JPH07506113A - 前立腺癌，胃癌および乳癌に関連する腫瘍を抑制するための医薬製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 前立腺癌、胃癌および乳癌に関連する腫瘍を抑制するための医薬製剤 発明の分野 本発明は、前立腺癌、胃癌、乳癌（ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ）および良性前 立腺過形成に起因する腫瘍に対する腫瘍抑制剤として使用するための医薬製剤に 関する。

発明の背景 前立腺は雄の哺乳動物だけに見られるものであり、精液、血液および数種の調節 ペプチドのいくつかの成分を産生ずる。前立腺は、支質および上皮細胞を含み、 後者の群は円柱分泌細胞および基底非分泌細胞から成る。これらの基底細胞およ び支質細胞の増殖は、よくある前立腺疾患のひとつである良性前立腺過形成（Ｂ ＰＨ）をひき起こす。もうひとつのよくある前立腺疾患は前立腺癌（Ｃａ　Ｐ） であり、これは致死的な病態生理学的な前立の腺癌の中で最もよくあるもので、 前立腺の抹消領域の上皮細胞の悪性変換を生じるものである。前立腺癌および良 性前立腺過形成は、老齢ヒト男性人口において高い発生率を有する２つのよくあ る前立腺疾患である。５５歳以上の男性の４人に約１人がなんらかの前立腺疾患 にかかっている。前立腺癌は、男性老人の死に係わる癌を引き起こす原因の第二 番目であり、米国において、年間約９６．０００人か前立腺癌と診断され、約２ ６．０００人が死亡していると報告されている。

種々の前立腺疾患の病因を理解するために、正常、良性および癌性前立腺により 合成され、分泌される種々の物質の研究が行われているが、それらの研究により 、これらの物質のうちある種のものは、前立腺疾患の診断において、免疫組織化 学的腫瘍マーカーとして使用しうろことが明らかとなった。正常な前立腺により 分泌される３つのおもなタンパク質またはペプチドは、前立腺酸性ホスファター ゼ（ＰＡＰ）　、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）および前立腺インヒビンペプチド （これは、Ｐ　Ｉ　Ｐ、インヒビンおよびＰｒｏｐｅｐを含むいくつかの略語で 知られている。）である。以下、Ｐｒｏｐｅｐという用語を用いてこの物質を称 することとする。

代謝的および免疫組織化学的研究により、前立腺がＰｒｏｐｅｐの主要な供給源 であることが示された。Ｐｒｏｐｅｐは、成熟雄ラットにおいて１ｎ−ｖｉｔｒ ｏでも１ｎ−ｖｉｖｏでも循環する卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）のフィードバッ ク制御に関与し、前記ホルモンの分泌を抑制する働きをする。ｐｒｏｐｅｐは下 垂体部位および前立腺部位の両方で働くが、それは両部位にｐｒｏｐｅｐに対す る受容体サイトが存在するからである。

ＰＳＡとＰＡＰの両方とも前立腺疾患の検出における腫瘍マーカーとして研究さ れてきたが、両物質とも良性の前立腺過形成を有する前立腺においてレベルの上 昇を示すので、どちらのマーカーも特異的なものではなく、それ故、その有用性 が限られている。

最近では、Ｂ　Ｐ　ＨまたはＣａＰの患者の血清中のＰｒｏｐｅｐ濃度は正常人 より有意に高いことが示されている。正常男性に観察されるｐｒｏｐｅｐの最も 高い血清濃度は約４０　ｎｇ／ｍｌであるが、Ｂ　Ｐ　ＨまたはＣａＰのいずれ かの男性においてはＰｒｏｐｅＩ）の血清濃度は３００−４０Ｏｎｇ／ｍｌの範 囲にあることが観察されている。正常な前立腺を有する被験者とＢＰＨまたはＣ ａＰのいずれかを示す患者におけるＰｒｏｐｅｐの濃度はいくらかのオーバーラ ツプがあることから、それら自体の血清レベルはあまり重要ではない。

前立腺癌の治療におけるおもな療法はアンドロゲン切除である。

多くの患者は初期的にはこの治療に応答するが、その有効性は時間経過とともに 減少する。その第１の理由は、おそらく、異種集団のアンドロゲン依存性および アンドロゲン非依存性細胞が存在するためであろう。そのようなシナリオにおい て、アンドロゲン感受性細胞はアンドロゲン処理に応答するが、存在するアンド ロゲン不感受性細胞は減少することなく増殖し続けるであろう。

現在のところ重い器具を必要とする他の形態の癌は、女性の乳癌および胃腸管の 癌である。現在、マイトマイシン、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、シ スプラチン、５−フルオロウラシル、メトトレキセート、アドリアマイシンおよ びトノマイシン（ｄｏｎｏｍｙｃｉｎ）のような種々の制癌剤の使用は、そのよ うな癌の治療のための療法の一部である。そのような治療の欠点は、効果的な治 療に必要な濃度範囲において薬物による有害な副作用が存在することである。

従って、アンドロゲン感受性およびアンドロゲン非感受性細胞の両方に対して効 果的に使用できるような、前立腺、乳および胃腸癌細胞の増殖を抑えるより効果 的な手段を見いだすことは有益なことである。

発明の概要 本発明は、ある見地において、前立腺インヒビンペプチドおよび前立腺インヒビ ンペプチドの類似体から成る群より選択されたペプチドを前もって決定した濃度 範囲で含む医薬製剤を提供するものである。

