JPH07506114A

JPH07506114A - アミリン突然変異タンパク質

Info

Publication number: JPH07506114A
Application number: JP6505266A
Authority: JP
Inventors: アンドリューズ，グレン・コルトン; クルーター，デヴィッド・ケヴィン
Original assignee: ファイザー・インコーポレーテッド
Priority date: 1992-08-06
Filing date: 1993-05-12
Publication date: 1995-07-06
Also published as: EP0654042B1; ES2122010T3; DE69321473D1; FI933476A; CA2141203C; DE69321473T2; DK0654042T3; WO1994003491A1; EP0654042A1; CA2141203A1; ATE171951T1; FI933476A0

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】アミリン突然変異タンパク質発明の分野本発明は、インスリン作用抑制活性を有するアミリンの突然変異タンパク質およびそれらの誘導体並びにそれらの薬学的に許容しうる塩に関する。更に詳しくは、本発明は、インスリン作用抑制活性を有するヒトアミリンの突然変異タンパク質、ラットアミリンの突然変異タンパク質およびそれらの誘導体並びにそれらの薬学的に許容しうる塩に関する。本発明の突然変異タンパク質および誘導体は、筋肉または筋肉細胞におけるインスリン作用を抑制するのにおよびインスリン作用の抑制を必要とする哺乳動物におけるインスリン作用を抑制するのに有用である。したがって、本発明は、更に、インスリン作用の抑制を必要とする哺乳動物におけるインスリン作用を抑制する方法および筋肉または筋肉細胞におけるインスリン作用を抑制する方法に関する。また更に、本発明は、アミリンによって引き起こされた筋肉または筋肉細胞におけるインスリン作用の抑制を阻害する化合物の能力を検定する方法に関する。更にまた、本発明は、上記の突然変異タンパク質、誘導体または塩を含む薬剤組成物に関する。

背景技術ヒトアミリンは、−次アミノ酸配列Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　ＧｌｎＡｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ｓｃｒ　５ｅｒＡｓｎ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　ＴｈｒＡｓｎ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　（配列番号＝１）を有する３７アミノ酸ポリペプチドである。

ラットアミリンは、−次アミノ酸配列Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　ＧｉｎＡｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　５ｅｒＡｓｎ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　ＴｈｒＡｓｎ　Ｖａｔ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　（配列番号＝２）を有する３７アミノ酸ポリペプチドである。

アミリンは、２位および７位のＣｙｓ残基間にジスルフィド結合を有する。それは、すい臓Ｂ細胞の分泌産物である。ＩＩ型糖尿病患者においては、すい臓中にアミリン誘導アミロイドが広範囲にわたって沈着しており、アミロイドは疾患に関係した病理学の一因であるということが仮定された。ウェスターマークウェスターマーク、Ｐ、ら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏ　ｉａ　３０：８８７〜８９２Ｄｉａｂｅｔｏｌｏ　ｉａ　３３：２８５〜２８９　（１９９０）。

単離されたヒラメ筋において、アミリンは、インスリンに刺激されたグリコ−。

インビボの骨格筋におけるインスリン作用に対するアミリンの効果は、上記の単離されたヒラメ筋における主な効果であるグリコーゲン合成の阻害であることが報告された。

筋肉または筋肉細胞におけるインスリンに刺激された解糖を減少させるためのアミリンおよびカルシトニン遺伝子関連ペプチドの使用並びにその拮抗薬の検定法は、１９９１年３月１５日出願の、本譲受人に譲渡された米国特許第０７／６７０．５３６号明細書に開示されている。

若干のアミリン拮抗薬およびそれらの使用は、１９８９年７月１３日公開のＷＯ３９１０６１３５号明細書（ＰＣＴ／ＵＳ　８９１０　ＯＯ４９）に記載されている。

発明の開示本発明は、−次配列Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　ＧｌｎＡｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｘａａ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　５ｅｒＡｓｎ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　ＴｈｒＡｓｎ　Ｖａｎ、　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　（配列番号：３）およびＬｙｓ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　ＧｌｎＡｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｘａａ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　５ｅｒＡｓｎ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　ＴｈｒＡｓｎ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　（配列番号：４）（但し、Ｘａａは、ＰｈｅＸＴｙ　ｒ、−ヨウ素化Ｔｙｒまたはニヨウ素化Ｔｙｒである）から成る群より選択されるアミノ酸配列である］を含む、インスリン作用抑制活性を有するポリペプチドまたはそれらの誘導体並びにそれらの薬学的に許容しうる塩に関する。

本発明の好ましいポリペプチドは、上記の配列番号：３を有するものである。

本発明の更に好ましいポリペプチドは、２位のＣｙｓ残基および７位のＣｙｓ残基間にジスルフィド結合か存在している配列番号二３を有するものである。

本発明は、更に、インスリン作用抑制量の本発明によるポリペプチド存在下において筋肉または筋肉細胞でのインスリン作用を抑制する方法に関する。

更に、本発明は、アミリンによって引き起こされた筋肉または筋肉細胞でのインスリン作用の抑制を阻害する化合物の能力を検定する方法であって、（ａ）インスリン、本発明によるポリペプチドまたはその誘導体、該化合物およびグルコースの存在下で筋肉または筋肉細胞をインキュベートし；（ｂ）工程（ａ）のインキュベートされた筋肉または筋肉細胞によって生産されたグリコーゲンの量を測定し；そして（ｃ）工程（ｂ）で測定された量を、筋肉または筋肉細胞がインスリン、本発明によるポリペプチドまたはその誘導体およびグルコースの存在下でインキュベートされた場合の工程（ｂ）によって測定された量に対して比較することを含む上記方法に関する。

上記方法において、用いられるグルコースは放射性標識されているのが好ましいし、グリコーゲンの量の測定は、放射性標識グリコーゲンの量の測定であるのか好ましい。

更に、本発明は、本発明によるポリペプチドおよび薬学的に許容しうる希釈剤または担体を含む薬剤組成物に関する。

また更に、本発明は、インスリン作用の抑制を必要とする哺乳動物においてインスリン作用を抑制する方法であって、該哺乳動物に対して有効量の本発明のポリペプチドを投与することを含む上記方法に関する。

