JPH07507045A - 慢性関節リウマチ治療用のペプチドおよび抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 慢性関節リウマチ治療用のペプチドおよび抗体子は、血清ＩｇＡと主要な抗プロ テアーゼであるα１−抗トリプシン（α、−ＡＴ）との間の共有結合複合体であ ることがしだいに明らかになっている。このジスルフィドブリッジド複合体は、 ＲＡ患者の血清および関節液中に異常な高レベルで存在することが分かった。生 体内試験からは、この複合体がマウスのマクロファージからの組織分解酵素の放 出を誘発することができ、一方、複合体自体をウサギまたはマウスの膝関節に注 射すると、すぐにＲＡ状関節炎を引き起こすことかげられることで説明すること ができる（スタンワース、Ｄ、Ｒ，−１ｍｍｕｎ薬には、これらが比較的毒性で あり、そのため多くのリウマチ患者が治療を早期にやめる原因となっているとい う問題がある。

従って、慢性関節リウマチと戦う別の手段を見いだすことが望ましく嵐。

られる非常に高レベルのチオール反応性１ｇＡを作り出すことが知られている。

このたび、帯電アミノ酸基について特定の規定用件を満たし、そしてチオール反 応性システィン残基においてチオール反応性１ｇＡと相互作用することのできる 特定のペプチドが、ＩｇＡ−αＩＡＴ複合体を解離したりあるいはＩｇＡ−α＋ ＡＴ複合体の形成を妨げることができることを見いだした。複合体の解離または 複合体形成の防止は、臨床的ＲＡに対して好ましい効果を有することが期待でき 、従って治療の可能性のあるものである。ＩｇＡ−αＩＡＴ複合体に対して生じ るモノクロナール抗体もまた、ＲＡ患者のＩｇＡ−αＩＡＴ複合体の効果を軽減 することができる。

従って、本発明は、治療に用いるための２０以下のアミノ酸残基の合成ペプチド またはその類似体（類似体は少なくとも部分的に非ペプチド性である）を提供す るものであって、チオール活性システィン残基、およびチオール活性システィン 残基の（必ずしも隣接していないが）Ｎ末端サイドにまたは（必ずしも隣接して いないが）Ｃ末端サイドにまたは（必ずしも隣接していないが）ＮおよびＣ両末 端サイドに位置する少なくとも２つの正に帯電したアミノ酸残基よりなるもので ある。ここのおよび本明細書における「よりなる」という言葉は、「から構成さ れる」または「を含む」を意味する。従って、全体のペプチドは、ペプチドの一 端または両端にさらにペプチド配列または非ペプチド配列を有する、上で定義し た以上のペプチドを包含することができる。ペプチドは通常３−２０のアミノ酸 残基、さらに一般的には４−１０のアミノ酸残基を有する。ペプチドの末端基は 、例えばＮ−アシル化またはＣ−アミド化によってブロックしてもよく、または ペプチドはどのような従来法で誘導体化してもよい。

本発明はまた、治療に用いるための、ヒトＩｇＡおよびα１−抗トリプシンの複 合体の抗原決定基に対して特異的な抗体ドメインよりなるリガンドを提供するも のであり、この抗体ドメインは遊離ヒトＩｇＡおよび遊離ヒトα１−抗トリプシ ンと実質的に非反応性である。

この定義はモノクロナールおよびポリクロナール抗体、その抗原結合フラグメン ト、例えばＦａｂ’およびＦ（ａｂ’）＊フラグメント、ハイブリッド抗体、ヒ ト化抗体および単一鎖ドメイン抗体を包含する。簡略化のために、「抗体」とい う言葉は以後このリガンドを示すのに用いる。

図面の簡単な説明 図１は、ウサギの関節侵食の原因を決定する実験結果であり、ここで（Ａ）はＩ ｇＡを注射したウサギの結果を示す。（Ｂ）は滑液を注射したウサギの結果を、 そして（Ｃ）はＩｇＡ−α、ＡＴ複合体を注射したウサギの結果を示す。

図２は、本発明のペプチドまたはプラセボのいずれかを関節炎のウサギに投与し た実験結果を示すものである。

好ましい具体例の説明 本発明のペプチドは、チオール活性システィン残基および少なくとも２つの正に 帯電したアミノ酸があるものである。便宜上この明細書では、ペプチドについて 論じるとき、アミノ酸に対して１字コードおよび３字コードを使用する。１字コ ードおよび３字コードは以下に示す。

アラニン　Ａｌａ　Ａ アルギニン　Ａｒｇ　Ｒ アスパラギン　Ａｓｎ　Ｎ アスパラギン酸　Ａｓｐ　Ｄ Ａｓｎおよび／またはＡｓｐ　Ａｓｘ　Ｂシスティン　Ｃｙｓ　Ｃ グルタミン　Ｇｌｎ　Ｑ グルタミン酸　Ｇｌｕ　Ｅ Ｇｌｎおよび／またはＧｌｕ　Ｇｌｘ　Ｚグリシン　Ｇｒｙ　Ｇ ヒスチジン　Ｈｉｓ　Ｈ インロイシン　Ｉｌｅ　Ｉ ロイシン　Ｌｅｕ　Ｌ リンノ　Ｌｙｓ　、　Ｋ メチオニン　Ｍｅｔ　Ｍ フェニルアラニン　Ｐｈｅ　Ｆ プロリン　Ｐｒｏ　Ｐ セリン　Ｓｅｒ　Ｓ トレオニン　Ｔｈｒ　Ｔ トリプトファン　Ｔｒｐ　Ｗ ２Ｏの最も一般的なアミノ酸の中で、正に帯電したアミノ酸は塩基性のものであ り、アルギニン、リンノまたはヒスチジンである。負に帯電したアミノ酸は酸性 のものであり、アスパラギン酸およびグルタミン酸である。中性アミノ酸は全体 にわたる正または負の電荷を持たず、残りのアミノ酸がそれらにあたるものであ る。もちろん、一般的ではないアミノ酸または一般的なアミノ酸の誘導体を、２ ０の最も一般的なアミノ酸の代わりに用いてもよい。

チオール活性システィン残基と少なくとも２つの正に帯電したアミノ酸残基とは 共に次の一般式で表すと都合がよい・［Ｚ’、−Ｊ’、−Ｂ’ｃ］　、−Ｃｙｓ −［Ｂ”ｎ−Ｊ２．−Ｚ”ｂ］　。

（式中、 ｍは０またはＬｎは０または１、そしてｍ＋ｎは１または２であり：Ｊ′および Ｊ２は正に帯電したアミノ酸残基の配列であり；Ｚｌ、Ｚ２、ＢＩおよびＢ２は 正に帯電した、負に帯電したもしくは中性のアミノ酸残基、または正に帯電した 、負に帯電したもしくは中性のアミノ酸残基の混合物であり： Ｘ＝Ｏまたは１、ｙ＝ｏまたは１、およびｘ＋ｙ＝ｌまたは２であり；Ｃ＝Ｏ− ４、ｄ＝ｏ−４、ａ＝ｏ−１８、およびｂ＝ｏ−１８であり、但し、ｍ＝ｏのと き、Ｂ２およびＺ２の少なくとも１つは正に帯電したアミノ酸残基であり、ｎ＝ ０のとき、ＺｌおよびＢ１の少なくとも１つは正に帯電したアミノ酸残基であり 、ｍ＝ｎ＝１およびｙ＝０のとき、Ｚｌ、Ｂ１、Ｂ２およびＺｌの少す（トも１ つは正に帯電したアミノ酸残基であり、そしてｍ＝ｎ＝１およびＸ＝Ｏのとき、 Ｚｌ、　８１％Ｂ２およびＺ２の少なくとも１つは正に帯電したアミノ酸残基で ある。