本発明のもうひとつの見地においては、前立腺インヒビンペプチドおよび前立腺 インヒビンペプチドの合成類似体を含む群より選択されたペプチドを前もって決 定した濃度範囲で含む、１ｎ−ｖｉｖＯて種々の癌性腫瘍の増殖を抑制するため の医薬製剤が提供される。本発明のこの見地において、医薬製剤は、前立腺にお ける癌性腫瘍の増殖に向けられるもので、医薬的に許容できる担体を含み、該製 剤において、前立腺インヒビンベブチドの濃度は、病的な前立腺において観察さ れる前立腺インヒビンペプチドの濃度より一般に高い。

本発明の同様の見地において、医薬製剤は、癌性腫瘍の増殖を抑制することに向 けられるもので、さらに制癌剤、例えば、マイトマイシン、イダルビシン、シス プラチン、５−フルオロウラシル、メトトレキセート、アドリアマイシンおよび トノマイシンを含む制癌剤の群より選択された薬物を含んでもよい。

本発明のもうひとつの見地において、適当な医薬投与形態にある前立腺インヒビ ンペプチドおよび前立腺インヒビンペプチドの合成類似体を含む群より選択され たペプチドを含む、１ｎ−ｖｉｖｏで前立腺癌腫瘍の増殖を抑制するための医薬 製剤が提供される。

本発明のさらにもうひとつの見地において、種々の癌の患者を治療するだめの医 学的処理方法であって、前立腺インヒビンペプチドおよび前立腺インヒビンペプ チドの合成類似体を含む群より選択されたペプチドを前もって決定した濃度範囲 で含む医薬製剤を適当な医薬投与形態で投与することを含む前記方法が提供され る。本発明のこの見地においては、前記の方法は好ましくは前立腺癌の治療に向 けられる。前記方法が胃腸管の癌の治療に向けられる場合には、医薬製剤はさら に任意に制癌剤を含んでもよく、該制癌剤は、マイトマイシン、イダルビシン、 シスプラチン、５−フルオロウラシル、メトトレキセート、アドリアマイシンお よびトノマイシンを含む制癌剤の群より選択され、その混合物は適当な医薬投与 形態にある。

表のリスト 表１は、無傷の成熟雄ラットにおける、ＦＳＨおよびＬＨの血清レベル（ｎｇ／ ｍｌ　−’　）に対するＰｒｏｐｅｐ投与の効果を示すデータをまとめたもので ある。

表１１は、細胞増殖に対するＰｒｏｐｅｐの効果を示すデータをまとめたもので ある。

表ＩＩ＋は、精巣および前立腺の重量（ダラム）に対するＰｒｏｐｅｐの効果を 示すデータをまとめたものである。

表ＩＶは、Ｐｒｏｐｅｐ投与レベルおよびその後の腫瘍生存率に関する１ｎ−ｖ ｉｖｏデータをまとめたものである。そして、表■は、２つの異なるレベルのＰ ｒｏｐｅｐによる処理後１４日目にラットにおいて測定された種々のホルモンレ ベルに関するデータをまとめたものである。

図面の簡単な説明 添付の図面を参照して、本発明について記載する。なお、図１は、ヒトＰｒｏｐ ｅｐの完全な配列を示す。

図２は、ゲル透過カラム（ＬＫＢ−ＴＳＫ　Ｇ　３０００　ＳＷ７．５ｘ６００ 　ｍｍ）上のＰｒｏｐｅｐのＨＰＬＣプロフィールを表すものであり、この物質 は主要ピークとして溶離されている。

図３は、Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ　ＲＰ−１８のカラム（５μ＋ｎ；　０．４ｘ２ ５　ｃｍ、溶離剤、Ａｏ、１％（ｗ／ｖ）　ＴＦＡ水溶液、Ｂｏ、１％ＴＦＡ水 溶液中の５０％Ｃ！（３ＣＮ；流速１　ｍ１７分、１ｎｓｅｔ：精製Ｐｒｏｐｅ ｐのＳＤＳゲル電気泳動パターン（Ｌａｅｍｍｌｉ、　１９７０の方法））上の 精製Ｐｒｏｐｅｐの逆相ＨＰＬＣを表すものである。

図４〜９は、以下に記載する１ｎ−ｖｉｔｒｏ細胞および１ｎ−ｖｉｖｏ癌性腫 瘍に対するｐｒｏｐｅｐの効果の種々の検討をまとめているプロットを示す。

図１０は、１ｎ−ｖｉけ０での前立腺癌細胞の増殖およびＰｒｏｐｅｐによるそ の抑制に対するＦＳＩＩの効果の検討をまとめたものである。

図１１および１２は、本発明の医薬組成物において有用性を有する、枠で囲って 示した種々の断片を有するヒ）−Ｐｒｏｐｅｐの完全なヒト配列を表すものであ る。

図１３は、表ＩＶのデータを棒グラフの形でまとめたものである。

図１４〜２０は、１ｎ−ｖｉｔｒｏ胃癌細胞に対する、ｐｒｏｐｅｐ、種々の制 癌剤およびＰｒｏｐｅｐとこれらの種々の制癌剤との組合せの効果の検討をまと めたものである。

発明の説明 前立腺癌に関連した病態生理学的状態下における高レベルのＰｒｏｐｅｐは、い つでも明らかに効果的であるとは限らないものの、前立腺により開始されうる防 御機構の一形態として働く可能性があると、本発明者らは考えた。種々の１ｎ− ｖｉｖｏおよび１ｎ−ｖｉｔｒｏ実験検討を行い、以下にまとめて、前立腺癌の 増殖を抑制するための腫瘍抑制剤としての、病的な前立腺により分泌される濃度 より高い濃度のＰｒｏｐｅｐの効果を測定した。また、いくつかの検討を行って 、Ｐｒｏｐｅｐの合成類似体、特に、１０．１７および２８個のアミノ酸基を有 する断片の腫瘍抑制剤としての効果を測定した。これらの合成類似体は、黄体形 成ホルモン（Ｌｌｌ）のレベルを変えることなく、循環ＦＳＨレベルを優先的に 抑制するという、ｐｒｏｐｅｐの作用に非常によく似た作用を呈することが示さ れた。