詳細な説明本明細書および請求の範囲を通して用いられる「誘導体」という用語は、制限されないが、いずれもインスリン作用抑制活性を有する、配列番号：３または配列番号＝４に対して十分な相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド並びに重要でないアミノ酸置換を有するそれらの変異型を包含する。

本明細書および請求の範囲を通して用いられる「インスリン作用抑制活性」という用語は、制限されないが、インスリンが筋肉または筋肉細胞に対して持っている効果を抑制する本発明のポリペプチドの能力を包含する。例としておよび制限としてではなく、本発明のポリペプチドは、筋肉または筋肉細胞におけるインスリンに刺激されたグリコーゲン合成を抑制する。

本明細書および請求の範囲の目的のために、本明細書中のアミノ酸は全て、Ｇｌｙを明らかに例外とするしアミノ酸であり、Ｇｌｙは、そのカルボキシル基およびアミノ基の他に、α炭素に水素のみが存在するためにそのように分類されな本明細書および請求の範囲を通して用いられるｒＨＮ−Ｒ−ＣＯＮＨ２Ｊという表現において、そのＨ２Ｎ一部分は、配列ＲのＮ末端アミノ酸のＮ末端アミノ基を意味し且つ−ＣＯＮＨ２部分は、配列ＲのＣ末端アミノ酸のＣ末端カルボキシル基のアミドの形を意味する。

本明細書および請求の範囲を通して用いられる「筋肉」という用語は、インビボの完全な筋肉並びにそのストリップなどの筋肉の種々のエクスビボ標本を包含する。

本明細書および請求の範囲を通して用いられる「筋肉細胞」という句は、インビボの完全な筋肉中に存在するにせよ、筋肉の種々のエクスビボ標本中または筋肉細胞自体のインビトロ培養物中に存在するにせよ、いずれにしても全ての筋肉細胞を包含する。

本発明のポリペプチドを、本明細書および請求の範囲において一次アミノ酸配列の形で示しているが、本発明の範囲内に包含されるのは、Ｃｙｓ残基２およびＣｙｓ残基７間にジスルフィド結合が存在しているこのようなポリペプチドであるということは理解されるべきである。

本発明のポリペプチドは、当業者に周知の種々の方法によって製造される。例えば、ポリペプチドは、ＡＢＩによって提供される標準的なｔＢＯｃ化学プロトコル（ＮＭＰ／ＨＯＢｔ化学のバージョン１．４）にしたがってアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（ＡＢＩ）４３０Ａ固相ペプチド合成機などの自動ペプチド合成機を用いて合成することができる。

このようなプロトコルは、ヒドロキシベンゾトリアゾール活性エステルカップリングおよびそれぞれのカップリング後の未反応遊離アミノ末端の無水酢酸キャッピングを用いる。樹脂試料は、それぞれのカップリングの最後に自動的に除去され、そして定量的ニンヒドリン検定を用いてカップリング効率を監視する。

３７位のＴｙｒ残基か−またはニヨウ素化されたアミリンは、インスリン作用を抑制しないということが分かった。更に、式（式中、Ｗは、配列番号、１である）を有するアミリンのポルトン・ハンター（Ｂｏ　ｌ　ｔ　ｏｎ−Ｈｕｎ　ｔ　ｅ　ｒ）誘導体はインスリン作用を抑制しないということも、モノ−または分かった。これに対して、本発明のポリペプチドは、配列番号、■および配列番号、２を有する突然変異タンパク質であり、インスリン作用を抑制し、そして特に、アミリン作用およびその拮抗薬の研究のための各種検定において有用であるポリペプチドのヨウ素化された形を提供する。

アミリンによって引き起こされた筋肉または筋肉細胞におけるインスリン作用の抑制を阻害する化合物の能力についての本発明による方法を、以下に記載のように実施する。該方法は、インスリン、本発明によるポリペプチドまたはその誘導体、検定される化合物およびグルコースの存在下で筋肉または筋肉細胞をインキュベートし、インキュベートされた筋肉または筋肉細胞によって生産されたグリコーゲンの量を測定し、そしてそのように測定された量を、筋肉または筋肉細胞かインスリン、ポリペプチドまたはその誘導体およびグルコースの存在下でインキュベートされた場合に生産されたグリコーゲンの量に対して比較することを含む。

上記の方法において、インキュベートされた筋肉または筋肉細胞によって生産されたグリコーゲンの量は、以下のように測定することかできる。秤量された筋肉または筋肉細胞を、沸騰水浴中で２０〜３０分間加熱することによって３０％ＫＯＨ３ｍｌ中に溶解させる。冷却後、グリコーゲンを９５％エタノール１゜２容量で沈殿させる。次に、試料を加熱して沸騰させ、そして冷却後、３０００ｒｐｍで遠心分離してグリコーゲンをペレットにする。ペレットを水中に再溶解させ且つエタノールで再沈殿させる。次に、０．６Ｎ　ＨＣＩ　６ｍｌを加え、試験管をガラスマーブルで覆い、そして沸騰水浴中で約２〜２．５時間加熱することによってグリコーゲンを加水分解する。溶液を冷却し且つ中和する。次に、得られた遊離グルコースを、自動グルコース分析機を用いて決定する。

しかしながら、いずれも以下に記載したように、放射性標識グルコースを用い且つ生じた放射性標識グリコーゲンの量を測定することによって上記方法を実施することが好ましい。

上記方法の目的のために、クレッタズ（Ｃｒｅｔｔａｚ）、Ｍ、ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、１８６：５２５〜５３４　（１９８０）によって記載された手順にしたがって、解剖し且つ取出して約２５〜３５ｍｇ重量の試料片にしたラットヒラメ筋を用いることが好ましい。筋肉試料片を、１．２ｍＭカルシウムを液が入っている適当な容器中に入れる。このような筋肉試料片に適当な容器は、上記の１．２ｍＭカルシウムを含むガス処理したクレブス−リンガ−重炭酸塩緩衝液４ｍｌが入っている５０ｍ１エレンマイヤーフラスコである。本発明の方法の実施に対して不可欠ではないが、筋肉試料片を前記緩衝液中において９５％よび検定される化合物を更に含む前記緩衝液中において３７℃で（水浴を振とうする）１５分間インキュベーションした後、インスリン、本発明によるポリペプチドまたはその誘導体、放射性標識グルコースおよび検定される化合物の存在下において３７℃でインキュベーションすることが好ましい。このような逐次的インキュベーションのそれぞれを、５０　ｍ　ｌエレンマイヤーフラスコ中においてそれぞれの緩衝ｉｆｆ１４ｍｌ中で実施するのか好ましい。

