ＯＬｙ　（＄撃■ コＳ　４０　４５ Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　ｓａｒ　Ｃｙｓ　Ｓａｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｓｕ　 Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｔｔｐ　−ｕ　ｉｌｌ＠　ＶＪＩＩ　！’窒■ Ｓ０　５５　６０ ＧＬｕ　Ｓａｒ　λＬｌｌ　Ｓｅｒ　ｈａｐ　ｈａｐ　ｈａｐ　＾１ｐ　ｈａｐ 　ｈａｐ　＾１ｐ　丁ｒｐ　ｉ’ｒｏ　ｈａｐ　Ｓａｒ　Ｐ秩B ６５　）Ｏ７５ａ。

Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｓａｒ　ＡＬａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ａｒｇ　 Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　ＡＬａ　ＡＬａ　Ｐｒｏ　Ａｒ９Ｐｒｏ　ＰｒＱ　Ｇ Ｌｙ　ｆ’ｒｏ　Ｈｌｓ　Ａｚｇ　ｉ’ｒｏ　ＡＬａ　ｊｒｐ八ｌへ　ｈｘｑ　 （Ｌｙ＾ｌａ　Ｏｌｙ　ｔａｕ　Ｔｈｒｌｏｏ　１０５　１１Ｇ Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｔｈｅ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　ＡＬａ　Ｐｒｏ　Ｓａｒ： 　Ａｌａ　Ｐｈ＊　Ａｒ９　人ｒ９　ＡＬａ　ｇｓｒ　ＰｒB １１５　１２０　１２ｔ Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　５＠ｒ　Ｐｒｏ　ｋｘｑ　Ｓａｔ　〒ｈ【　 τｒｐ入ｒ９　人Ｌａ　Ｃ’ｙｓ　ＡＬａ　Ｃｙｓ　＾ｓｐ１コ０　１コ５　１ ４０ Ａｌａ　Ａｒ９　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　ｈｘｑ　入ｔｑ　Ｓｅ１： 　Ｐｒｏ　Ｐｒ６　Ａｒｇ　Ｐｔ６　Ｐｒｏ　ｈｘｑ　Ｐｅ■ １４５　１５０　Ａｓｓ　１ＧＯ ｆｌｒｏ　Ａｒｇ　Ｐｔｏ　Ｐｒｏ　ｋｒｑ　Ｐｒｏ　Ｉ’ｒｏ　ｌｒｇ　Ｐｒ 。

（２）　配列番号：２９についての情報：（ｉ）配列特性： （Ａ＞長　さ−１８０アミノ酸 ＦＢ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本鎖 ＣＤ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉｌ配列の種類：ペプチド （ｘｉ）配　列：配列番号：２９： Ａｒｇ　Ｓｉｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　ｋｒｇ＾ｌａ　Ｔ７　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｒ ｇ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｃ１ｙ　Ｐｒｏ　ＴｒｐＰｒｏ　Ｐｌ：ｏ　Ｂｅ 互Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｓｐ 　Ｔ？：　Ｐｒｏ　Ｘｉｓ　Ｇｌｙｃｌｙ　ｌｒｇ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　０１ｙＣ １ｙ＾ｌａ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　５＠ｒ　Ｖａｌ　ｋｒｑ　Ａｒｇ　Ｖａ ｌ　Ｐｈ５１コ０　１３５　１４０ （２）配列番号＝３０についての情報・（ｉ）配列特性： （Ａ）長　さ、４６アミノ酸 （Ｂｌ型・アミノ酸 （Ｃ）鎖の数・一本川 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：ペプチド （×１）配　列：配列番号＝３０： ）ｌｅｔ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｈｌｓ　Ａｚｇ 　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　ｋｘｑ　ＰｒB ｌ　Ｓ　１０　１ｓ （２）配列番号＝３１についての情報・（ｉ）配列特性： （Ａ）長　さ：１２６アミノ酸 （Ｂｌ型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種類、ペプチド （ｘｉｌ配　列：配列番号：３１： Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　ｓ＠ｒ　Ｃｙｌｌ　！ｉ紅　Ｌａｕ 　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｔｒｐ　Ｌａｕ　ＨＬ■ Ｉ　Ｓ　１０　１ｓ Ｖａｌ　Ｐｒｏ　（ｌｕ　Ｓｅｒ　ＡＬａ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　ＡＬＰ　 ＡｊＰ　ＡＳＰ　＾１ｐ＾ｇｐ　Ｔｒｐ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ２０　２５　コ０ ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　 Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ａｌｍ　Ａｌａ　＾１畠Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｐ ｒｏ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｏｌｙ　Ｐ ｒｏ　Ｃ１ｙ　Ｇｌｙ　Ｏｌｙ　Ａ１ｍ５ｏ　５５　６０ ＾ａｎＰｒｏ５＊ｒＨＬｍＰｒｏＰｒｏＳｓｒ入ｒｇＰｒｏｔｈ＠ＡｒｇＬ＠ｕ ＰｒｏＰｒｏλｒｇＬｓｕ＾１１１　Ｌ＠ＬＩ　Ａｒｇ　Ｌａｕ　ｋｒｑ　Ｖａ １τｈｒ＾１１１　Ｇｌｕ　Ｈｌｓ　Ｌａｕ　ＡＬａ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　ｋｒｑ 　Ｔ−■ ａｓ　９０　９５ ＾ｒｇ　Ａｒｇ　ＡＬａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｃ１ｙ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　 Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｉ！ｒｅ　ＡＬａ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　＾１■ Ｚｏｏ　１０５　ｉ１０ 丁ｈｒ　Ｐｒｏ　ＡＬａ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　ＡＬａ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａ１亀　 丁ｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｐｒ。