図１０の棒グラフは、１ｎ−ｖｉｔｒｏでの前立腺癌細胞の増殖およびｐｒｏｐ ｅＩ）によるその抑制に対する、ＦＳＨの効果の検討をまとめたものである。こ の腫瘍細胞は、組織培養で、０．５Ｘ血清とともに、Ｐ「ｏｐｅｐに４８時間晒 された。

ｐｒｏｐｅｐの製造 図１を参照すると、ｐｒｏｐｅｐは少なくとも９４個のアミノ酸残基を含む単純 非グリコジル化タンパク質である。天然のＰｒｏｐｅｐは、１０．５ｋｄおよび １６　ｋｄの２つの形態で存在することが知られている。Ｐｒｏｐｅｐの遺伝子 は、ヒト前立腺から、組換えＤＮＡ技術を用いてクローニングされている。

Ｐｒｏｐｅｐ抗原は、改良された（Ｔｈａｋｕｒ　ｅｔ　ａｌ、　ａｎｄ　５ｈ ｅｔｈ　ｅｔ　ａｌ。

（１９８４）　インヒビン（ＦＳＨ分泌の抑制）様活性を有するヒト精漿由来の ポリペプチドのキャラクタリゼーション、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ。

１６５、１１．−１５．）、Ｔｈａｋｕｒらの基本的手法に従って精製された（ Ｔｈａｋｕｒｅｔ　ａｌ、　（１９８１）ヒト精漿由来のインヒビンの単離およ び精製、　Ｉｎｄｉａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｂｉ ｏｌｏｇｙ、　１９．３０７−３１３）。精子不含のヒト精漿をアルコール（１ ：４　ｖｏｌ／ｖｏｌ）で沈殿させ、その後、０゜０５　Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ４， ０で抽出した。可溶性タンパク質を、クロマトグラフィーにより５ｅｐｈａｄｅ ｘ　Ｇ−１００カラム（３，５ｘ１００　ｃｍ）にて、平衡化および溶離のため に０．０１Ｍ酢酸緩衝液を使用して分離した。

ＦＳＨ抑制活性を有する両分につき、ＤＥＡＥセルロース（３ｘ３０　ｃｍ）上 でイオン交換クロマトグラフィーを行った。このカラムを最初に０．０５　Ｔｒ ｉｓ緩衝液ｐｌ（８，０で洗浄した。結合物質を同じ緩衝液中でＮａＣｌ勾配（ ０−０，５Ｍ）を用いて溶離した。続いて、ゲル透過カラム（ＬＫＢ−ＴＳＫ　 Ｇ−３００ＯＳ、Ｗ、、　７．５　ｘ　６００　ｍｍ）および平衡化と溶離のた めの０．ＯＩＭ酢酸緩衝液ｐ１１４を使用して、高圧液体クロマトグラフィー（ ＩＩＰＬｃ）により、回収した活性物質を精製した（図２を参照）。

このＨＰＬＣ精製物質は、ｐｔ＋ｓ、３ての５ＤＳ−ゲル電気泳動て単一のバン ドを示した（図３の挿入を参照）。逆相ＨＰＬＣでは、この精製物質は単一で均 一なピークとして溶離された（図３を参照）。

無傷の成熟雄ラットを用いて、精製の各段階で得られた画分の生理活性をアッセ イした。このアッセイは、循環ＦＳＨレベルの抑制に基つくものである。ＨＰ　 Ｌ　Ｃ精製Ｐｒｏｐｅｐを連続して３日間成熟雄ラットに投与すると、循環ＦＳ Ｈレベルの特異的な抑制が生じた（表Ｉを参照）。ＬＨレベルの有意な変化は観 察されなかった。

デカペプチドＰｒｏｐｅｐ類似体の合成本明細書中に開示されている主題発明の 一部を構成するＰｒｏｐｅｐのデカペプチド類似体は、ｐｒｏｐｅｐ配列のカル ボキシ末端の８５−９４アミノ酸残基の合成類似体である。このデカペプチドは 、Ｐｒｏｐｅｐの８５の位置のりシン残基がチロシン残基に置換され、８７の位 置のシスティン残基がアセトミドメチル（ａｃｅｔｏｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）基 で保護されている点で、Ｐｒｏｐｅｐと異なる。この合成デカペプチドおよび他 の断片を自動ペプチド合成機で製造した。

ＩＮ−ＶＩＴＰＯおよびＩＮ−ＶＩＶＯ検討ＣａＰの研究用の卓越した動物モデ ルであるラットＤｕｎｎｉｎｇ　Ｒ−３３２７−Ｇ腫瘍を用いて、検討を行った 。このＤｕｎｎｉｎｇ腫瘍は、コペンハーケンＸフィッシャー３４４ラットにお ける１ｎ−ｖｉｖｏでもセルラインのような１ｎ−ｖｉｔｒｏても維持てきる、 増殖が速く、分化しにくく、移植可能な腫瘍である。

実験１ ＩＮ−ＶＩＴＰＯ細胞に対するＰｒｏｐｅｐの効果コペンハーケンｘ３４４雄キ ャリアーラットにおいて２０および２８代の１ｎ−ｖｉｖｏ継代に解離した細胞 由来のＤｕｎｎｉｎｇ腫瘍Ｒ−３３２７−Ｇラインをこの１ｎ−ｖｉｔｒｏ検討 用に用いた。腫瘍を切除し、単一の細胞に解離させ、Ｔ−２５培養フラスコ（Ｃ ｏｒｎｉｎｇ　Ｎ、Ｙ）中で培養した。