Ｂ１およびＢ２はまたアミノ酸のｂおよびＣの長さによって決まる長さに等しい 長さの非ペプチドスペーサーアームを表す）。

本発明のペプチドは、ＩｇＡ−αＩＡＴ複合体の形成を妨げたり、あるいはすで に形成されたＩｇＡ−α＋ＡＴ複合体を解離することができる短いペプチドであ るのが好ましく、モしてＲＡの予防または治療に特に有用である。これらはチオ ール活性ＩｇＡ内のシスティン残基と相互作用し、従ってα、ＡＴが結合するの を妨げたり、またはすでに結合したαＩＡＴを解離することができるので効果的 である。　ペプチドは、チオール活性システィン残基の片側または両側に十分な アミノ酸残基を含んでいて、確実に、得られるペプチドがチオール反応性（り結 合的に複合しないものでなければならない。

ペプチドはまた、すでに形成されているＩｇＡ−（ＥＩＡＴ複合体を解離するこ とができなければならない。ペプチドの長さは３−２０、好ましくは４−１０、 さらに好ましくは４−７アミノ酸残基の長さである。

より短いペプチドは、本発明のペプチドに対する免疫反応を持つホストが被る危 険性を最少にするので好ましいものである。

本発明のペプチド中の正に帯電したアミノ酸残基の数は少なくとも２つである。

これらは、チオール反応性システィンの（必ずしも隣接していないが）Ｎ末端に 、チオール反応性システィンの（必ずしも隣接していないが）Ｃ末端に、または チオール反応性システィンの（必ずしも隣接していないが）ＮおよびＣ両末端に 位置し、そしてシスティン残基の同じサイドにあるとき、２つの正の電荷は互い に隣り合っている必要はない。２つの正に帯電したアミノ酸残基が共にシスティ ン残基のＮ末端またはＣ末端のいずれかに位置するとき、Ｎ末端であるのが好ま しい。さらに好ましいのは、正に帯電したアミノ酸残基がチオール活性システィ ン残基のＮおよびＣ末端の両方にあるときである。

正に帯電した残基はチオール活性システィン残基に直接隣接するか、またはスペ ーサーアームによってこれから離れていてもよく、ペプチドがチオール活性シス ティン残基のＮおよびＣ末端サイドの両方にある正に帯電したアミノ酸残基より なる場合、チオール活性システィン残基のＮ末端サイド、Ｃ末端サイドまたはＮ およびＣ両末端サイドにスペーサーアームがあり、そして長さは異なっていても よい。このスペーサーアームは一般式においてＢＩおよびＢ！で示される。Ｂｌ およびＢ２はアミノ酸残基であるのが好ましく、１−４アミノ酸残基の長さであ り、Ｂコは１−３残基の長さであるのが好ましい。スペーサーアームに見られる アミノ酸は正に帯電した、負に帯電したもしくは中性に帯電したアミノ酸残基、 または正に帯電した、負に帯電したもしくは中性に帯電したアミノ酸残基の混ざ ったものである。スペーサーアームのアミノ酸はシスティンでないのが好ましい 。

より好ましいのは、アミノ酸が中性に帯電したものであり、さらに好ましいのは 、アミノ酸がグリ７ンであるものである。正に帯電したアミノ酸残基がＮ末端、 Ｃ末端またはＮおよびＣ両末端でシスティン残基に直接隣接していると、さらに 好ましい。

好ましいペプチドは、（ｉ）α１ＡＴの残基２３１−２３３またはその類似体、 すなわち、Ｈ４５−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ　（上記一般式において、ｍ＝ｌ、ｎ−１、 Ｃ；ｄ＝０、ｘ＝ｙ＝１）または（ｉ　ｉ）α、ＡＴの残基２３２−２３４また はその類似体、すなわち、Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ　（上記一般式において、ｍ ＝ｎ＝１、ｄ＝１、ｙ＝１）よりなるまたは含むものである。さらに好ましいの は、ペプチドが少なくともａＩＡＴの残基２３１−２３４またはその類似体、す なわち、）（ｉｓ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ　（上記一般式において、ｍ＝ｌ、 ｎ＝１、ｃ＝０．１、ｄ＝１、ｘ＝ｌ、ｙ＝２）よりなるもノテある。

ヒトα、ＡＴ配列を代表する好ましい配列は、ａＩＡＴの残基２２７−２３７ま たはその類似体、すなわち Ｐｈｅ−Ａｓｎ−１１ｅ−Ｇｉｎ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ− ３ｅｒ−３ｅｒ （式中、ｍ＝１、ｎ−１、Ｃ＝Ｏ１ｘ＝１、ａ＝４．ｄ＝１、ｙ＝ｌおよびｂ； を組み込んで延長してもよい。

本発明のペプチドはＣ末端でアミド化するのが好ましい。このアミド化の効果は 、ペプチドの半減期を長くして、より短いペプチドを用いることができるように し、そして抗リウマチ活性を高めることである。Ｎ末端が正に帯電したアミノ酸 残基である場合、Ｎ末端はアンル化しないのが好ましい。

ＤおよびＬアミノ酸の混合物を用いてもよ（、あるいはペプチドはもっばらＤ残 基を含んでいても、もしくはもっばらＬ残基を含んでいてもよい。

ＲＡ治療に用いる抗体は、ヒ目ｇＡおよびヒトα、ＡＴの複合体（ＩｇＡ−α、 ＡＴ）の抗原決定基に対して特異的な抗体ドメインよりなる。この抗体ドメイン は遊離ヒト■ｇＡおよび遊離ヒトαＩＡＴと比較的非反応性である。ＩｇＡおよ びα、ＡＴの複合体（ＩｇＡ−α、ＡＴ）は、慢性関節リウマチの患者から取っ た分析物に見られる自然に生じる複合体である。以下に例示するように、必ずし もそうではないが、最も好ましいのは、抗体がそのような複合体に対して生じる モノクロナール抗体よりなるものである。最も好ましいモノクロナール抗体は、 下記の特許寄託の対象であるハイブリドーマから得られるものである。精製した 自然に生じる複合体を精製したものから製造したポリクロナール抗体は、ＩｇＡ −α＋ＡＴ複合体に対して特異的ではないことが分かり、即ち得られた抗血清は 非複合１ｇＡおよびａＩＡＴとも反応した。

あるいは、抗体は、ｒｇＡ−α＋ＡＴ複合体に特異的な免疫原決定基を構成する 部位を代表する、ＩｇＡの重鎖とα、ＡＴ鎖配列とが共有結合した短鎖ペプチド である合成ペプチドに対して生じるものでもよい。具体例では、第１ペプチドフ ラグメントはヒトＩｇＡのＦｃ領域に見られるアミノ酸配列またはこの配列の類 似配列を有し、第２のペプチドフラグメントはヒトα、ＡＴに見られるアミノ酸 配列またはこの配列の類似配列を有し、これらは互いに共有結合している。共有 結合の好ましい形は、ヒトＩｇＡのＦＣ領域における、ヒトＩｇＡのＣ末端に対 して、後ろから２番目のシスティン残基のヒトα、ＡＴに対する結合の免疫原性 ３次元形態を保つＳ−８結合である。