インスリン、本発明によるポリペプチドまたはその誘導体、放射性標識グルコースおよび検定される化合物を含む前記緩衝液中での筋肉試料片のインキュベーションは３７℃で（水浴を振とうする）行ない、ここで緩衝液は６０分間ガス処ドまたはその誘導体を約１０　Ｍ〜約１０　Ｍ濃度で用いることが好ましく１゜本発明において用いられる放射性標識グルコースのために種々の標識を用（−ることができるが、このようなグルコースを、グリコーゲンの生産：こよって検出可ることか好ましい。

インスリンは商業的に入手可能であり且つエランコ・プロダク゛ソ・カンノ々ニー（Ｅｌａｎｃｏ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｃｏ、）、インディアナポリス、インディアナ州４６２８５などの様々な販売元から入手しうる。放射性標識グルコースも、様々な供給者、例えば、アマ−ジャム・コーポレーション（Ａｍｅ　ｒｓｈａｍＣｏｒｐ、）　、２６３６サウス・クリアプルツク、アミリン作用・ノＡイ゛人イリノイ州６００６５およびニュー・イングランド・ヌークリア（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）、私書箱８００２４、ウイルミントン、プラウエア州１９８８０から商業的に入手可能である。

放射性標識グルコース存在下において、概して約１時間のインキュベーション時間終了後、筋肉試料片を取出し、そして以下に記載のように放射性標識グリコーゲンについて検定する。筋肉試料片をＩＮ　ＮＡＯＨ１，０ｍｌ中１こ入担約６０℃で約１時間保持する。次に、グリコーゲンの１００ｍｇ／ｍｌ溶液０゜１ｍｌを加える。水冷１００％エタノール２．５ｍｌを加え且つ一２０℃で一晩中貯蔵することによってグリコーゲンを沈殿させる。得られた沈殿グリコーゲンを、卓上遠心分離機において３０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって集める。上澄みを除去し、そしてペレットを水冷６０％エタノールで３回洗浄する。最後の洗浄後、ペレットを水１００ｍｌ中に溶解させ且つ標準的な方法および装置を用いる液体シンチレーション計数計で計数する。

当然ながら、上記の方法は、種々の容量および容器並びに筋肉試験片の代わりの筋肉細胞を用いてムタテイス・ムタンデイス（ｍｕｔａｔｉｓｍｕ　ｔ　ａｎｄ　ｉ　ｓ）に適用しうる。本明細書中の開示によって可能性を与えられた当業者は、このような変化を容易に理解し、そしてこめような変化（こつＩＩ）でのグリコーゲンの尺度を計算することができるような適当な変更を行なう。グ１ノコ −ケンの適当な測定値はいずれも本発明の範囲内である。

インスリンに刺激されたグリコーゲン合成を減少させるアミリンの能力を阻害することができる化合物は、筋肉または筋肉細胞におけるインスリンに刺激されたグリコーゲン合成を減少させる本発明によるポリペプチドまたはその誘導体の能力を阻害する化合物として定義される。確認は、化合物が存在する場合の筋肉または筋肉細胞中に存在するグリコーゲンの濃度、例えば、”４Ｃｃｐｍと、化合物が不存在である場合の濃度とを比較することによって行なわれる。生産されたグリコーゲンを一層高濃度で、例えば、一層大きい数の”Ｃｃｐｍで生じるこれらの化合物のために、このような化合物は、筋肉または筋肉細胞番ごおけるインスリンに刺激されたグリコーゲンを減少させるアミリンの能力を阻害する。

本発明によるポリペプチドおよびそれらの誘導体の薬学的に許容しうる塩は、当業者に周知の標準法にしたがって製造される。

本発明によるポリペプチドまたはその誘導体を含む薬剤組成物は、当業者に周知の方法にしたがって製造しうる。例えば、ポリペプチドまたはその誘導体は、薬学的に許容しうる希釈剤または担体と組合せることができる。本発明によるポリペプチドまたはその誘導体を静脈内、筋肉、腹腔内または皮下に投与する場合、当該技術分野において周知の適当な滅菌希釈剤を用いる。このような薬剤組成物は十分な量のポリペプチドまたはその誘導体を含むので、以下に記載したような適当な投薬量を適当な期間にわたって投与することができる。

インスリン作用の抑制を必要とする哺乳動物においてインスリン作用を抑制するのに有効な投薬量は、本発明によるポリペプチドまたはその誘導体を静脈内、筋肉、腹腔内または皮下に投与する場合、約１０　Ｍ〜約１０　”Ｍの血漿濃度を生じる量である。好ましい投薬量範囲は、約１０　Ｍ〜約１０−８Ｍの血漿濃度を生じる範囲である。しかしながら、その範囲外の投薬量が可能であり且つ本発明の範囲内でもあることは理解されるべきである。適当な投薬量は、担当医師によって決定されうるし且つ決定され、しかも処置される症状の苛酷さ、更には投与されたポリペプチドまたは誘導体によって達成された応答並びに患者の年齢、性別および病歴の結果である。

以下の実施例は、本発明を例証するものであり、いずれにせよ、本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。