解離した腫瘍細胞をトリプシン処理（３７℃にて３分間、０．２５Ｘ　ｌ−リプ シンおよび０．０２％ＥＤＴＡ）により培養フラスコから除去し、２ｍＭ　Ｌ− グルタミン酸、２０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ、　Ｈｙｃｌｏｎｅ　Ｌａｂｓ、、 　Ｌｏｇａｎ、　Ｖ、Ｔ、）および抗生物質（完全培地＝ＣＭ）を補充したアル フｙ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯＬａｂｓ、　Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、　Ｎ、Ｙ、 ）にて継代培養した。培養物を５日毎に継代培養した。

コロニーアッセイのために、２〜１０１ｎ−ｖｉｔｒｏ継代のＲ−３３２７−Ｇ 細胞をトリプシン処理し、単一細胞懸濁液に分散させ、３５　ｍｍ＋組織培養皿 にて、２　ｍｌ　ＣＭＭｏ２５〜１．Ｏｘ　１０’個の生育可能な細胞で培養し た。ｐｒＯｐｅｐをＣＭにて種々の濃度で希釈し、濾過し、滅菌し、次いで適当 な濃度で培養皿に添加した。これらの培養皿を加湿したインキュベーター中、３ ７℃、５Ｘ　ＣＯＲ下で、７日間インキュベートした。これに続いて、培養皿を あけ、冷リン酸緩衝生理食塩水ＣＰＢＳ）溶液中で２回洗浄し、次いで無水メタ ノール中で５分間固定した。その後、培養皿を酸性化ハリスへマドキシリンで染 色し、コロニーの数をマニュアルで計測した。

約２０％〜３０％のプレートされたＲ−３３２７−Ｇ細胞は７日以内に特徴的な 拡散したコロニーを形成した。典型的には、コロニーは１０２゜３±１３．７個 の細胞から成っていた。種々の濃度のｐｒｏｐｅｐの添加により、コロニー数お よびコロニーサイズの両方の投与量依存性の抑制が観察された。１００　ｎｇ／ ｍ１以上の濃度で、コロニー抑制は有意となり、ｌμｇ／ｍｌのＰｒｏｐｅｐ濃 度で５０％の減少となった。Ｐｒｏｐｅｐ濃度を増加させると、小さな細胞クラ スターが生じた（５０個の細胞−図４）。培養の４日目に培養培地にＰｒｏｐｅ ｐを補充すると、一度にＰｒｏｐｅｐを添加するより、コロニー増殖はより効果 的に一貫して抑制された。

実験２ ＩＮ−ＶＩＴＲＯ細胞に対するデカペプチドおよび他の断片の効果図１１の枠に 示す合成デカペプチドはＰｒｏｐｅｐの生物学的作田に類似した作用を示したの で、Ｒ−３３２７〜Ｇ細胞に対するその効果を検討した。図５を参照すると、ｐ ｒｏｐｅｐのデカペプチド合成類似体は１ｎ−ｖｉｔｒｏのＲ−３３２７−Ｇ細 胞培養物に対して類似の抑制作用を有している。詳細には、５０　ｎｇ／ｍｌの デカペプチドで５０％のコロニー数の抑制が観察され、それは、１μｇ／ｍｌで 最大の７０％の抑制につながった。しかしながら、今度は図４を参照すると、等 モル濃度の天然のＰｒｏｐｅｐは、デカペプチドと比較して、より大きな抑制効 果を有していることがわかった。１７個および１８個のアミノ酸基を有する他の 合成断片（図１２を参照）は、前立腺腫瘍増殖を抑制する類似の効果を示したが 、データは示していない。

実験３ Ｒ−３３２７−Ｇ腫瘍はアンドロゲン感受性およびアンドロゲン非感受性細胞の 両方を含んでいる。これらの２種の細胞集団に対するＰ「ｏｐｅｐの効果を１ｎ −ｖｉｔｒｏで検討した。細胞を２０代の１ｎ−ｖｉｖｏ継代においてＲ−３３ ２７−Ｇ腫瘍から解離し、ステロイドの存在下および不存在下で培養した。比較 のために、大部分がアンドロゲン非感受性であることが知られている２８代１ｎ −ｖｉｖｏ継代からの細胞を同様の方法で培養した。

１ｎ−ｖｉｖｏの細胞に対する種々の濃度のＰｒｏｐｅｐの効果の結果を図６に まとめる。Ｐｒｏｐｅｐの効果は、すべての試験条件下で、アンドロゲン感受性 およびアンドロゲン非感受性細胞の両方に対して類似したものであった。各アッ セイ条件下に見られた実際のコロニー数はこれらの細胞で異なっていたが、Ｐｒ ｏｐｅｐが誘導したコロニー抑制の程度はすべてにおいて似たものであった。

実験４ Ｐｒｏｐｅｐによる細胞増ｊの抑制 即座の細胞死の結果、あるいは細胞周期の遅れにより、コロニー抑制が生じる可 能性もありうる。これらの２つの抑制経路ヲ区別するために、以下の実験を行っ た。

０．５　ｘ　１０’個の細胞のアリコートを２４ウエルプレートに培養し、種々 の濃度のＰｒｏｐｅｐとともにインキュベートした。３日および７日目に細胞数 を計測した。対照ウェルでは、細胞数は３日後には４倍に、７日後には２８倍に 増加した。ｐｒｏｐｅｐの１μｇ／ｍｌの投与量では、細胞数の増加は３日目に は観察されなかったが、７日目には５倍の増加が観察された（表ＩＩを参照）。