上記抗体を生じるのに用いうる好ましい抗体および合成ペプチドの例は、■ｇＡ −α＋ＡＴ複合体に特異的なモノクロナール抗体およびこれらの抗体をＲＡの診 断方法に用いることに関するＵＫＰＡ９１１１２１５．１に示されている。最も 好ましい抗体は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏ１１ｅｃｔｊｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａ ｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ、英国、ウイルトンヤー、ンールスベリー、ボー トンダウンに１９９０年２月６日に受託番号ＥＣＡＣＣ９００２０６１１（以後 、ＮＬＷ、５４と呼ぶ）および１９９０年１２月１３日に受託番号ＥＣＡＣＣ９ ０１２１３０２（以後、ＮＬＷ、５０と呼ぶ）で寄託した。ＮＬＷ、５０は最も 好ましい抗体である。寄託は特許手続きの目的のための微生物寄託の国際承認に 関するブダペスト条約の規定の下で行った。

ＲＡ治療用の抗体の製造は、好ましくはアジュバントを用いて、免疫原、好まし くは【ｇＡ−α、ＡＴ＊合体を、ウサギ、モルモットまたはマウスのような哺乳 動物に投与し、約１カ月後に動物の血液を取り、そして得られた抗血清を単離す ることによって行うことができる。改良された力価は、ある期間、注射を繰り返 すことによって得られる。

抗体にはヒトおよびネズミのモノクロナール抗体並びにそのＦａｂ’およびＦ（ ａｂ’）ｚフラグメントが含まれる。抗体は、外来の動物免疫グロブリンに対す る不利な反応を最少にするために、ヒト化するのが好ましい。

抗体は、例えば、可変部の相補性決定領域のみが人体に対して外来性である、Ｅ ＰＡＯ２３９４００（ウィンター）に記載の方法に従ってヒト化することができ る。

ペプチドおよび抗体は予防および治療の両方に用いうる。ＵＫＰＡ９１１１２１ ５．１　（ＮＲＤＣ）には、同様な症状が現れる他の疾患とは異なるものとして ＲＡ患者を診断する方法が記されている。この方法はまた、関節侵食がまだ現れ ていない患者（いわゆる「初期ＪＲＡ患者）のＲＡを発見するのにも用いつる。

この方法は、循環ＴｇＡ−αＩＡＴ複合体の量を測定するものである。従って、 初期のＲＡ患者を絶えず調べることによって、個々の患者における複合体の通常 レベルをつきとめることができ、個々の患者の通常値の上の循環複合体のレベル によってペプチドの投与量を正確に計算することができる。初期のＲＡ患者のペ プチドおよび／または抗体は予防的に（すなわち、高レベルの【ｇＡ−α＋ＡＴ 複合体の形成を妨げるために）投与するのが好ましい。関節侵食がすでに現れて いる患者では、ペプチドおよび／または抗体の予防的投与は遅すぎ、従って、こ れらを治療的な意味で投与する。その投与量はこれらの患者に見られる循環複合 体レベルによって決まり、その値は、ＲＡが発症する前の「通常」レベルがどの 程度か、またはどの濃変でＲＡの症状が軽くなるかということを知ることによっ て決定した値が、その個々の患者に対して標準であると考えられる。

治療に用いるためのペプチドおよび抗体は、様々な方法で用いられる人間のため の薬剤に使用される生理学的に許容される希釈剤または担体と共に配合しうる。

これらは例えば注射または注入に適した形で配合され、従って無菌であり、発熱 物質を含んでいないのが都合よい。これらはまた液体または固体のような経口投 与に適した形に配合するのが好ましい。

従って、本発明の第２の態様は、上記のペプチドまたは抗体および生理学的に許 容される希釈剤または担体よりなる医薬組成物を提供するものである。

ペプチドおよび／または抗体は経口投与に適した形で配合しつる。すなわち、こ れらは液体、希釈剤また担体に混和しうるが、固体、例えばでんぷん、ラクトー ス、デキストリンまたはステアリン酸マグネシウムのような一般的な固体担体材 料を用いるのがより一般的である。そのような固体組成物は錠剤、カプセル等の ような成形タイプのものが都合がよい。

抗体および／またペプチドは非経口ルート、好ましくは関節的注射によってホス トに導入するのが好ましい。どのような一般的な液体また固体賦形剤を用いても よく、これらはホストに許容されそしてホストに不利な副作用またはワクチンに 有害な作用を持たないものである。生理学的ｐＨ１例えば６．　８−７．　２、 好ましくはｐＨ７，０のリン酸塩含有緩衝生理食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ）を賦形剤と して単独でまた適当なデポソト（ｄｅｐｏｔ）と共に使用しつる。

組成物は単位投与量の形で配合してもよく、その投与量および投与回数は個々の 患者の疾患の重症度によって決まる。ＩｇＡ−α、ＡＴ複合体のレベルを例えば ＵＫＰＡ９１１１２１５．１に記載の方法によって絶えず調べることは、個々の 壱者の投与量を決める助けとなる。

本発明を以下の実施例によって説明する。

実施例１　ペプチドの合成 標準Ｆｍｏｃ化学を用いＬＫＢ　Ｂｉｏｌｙｎｘ自動操作ペプチド合成機を使用 して、ペプチドを合成した。合成の際、全てのシスティン残基はトリチル基で保 護した。ペプチドの開裂および脱保護は、９５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、 ５％エタン−ジチオール混合物を用いることによって行った。次に、ペプチドを 回転蒸発させてＴＦＡを除去し、エーテルを数回変えてエーテル抽出してエタン ジチオールを除去し、そして０．０５Ｍの酢酸中に抽出した。ペプチドの最終洗 浄を次にセファデックスＧＩＯゲル濾過カラムを使用して行った。次いで、ペプ チドを凍結乾燥し、そして使用するまで４℃のデシケータ−に貯蔵した。使用す る前に、全てのペプチドを、以下のような一部変更したエルマン試験によって遊 ＭＳＨの存在をチェックした。

１００μｍのペプチド（０，５ｍＭ）を、軟質マイクロタイタープレート（ファ ルコン）中で、０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ８，０）を用いて２倍希釈した。

システィン（０，２Ｍ）もまた２倍希釈して基準として用いた。次に、６４５μ ｇ／ｍ＋の５．５′−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）２５μｍを各穴に加え た。１５分間発色させ、次にプレートをマルチスキャンプレートリーダーで４１ ０μｍにて読み取った。検量曲線はシスティンを用いて作り、ペプチドに対する 遊離ＳＨを計算した。

次のグループのペプチドを合成した。チオール活性システィン残基に対する少な （とも２つの正に帯電したアミノ酸残基の配置がペプチドの性質に及ぼす影響を 示すために、そして異なる従属一般式を有する本発明の範囲内のペプチドを比較 するために、各種グループを定義するのが都合がよい。以下の従属一般式におい て、「＋」は環基性残基、「−」は酸性残基、ｒｒＪおよびｒｓＪは他のアミノ 酸残基（必ずしもそうではないが、通常はグリシン）を示す。