（２）配列番号＝３２についての情報：（ｉ）配列特性： （八）長　さ＝７３アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ１鎖の数ニ一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の稲類：ベブチド （×１）配　列：配列番号、３２： 入１ａ　入ｒｇ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｐｈ＠　５＠ｒ　Ｐｒｏ　ＨＬｍ　Ｖａｌ　 入ｒｇ　ＶａＬ　Ａｒｇ　Ｈｌｓ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌｌ　Ｓ　１０　１ｓ Ｔｒｐ　ＡＬａ　Ｓｅｒ　ＡＬａ　Ａｌａ　ｌｒｇ　Ｌａｕ　ＡＬａ　入ｒ９　 人ｒｇ　Ｇｌｙ　Ｓａｒ　Ｔｒｐ　ＡＬａ　入ｒｇ　ＧｌｕＡｒｇ　入１鳳　Ａ ｓｐ　Ａｒｇ　Ａｌａ　入’９　Ｐｈａ　入ｒ９＾ｘｑ　Ａｒｇ　ＶａＩ　Ａｌ ａ　Ｇｌｕ　ＡＬａ　ＧＬｕ　入ｌ龜Ｖａｌ　！ｌＩＩ　Ｃ１ｙ　Ｐｒｏ　Ｃｙ ｅｓ　Ｌａｕ　Ｏｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　ＡＬａ　入ｒｇ　Ａｌａ　＾ｒ９　Ａ ｌｍ　！、＠ｕ　■P＆ Ｓｏ　Ｓ５　６０ 人ｒｇ　ＧＬｙ　ＡＬａ　Ｇｌｙ　Ｉ’ｒｏ　入１蟲　＾ｓｎ　Ｓｅｒ　Ｖａ１ （２）配列番号：３３についての情報 （ｉｌ配列特性： （Ａ）長　さ＝１７９アミノ酸 （Ｂ）型、アミノ酸 （Ｃ１鎖の数ニ一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：ペプチド （ｘｉ）配　列二配列番号＝３３＝ ｘａｔＡｌａ　Ａｒｇ　ｉｒｇ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　ＡＺＶ　１ｌｌｓ　ｌｒｇ　 Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　ｌｒｇ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｐｒ。

１　、Ｓ　１０　１ｓ Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　ＡＬａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　 Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　ｅｙｓ　Ｓｅｒ　ｔＪｕ　Ｌａｕ　Ｌ＠ｕｓｏ　ｓｓ　ａ。

Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｔｒｐ　Ｌａｕ　Ｇｉｎ　ＶａＬ　Ｐｒｏ　（ｉｌｕ　Ｓｅｒ 　ＡＬａ　！ｉｅｒ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　＾|ｐ ６Ｓ　）Ｏ７５８０ ＾ｓｐ　ａｓｐ　Ｔｒｐ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　ｌ’ｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ 　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　ＡＬａ　Ｐｒｏ　Ｏｌｕ　ＡＬａ　入ｒX ＩＩｓ　９０　９５ Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　入１ａ　Ａｌａ　入１ａ　Ｐｒｏ　入ｒ９　Ｐｒｏ　ｋｒｑ　 Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒ６　ＰｔＣ５０１ｙ　ＡＬａ　ＧｌｙＷｏｏ　１０ｓ　１ １０ Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａ１畠　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　ｓａｒ　Ｈｌｍ　 Ｉ’ｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｐｒ６　ｐｈｅ　＾ｘ■ Ｌｓｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　入ｘｑ　ｔＪｕ　ＡＬａ　Ｌａｕ　Ａｒｇ　Ｌａｕ　 ｌｒｇ　Ｖａｌ　丁ｈｒ　ＡＬａ　ＧＬｕ　ＨＬｍ　Ｌ＠ｕ１コ０　１３５　１ ４０ Ａｌａ　ｋｒｑ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　ｋｒｑ　Ａｒｇ＾１ｍ　にｌｙ　Ｇ ｌｙ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ＾ｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｐｒ。

１４５　１５０　１ｓｓ　１６０ （２）配列番号＝３４についての情報：（ｉ）配列特性： （＾）長　さ＝７３アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本川 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｘｉ）配　列：配列番号；３４： τｒｐ　ＡＬａ　Ｓ＠ｒ　入１ａ　ＡＬａ　入ｒｇ　Ｌｅｕ　ＡＬａ　＾ｘ９　 Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　丁ｒｐ　ＡＬａ　Ａｒｇ　（ｌｕＡｒｇ＾１ａ八―ｐ 　ｋｒｑ　Ａｌａ　ｋｔｑ　Ｐｈ＠Ａｒｇ　ｋｘｑ　Ａｒｇ　Ｖａｌ＾ｌａ　Ｃ Ｌｕ＾Ｌａ　ＧＬｕ＾１ａコＳ　４０　４％ ＶａＩ　ＸＬ＊　ＧＬｙ　Ｐｒｏ　Ｃｙｍ　Ｌ＠ｕ　ＧＬｙ　Ｌｙｓ　ＧＬｕ　 ＡＬａ　Ａｒｇ　ｌａ　＾ｒ９　ＡＬａ　Ｌａｕ　入１ａｓｏ　ｓｓ　ｓ。

入ｒｇ　Ｏｌｙ　ＡＬａ　ｃｌｙ　Ｉ’ｒｏ　ＡＬａ　＾−ｎ　Ｓ＠ｒ　Ｖａ１ ６５　）Ｏ （２）配列番号：３５についての情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長　さ：１８アミノ酸 （Ｂｌ型、アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本川 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：ペプチド （ｘｉ）配　列：配列番号：３５； Ｇｌｙ　Ｍ・ｔ ＦＩＧ、ｌＡ ＦＩＧ、ｌＢ ＦＩＧ、１Ｃ ＦＩＧ、１Ｄ ＦＸＧ、２ ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、　４ 城　ε０■１　。

ＦＩＧ、６Ａ ＦＩに、６Ｂ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ａ　６１　Ｋ　４８１００ 　８３１４−４ＣＣＯ７Ｈ２１１０４Ｂ　８６１５−４ＣＣ１２Ｎ　１５１０９ 　ＺＮＡ （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＰＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＳＮ、　ＴＤ。

ＴＧ）、ＡＴ、ＡＵ、ＢＢ、ＢＧ、ＢＲ，ＣＡ、ＣＨ。

ＣＺ、ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、ＬＵ、 ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎ。

、　ＮＺ、ＰＬ、ＰＴ、　ＲＯ，ＲＵ、　ＳＤ、ＳＥ、ＳＫ。

Ａ Ｉ

Claims (33)