この検討の結果をさらに、３Ｈ−チミジンを用いるＤＮＡ合成を測定することに より確認した。詳細には、Ｒ−３３２７−Ｇ細胞を２４ウ工ル組織培養プレー） 　（Ｃｏｓｔａｒ、　ＭＡ）にてＰｒｏｐｅｐの存在下または不存在下で６日間 培養した。１０７１Ｍチミジン（Ｓｉｇｍａ　ＭＯ）を含有するＣＭ中で希釈し た３Ｈ−チミジン（６８Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ、ＩＣＮ　Ｃａ）を添加して、培養ウ ェルを２倍にした（０．５μＣｉ／ｍｌ）。プレートをさらに１８時間インキュ ベートした。前記したように、取り込まれた３Ｈ−チミジンの量をトリクロロ酢 酸による沈殿により評価した。図７は、ＤＮＡ合成で表現した、７日目のｐｒｏ ｐｅｐインキュベート培養物における３Ｈ−チミジンの取り込みのパターンを示 す。１μｇ／ｍｌの量てＰｒｏｐｅｐを投与した培養物は、７日目までに、対照 のものと比較してわずか約２０％の放射能を取り込んだ。ｐｒｏｐｅｌ）の抑制 効果は３日目より７日目における方がより顕著であった。

実験５ ＩＮ−ＶＩＶＯ実験 コペンハーケン×フィッシャー３４４Ｆハイブリッド雄ラットの耳に札を付け（ ｅａｒ−ｔａｇｇｅｄ）、前記したように、Ｒ３３２７−Ｇ細胞を移植した（２ ８代の１ｎ−ｖｉｖｏ継代において１ｘｌＯ’細胞／動物）。腫瘍移植時に、動 物の体重は約５００グラムであった。腫瘍体積が０．２〜０．５ｃｃと測定され た時に、処理を開始した。

腫瘍を有する動物を８匹ずつの２群に分けた。対照群からなる１群には生理食塩 水を注射し、他の群には５μｇ／ｋｇの量で生理食塩水に溶解したＰｒｏｐｅｐ を毎日皮下投与した。

式０．５２３６　Ｘ長さｘ幅×深さを用いて３次元測定により、腫瘍体積を概算 した。腫瘍移植の２４日後、その時までには対照群の腫瘍が壊死状態になり始め る時点で、ラットを犠牲にした。副性器（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ　ｓｅｘ　ｏｒｇ ａｎｓ）および腫瘍をラットから切り出し、重量を測定した。

生理食塩水群と比較して、腫瘍の増殖の有意な減少がＰｒｏｐｅｐで処理した動 物において観察された。図８を参照すると、対照群とＰｒｏｐｅｐ処理群との腫 瘍体積の差は処理が長期に渡るにつれますます顕著になった。対照群の腫瘍が２ ４日目に壊死状態になり始めたので、この日に腫瘍および副性器を切り出し、重 量を測定した。

平均腫瘍重量は、生理食塩水処理対照群について６．４４±１．１９ｇであった のと比較して、Ｐｒｏｐｅｐ処理群では２．６６±０．４８ｇであった。

生理食塩水処理対照群と比較して、５８％の腫瘍重量の減少が、実験の終了時、 すなわち、腫瘍移植後２４日目あるいはｐｒｏｐｅｐの投与後１０日目に観察さ れた。Ｐｒｏｐｅｐ処理群において、精巣重量および前立腺重量の有意な変化は 観察されなかった（表ＩＩＩを参照）。

腫瘍を有する動物を８匹ずつの３群に分けた。第１群は対照群であり、生理食塩 水で処理した。第２群にはＰｒｏｐｅｐを５μｇ／ｋｇの量で投与し、第３群に は１０００μｇ　ロイプロライド（Ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）７ｋｇを投与した。

各動物の腫瘍体積が約１０　ｃｃになるまで、この処理を継続した。腫瘍体積は 、前記のように、１週間に２回測定した。

各動物の個々の腫瘍の腫瘍体積データをｌｏｇ変換した。処理群および対照群間 の統計的分析はスチューデントの“【”検定により行った。

これらの結果はＰｒｏｐｅｐの投与後の増殖抑制を明らかに示したので、さらに 検討を広げ、Ｐｒｏｐｅｐ処理動物における腫瘍増殖の遅れを評価した。腫瘍の 大半は、それらが１０　ｃｃの体積に達するときまでに、壊死状態となる。その 後、この測定は正確でないかもしれないことを心に留めて、この検討の終了時に １０　ｃｃを取った。

処理群の８匹の動物のうち、６匹の腫瘍体積が４２日までに１０　ｃｃに達し、 ２匹の腫瘍体積が３８日までに１０　ｃｃに達した。生理食塩水対照群において 、腫瘍体積は３０日までにこの大きさに達した（図９を参照）。換言すれば、腫 瘍増殖の１０日の遅れがＰｒｏｐｅｐ処理動物に観察された。すべての実験にお いて、処理群および対照群の動物の腫瘍増殖率曲線の相違は類似していた。

前記の実験に使用した細胞は２８代の１ｎ−ｖｉｖｏ継代からのものであり、そ れらはあまり分化していないアンドロゲン非感受性腫瘍である。この初期の観察 を確認するために、１群の動物を抗アンドロゲンであるロイプロライドで処理し た。食塩水対照群と比較して、ロイプロライド処理動物の腫瘍増殖率に有意な差 はなかった。

実験７ ＭＡＴ−ＬＹＬＵ（？　ルラインを用いるＩＮ−ＶＩＶＯ実験アンドロゲン非ケ ン性Ｄｕｎｎｉｎｇラット腺癌セルラインＭａｔ−Ｌｙｌｕをバルテモア、メリ ーラ〉・ドのジョーンズポプキンス医科学校のイサック（Ｊ、　Ｔ、　ｌ５ａａ ｃｓ）博士から入手し、１０％ウシ胎児血清および１％抗生物質を含有するＲＰ ＭＩ　１６４０培地を用いて実験室で培養した。細胞がコンフルエントに達した とき、トリプシン処理し、単一細胞懸濁液に分散させ、細胞数を血球計を用いて 計測した。