（ａ）　グループ１：　＋　ｒ　Ｃｙｓ　ｓ　＋　ｎｈｔこのグループのペプチ ドでは、正に帯電したアミノ酸残基がチオール活性システィン残基のＮまたはＣ 両末端にある。ペプチドはアミド化してもよ＜（「ｎｈ２Ｊで表される）、正に 帯電した残基は、従属一般式においてｒｒＪおよびｒｓＪで表されるスペーサー 残基によってチオール活性システィン残基がら離しテモヨイ。本発明（Ｄ　一般 式テハ、ｍ＝ｎ＝１、ｘ＝ｙ＝ｌ、ｍ＝ｏ−４，ｂ＝０このグループのペプチド では、正に帯電したアミノ酸残基がチオール活性システィン残基のＣ末端にある 。本発明の一般式によると、ｍ＝ｏ１ｎ＝１、ｄ＝０−４ＣｒｒＪで表されるよ うに）　、ｂ＝１−５　（ｓ＝ｏ−４のとき、「Ｓ＋」で表されるように）ｙ＝ １である。

（ｃ）　グループ３：　＋　ｒ、＋　ｓ　Ｃｙｓ　ｎｈｚこのグループのペプチ ドでは、正に帯電したアミノ酸残基がチオール活性システィン残基のＮ末端にあ る。本発明の一般式によると、ｍ＝１、ｎ＝＝ｏ、ｘ＝１、ｃ＝０−４　（ｒｓ Ｊで表されるように）　、ａ＝ｏ−５（ｒ＝ｏ−４のとき、「＋ｒ」で表される ように）である。

（ｄ）　グループ４：　ｒ　Ｈｉｓ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　ｎｈｘこのグル ープのペプチドは全て「コア」としてＨｉｓ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ配列を有 する。本発明の一般式によると、ｍ＝ｎ＝１、ｃ＝ｄ−０、ｘ＝ｌ、ｙ＝ｌ、ａ ＝Ｏおよびｂ＝１である。さらに、ペプチドは単数または複数の残基ｒｒＪによ ってＮ末端で延長される。負に帯電した残基が存在する影響を調べる。

（ｅ）　グループ５：　Ｈｉｓ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　ｓ　ｎｈ。

グループ５のペプチドは、ペプチドが単数または複数の残基ｒｓＪによってＣ末 端で延長されている他は、グループ４と同じである。再び、負に帯電した残基の 影響を調べる。

（ｆ）　グループ６ 各種対照ペプチド、および本発明の一般式に従っているが、上記従属一般式に当 てはまらない、例えば非アミド化した、ペプチド。

実施例２１ｇＡ−α、ＡＴ複合体の製造ＩｇＡ骨髄腫（Ｂｒｉｅｒｌｅｙ）血漿 に、トロンビン（ＩＯＩＵ／１００ｍ１血漿）を加えることによって脱繊維素を 行った。次に、血漿を一晩４℃で撹拌し、得られた繊維素凝塊を除いて血清を得 た。絶えず撹拌しながら飽和硫酸アンモニウムを滴加して、４℃で最終濃度を５ ０％にした。混合物を次にＭＳＥ　Ｃｏｏ１ｓｐｉｎ２中で３００Ｏｒｐｍにて １５分間４℃で遠心分離した。得られた沈殿物を超純水に再溶解し、ｐＨ７，２ のリン酸塩含有緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を何回か交換しながら透析した。次に 、試料を４℃で、ＰＢＳで平衡化したセファクリル５３００ＨＲゲル濾過カラム に加え、そして分離の際、ＰＢＳを緩衝液として使用してタンパク質フラクショ ンを集めた。抗ＩｇＡ−α、ＡＴを予め塗布したプレートを使用するＥＬＩＳＡ 法を用いて、カラムフラクションを■ｇＡ−αＩＡＴの存在について分析した。

複合体陽性フラクションをプールし、Ａｍ１ｃｏｎ　Ｃｅｎｔｒｉ−ｐｒｅｐ濃 縮器を使用して濃縮した。複合体に富むフラクシヨンを次に４℃でセファクリル ５２００ＨＲゲル濾過カラムに加え、ＥＬＩＳＡ法を用いてＩｇＡ−αＩＡＴ陽 性フラクションを集めた。フラクションを前のように濃縮した。純度はＨＰＬＣ ＳＳ、ＤＳ−ＰＡＧＥおよび２次元電気泳動によって確認した。

実施例３　生体内試験 （ａ）ウサギに慢性関節リウマチを誘発させる方法（ｉ）活性モデル 一般的的なりｕｍｏｎｄｅ　Ｄ、Ｃ，−Ｇｌｙｎｎ　Ｌ、Ｇ、法（Ｂｒｉｔｉｓ ｈ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ。

１９６２．４３、ｐ３７３）によって、または関節炎原として変形自己ＩｇＧを 用いて一般的なモデルには見られないリウマチ因子の形成を開始する上記の方法 の変形法（ガロウェイ等、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９８３．４９．５１１）に よって、ＲＡの活性モデルをウサギでつくることができる。下記の代替法を実施 した。

５ｍｇのオボアルブミン（ＯＡ）を含む０．５ｍｌ殺菌生理食塩水を０．５ｍ１ の完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）に懸濁させたものを、ウサギの首筋の ３つの異なる部位に皮下（Ｓ　Ｃ）注射した。１４日後、５ｍｇのＯＡを含む０ ゜５ｍｌ殺菌生理食塩水を不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）に懸濁させ たものを、ウサギの首筋の３つの異なる部位に皮下（ＳＣ）注射した。さらに１ ０日後、生理食塩水中に５００，２００．１００ｍｇ／ｍ＋で含まれる０Ａ（１ ００μｌ）を動物に皮肉注射することによって動物の遅延した過敏性反応につい て試験し、殺菌生理食塩水を陰性の対照として用いた。２４時間後、注射部位を 検査し、腫れおよび赤みを調べた。陰性反応（腫れは見られず、赤みはほとんど または全（ない）の全ての動物に５ｍｇのＯＡを含む殺菌生理食塩水を０．５ｍ ｌのＩＦＡｌ、：懸濁したものを別に（皮下）注射した。７日後、１０ｍｇのＯ Ａを含む０．５ｍｌ殺菌生理食塩水を右膝関節に関節的注射することによって関 節炎を誘発させ、０．５ｍｌの殺菌生理食塩水を陰性対照として左膝関節に注射 した。

カリパスを使用して膝の幅を測定することによって、腫れの程度を調べた。

（１１）　受動モデル 単離したＩｇＡ−α、ＡＴ複合体を膝関節に注射することによって、ウサギのグ ループに関節炎を誘発させた。ＩｇＡ−α、ＡＴ複合体は実施例２に記載の方法 によって精製した。これによって、ウサギに慢性関節炎がすみやかに現れた。

このシステムは活性モデルに比べて２つの利点を有する。第１は、ＲＡ発症速度 であり、そして第２は、ＲＡがＩｇＡ−αＩＡＴ複合体自体によって誘発された ことが分かっていることである。これを次のように証明する；何組かの正常なウ サギに、０．５ｍｌ生理食塩水（陰性対照）を一方の関節に、そして０．５ｍｌ 試験物質ＣｆｇＡ、ＩｇＡ−ａ、ＡＴ複合体、またはＩｇＡ−α、ＡＴ複合体に 関して陰性であるがα、ＡＴは高い滑液（ＳＦ））を他方に関節内（ｉａ）注射 した。カリパスを使用して関節の幅を測定することによって、ＲＡの経過を調べ 、関節に注射した対照および試験物質を比べた（図１ａ、ｂおよびＣ）。