本発明のポリペプチドを製造する以下に記載の実施例のために、特に断らない限り、以下の条件および材料を用いた。ポリペプチドの合成は、アプライド・バイオシステムズ（ＡＢＩ）４３０Ａペプチド合成機（アプライド・バイオシステムズ、フォスター・シティ−１ＣＡ）で行なった。ＡＢＩによって提供される標準的なｔＢＯＣ化学プロトコルを用いた（Ｎ−メチルピロリドンヒドロキシベンゾトリアゾール化学のバージョン１．４）。プロトコルは、ヒドロキシベンゾトリアゾール活性エステルカップリングおよびそれぞれのカップリング後の未反応遊離アミノ末端の無水酢酸キャッピングを用いた。樹脂試料をそれぞれのカップリングの最後に自動的に除去し、そして当業者に周知の標準法にしたがって、定量的ニンヒドリン検定を用いてカップリング効率を監視した。

ｔＢＯＣアミノ酸はいずれもアプライド・バイオシステムズ（フォスター−シティ−１ＣＡ）から前記合カートリッジで購入された。以下のアミノ酸側鎖保護を用いた。Ｌｙｓにはｐ−クロロカルボベンゾキシ、Ａｒｇにはｐ−トルエンスルホニル、Ｔｙｒには２−ブロモカルボベンゾキシ、ＨｉｓにはＮ−（π）−ベンジルオキシメチル、ＳｅｒおよびＴｈｒには０−ベンジル、ＣｙｓにはＳ−アセトミドメチル（ＡＣＭ）または５−４−メチルベンジル。固相合成溶媒および試薬は、キーストーン・バイオチク（Ｋｅｙｓｔｏｎｅ　Ｂｉｏｔｅｃ）ｓ）（フィラデルフィア、ＰＡ）から入手されたｔ−ＢＯＣＣｙｓ　（ＡＣＭ）以外は全て、アプライド・バイオシステムズ（フォスター・シティ−１ｃＡ）から入手された。

Ｃ末端アミドポリペプチドをベンズヒドリルアミン樹脂（０，７７ｇ５０．　６５ミリモル／ｇ）上で組み立てた。最後のｔ−ＢＯＣ保護の除去は、合成の最後に合成機で行なった。

ポリペプチドを樹脂から取出すために、ポリペプチド樹脂（５００ｍｇ）をｐ− クレゾール１ｍｌ中に懸濁させ、モしてフッ化水素酸（ＨＦ）装置（ペニンスラ・ラブダ（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ　１ａｂｓ）、ベルモント、Ｃａ）に対してインライン結合した４０ｍ１　Ｋｅ　ｌ　−Ｆ　（登録商標）反応容器中において一７８℃まで冷却した。全容量を濃ＨＦで１２ｍ１に調整した。０〜５℃で１時間撹拌後、ＨＦを真空中で除去した。得られた残留物をトリフルオロ酢酸３ｍｌ中でスラリーにし、そして固形物を濾過によって除去した。濾液をジエチルエーテル４０ｍ１中に沈殿させた。沈殿を濾過し、新しいエーテルで洗浄し、そして真空乾燥させた。

Ｃｙｓ２および０７５７間にジスルフィド結合を形成するために、上記のように製造された粗製ポリペプチド１００ｍｇ　（２６μモル）を、６Ｍグアニジン塩酸塩、５０ｍＭ）リス、ｐＨ８，５中に溶解さ也そして酢酸１５．６ｍｌ中に溶解したヨウ素３１．６ｍｇ　（１２５μモル）で処理した。２時間の反応時間後、溶液を１０００ダルトンカツトオフスペクトロボア（Ｓｐｅｃｔｒｏｐｏｒ）６（スペクトラム（Ｓｐｅｃ　ｔ　ｒｕｍ）　、ロサンゼルス、Ｃａ）透析バッグに移し、そして３３ｍＭチオ硫酸ナトリウムに対して透析した。ヨウ素の色が透析物から消えた時に、チオ亜硫酸塩透析緩衝液を蒸留水で、すなわち透析された水対蒸留水（４Ｘ２リツトル）で置き換え、最終透析は４℃で一晩中行なわれた。透析物を、２０ｘ２５０ｍｍヴイダク（Ｖｙｄａｃ）Ｃ−１８プロテイン／ペプチドカラムおよび２０％Ｂ１８０％Ａ〜５０％Ｂ１５０％Ａの３０分間にわたる勾配溶離システム（Ａは５％アセトニド・リル／水１０．１％トリフルオロ酢酸、Ｂは１００％アセトニトリル）を用いるウォーターズ・デルタ・プレグ（Ｗａｔｅｒｓ　Ｄｅｌｔａ　Ｐｒｅｐ）３０００での分離用逆相高速液体クロマトグラフィーによって二つの等しいアリコート中に精製した。精製試料での分析データは、プラズマ・デソーブション質量分析計（Ｐ　１　ａ　ｓｍａＤｅｓｏｒｐｔｉｏｎ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）（ＰＤＭＳ）、エレクトロスプレィ質量分析計（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ　ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）（ＥＳ−ＭＳ）、高速原子衝撃質量分析計（Ｆａｓｔ　Ａｔｏｍ　Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ　ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）（ＦＡＢ−ＭＳ）およびアミノ酸分析（ＡＡＡ）を用いて得られた。

分析用高速液体クロマトグラフィーは、３．９ｘ３００ｍｍウォーターズμ−ボンダパックＣ−１８逆相カラムを２０％Ｂ１８０％Ａ〜５０％Ｂ１５０％Ａの３０分間にわたる勾配（Ａは５％アセトニトリル／水１０．１％トリフルオロ酢酸、Ｂは１００％アセトニトリル）で用いて行なった。

Ｃｙｓチオール残基の４−メチルベンジル保護を用いて合成されたポリペプチドを、当業者に周知の標準法にしたがってヨウ素／酢酸を用いて酸化し、そして上記の高速液体クロマトグラフィー精製を施した。

実施例ＩＲは配列番号：３であり；ＸａａはＴｙｒであり、そしてＣｙｓ２および、５ミリモル規模で行なわれて、樹脂に結合したポリペプチド１．８４ｇを与えた。樹脂全体を前記のように脱保護して、粗製ポリペプチド８２８ｍｇを得た。