２ｘｌＯ’個の細胞を側腹部領域の２面に皮下注射することにより、約２００グ ラムの重量の成熟コペンハーケン雄ラットに腫瘍を誘導した。動物を異なる群に 分け、Ｐｒｏｐｅｐの注射を腫瘍増殖の誘導後４日目に開始した。表ＩＶは、動 物に注射された種々の濃度のＰｒｏｐｅｐを示す。

動物に毎日注射を行い、腫瘍細胞の投与後１４日目に犠牲にした。対照群と処理 群の両方について、体重および腫瘍重量を記録した。血液を心臓穿刺により採取 し、血清ＦＳＨ、ＬＨ、プロラクチン、テストステロンおよびＰｒｏｐｅｐをラ ジオイムノアッセイにより測定した。対照群、並びに、５　ｎｇおよび５０　ｎ ｇの投与量のＰｒｏｐｅｐで処理した動物について、上記のホルモンの血清レベ ルを表■にまとめる。これらの結果は、ＦＳＨレベルが投薬により減少すること を示しており、このことは、Ｐｒｏｐｅｐの作用機構がＦＳＨのレベルに関係し ていることを示唆している。さらに、テストステロンレベルは不利な影響を受け ないが、このことは、前立腺および他の形態の癌の治療に用いられる今日の薬物 について観察される性欲の喪失とは対照的に、性欲の喪失がないことを示してい る。

各動物からの一片の腫瘍組織を１０％緩衝化ホルマリン中で固定して、細胞の形 態を調べた。表ＩＶは、対照群（１００％）と比較した処理群の腫瘍の％生存率 を示す。表ＩＶの結果は、図１３の棒グラフにまとめる。

上記の検討は、Ｐｒｏｐｅｐを前もって決定した濃度範囲で投与すると、前立腺 に関連する癌性腫瘍が１ｎ−ｖｉｖｏで有意に抑制されることを示している。詳 細には、Ｐｒｏｐｅｐを用いたＤｕｎｎｉｎｇラットの検討は、２００グラム体 重当たり約５　ｎｇ〜５００　ｎｇの効果的な薬物投与“窓（ｗｉｎｄｏｗ）″ が存在することを示している。これらの結果はいくつかの検討により確認されて いる。

当業者は、ヒトに適用されるようなＰｒｏｐｅｐに対する医薬的に適当な投与形 態を調製する方法に通じているであろう。当業者は、そのような投薬が、例えば 、リポソームデリバリ−システム、徐放機構を示す多糖、サリスティック（ｓａ ｌｉｓｔｉｃ）または他のポリマーインブラントまたはミクロスフェアを含む時 間放出デリバリ−システムにおいてカプセル化された形態であってもよいと理解 するであろう。

実験９ タタメモリアル（Ｔａｔａ　Ｍｅｍｏｒｉａｌ）病院にて胃切除を受けた胃癌の 患者から胃腫瘍標本を採取した。腫瘍標本を滅菌ＤＭＥＭ中に採取して、すぐに 冷条件下の実験室に移した。最後に、胃腫瘍標本を滅菌した一対のはさみで細断 した。この最後に細断した胃組織を１％コラゲナーゼ１およびＩＶとともに、１ ０％ウシ胎児血清（Ｆｅ２）を含有するダルベツコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）中 、３７℃で５Ｘ　ＣＯ□下、インキュベーター中で１時間インキュベートした。

その後、全混合物をミリポアフィルタ−アセンブリーおよびワイヤーメツシュ（ ３０μｍサイズ）に通して、胃腫瘍細胞の単一細胞懸濁物を得た。

さらに、得られた細胞を滅菌培養ボトルにて、ｌＯ％ＦＣ３を含有する５０　ｍ ｌのＤＭＥ！ｉｌ中で初代培養に付し、１２〜１８時間、３７℃で５％ＣＯ７下 、インキュベーター中で、０．１．０．５．１．０および５．０　μｇ／ｍｌ濃 度のＰｒｏｐｅｐ　１０μｌとともに、滅菌した９６ウエルマイクロタイタープ レート中でインキュベートした。６マイクロウエル各々のブランクおよび対照を 試験に加えて行った。プレートを４８時間、３７℃で５Ｎ　ＣＯ□下でさらにイ ンキュベートした。４８時間後、１０μｌの５　ｍｇ／ｍｌ　ＭＴＴを各ウェル において添加した。３７°Ｃでのインキュベーションの６時間後、１００μｌの ］、　Ｎ　ＨＣＩ：イソプロパノール（１２５）を各ウェルに添加し、激しく攪 拌してファルマザン（ｆａｒｍａｚａｎ）結晶を溶解した。５４０　ｎｍでの吸 光度の値をＥＬＩＳＡリーダーで測定した。ブランクの値を対照および試験値か ら差し引いた。

各濃度のＰｒｏｐｅｐ、種々の濃度の公知の１）シスプラチン、５−フルオロ− ウラシル、メトトレキセート、マイトマイシンを含む、胃癌の治療に用いられる 制癌剤、および２）イダルビシン、アドリアマイシン、ドクサルビシン（ｄｏｘ ｏｒｕｂｉｃｉｎ）およびトノマイシンを含む、化学療法に用いられる他の制癌 剤、並びにｐｒｏｐｅｐとこれらの制癌剤との組合せについて、パーセント細胞 生存を計算し、対照と比較した。これらの検討の結果を図１４〜２０にまとめる 。

