JPH07505335A - 分子画像化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 分子画像化法 ｉシ」１ 本発明は、予め選択した巨大分子を特異的に結合することができる限定表面部位 を有する固体吸着剤であって、複雑な混合物から目的の溶質を分離するために有 用で、さらに様々な種類の分析においても有用なものに関する０本発明はまた、 そのよ、うな表面を製造するうえで有用な一群の合成技術に関する。

巨大分子（例えば蛋白質）の表面への吸着は、疎水性結合、静電気結合および水 素結合による多数の部位での誘因を必要とする。したがって、クロマトグラフィ ー充填剤として用いられる表面は、この吸着過程で利用可能な高密度のイオン性 、疎水性またはヒドロキシル含有基を有する。この表面と吸着される蛋白との間 の接触面は、蛋白の大きさおよび荷電基または他の基の表面密度に依存するけれ ども、約１０−１００個の表面基を含むであろう、典型的には、吸着は蛋白表面 の５から１０個の基を介して生じるので、極めて過剰の表面官能基が存在する。

吸着剤の官能基の表面密度が減少するにつれ、典型的には、蛋白吸着の強さは急 速に低下する。吸着剤表面の基の数は結合に必要なものより多いが、そのような 基は適切に分散されているわけではない。

この作用は図ＩＡおよび図ＩＢで模式的に示す０図ＩＡでは、蛋白の接近可能な 表面領域（ｌＯ）は、５つの分散した陰イオン基を有し、これらすべては、吸着 剤の表面１２の上に高密度で分散した１つまたは２つ以上の陽イオンと接近して 存在する。

図ＩＢに示すように、より低い表面密度では、蛋白表面の陰イオンの空間配置が 、吸着剤上の陽イオンの配置と釣り合っていないので、蛋白の結合は弱くなる。

もちろん、実際の反応は、いくつかの点で図示したような簡略化しすぎた状態と は異なる０例えば、１）荷電基は吸着剤上に無作為に配置されている、２）吸着 は三次元で生じる、例えば、図ＩＢに示した四角の中の荷電対は、紙の面に垂直 な方向に間隔を空けて配置されうる、３）蛋白は、陽イオン表面によって反発さ れる陽イオンをその表面に有することがある、さらに４）静電気誘因加えて、作 用している他の物理相互反応が存在する。

この相補的な吸着現象は、混合溶液中の溶質の種々の吸着特性を利用する分析物 の精製および、分析を行うクロマトグラフィ一工程において最も広く用いられる 。クロマトグラフィーシステムを製造する業者は、一般にできる限り均質で、高 密度の官能基を有する吸着剤表面をつくろうとする。相補性は、分析物上の官能 基の小群と相補性を有する吸着剤表面の単一群の存在を基にしている。吸着クロ マトグラフィーでは、例えば、シリカ表面のシラノール基を水素結合を介して溶 質と結合させるために用いられる。これは、一般的には、水素結合が強力な有機 溶媒中で達成される。イオン交換クロマトグラフィーでは、上記のように、荷電 表面は静電気反応を介して反対荷電の分子種と反応する０反応のための推進力は 、部分的には結合におけるエンタルピーの変化に由来し、さらに部分的には、吸 着剤と吸着物質の両表面の水の置換によるエントロピー効果に由来する。逆相お よび疎水性反応クロマトグラフィーでは、疎水性分子が吸着剤表面に押しつけら れ、比較的極性の高い溶媒との疎水性接触部分を最小にさせるので、エントロピ ー効果は最大限に利用される。さらにまた、固定金属親和性クロマトグラフィー は、吸着過程において相補性官能基が関与する別の例である。

この系では、固定金属配位化合物は、亜鉛または銅のような金属の存在下で、ポ リペプチドの接近可能な外部表面のヒスチジンと反応する。この結合は、ヒスチ ジンの数および空間的配置に基づく特異的なるポリペプチド結合を生しる。これ らのすべての系は、不規則な高リガンド密度を有する表面を利用する。

分子の特異的な構造特性と吸着剤表面の構造特性とを適合させる試みは為されな い。

親和性クロマトグラフィーは、分子間ドツキングおよび吸着を達成するために生 物学的な系を利用する。この系では、吸着剤の表面を、自然な状態でポリペプチ ドと結合する生物学的物質に類似させる。親和性反応は、一般に静電気的誘因、 疎水性反応、水素結合および立体化学的適合性を含む多くの現象に基づく。