粗製ポリペプチド７ｍｇの高速液体クロマトグラフィー精製は、ＥＳ−ＭＳ分析によって質量が３９０５．１Ｄａ　（３９０５，０６Ｄａが予想された）であることが示されたポリペプチド２．０ｍｇを与えた。ジスルフィド結合形成は、前記のように粗製還元ペプチド５０ｍｇ上で達成されて、透析および高速液体クロマトグラフィー精製後に表題ポリペプチド１．７ｍｇを得た。ＥＳ−ＭＳ分析により３９０３．３Ｄａの質量が得られた（３９０３．０４Ｄａが予想された）。

アミノ酸分析は予想の組成を示した。

ビス−Ｉ　Ｔｙｒであり、そしてＣｙｓ２および０７８７間、８ｘｌＯ”モル）の溶液に対して、１０ｍＭトリス　ｐＨ７，２緩衝液１５μｌ中のクロラミン− Ｔ　５０μｇを加えた。溶液を１５秒間撹拌後、上記実施例１で製造されたポリペプチド７００μｇの１０ｍＭ）リス　ｐＨ７，２緩衝液１００μｍ中溶液を加え、そしてヨウ素化混合物を周囲温度で５分間撹拌した。

反応を０℃まで冷却し、そして前記の分離用逆相分析高速液体クロマトグラフィーを施した。二つの主要画分を集めた。モノヨードＴｙｒ含有ポリペプチドは１３．５分に溶離さね、ＥＳ−ＭＳ分析によって４０２８．６Ｄａの質量が示された（４０２８．４６Ｄａが予想された）。アミノ酸分析は予想のペプチド組成と一致し、モノヨードＴｙｒ含有表題ポリペプチドの全収量は３３μｇであった。

ビスヨードＴｙｒ含有ポリペプチドは１４，０分に溶離され、ＥＳ−ＭＳによって４１５４．６Ｄａの質量が示された（４１５５．３６Ｄａが予想された）。アミノ酸分析は予想のペプチド内容と一致し、ビスヨードＴｙｒ含有表題ポリペプチドの全収量は６７μｇと示唆された。

ビス−Ｉ　Ｔｙｒであり、そしてＣｙｓ２およびＣｙｓ７間１％ＴＦＡ中０．２９μｇ／μｌ溶液に対して、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７，４を８（ｂｚ　１、ヨウ化ナトリウム（１１２５）０．４Ｔｕｇ　（５ｍＣｉ）を含む溶液１５μＬ１５ｍＭ過酸化水素１５μｌおよびラクトペルオキシダーゼ溶液３２μｌ　（１，７μｇ／μｍ）を加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌した。

次に、混合物を、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、５０ｍＭトリスｐＨ６，１中の１μ ｇ／μｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）２００μｌで希釈し、そして速やかにウォーターズμボンダバクＣ−１８，３，９ｘ３００ｍｍ高速液体クロマトグラフィーカラムに充填した。モノヨードおよびビスヨード標識ポリペプチド両方を、上記実施例２に記載のように集めた。２μｇ／μｌのＢＳＡ水中溶液のアリコート５μｌをそれぞれの画分に加えた。実施例２によって製造された、　１２４ヒス−■　Ｔｙｒ枳Ｊペプチドと、この実施例によるビス−１１５Ｔｙｒポリペプチドとの同時注入は、ビス−１１２４Ｔｙｒの紫外線検出および前記の分析高速液体知マドグラフィーによるビス−１１２５Ｔｙｒポリペプチドの放射線検出によって実証されたように、同一の保持時間であることを示した。

実施例４Ｒは配列番号＝４であり；ＸａａはＴｙｒであり、モしてＣｙｓ２および、５ミリモル規模で行なわれて、樹脂ポリペプチド２．５７ｇを与えた。樹脂の６００ｍｇ部分を前記のように脱保護して、粗製ポリペプチド１８０ｍｇを得た。粗製ポリペプチド７ｍｇの高速液体クロマトグラフィー精製は、ＰＤＭＳ分析によって質量が３９２２．５Ｄａ　（３９２２，２Ｄａが予想された）であることが示されたポリペプチド２．０ｍｇを与えた。ジスルフィド結合形成は、前記のように粗製ポリペプチド４０ｍｇ上で達成されて、透析および高速液体クロマトグラフィー精製後に表題ポリペプチド４．０ｍｇを得た。ＰＤＭＳ分析により、３９２１．２Ｄａの質量が得られた（３９２０．２Ｄａが予想された）。ＥＳ−ＭＳ分析により、３９１９．９Ｄａの質量が得られた（３９２０．２Ｄａが予想された）。アミノ酸分析は予想の組成を示した。

、　１２４ヒス−Ｉ　Ｔｙｒであり、そしてＣｙｓ　およびＣｙｓ７間て表題ポリペプチドを得た。モノヨードＴｙｒ含有ポリペプチドのＰＤＭＳ分析により、４０４６．８Ｄａの質量が得られた（４０４６．０８Ｄａが予想された）。ビスヨードＴｙｒ含有ポリペプチドのＰＤＭＳ分析により、４１７３．５Ｄａの質量が得られた（４１７１．９８Ｄａが予想された）。ポリペプチドのアミノ酸分析は予想のアミノ酸組成と一致した。

ビス−Ｉ　Ｔｙｒであり、そしてＣｙｓ　およびＣｙＳ７間て表題ポリペプチドを得た。

配列表（１）一般情報：（１）出願人：アンドルーズ・グレン（Ａｎｄｒｅｗｓ、Ｇｌｅｎｎ　Ｃ，）クロイタ−・デーピッド（Ｋｒｅｕｔｔｅｒ、ＤａｖｉｄＫ。

ファイザー・インコーホレーテッド（Ｐｆｉｚｅｒ　Ｉｎｃ。

）、非米国（ｉ　ｉ）発明の名称ニアミリン突然変異タンパク質（ｉｉｉ）配列の数：４（ｉｖ）宛先：（Ａ）住所：Ｐ、Ｃ，リチャードソン博士、ファイザー中インコーポレーテツド（Ｂ）地区：２３５イースト（Ｅａｓｔ）４２番街（Ｃ）車名：ニューヨーク（Ｄ）州名：ニューヨーク（Ｅ）国名：米国（Ｆ）郵便番号：１００１７−５７５５（ｖ）コンピューター読取り形式：（Ａ）中型：フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣ適合（Ｃ）操作システム：　ＰＣ−ＤＯ３／ＭＳ−ＤＯ３（Ｄ）ソフトウェア：パテントインリリース（ＰａｔｅｎｔｌｎＲｅｌｅａｓｅ）＃１．０、バージョン（Ｖｅｒｓｉｏｎ）＃１．２５（ｖｉ）現行出願資料：（Ａ）出願番号：（Ｂ）出願臼：（Ｃ）分類：（ｖｉｉ）先行出願資料：（Ａ、）出願番号：ＵＳ　０７／９２６，７８３ＣＢ）出願口：１９９２年８月６日（ｖｉｉｉ）弁理士／代理人情報：（Ａ）氏名：ベンソン・ブレツブ（Ｂｅｎｓｏｎ、Ｇｒｅｇｇ）　Ｃ。