実験の終わりに、関節を肉眼的におよび組織病理学的に調べた。肉眼的には■ｇ ＡおよびＳＦを注射した関節は正常に見え、腫れはなく、膝蓋骨上下の脂肪パッ ドは白く、脂肪パッドによる膝蓋骨の過剰成長はないが、■ｇＡ−αＩＡＴ複合 体を注射した動物には腫れが見られ、脂肪パッドは褐色（細胞の炎症を示す）で あり、膝蓋骨および十字靭帯力伏きくなり、過剰成長していた。組織病理学的に は細胞の脂肪パッドへの浸潤、滑膜内層の細胞数の増加、絨毛の形成、膝蓋骨の 過剰成長および膝蓋骨におけるプロテオグリカンの破壊が見られた。ＩｇＡ−α 、ＡＴ複合体を注射した動物に見られる全ての変化は、慢性関節リウマチタイプ の疾患と一致した。

（ｂ）　ＲＡの受動モデルにおけるペプチドの抗リウマチ作用の測定正常なウサ ギの左膝に０．５ｍｌの生理食塩水を陰性対照として関節的注射（１ａ）するか 、または０．５ｍｌの精製１ｇＡ−α、ＡＴ複合体を右膝に関節的注射（ｉａ） して関節炎を誘発させた。これによって関節炎がすみやかに誘発された。これを カリパスを使用して関節の幅を測定することによって調べｈ０関節炎が誘発され て４８時間後に、αＩＡＴのアミノ酸２３１−２３４を表すペプチドＨｉｓ−Ｃ ｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓの１０ｍｇ／ｍｌ溶液０．１ｍｌをｉａ注射した。陰性対 照として、他の動物を経口ラクトース投与で治療した。これを試験期間中、２− ３日間隔で繰り返した。１４日後、動物を犠牲にし、後の組織学的検査のために 関節部分を取った。

０日　生理食塩水（左膝）、ＩｇＡ−α＋ＡＴ（右膝）２日　ペプチド（右膝） ４日　〃／／ ７日　〃　〃 １９日 １４日　動物を犠牲にした 結果は表２に示す。

データの統計学的（を試験）分析から、治療期間を通して２つの異なる日（すな わち、治療開始後、１日および１１日）にペプチドを注射したグループの関節の 腫れの有意な減少が示された：陰性対照グループの（ブラセボで治療した）動物 の関節の大きさと比べることによって行った。

実施例４　合成ペプチドの抗リウマチ活性の試験管内試験試験管内で本発明のペ プチドが精製ＩｇＡ−α、ＡＴ複合体を解離する能力について、以下のように試 験した。抗リウマチ薬であるＤ−ベニンラミンおよび合成ペプチドを対照として 用いた。

（ａ）ＨＰＬＣ分析 精製ＩｇＡ−α、ＡＴ複合体の５７μｇ／ｍｌ溶液５０μｌを、同量のペプチド または薬剤（５００μＭ）で９０分間、３７℃にてインキュベートした。２５ｐ １のインキュベート混合物を次に長さ３０ｃｍのＴＳＫ　Ｇ３０００　５ＷＸＬ 　ＨＰＬＣカラムに加えた。試料を波長２０６ｎｍ、流速１ｍｌ／分でリン酸塩 緩衝液（０，１Ｍ）ｐＨ７，１を用いて調べた。

結果を以下の表１−６の「最少ＨＰＬＣＪの欄に示す。これらはペプチドが試験 管内のＩｇＡ−α、ＡＴ複合体を解離する能力を表す。

これらの実験において、ベースラインレベルは１４％の複合体、遊離ＩｇＡ比よ りなる。確実な解離効果を生じるペプチドの最低濃度は２０％の複合体：遊離Ｉ ｇＡ比となるものである。結果の表において、全てのペプチド値はμＭｏｌで表 す。〉５００μＭのペプチド値は、試験した最高ペプチド濃度では複合体の解離 が生じないと解釈する。

（ｂ）　Ｇ３−活性の阻害 各種ペプチドを、これらがＩｇＡ−α、ＡＴ複合体の代替補体（Ｇ３）経路活性 化を妨げる能力について試験した。

非免疫性１ｇＡ−α、ＡＴ［合体による代替補体経路活性化能力及び抗リウマチ 性ペプチドによるこの活性化のその後の阻害の測定方法を以下に記載する。

この方法は、リッチおよびスタンワース、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒ ｓ、１９８０．１．３６３，３６６によって記載された方法に基づ（ものであり 、これを小規模化してマイクロタイタープレート上で実施できるようにしたもの である。

１０ｍＭのＥＧＴＡでのキレート化によってカルシウムを除去して一般的な補体 経路をブロックした新鮮で正常なヒト血清を少し希釈したものが、３７℃でイン キュベートしたとき、感作していないウサギの赤血球を９０％以上血液細胞溶解 するという、プラッツーミルおよびイシズカ（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　、１９７ ４）、１１３、３４８．３５８）の初期の観察をこの分析に用いた。

非免疫性複合体１ｇＡ−α、ＡＴは従来、代替経路の補体を活性化し、そしてウ サギの赤血球の細胞溶解を阻害する唯一公知の可溶性複合体であると見られてき た。この阻害には生物学的に活性な複合体が必要とされる。１０年を経たＩｇＡ 骨髄腫血漿から単離した複合体は、代替補体を活性化すること力坏可能であるこ とが分かり、従って生物学的に活性ではない。

必要な緩衝液 この分析に必要な緩衝溶液は（ａ）全体細胞溶解緩衝液（超純粋中の１％トリト ン１００）、（ｂ）次ぎのような代替経路の補体結合反応の希釈剤（Ａ　Ｐ　Ｃ ＦＤ）： ８３容量　ＣＦＤ、ＤＨ７，２（１オキソイド錠剤：１００ｍ１　ＵｐＷ） １０容量　０．１Ｍ　ＥＧＴＡ　ｐＨ７，２７容量　ＭｇＣｈ　ｐＨ７，２ （この緩衝液はまた２倍濃度の形にも製造された）、および（Ｃ）細胞貯蔵用緩 衝液（０，１Ｍクエン酸塩緩衝液　ｐＨ６，２）であった。

させ、次に、−晩４℃で貯蔵した。血清を取り出し、１ｍｌのアリコートの形で 一７０℃で貯蔵した。使用する場合、血清を解凍し、そして１００μＩの０．　 １ｍ　ＥＧＴＡ　ｐＨ７，２および７０μｍの０．１ｍ　ＭｇＣｌ２ｐＨ７，２ を加えた。

ウサギの赤血球細胞 健康なウサギの静脈穿刺によってウサギの赤血球細胞（ＲＢＣ）を得、領　１Ｍ クエン酸塩緩衝液ｐＨ６，２に集めた。ＲＢＣをクエン酸塩緩衝液で３回洗浄し 、細胞をこの緩衝液中に貯蔵した。この緩衝液は毎週取り替えた。細胞はこのよ うにして３週間貯蔵することができた。

ペプチド ペプチドは実施例１のように合成し、ＵＰＷで１ｍＭにした。使用前はこれらを 一７０℃で冷凍保存した。

ｒｇＡ−α、ＡＴ複合体 これは前記実施例２のように製造した。これは使用前は少量のアリコートの形で 冷凍保存した。

分析方法 （ｉ）　Ｒｂ　ＲＢＣをちょうど１００％細胞溶解するのに必要な血清希釈率の 判断 底が丸い穴をもつ軟質マイクロタイタープレートを使用し、１００μｌのそのま まの血清（ＥＧＴＡおよびＭ　ｇ　ＣＩ　２を加えた）を第１の二重反復穴に加 えた。