生物学的巨大分子対（例えばりガントとレセプター、または抗体と抗原）間の可 逆的結合反応は、これら反応の優れた特異性および親和性を利用する系が構築す るために幅広く利用されている。親和性クロマトグラフィーは、多くの場合特異 的結合蛋白（以前は典型的には多クローン性抗血清であったが、現在は単クロー ン性抗体が普通である）の高表面積固体マトリックス（例えばカラムに充填され た多孔性粒子材）への固定を含む。

試料混合物はカラム中を通過し、ここで標的溶質は固定された結合蛋白に結合す る。続いてカラムを洗浄し、その後、標的物質を溶出させ、より純度の高い分画 を得る。また、そのような特異的結合表面よりなる固体支持体は、固定結合蛋白 が分析物を選択的に捕捉し、それによってサンプル中の分析物を分離する免疫検 定にも用いられる。

このような意味で有用な特異的結合蛋白を製造し、さらにそれらを表面上に固定 する方法では、たゆまない、時には劇的な改良がみられた。したがって、単クロ ーン抗体が一般的に多クローン抗血清に置き換えられることにより、採血物から 抗体を精製する必要がなく、エピトープ特異的結合が可能となり、さらにこれら 有用な化合物を工業的規模で製造することが理論的に可能な技術が確立された。

より最近では、蛋白工学および組換え体発現における進歩により、天然の抗体の 抗原結合領域を模倣する全合成結合部位のデザインおよび製造を可能となった。

この技術が非常に有用である一方、欠点が無いわけではない。

結合蛋白は高分子量の生物学的巨大分子で、その機能は、使用または保存に際し て比較的穏やかな条件に曝したときさえ容易に変化する三次元構造の維持にかか っている。さらに、抗体または予め定めた標的分子に対して特性を有す名それら の生合成類似体を製造することは、当該技術分野の範囲内にあるが、一方、この 調製用技術は時間および経費がかさみ、精製は困難で、さらに活性を維持しつつ それらを高密度で表面に固定する技術は不完全である。さらに、インビボで治療 的または予防的に使用することを目的とする物質の精製に、そのような特異的結 合表面を用いる場合、外来の生物学的物質が生成物に混入する危険性がある。こ のことは品質制御を困難にし、精製系の設計を複雑にし、さらに薬剤の規制承認 を得るために必要な費用や時間を増加させる。

分子認識は生物学的系において重要な現象である。表面と分析物との間の接触面 に含まれる領域は、アミノ酸および単糖類の場合ＩＯから１００平方人と小さく 、四次元構造を形成するポリペプチド間の接触面は数千人の範囲の大きさである 。接触面の表面積が約１０−１００平方人の間のレベルでは、性状を首尾よ（模 倣することができた。これは上記で考察した近代親和性クロマトグラフィーの基 本である。しかしながら、より広い接触面表面積を用いることによって、識別能 力を高めることが可能であろう。

本発明の目的は、予め選択した標的分子と強い特異性と親和性で可逆的、非共有 結合的に結合する多数の部位からなる合理的にデザインされた安定で、安価に製 造できる固体材の表面を提供することである。また別の目的は、上記のように生 物由来の固定化巨大分子の使用に限られる特異的結合を伴う種々のタイプの分析 において使用に適した物質を提供することである。

また別の目的は、慣用的な親和性クロマトグラフィー表面と較べて、より耐久性 があり、より広範な条件で有用で、より安価に製造できる、調製用および分析用 クロマトグラフィー分離の両方に有用な特異的結合部位を含む表面を有する固体 を提供することである。さらに別の目的は、空間的に適合する静電気的誘引、疎 水性反応、キレート反応、水素結合および／または立体化学的適合を介して、一 定のいずれの巨大分子表面とも結合することができる多様な領域を含む、合理的 にデザインされた表面の合成を可能にする一群の合成技術を提供することである 。