（Ｂ）登録番号：３０，９９７（Ｃ）照会／事件整理番号：　ＰＣ８１５７ＡＧＣＢ（ｉｘ）通信情報：（Ａ）電話：　（２０３）４４１−４９０１（Ｂ）ファクシミリ：　（２０３）４４１−５２２１（２）配列番号＝１の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：３７アミノ酸（Ｂ）種類二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉ　ｉ）分子種類：ペプチド（ｘｉ）配列種類：配列番号：ＩＬｙｓ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕｌ　５　１０　１５Ｖａｌ　ｔｌｉｓ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　ＶａP Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ（２）配列番号：２の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ＝３７アミノ酸（Ｂ）種類二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉ　ｉ）分子種類：ペプチド（ｘｉ）配列種類：配列番号＝２Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕｌ　５　１０　１５Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｖａ１Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ（２）配列番号：３の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ＝３７アミノ酸（Ｂ）種類二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉ　ｉ）分子種類：ペプチド（ｉｘ）特色：（Ａ）名称／キー：修飾部位（Ｂ）位置＝１−５（Ｄ）その他の情報・／注記＝　ｒＰｈｅ、Ｔｙｒ、−ヨウ素化Ｔｙｒまたはニヨウ素化ＴｙｒＪ（ｘｉ）配列種類：配列番号＝３Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｘａａ　Ｌｅｕｌ　５　１０　１５Ｖａｔ　ｔｌｉｓ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　ＶａP Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ（２）配列番号＝４の情報：（１）配列の特徴。

（Ａ）長さ：３７アミノ酸（Ｂ）種類二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉ］）分子種類：ペプチド（ｉｘ）特色：（Ａ）名称／キー：修飾部位（Ｂ）位置：１５（Ｄ）その他の情報：／注記＝　ｒＰｈｅ、Ｔｙｒ、−ヨウ素化Ｔｙｒまたはニヨウ素化Ｔｙ　ｒＪ（ｘｉ）配列種類：配列番号＝４Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｘａａ　Ｌｅｕｌ　５　１０　１５Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｖａ１Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成　７年　２月　６日１、特許出願の表示ＰＣＴ／ＵＳ９３１０４３１４２、発明の名称アミリン突然変異タンパク質３、特許出願人住　所　アメリカ合衆国ニューヨーク州１００１７．ニューヨーク。

イースト・フォーティセカンド・ストリート　２３５名　称　ファイザー・インコーホレーテッド４、代理人住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区５、補正書の提出日このようなプロトコルは、ヒドロキシヘンシトリアゾール活性エステルカップリングおよびそれぞれのカップリング後の未反応遊離アミノ末端の無水酢酸キャッピングを用いる。樹脂試料は、それぞれのカップリングの最後に自動的に除去され、そして定量的二／ヒドリン検定を用いてカップリング効率を監視する。

３７位のＴｙｒ残基が−またはニヨウ素化されたアミリンは、インスリン作用を抑制しないということが分かった。更に、式（式中、Ｗは、配列番号＝１である）を有するアミリンのホルトン・ハンター（Ｂｏ　Ｉ　ｔ　ｏｎ−Ｈｕｎ　ｔ　ｅ　ｒ）誘導体はインスリン作用を抑制しないということも分かった。これに対して、本発明のポリペプチドは、配列番号　１および配列番号、２ををする突然変異タンパク質であり、インスリン作用を抑制し、そして特に、アミリン作用およびその拮抗薬の研究のための各種検定において有用であるポリペプチドのヨウ素化された形を提供する。

アミリンによって引き起こされた筋肉または筋肉細胞におけるイノスリン作用の抑制を阻害する化合物の能力についての本発明による方法を、以下に記載のように実施する。該方法は、インスリン、本発明によるポリペプチドまたはその誘導体、検定される化合物およびグルコースの存在下で筋肉または筋肉細胞をインキュベートし、インキュベートされた筋肉または筋肉細胞によって生産されたグリコーゲンの量を測定し、そしてそのように測定された量を、筋肉または筋肉細胞がインスリン、ポリペプチドまたはその誘導体およびグルコースの存在下でインキュベートされた場合に生産されたグリコーゲンの量に対して比較することを含む。

上記の方法において、インキュベートされた筋肉または筋肉細胞によって生産されたグリコーゲンの量は、以下のように測定することができる。秤量された筋肉または筋肉細胞を、沸騰水浴中で２０〜３０分間加熱することによって３０％ＫＯＨ３ｍｌ中に溶解させる。冷却後、グリコーゲンを９５％エタノール１゜２容量で沈殿させる。次に、試料を加熱して沸騰させ、そして冷却後、３０００ｒｐｍで遠心分離してグリコーゲンをペレットにする。ペレットを水中に再溶解させ且つエタノールで再沈殿させる。次に、０．６Ｎ　ＭＣＩ　６ｍｌを加え、試験管をガラスマーブルで覆い、そして沸騰水浴中で約２〜２．５時間加熱することによってグリコーゲンを加水分解する。

手続補正書１、事件の表示ＰＣＴ／ＵＳ９３１０４３１４２、発明の名称アミリン突然変異タンパク質３、補正をする者事件との関係　特許出願人名　称　ファイザー・インコーホレーテッド４、代理人住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区電話３２７０−６６４１〜６請求の範囲を次のように訂正する。