【特許請求の範囲】
1. １．ニューロン細胞におけるプログラムされた細胞死を予防し又は治療する方法 であって： （ａ）γ１３４．５遺伝子を含む非病原性ベクターを調製し、 （ｂ）非病原性ベクターを、プログラムされた細胞死を受けているか又は受けそ うなニューロン細胞に導入する ことを含む、上記の方法。
2. ２．ベクターが、非病原性を与える方法により改変されたＨＳＶ−１又はＨＳＶ −２ウイルスを含む、請求の範囲第１項に記載の方法。
3. ３．前記の改変が、ＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２ウイルスゲノムのＩＣＰ４遺伝子 、α４遺伝子又はα０遺伝子の欠失を含む、請求の範囲第２項に記載の方法。
4. ４．前記の改変が、ＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２ウイルスゲノムのＩＣＰ４遺伝子 、α４遺伝子又はα０遺伝子の突然変異損傷を含む、請求の範囲第２項に記載の 方法。
5. ５．前記のベクターが、改変されたレトロウイルス、ワクシニアウイルス、ピコ ルナウイルス、コロナウイルスエウニアウイルス、トガウイルス、又はラブドウ イルスを非病原性を与えるような方法で含む、請求の範囲第１項に記載の方法。
6. ６．ベクターが多能性神経細胞系統を含む、請求の範囲第１項に記載の方法。
7. ７．請求の範囲第６項に記載の多能性神経細胞系統の細胞を、前記のプログラム された細胞死を受けているか又は受けそうなニューロン細胞が位置する中枢神経 系の領域に移植することを含む方法によって、ベクターをプログラムされた細胞 死を受けているか又は受けそうなニューロン細胞に導入することを更に含む、請 求の範囲第１項に記載の方法。
8. ８．細胞死を受けているか又は受けそうなニューロン細胞の末梢神経終末の部位 へのベクターの注射によって、ベクターを動物のニューロン細胞に導入すること を更に含む、請求項１に記載の方法。
9. ９．ベクターをニューロン細胞とインキュベートすることによって、ベクターを 、細胞死を受けそうな又は受けている培養中のニューロン細胞へ導入することを 更に含む、請求の範囲第１項に記載の方法。
10. １０．ウイルスベクターに非病原性を与えるゲノム改変を有するＨＳＶ−１又は ＨＳＶ−２ウイルスを含むウイルスベクター。
11. １１．前記のゲノム改変が、ＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２ゲノムのＩＣＰ４遺伝子 、α４遺伝子又はα０遺伝子の欠失を含む、請求の範囲第１０項に記載のウイル スベクター。
12. １２．前記のゲノム改変が、ＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２ゲノムのＩＣＰ４遺伝子 、α４遺伝子又はα０遺伝子の突然変異損傷を含む、請求の範囲第１０項に記載 のウイルスベクター。
13. １３．非病原性のレトロウイルス、ワクシニアウイルス、ピコルナウイルス、コ ロナウイルス、エウニアウイルス、トガウイルス、又はラブドウイルスを含むウ イルスベクター。
14. １４．ニューロン細胞におけるプログラムされた細胞死を予防し又は治療する方 法であって： （ａ）ＩＣＰ３４．５又はその生物学的機能等価物を調製し、 （ｂ）ＩＣＰ３４．５又はその生物学的機能等価物を製薬上許容し得るキャリア ーと組合せて製薬組成物を形成し、そして （ｃ）その組成物を、プログラムされた細胞死を受けそうな又は受けているニュ ーロンに投与することを含む、上記の方法。
15. １５．前記の製薬組成物が、ＩＣＰ３４．５又はその生物学的機能等価物を製薬 上許容し得るキャリアー中に含む、請求の範囲第１４項に記載の製薬組成物。
16. １６．ＩＣＰ３４．５又はその生物学的機能等価物を：（ａ）ＩＣＰ３４．５又 は生物学的機能等価物をコードし得る核酸断片を調製し、そして （ｂ）その断片を発現させてＩＣＰ３４．５又は生物学的機能等価物蛋白質を製 造する ことを含む方法により調製する、請求の範囲第１４項に記載の方法。
17. １７．断片を宿主細胞にトランスファーして、その宿主細胞をその断片の発現に 適した条件下で培養する、請求の範囲第１６項に記載の方法。