これからＡＰＣＦＤで２倍希釈列を作成して５０μｌの液が入った穴にした。８ つの試験穴（−二重反復穴）で十分であった。

８つの穴は陽性対照（１００μｍ　１％トリトン／ＵＰＷ）として準備した。

８つの穴は陰性対照（１００μＩ　ＡＰＣＦＤ（ブランク））として準備した。

５０μｍのＡＰＣＦＤを試験穴に加え、５０μｍの１％ウサギのＲＢＣを全ての 穴に加えた。次に、プレートを３７℃で３０分間インキュベートし、そして１０ 分間２０００ｒｐｍで遠心分離した。

７５μｍの上澄み液を注意深（取り出し、底が平らな穴のマイクロタイタープレ ート上で平板培養した。次に、プレートを４１０ｎｍ干渉、６９０ｎｍ基準で読 み取った。ゼロまたはブランク値は陰性対照穴の平均値として計算し、そして陽 性対照穴の平均を用いて、血清希釈物に対する細胞溶解率を計算した。それ以上 の分析では、細胞溶解がＲｂ　ＲＢＣの約８０％である血清希釈物を用いた。

これは通常１：４ないし１：６の希釈（すなわち、１ｍｌ血清：４ｍｌのＡＰＣ ＦＤないし６ｍｌのＡＰＣＦＤ）であった。

（白）　代替補体経路阻害剤としての」ｇＡ−α、ＡＴ複合体の使用ＡＰＣＦＤ ｔ−２倍１１ｉ１Ｌ−（、Ｉ　ｇ　Ａ　−ａ　ｌＡ　Ｔ　複合体の１１希釈物ヲ ツクツた。この複合体の１＝１希釈物１００μｍを第１の二重反復穴に加えた。

これをＡＰＣＦＤで２倍希釈して、１つの穴当たり５０μｌにした。５０μｌの 予め決められた希釈の血清（上記（ｉ）参照）を各穴に加えた。上記のような陽 性および陰性対照穴並びに血清のみを含む穴を対照として用いた。プレートを３ ７℃で３０分間インキュベートし、次に、２００Ｏｒｐｍで１分間遠心分離した 。５０μｍの１％ウサギ赤血球細胞を各穴に加え、プレートを再び３７℃で３０ 分間インキュベートした。次に、プレートを２０００ｒｐｍで１０分間再び遠心 分離した。７５μＩの上澄み液を各穴から取り出し、平底穴のマイクロタイター プレート上で平板培養し、これを４１０ｎｍ干渉６９０ｎｍ基準で読み取った。

使用した血清希釈物がウサギのＲＢＣを有意な程度にまで細胞溶解したことを確 認するために、対照の穴をチェックした。次に、複合体希釈物に対する平均の阻 害率を血清対照の穴に対して計算した。これによって、分析の次の段階に適した ＩｇＡ−α、ＡＴ複合体の濃度を決定することができる。適当な濃度は１：工な いし１．４　複合体：ＡＰＣＦＤの範囲であった。

（ｉ　ｊ　ｉ）　ウサギＲＢＣの代替経路補体細胞溶解の複合体阻害の阻害剤と して推定されている抗リウマチ性ペプチドの使用ペプチド（５００μＭａ度）を ２倍濃縮ＡＰＣＦＤで１；１に希釈した。次に、ペプチドのこれらの溶液を底が 丸い穴をもつマイクロタイタープレート上で２倍希釈して、１つの穴当たり２５ μＩのペプチド溶液にした。陽性および陰性対照、血清のみの対照および血清プ ラスＩｇＡ−α、ＡＴ複合体の対照が分析に含まれた。ＩｇＡ−α、ＡＴ複合体 を適当に希釈したちの２５μｍ　（上記（ｉ　ｉ　ｉ）参照）を試験穴に加え、 プレートを２００Ｏｒｐｍで１分間遠心分離した。次に、プレートを３７℃で１ ．５時間インキュベートした。５０μｌの適当な血清希釈物（上記（ａ）参照） を加え、プレートを２００Ｏｒｐｍで１分間遠心分離し、次に、３７℃で３０分 間インキュベートした。５０μｍの１％ウサギＲＢＣを加え、さらに３７℃で３ ０分間インキュベートした後、プレートを２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し た。上澄み液を前のように取り出した。

結果の説明 血清、血清および複合体（Ｃ＋Ｓ）並びに全血液細胞溶解用の穴のそれぞれの平 均値を計算した。血清穴による細胞溶解に対する血液細胞溶解率を計算した。

ペプチドは、細胞溶解率がＣ＋Ｓによって得られる計算された細胞溶解率平均に 等しいときに、抗体力価を有すると考えられる。ペプチドの力価ポイントは、Ｃ ＋Ｓ平均値より大きな細胞溶解を生じるペプチドのμＭ濃度として計算した。

結果は以下の表１−６に示す。結果はＣ３活性化を妨げるのに必要なペプチドの 最低濃度として表し、ＩＩＣに示す。

（Ｃ）　マクロファージ阻害分析 精製したヒトＩｇＡ−α、ＡＴ複合体を加えることによってマウスのマクロファ ージ細胞系（ＰＵ５１８）を刺激して、リソソーム酵素を放出させた。次に、こ の放出がペプチドまたは他の薬剤によって阻害される程度を調べた。阻害の程度 は活性度で示した：ペプチドまたは他の薬剤濃度は５０％の阻害が記録された濃 度である。方法を簡単に以下に記す・ ２５μｌのペプチドまたは薬剤を、殺菌した組織培養９６穴プレート中で、ＲＰ Ｍ１１５４０＋１０％ウシ胎児血清（Ｆｅ２）で２倍希釈した。０．２ｍｇ／ｍ ｌのＩｇＡ−ａ、ＡＴ複合体を含むＲＰＭＩ　１６４０＋１０％ＦＣ３２５μｍ を次に全ての穴に加えた。２Ｘ１０’細胞／ｍ＋の細胞を含むＲＰＭ１１６４０ ＋１０％ＦＣ３５０μｍを各穴に加えた。

細胞のみおよび細胞＋ＩｇＡ−α、ＡＴ複合体の対照の穴も準備した。次にプレ ートをそっと混合し、−晩（１６時間）３７℃にて４％Ｃｏ２雰囲気中でインキ ュベートした。次に、プレートを１２０Ｏｒｐｍで１０分間、ベンチトップ遠心 分離で遠心分離した。

次に、４０μｌの上澄み液を各穴から取り出し、９６穴ポリスチレン分析プレー トに加え、これに、２ｍＭのフェノールフタレイン−β−Ｄ−グルコリン酸を含 有する１６０ｍＭ酢酸塩緩衝液（ｐＨ４，３）４０μｌを加えた。基準曲線を得 るために、フェノールフタレインを酢酸塩緩衝液で希釈したちの１００−５μ１ ｍｌも分析プレートの別の穴に加えた。

次に、プレートを３７℃で４時間インキュベートし、その後、０．２Ｍ　ＮａＣ １を含有する０、２Ｍグリシン／ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０，６）１５０μｍを 加えて反応を停止させた。

次に、プレートを３分間振盪し、そして５．７０ｎｍでの光学密度をプレートリ ーダーで読み取り、そして細胞から放出されたβ−Ｄ−グルコロン酸の量を計算 した。放出を５０％阻害するペプチドおよび薬剤の濃度を書き留めた。