これらの結果が示しているように、ｐｒｏｐｅｌ）単独で胃癌細胞に対して細胞 毒として作用する。しかしながら、種々の制癌剤と組み合わせて使用したＰｒｏ ｐｅｐは、図１４〜２０に見られるように、癌細胞に対する細胞毒効果が有意に 増加する。純粋なＰｒｏｐｅｐおよび制癌剤と比較すれば、種々の組合せで得ら れる共生的な効果は明らかである。ｐｒｏｐｅｐと種々の制癌剤との開示された 組合せで得られる癌細胞増殖を阻止する際に、かなり有益で、共生的な効果に加 えて得られるさらなる利点がある。詳細には、薬物が単独で使用される治療計画 と比較して低い濃度の制癌剤を利用する上記の組合せについては、有意に増加し た治療効果が得られるので、前記制癌剤が関与する有害な副作用が、単独でより 多量の投与量で使用された前記制癌剤て通常観察されるよりもかなり減少する治 療法を提供できる可能性がある。

Ｐｒｏｐｅｐ、腫瘍増殖を抑制する効果を示すＰｒｏｐｅｐの断片、および公知 の制癌剤とＰｒｏｐｅｐとの組合せの、哺乳動物に見いだされる種々の癌、例え ば、前立腺癌、乳癌および胃腸癌の治療への利用可能性は、当業者にとって容易 に理解されよう。さらに、Ｐｒｏｌ）ｅｐおよびその適当な断片の良性前立腺過 形成の治療への使用も当業者にとって明らかであろう。本明細書に開示した検討 は、Ｐｒｏｐｅｐ、その類似体およびｐｒｏｐｅｐおよび類似体と種々の制癌剤 との組合せが体内のＦＳＨのレベルの上昇によって特徴付けられる疾患の治療に おける有効性を示しているものであると解釈される。

１０〜５０μｇの範囲の種々の量のＰｒｏｐｅｐを成熟雄ラットに４〜１２週間 投与したところ、体重、あるいは臨床化学的に測定されるパラメータに有害な毒 性効果はなかった。

当業者は、Ｐｒｏｐｅｐおよび前記制癌剤の混合物に対する医薬的に適当な投与 形態、並びに、胃腸管の癌に罹患している特定の患者についての適当な投与量お よび計画を導くことができる方法に通しているであろう。さらに、そのような投 薬が、例えば、リポソームデリバリーシステム、徐放機構を示す多糖、サリステ ィックまたは他のポリマーインブラントまたはミクロスフェアを含む時間放出デ リバリ−システムにおいてカプセル化された形態であり表１ てちよいと理解するであろう。

Ｐｒｏｐｅｐ、それに関連する種々の断片、並びに、Ｐｒｏｐｅｐおよびその断 片と制癌剤との組合せが、前立腺癌および胃腸管の癌の治療に効果を示すことが 本明細書に開示されたが、当業者は、ＦＳＩ（レベルの上昇により特徴付けられ る種々の癌の治療について、Ｐｒｏｐｅｐ、その断片およびこれらの化合物と種 々の制癌剤との組合せを用いて、本発明の範囲を逸脱することなく、数多くの変 更が可能であることを理解するであろう。

無傷の成熟雄ラットにおけるＦＳＩ＋およびＬｌｌの血清レベル（μｇｍｌ−’ 処理　細胞数 表ＩＩＩ 重ｆｆ１（ダラム） 精巣　前立腺 生理食塩水対照　３．２６　＋／−０，１９１，２６＋／−０，２４Ｐｒｏｐｅ ｐ処理　３．５６　＋／−０，３１１，１１＋／−０，２１表ＩＶ 群　対照と比較した％生存率 ｐｒｏｐｅｐ投与量 〇一対照　１００％ ５ピコグラムＩ）　１００％ ５０１）ｇ　Ｉ）　１００％ ０．５ナノ　８５％ （２つの実験からの平均） ５　ｎｇ　６８％ ５０　ｎｇ　６３％ ５００　ｎｇ　６４％ （２つの実験からの平均） ５μｇ　７０％ 表Ｖ 循環レート（ＲＡＴＥ　ＣＩＲＣＵＬＡＴ！ＯＮ）についてのホルモンレベル動 物は３〜１３日間処理した。動物は１４日目に犠牲にした。

ＮＨ２−５ｅｒ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　工ｌｅ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　 Ｇｌｙ　Ｖａｌｌ　５　１０ Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｍｅｊ　 ＡｓｐＬｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｕｙ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　工ｌｅ　Ａ ｓｎ　５ｅｒＧｌｕ　Ｔｒｐ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　Ｇｌ ｕ　Ｔｈｒ　ＣｙｓＴｈｒ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　工１ｅ 　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　ＣｙｓＴｈｒ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　 Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　ＡｓｐＬｙｓ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　Ａ ｒｇ　工ｌｅ　Ｐｈｅ　Ｉ、ｙｓ　ＬｙｓＧｌｕ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔ ｙｒ　工ｌｅ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　ＬｙｓＬｙｓ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｌｙ ｓ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　５ｅｒＧｌｕ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ 　Ｉｌｅ　−ＣＯＯＨＦ工ＧＵＲＥ　１ ｔｏ　２０　５０　４０　５０　６０ 体積　（ｍｌ） Ｆ工ＧＵＲＥ　２ １０　２０　’Ｓｏ　４０　５０　６０時間紛） ↓ □ ００ｔ Ｆ工ＧＵＲＥ　５ １２５［ Ｆ工ＧＵＲＥ６ ０．０　０．５　ＬＯ１，５２，０２，５Ｐｒｏｐｅｐ　（ｕｇ／ｍ１） 処理期間（日） 処理期間（日） Ｆ工ＧＵＲＥ　９ Ｆ工ＧＵＲＥ　１０ ＮＨ２−５ｅｒ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　工ｌｅ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　 Ｇｌｙ　Ｖａｌｌ　５　１０ Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｍｅｔ　 ＡｓｐＬｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｉ（ｉｓ　Ｐｒｏ　工ｌｅ　 Ａｓｎ　５ｅｒＧｌｕ　Ｔｒｐ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　Ｇ ｌｕ　Ｔｈｒ　ＣｙｓＴｈｒ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｉｌ ｅ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　ＣｙｓＴｈｒ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ 　Ｖａｌ　Ｇｕｙ　Ｔｙｒ　ＡｓｐＬｙｓ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　 Ａｒｇ　工ｌｅ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　ＬｙｓＧｌｕ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔ ｙｒ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　ＬｙｓＬｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｓ ｎ　Ｌｙｓ　日ｉｓ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　５ｅｒＧｌｕ　Ｔｒｐ　Ｇｌｎ 　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ３５４゜ Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　 ＣｙｓＴｈｒ　Ｌｅｕ　ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｔ ｙｒ　Ａｓｐ１３ｏ「 Ｆ工σＬＴＲＥ　１．３ ＦＩＣＵＲＥ　１４ Ｐｒｏｐｅｐ　ｏｒ　Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ　（ｕｇ／ｍ１）Ｆ工ＧＵＲＥ　１ ．７ Ｐｒｏｐｅｐまたはメトトレキセート　（ｕｇ／ｍ１）Ｆ工ＧＵＲＥ　１Ｂ 手続補正書 平成７年２月２８日