18. １８．核酸断片を組換えベクターのトランスフェクション又はトランスフォーメ ーションによって宿主細胞にトランスファーする、請求の範囲第１７項に記載の 方法。
19. １９．蛋白質を単離し且つ精製することを更に含む、請求の範囲第１７項に記載 の方法。
20. ２０．組成物を、直接の、髄腔又は静脈注射により、又は経口投与により、動物 に投与する、請求の範囲第１４項に記載の方法。
21. ２１．組成物を蛋白質が細胞に入るように含む培地中で前記の細胞をインキュベ ートすることにより、組成物を培養中のニューロン細胞に投与する、請求の範囲 第１４項に記載の方法。
22. ２２．細胞をプログラムされた細胞死から保護することの出来る候補物質の能力 を測定する方法であって：（ａ）プログラムされた細胞死に感受性のニューロン 細胞系統を調製し、 （ｂ）前記の細胞系統を候補保護物質と合わせ、（ｃ）インキュベーション溶液 を、細胞がプログラムされた細胞死を誘導し得る条件又は物質にさらされるよう に改変し、そして （ｄ）候補物質が細胞をプログラムされた細胞死から保護したか否かを測定する ことを含む、上記の方法。
23. ２３．候補物質が、ＩＣＰ３４．５の推定の生物学的機能等価物である、請求の 範囲第２２項に記載の方法。
24. ２４．ＩＣＰ３４．５又はその生物学的機能等価物の保護機能を強化する候補物 質の能力を測定する方法であって： （ａ）プログラムされた細胞死に感受性のニューロン細胞系統を調製し、 （ｂ）前記の細胞系統の細胞を候補強化物質と合わせ、 （ｃ）インキュベーション培地にＩＣＰ３４．５又はその生物学的機能等価物を 加え、 （ｄ）インキュベーション溶液を、細胞がプログラムされた細胞死を誘導し得る 条件又は物質にさらされるように改変し、そして （ｅ）候補物質がＩＣＰ３４．５又は生物学的機能等価物の保護効果を強化した か否かを測定することを含む、上記の方法。
25. ２５．γ１３４．５発現又はＩＣＰ３４．５若しくはその生物学的機能等価物の 活性のインヒビターとして作用する候補物質の能力を測定する方法であって：（ ａ）プログラムされた細胞死に感受性のニューロン細胞系統を調製し、 （ｂ）前記の細胞系統を候補阻害物質と合わせ、（ｃ）インキュベーション培地 にＩＣＰ３４．５又はその生物学的機能等価物を加え、 （ｄ）インキュベーション溶液を、細胞がプログラムされた細胞死を誘導し得る 条件又は物質にさらされるように改変し、そして （ｅ）候補物質がＩＣＰ３４．５又は生物学的機能等価物の保護効果を阻止した か否かを測定することを含む、上記の方法。
26. ２６．遺伝子治療のために遺伝子を送達する方法であって： （ａ）遺伝子治療のための遺伝子を請求の範囲第１０、１１、１２又は１３項の 何れか１つに記載のベクターと結合させ、 （ｂ）その遺伝子及びベクターを製薬上許容し得るキャリアーと組合せて製薬組 成物を形成し、そして（ｃ）前記の製薬組成物を、遺伝子及びベクターが意図し た細胞標的に到達するように投与することを含む、上記の方法。
27. ２７．前記の製薬組成物を、動物への注射によって、前記の細胞標的の部位へ導 入する、請求の範囲第２６項に記載の方法。
28. ２８．前記の細胞標的が中枢神経系にあり、製薬組成物を動物への注射によって 、前記の細胞標的の部位に位置するニューロンから始まる末梢神経終末の部位に 導入する、請求の範囲第２６項に記載の方法。
29. ２９．前記の製薬組成物を髄腔内注射又は静脈注射によって導入する、請求の範 囲第２６項に記載の方法。
30. ３０．遺伝子及び薬理学的に許容し得るキャリアーと組合せたベクターを含む、 請求の範囲第２６項に記載の製薬組成物。
31. ３１．腫瘍形成性疾患又はウイルス感染を治療する方法であって： （ａ）請求の範囲第２５項の候補物質を調製し、（ｂ）その候補物質を製薬上許 容し得るキャリアーと組合せて製薬組成物を形成し、そして （ｃ）その組成物を腫瘍細胞標的に投与することを含む、上記の方法。
32. ３２．製薬組成物を、注射によって、細胞標的の部位に直接投与するか、静脈注 射、髄腔内注射、又は経口により投与する、請求の範囲第３１項に記載の方法。
33. ３３．製薬上許容し得るキャリアーと組合せた候補物質を含む、請求の範囲第３ １項に記載の製薬組成物。