「１　−次配列Ｈ２Ｎ　Ｒ−ＣＯＮ　Ｈ□ ［式中、Ｒは、Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ＾ｌａ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　ＧｉｎＡｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｘａａ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　１ｌｉｓ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ＾ｓｎ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ＾ｌａ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　ＴｈｒＡｓｎ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　（配列番号　３）およびＬｙｓ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　ＧｉｎＡｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｘａａ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　５ｅｒＡｓｎ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　ＶａＬ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　ＴｈｒＡｓｎ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　（配列番号・４）（但し、Ｘａａは、ＰｈｅＳＴｙｒ、−ヨウ素化Ｔｙｒまたはニヨウ素化Ｔｙｒである）から成る群より選択されるアミノ酸配列である］を含む、インスリン作用抑制活性を有するポリペプチドまたはその誘導体並びにその薬学的に許容しうる塩。

２　Ｒが、Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ＾ｌａ　Ｔｈｒ　ＧｉｎＡｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｘａａ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ八ｓへ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　ＴｈｒＡｓｎ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　八ｓｎ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　（配列番号：３）である請求項１に記載のポリペプチドまたはその薬学的に許容しうる塩。

３、　ＣｙｓｚおよびＣｙ　ｓ　７間に７スルフイド結合が存在している請求項２に記載のポリペプチド。

４、　ＸａａがＰｈｅである請求項３に記載のポリペプチドまたはその薬学的に許容しうる塩。

５、　ＸａａがＴｙｒである請求項３に記載のポリペプチドまたはその薬学的に許容しうる塩。

５、　Ｘａａが−ヨウ素化Ｔｙｒである請求項３に記載のポリペプチドまたはその薬学的に許容しうる塩。

７　−ヨウ素化Ｔｙｒがモノ−１１２５Ｔｙｒである請求項６に記載のポリペプチドまたはその薬学的に許容しうる塩。

３、Ｘａａがニヨウ素化Ｔｙｒである請求項３に記載のポリペプチドまたはその薬学的に許容しうる塩。

９、　ニヨウ素化Ｔｙｒがビス−１１２５Ｔｙ　ｒである請求項８に記載のポリペプチドまたはその薬学的に許容しつる塩。

１０、　請求項１に記載のポリペプチドおよび薬学的に許容しうる希釈剤または１１、筋肉または筋肉細胞におけるインスリン作用を抑制する方法であって、インスリン作用抑制量の請求項１に記載のポリペプチド存在下において上記筋肉または筋肉細胞をインキュベートすることを含む上記方法。

１２、ポリペプチドが、Ｘａａが−ヨウ素化Ｔｙｒおよびニヨウ素化Ｔｙｒであるポリペプチドから成る群より選択される請求項１１に記載のインスリン作用を抑制する方法。

１３、インスリン作用抑制量の請求項７に記載のポリペプチド存在下において筋肉または筋肉細胞をインキュベートすることを含む、筋肉または筋肉細胞においてインスリン作用を抑制する方法。

１４、請求項９に記載のポリペプチドのインスリン作用抑制の存在下において筋肉または筋肉細胞をインキュベートすることを含む、筋肉または筋肉細胞においてインスリン作用を抑制する方法。

１５、筋肉がラットヒラメ筋である請求項１１に記載の筋肉または筋肉細胞においてインスリン作用を抑制する方法。

１６、筋肉がラットヒラメ筋である請求項１３に記載の筋肉または筋肉細胞においてインスリン作用を抑制する方法。

１７、筋肉がラットヒラメ筋である請求項１４に記載の筋肉または筋肉細胞においてインスリン作用を抑制する方法。

１８．　アミリンによって引き起こされた筋肉または筋肉細胞におけるインスリン作用の抑制を阻害する化合物の能力を検定する方法であって、（ａ）インスリン、請求項１に記載のポリペプチドまたはその誘導体、該化合物およびグルコースの存在下で筋肉または筋肉細胞をインキュベートし；（ｂ）工程（ａ）のインキュベートされた筋肉または筋肉細胞によって生産されたグリコーゲンの量を測定し、そして（Ｃ）工程（ｂ）で測定された量を、筋肉または筋肉細胞がインスリン、ポリペプチドまたはその誘導体およびグルコースの存在下でインキュベートされた場合の工程（ｂ）によって測定された蚤に対して比較することを含む上記方法。

１９　放射性標識グルコースを用い且つ放射性標識グリコーゲンを測定する請求項１８に記載の方法。

２０　ポリペプチドが、Ｘａａが−ヨウ素化Ｔｙｒおよびニヨウ素化Ｔｙｒであるポリペプチドから成る群より選択される請求項１９に記載の方法。

２１　−ヨウ素化Ｔｙｒがモノ−１１２５Ｔｙ　１であり、ニヨウ素化Ｔｙｒがビス−１１２５７ｙｒであり、そして放射性グルコースが１　＋４０グルコースである請求項２０に記載の方法。

２２　ポリペプチドが、アミノ酸配列Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ＾ｌａ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ＾ｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｘａａ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　１ｌｉｓ　Ｓｅｒ　５ｅｒＡｓｎ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ＾ｌａ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　ＴｈｒＡｓｎ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　（配列番号・３）を含む請求項２１に記載の方法。

２３　筋肉がラットヒラメ筋である請求項１８に記載の方法。

２４　筋肉がラットヒラメ筋である請求項２２に記載の方法。

２５　インスリンが約ＩＱ−１ＯＮｉ〜約１０−７Ｍで存在する請求項２３に記載の方法。

２６　インスリンが約ＩＱ−１０１ｖ）〜約１０−’Ｍで存在する請求項２４に記載の方法。

２７、ポリペプチドが約１０−８Ｍ〜約１０−’Ｍで存在する請求項２６に記載の方法。

２８、筋肉または筋肉細胞を、工程（ａ）の前にインスリン、ポリペプチドまたはその誘導体、化合物およびグルコースの存在下でブレインキュベートする請求項１９に記載の方法。

２９、　インスリン作用の抑制を必要とする人間以外の哺乳動物においてインスリン作用を抑制する方法であって、該哺乳動物に対して有効量の請求項１に記載のポリペプチドまたはその誘導体を投与することを含む上記方法。