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．前立腺インヒビンペプチドおよび前立腺インヒビンペプチドの類似体から成 る群より選択されたペプチドを前もって決定した濃度範囲で含む医薬製剤。
2. ２．製剤が医薬的に許容できる担体を含み、かつ、ペプチドの濃度が病的な前立 腺に観察される前立腺インヒビンペプチドの濃度より高い、良性前立腺過形成ま たは腺癌の増殖を抑制するための請求の範囲第１項記載の医薬製剤。
3. ３．医薬的に許容できる担体がペプチドをカプセル化するための時間放出カプセ ル化システムを含む請求の範囲第２項記載の医薬製剤。
4. ４．時間放出カプセル化システムがリボソームデリバリーシステムを含む請求の 範囲第３項記載の医薬製剤。
5. ５．時間放出カプセル化システムが徐放機構を示す多糖を含む請求の範囲第３項 記載の医薬製剤。
6. ６．腺癌が前立腺の腺癌である請求の範囲第２項記載の医薬製剤。
7. ７．腺癌が胃腸管の腺癌である請求の範囲第２項記載の医薬製剤。
8. ８．制癌剤を含む請求の範囲第７項記載の医薬製剤。
9. ９．医薬的に許容できる担体を含む請求の範囲第８項記載の医薬製剤。
10. １０．医薬的に許容できる担体が前立腺インヒビンペプチドと制癌剤との組み合 わせをカプセル化するための時間放出カプセル化システムを含む請求の範囲第９ 項記載の医薬製剤。
11. １１．時間放出カプセル化システムがリボソームデリバリーシステムを含む請求 の範囲第１０項記載の医薬製剤。
12. １２．時間放出カプセル化システムが徐放機構を示す多糖を含む請求の範囲第１ ０項記載の医薬製剤。
13. １３．良性前立腺過形成または腺癌の患者を治療するための医学的処理方法であ って、前立腺インヒビンペプチドおよび前立腺インヒビンペプチドの類似体から 成る群より選択されたペプチドを含む医薬製剤を適当な医薬投与形態で投与する ことを含む前記方法。
14. １４．腺癌が前立腺の腺癌であって、医薬製剤中のペプチドの濃度が病的な前立 腺に当然観察される前立腺インヒビンペプチドの濃度より高い請求の範囲第１３ 項記載の方法。
15. １５．腺癌が胃腸管の癌である請求の範囲第１３項記載の方法。
16. １６．医薬製剤が制癌剤を含む請求の範囲第１５項記載の方法。
17. １７．腺癌が乳癌である請求の範囲第１３項記載の方法。
18. １８．医薬製剤が制癌剤を含む請求の範囲第１７項記載の方法。
19. １９．ＦＳＨのレベルの上昇により特徴付けられる疾患の患者を治療する医学的 処理方法であって、前立腺インヒビンペプチドおよび前立腺インヒビンペプチド の類似体から成る群より選択されたペプチドを含む医薬製剤を適当な医薬投与形 態で投与することを含む前記方法。
20. ２０．前立腺インヒビンペプチドの類似体がＲ−１０、Ｒ−１７およびＲ−２８ 類似体から成る群より選択される類似体である請求の範囲第１９項記載の方法。
21. ２１．ＦＳＨのレベルの上昇により特徴付けられる疾患の患者を治療する医学的 処理方法であって、Ｒ−１０、Ｒ−１７およびＲ−２８類似体から成る群より選 択された前立腺インヒビンペプチドの類似体を含む医薬製剤を適当な医薬投与形 態で投与することを含む前記方法。
22. ２２．制癌剤がマイトマイシン、イダルビシン、シスプラチン、５−フルオロウ ラシル、メトトレキセート、アドリアマイシンおよびドノマイシンから成る群よ り選択される請求の範囲第８項記載の医薬製剤。
23. ２３．制癌剤がマイトマイシン、イダルビシン、シスプラチン、５−フルオロウ ラシル、メトトレキセート、アドリアマイシンおよびドノマイシンから成る群よ り選択される請求の範囲第１６項記載の方法。
24. ２４．制癌剤がマイトマイシン、イダルビシン、シスプラチン、５−フルオロウ ラシル、メトトレキセート、アドリアマイシンおよびドノマイシンから成る群よ り選択される請求の範囲第１８項記載の方法。