これらの実験結果は以下の表１−６に示す。

青１　グループ１のペプチド 配列 ＨＣＫｎｔ’＋２　０　０　１１６　１２５　６２ＨＣＫＫｎｈ２０　１　Ｄ２ 　Ｔｏ　１６　６０ＨＣＧＫｎｈ２　０　１　１４＋　５０　８　１００ＫＣＧ Ｋｎｈ２　０　１　１７７　ｓｏ　６２　２５０ＲＣＧＫｎｈ２　０　１　１３ ９　Ｔｏ　６２ＨＣＧＧＫｎｈ２　０　２　１４２　５０　１６　５００ＨＣＧ ＧＧＫｎｈ２０　３　１４３　１２５　３２　＋５０ＨＣＧＧＧＧＫｎｈ２　０ 　４　＋６ｏ　ｓｏ　４　９０ＨＧＣＫｎｈ２１　０　１６１　ＴＯｃ２　Ｔｏ 。

ＨＧＣＧＫｎｈ２　１　１　＋４４　Ｓｏ　３２ＨＧＣＧＧＫｎｈ２１　２　１ ６６　１０　＜２ＨＧＣＧＧＧＫｎｔ＋ｚ　＋　３　１６７　ＩＱ　＜２ＨＧＣ ＧＧＧＧｎｈ２　１　４　１６８　１０　８ＨＧＧＣＫｎｈ２　２　０　１６４ 　Ｓｏ　８ＨＧＧＣＧＫｎｈ２　２　１　１４５　５０　３２　３０ＨＧＧＣＧ ＧＫｎｆｉ２２　２　１６２　Ｔｏ　（２ＨＧＧＣＧＧＧＫｎｈ２　２　３　１ ６９　５０　８ＨＧＧｃＧＧＧＧＫｎｈ２２　４　１６１　Ｔｏ　＜２　＋００ ＨＧＧＧＣＫｎｈ２３　０　１６５　５０　ｃ２ＨＧＧＧＣＧＫｎｔ’１２　３ 　１　＋４６　Ｓｏ　３２ＨＧＧＧＣＧＧＫｎｈ２　３　２　１７１　５０　４ ＨＧＧＧＣＧＧＧＫｎｈ２３　３　１６３　５０　＜２ＨＧＧＧＣＧＧＧＧＫｎ ｈ２　３　４　１７２　Ｓｏ　４ＨＧＧＧＧＣＫｎｈ２　４　０　１５９　Ｉｏ 　８ＨＧＧＧＧＣＧＫｎｈ２　ａ　Ｉ　１５８　５０　１６ＨＧＧＧＧＣＧＧＫ ｎｈ２　４　２　１７３　Ｓｏ　４ＨＧＧＧＧＣＧＧＧＫｎｈｚ　４　３　１７ ４　１２５　４　１２５ＨＧＧＧ（、ＣＧＧＧＧＫｒ＋ｔ＋２ａ　ａ　１７５　 １２５　２結果から、少なくとも４「および３ｓ残基に達するまで、活性に認め られる影響を及ぼすことなく、スペーサー残基「およびＳの数を増加しうろこと が分かる。

グリシンは好ましいアミノ酸スペーサーであるが、結果から、負電荷を有するも のを含むどのようなアミノ酸も適していることが分かる。

嚢ヱ　グループ２のペプチド 配列 ＣＫＫｎｈ２　０　０　１１４　１２５　）＋２５０ＣＨＧＫｎｈ２　０　１　 １７６　）５００　１２５Ｃ）ＩＧＧＫｎｈｚ　Ｏｔ　１４８　１２５　３２Ｃ ＨＧＧＧＫｎｈ２０　３　１８６　＞５００　＞２５０　２５０ＣＨＧＧＧＧＫ ｎｈ２０　４　１８７　５０　６２ＣＧＨＫｎｈ２　１　０　１８３　＞５００ 　＞２５０ＣＧＧＨＫｎｈ２２　０　１８４／＋８９　＞５００１５０　〉２５ ０ＣＧＧＧＨＫｎｈ２　３　０　＋８Ｓ　＞５００　２５０ＣＧＧＧＧＨＫｎｈ ２４　０　１８８　＞５００　６２　１０００’（會酵素放出を促進） 抗復含体活性かいくらかあるが、グループ１のペプチドはど高０レベルで（才な い。

老良−グループ３のペプチド 配列　ｒ　Ｓ　（ＩＪＨ） ＨＫＣｎｈ２　００　１７８　１０　＋６　２００ＨＫＧＣｎｈ２　０　１　１ ８２　Ｓｏ　８ＨＫＧＧＣｎｈ２　０　２　１９１　Ｓｏ　ｃ２ＨＫＧＧＧＣｒ ｌｈ２　０　３　１９２　５０　ｃ２ＨＫＧＧＧＧＣｎｈ２０　’　＋９３　Ｓ ｏ　＜２　３０ＨＧＫＣｎｈ２１　０　１７９　５０　８ＨＧＧＫＣｎｈ２　２ 　０　１８０　Ｓｏ　４）ＩＧＧＧＫｃｎｈ２　３　０　１９４　５０　＜２） ＩＧＧＧＧＫｃｎｈ２　４　０　１９５　Ｓｏ　＜２　２００ＨＧＫＧＣｎｈ２ 　１　１　１８＋　Ｓｏ　３２　５００このグループのペプチドは高い抗複合体 活性を有する。

入Ａ　グループ４のペプチド ＤＨＣＫＫｎｈｚ　＋　、　１１３　Ｔｏ　７８　７０ＥＨＣＫＫｎｌ’＋２　 １　１５４　５　＜２ＤＧＨＣＫ￥：ｎｈ２　２　１１９　１０ＨＫＧＣＧＣｎ ｈ２　ａ　１９２　Ｓｏ　＜２ＥＧＨＣににｎｈ２　２　１５５　５　＜２　６ ０ＤＧＧ）ＩＣＫＫｎｈ２　３　１１８　Ｓ。

ＤＧＧＧＨＣｋ：Ｋｎｈｚ　ａ　１１７　Ｔｏ　８ＤＧＧＧＧ）ＩＣＫＫｎｈ２ 　Ｓ　１２９　Ｔｏ　３２　＋２５ＤＧＧＧＧＧＨＣＫＫｎｈ２６　１３０　Ｔ ｏ　１６ｄＡＨＣＫＫｎｈ２１　２０５　１０　１．９５ｃｄはアミノ酸のＤ残 基を示す） 混合電荷で構成されるものは活性であった。

前二　グループ５のペプチド 配列　くμＨ〉 ＨＣＫＫＤｎｈｚ　＋　＋２０　Ｓｏ　６２　２５ＨＣＫ１３Ｅｎｈ２１　＋５ ０　Ｓｏ　８ＨＣＫＩＣＧＤｎｈｚ　２　１２１　１２５　６２ＨＣＫＫＧＥｎ ｈ２　２　１５１　Ｓｏ　１６ＨＣＫＫＧＧＤｎｈ２　３　＋２２　Ｓｏ　３１ ＨＣＫＫＧＧＥｎｈ２　３　１５２　Ｔｏ　１２５ＨＣＩＣＫＧＧＧＤｎｈ２ａ 　１２３　５０　３１ＨＣＫＫＧＧＧＥｎｈ、、４　１５３　Ｓｏ　６３ＨＣＫ ＫｄＡｎｈ２１　２０６　５０　：ｌＩ　、３（ｄはアミノ酸のＤ残基を示す） 混合電荷で構成されるものは活性であった。