３０、インスリン作用の抑制を必要とする人間以外の哺乳動物においてインスリン作用を抑制する方法であって、該哺乳動物に対して有効量の請求項３に記載のポリペプチドまたはその誘導体を投与することを含む上記方法。」以上国際調査報告　。、Ｔ／１１゜。ｊ７．、Ａ’ｒ＋Ａ

Claims

【特許請求の範囲】

１．一次配列Ｈ２Ｎ−Ｒ−ＣＯＮＨ２［式中、Ｒは、【配列があります】および【配列があります】（但し、Ｘａａは、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、−ヨウ素化Ｔｙｒまたはニヨウ素化Ｔｙｒである）から成る群より選択されるアミノ酸配列である］を含む、インスリン作用抑制活性を有するポリペプチドまたはその誘導体並びにその薬学的に許容しうる塩。
２．Ｒが、【配列があります】である請求項１に記載のポリペプチドまたはその薬学的に許容しうる塩。
３．Ｃｙｓ２およびＣｙｓ７間にジスルフィド結合が存在している請求項２に記載のポリペプチド。
４．ＸａａがＰｈｅである請求項３に記載のポリペプチドまたはその薬学的に許容しうる塩。
５．ＸａａがＴｙｒである請求項３に記載のポリペプチドまたはその薬学的に許容しうる塩。
６．Ｘａａが一ヨウ素化Ｔｙｒである請求項３に記載のポリペプチドまたはその薬学的に許容しうる塩。
７．−ヨウ素化Ｔｙｒがモノ−Ｉ１２５Ｔｙｒである請求項６に記載のポリペプチドまたはその薬学的に許容しうる塩。
８．Ｘａａがニヨウ素化Ｔｙｒである請求項３に記載のポリペプチドまたはその薬学的に許容しうる塩。
９．ニヨウ素化Ｔｙｒがビス−Ｉ１２５Ｔｙｒである請求項８に記載のポリペプチドまたはその薬学的に許容しうる塩。
１０．請求項１に記載のポリペプチドおよび薬学的に許容しうる希釈剤または担体を含む薬剤組成物。
１１．筋肉または筋肉細胞におけるインスリン作用を抑制する方法であって、インスリン作用抑制量の請求項１に記載のポリペプチド存在下において筋肉または筋肉細胞をインキュベートすることを含む上記方法。
１２．ポリペプチドが、Ｘａａがーヨウ素化Ｔｙｒおよびニヨウ素化Ｔｙｒであるポリペプチドから成る群より選択される請求項１１に記載のインスリン作用を抑制する方法。
１３．インスリン作用抑制量の請求項７に記載のポリペプチド存在下において筋肉または筋肉細胞をインキュベートすることを含む、筋肉または筋肉細胞においてインスリン作用を抑制する方法。
１４．請求項９に記載のポリペプチドのインスリン作用抑制の存在下において筋肉または筋肉細胞をインキュベートすることを含む、筋肉または筋肉細胞においてインスリン作用を抑制する方法。
１５．筋肉がラットヒラメ筋である請求項１１に記載の筋肉または筋肉細胞においてインスリン作用を抑制する方法。
１６．筋肉がラットヒラメ筋である請求項１３に記載の筋肉または筋肉細胞においてインスリン作用を抑制する方法。
１７．筋肉がラットヒラメ筋である請求項１４に記載の筋肉または筋肉細胞においてインスリン作用を抑制する方法。
１８．アミリンによって引き起こされた筋肉または筋肉細胞におけるインスリン作用の抑制を阻害する化合物の能力を検定する方法であって、（ａ）インスリン、請求項１に記載のポリペプチドまたはその誘導体、該化合物およびグルコースの存在下で筋肉または筋肉細胞をインキュベートし；（ｂ）工程（ａ）のインキュベートされた筋肉または筋肉細胞によって生産されたグリコーゲンの量を測定し；そして（ｃ）工程（ｂ）で測定された量を、筋肉または筋肉細胞がインスリン、ポリペプチドまたはその誘導体およびグルコースの存在下でインキュベートされた場合の工程（ｂ）によって測定された量に対して比較することを含む上記方法。
１９．放射性標識グルコースを用い且つ放射性標識グリコーゲンを測定する請求項１８に記載の方法。
２０．ポリペプチドが、Ｘａａが−ヨウ素化Ｔｙｒおよびニヨウ素化Ｔｙｒであるポリペプチドから成る群より選択される請求項１９に記載の方法。
２１．−ヨウ素化Ｔｙｒがモノ−Ｉ１２５Ｔｙｒであり、ニヨウ素化Ｔｙｒがビス−Ｉ１２５Ｔｙｒであり、そして放射性グルコースが１−１４Ｃグルコースである請求項２０に記載の方法。
２２．ポリペプチドが、アミノ酸配列【配列があります】を含む請求項２１に記載の方法。
２３．筋肉がラットヒラメ筋である請求項１８に記載の方法。
２４．筋肉がラットヒラメ筋である請求項２２に記載の方法。
２５．インスリンが約１０−１０Ｍ〜約１０−７Ｍで存在する請求項２３に記載の方法。
２６．インスリンが約１０−１０Ｍ〜約１０−７Ｍで存在する請求項２４に記載の方法。
２７．ポリペプチドが約１０−８Ｍ〜約１０−７Ｍで存在する請求項２６に記載の方法。
２８．筋肉または筋肉細胞を、工程（ａ）の前にインスリン、ポリペプチドまたはその誘導体、化合物およびグルコースの存在下でプレインキュベートする請求項１９に記載の方法。
２９．インスリン作用の抑制を必要とする哺乳動物においてインスリン作用を抑制する方法であって、該哺乳動物に対して有効量の請求項１に記載のポリペプチドまたはその誘導体を投与することを含む上記方法。
３０．インスリン作用の抑制を必要とする哺乳動物においてインスリン作用を抑制する方法であって、該哺乳動物に対して有効量の請求項３に記載のポリペプチドまたはその誘導体を投与することを含む上記方法。