前二°グループ６のペプチド Ｄ−ペニシラミン　−　２５０　３１　５００システイン　−２５０＋６　５０ ０ ＥＶＤＧＴＣＹ　１２４　２５０　１６ＶＤＧＴＣＹ　１２５　２５０　３１ ＤＧＴＣＹ　１２６　＞５００ ＧＴＣＹ　１２７　５０ ＴＣＹ　１２８　１２５ サブス９　ニア　スｐ　３６　＞５００　）５００　＞５００ＨＣＫＫ　１０７ 　２５０ ＨＣＫ　１１０　５００ ＨＣ１１２２５０ ＣＫ　１０９　５００ ＣＫＫ　１０６　５００ ＣＫｎｈ２　１　Ｉｓ　ｓｏ。

グルタチオン　５００　３１ Ｎ−アセチルシスティン−５００４ ＫＴＫＣ５ＧＦＦＶＦ　３０　＞５００　３１　２５０ＶＳＷＭＡＥＶＤＧＴＣ Ｙ　８０　Ｔｏ　１６ＩＶＬＶＤＮＫＣＫＣＡＲ８９５０＋２５ＧＭＦＮＩＱＨ ＯＪＣＬＳＳ　９０　Ｓｏ　３＋ＨＣＣＧＫｎｈ２１４７　１０　３２　２５０ ＫＡＡＧＳ　９６　＞５００ ＤＨＣＫＫ　１０Ｂ　Ｔ。

ｄＡＨαにｄＡｎｈ２　２１０　１０　３．９（ｄはアミノ酸のＤ残基を示す） ペプチド１３３−１３７におけるようにコアのテトラペプチド（Ｈｉｓ　Ｃｙｓ 　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ）配列の延長は、活性に影響を及ぼさなかった。

コアのテトラペプチド　Ｈｉｓ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　（１０６，１０９， １１０，１１２，１１５）のより小さな変形では、それほど活性ではなかった： コアのテトラペプチドの非アミド化形（１０７）と同じであった。試験を行った 対照還元型物質の中では、グルタチオンおよびＮ−アセチルシスティンが比較的 不活性であった。

浄書（内容に変更なし） 複合体 Ｆｉｇ、２ 手続補正書坊式） 平成　７年　２月２８日

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．チォール活性システイン残基、およびチオール活性システイン残基の（必ず しも隣接していないが）Ｎ末端サイドに、（必ずしも隣接していないが）Ｃ末端 サイドに、または（必ずしも隣接していないが）ＮおよびＣ両末端サイドに位置 する少なくとも２つの正に帯電したアミノ酸残基を含む、治療に用いるための、 ２０以下のアミノ酸残基の合成ペプチドまたは少なくとも一部が非ペプチド性で あるその類似体。
2. ２．次の一般式で表わされる請求項１のペプチドまたはその類似体：［Ｚ１ａ− Ｌ１ｂ−Ｂ１ｃ］ｍ−Ｃｙｓ−［Ｂ２ｄ−Ｊ２ｄ−Ｊ２ｙ−Ｚ２ｂ］ｎ（式中、 ｍは０または１、ｎは０または１、そしてｍ＋ｎは１または２であり；Ｊ１およ びＪ２は正に帯電したアミノ酸残基の配列であり；Ｚ１、Ｚ２、Ｂ１およびＢ２ は正に帯電した、負に帯電したもしくは中性のアミノ酸残基の配列、または正に 帯電した、負に帯電したもしくは中性のアミノ酸残基の混ざった配列であり； ｘ＝０または１、ｙ＝０または１、およびｘ＋ｙ＝１または２であり；ｃ＝０− ４、ｄ＝０−４；そして ａ＝０−１８、およびｂ＝０−１８であり、但し、ｍ＝０のとき、Ｂ２およびＺ ２の少なくとも１つは正に帯電したアミノ酸残基であり、ｎ＝０のとき、Ｚ１お よびＢ１の少なくとも１つは正に帯電したアミノ酸残基であり、ｍ＝ｎ＝１およ びｙ＝０のとき、Ｚ１、Ｂ１、Ｂ２およびＺ２の少なくとも１つは正に帯電した アミノ酸残基であり、そしてｍ＝ｎ＝１およびｘ＝０のとき、Ｚ１、Ｂ１、Ｂ２ およびＺ２の少なくとも１つは正に帯電したアミノ酸残基であり、あるいはＢ１ およびＢ２はアミノ酸のｂおよびｃ残基の長さによって決まる長さに等しい長さ の非ペプチドスペーサーアームであってもよい）。
3. ３．正に帯電したアミノ酸残基がチオール活性システイン残基のＮ末端に位置す る、請求項１または２のペプチドまたはその類似体。
4. ４．正に帯電したアミノ酸残基がチオール活性システイン残基のＣ末端に位置す る、請求項１または２のペプチドまたはその類似体。
5. ５．正に帯電したアミノ酸残基がチオール活性システイン残基のＮおよびＣ末端 に位置する、請求項１または２のペプチドまたはその類似体。
6. ６．正に帯電したアミノ酸残基がチオール活性システイン残基に直接隣接してい る、請求項３、４または５のいずれかのペプチドまたはその類似体。
7. ７．正に帯電したアミノ酸残基が、スペーサーアームによって、チオール活性シ ステイン残基から離れている、請求項３または４のペプチドまたはその類似体。
8. ８．チオール活性システイン残基のＮ末端、Ｃ末端またはＮおよびＣ末端上のま たはこれらに隣接している正に帯電したアミノ酸残基が、スペーサーアームによ って、チオール活性システイン残基から離れている、請求項５のペプチドまたは その類似体。
9. ９．スペーサーアームが１−４のアミノ酸残基を含む、請求項７または８のペプ チドまたはその類似体。
10. １０．アミノ酸残基が中性アミノ酸残基である、請求項９のペプチドまたはその 類似体。
11. １１．中性アミノ酸残基がグリシンである、請求項１０のペプチドまたはその類 似体。
12. １２．３−２０のアミノ酸残基の長さである、先の請求項のいずれかのペプチド またはその類似体。
13. １３．４−１０のアミノ酸残基の長さである、先の請求項のいずれかのペプチド またはその類似体。
14. １４．残基Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓを含む、請求項１または２のペプチド。
15. １５．残基Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓを含む、請求項１または２のペプチ ド。
16. １６．残基Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓを含む、請求項１または２のペプチ ド。
17. １７．Ｃ末端でアミド化されている、先の請求項のいずれかのペプチド。
18. １８．ヒトＩｇＡおよびα１−抗トリプシンの複合体の抗原決定基に対して特異 的な抗体ドメインを含む治療に用いるためのリガンドであって、該抗体ドメイン が遊離ヒトＩｇＡおよび遊離ヒトα１−抗トリプシンと実質的に非反応性である 、上記のリガンド。
19. １９．モノクロナール抗体の形の請求項１８のリガンド。
20. ２０．該抗体のＦａｂ′フラグメントの形の請求項１８のリガンド。
21. ２１．該抗体のＦ（ａｂ′）２フラグメントの形の請求項１８のリガンド。
22. ２２．抗体がヒト化されている、請求項１９、２０または２１のリガンド。
23. ２３．予防的にまたは治療的に有効な量の先の請求項のいずれかのペプチドまた は抗体を含む医薬組成物。
24. ２４．抗体またはペプチドが注射に適した形に配合されている、請求項２３の医 薬組成物。
25. ２５．抗体またはペプチドが経口投与に適した形に配合されている、請求項２３ の医薬組成物。