本発明のこれらおよび他の目的、並びに特徴は、以下の図面、記述および請求の 範囲から明白となろう。

光凱■！肯 本発明は、物質組成として新規な吸着剤およびその表面で相補的官能基の相互反 応によって予め選択された分子を結合させるための有用な吸着剤の製造方法に関 する。この相補性によって、選択的で可逆的な結合が分子と表面との間に生じる 。この結合は、分子の精製（その検出または定量において）、また複雑な系から の分子の除去に用いることができる。そのような特異的な結合表面の製造方法を 、ここでは“分子画像化”法と呼び、この表面は“画像化”表面と呼ぶ。本発明 の実施によって、高表面積クロマトグラフィーマトリックス材、分子特異的吸着 剤および触媒的に活性な表面が提供される。これらの物質は、本明細書に開示し たように、幾何学的に制御された態様で少なくとも平行な方向、好ましくはその 下にある表面の面に対して垂直な方向に、多数の荷電基、疎水基、金属配位基、 およびそれらの種々の組み合わせを、共有結合的に付着させることにより、標的 巨大分子の分子表面上にそれらと相補的な基の鏡像を形成することによって合成 される。

これらの基は、好ましくは、水素含有基および陰性荷電原子（水素結合形成にお いて役割を果たす、例えば水素、窒素、燐または硫黄）に冨む親水性の下面の方 々に間隙を置いて配置される。

より具体的には、第一の観点において、本発明はその分子表面に間隙を置いて配 置されイオン化可能な複数の基を有する予め選択された巨大分子の分子との選択 的結合が可能な多数の領域を含む結合表面を形作る固体支持体を提供する。該領 域の各々は、表面または該表面に付着した被覆物に結合した、好ましくは共有結 合した、複数の荷電成分からなり、これらは当該領域内に間隙を置いた位置関係 で配置された鏡像関係にあり、さらに反対に荷電している。これらの領域は、分 子表面と結合表面間の空間的に適合する静電気的誘引によって、予め選択した分 子を他の分子に結合させる。

好ましい具体例では、この結合表面は実質的に、予め選択された分子上のイオン 化可能基と結合するもの以上の結合荷電成分を含まない、結合表面は、好ましく は、例えばクロマトグラフィーで有用な固体粒子状物質の表面に付着させた被覆 からなり、例えば粒子状スチレンジビニルベンゼンからなる。荷電成分は、陰性 荷電基、例えばカルボキシレート、スルホネート、ホスフェート、またはホスホ ネートを含むことができる。カルボキシル基が現在のところ好ましい。荷電成分 はまた、陽性荷電基、例えば第一、第二、第三、または第四アミンを含むことが できる。これら荷電成分は、好ましくは固体支持体または付着被覆に結合される 。これらは、その下にある表面に固定された柔軟なオリゴマー鎖を介して結合表 面を構成し、それによって空間的に離れている荷電成分は、構造的に忠実な荷電 表面を限定し、さらに、予め選択された巨大分子種表面の様相と少なくともある 程度まで適合するように荷電成分はその下の基層の表面から様々な距離をおいて 配置される。好ましくは、該表面上の各結合領域は、少な（とも５０平方人、好 ましくは少なくとも５００平方人、さらに最も好ましくは１０００平方人または それ以上の接触表面積を与える０本発明の重要な利点は、結合接触部分が抗原抗 体反応のそれよりはるかに太き（することができるという点である。空間的に離 れた荷電残基の下の結合表面は、好ましくは酸素に富む親水性ポリマー表面であ る０画像化表面は、種々の生物学的巨大分子を選択的に吸着させるために合成す ることができ、蛋白〔例えば天然または合成のリンホカイン、サイトカイン、ホ ルモン、成長因子、ペプチド、モルホーゲン、酵素、補因子、リガンド、レセプ ター、抗体および他の有用な蛋白）並びにポリペプチドを選択的に吸着するため に非常に通している。それらはまた、有機反応における中間体の類似体を吸着す るようにデザインし、それによって酵素反応を模倣する触媒表面を製造すること もできる。

結合表面に結合させた空間的に分散した荷電成分は、巨大分子表面上の１つまた はそれ以上の小区画と接触する、結合領域内の場所に配置された１つまたは２つ 以上の疎水性小区画の組み合わせとして存在することができる。この表面はまた 、各頬域内の場所に配置された１つまたはそれ以上の金属配位成分を含み、配位 金属イオンの存在下で該配位成分と例えば巨大分子表面に露出したヒスチジンの ようなイミダシル残基との間に金属配位結合形成することができる。

第二の観点において、本発明は、巨大分子の分子表面に間隔をおいて配置された イミダシル残基と吸着剤表面との間の１つまたはそれ以上の金属配位結合を介し て、予め選択した有機巨大分子と選択的に結合する領域を有する結合表面を形作 る固体吸着剤を提供する。結合表面上の各領域は、該領域内に互いに離れた位置 関係で配置された、少なくとも小群のイミダシル残基に対して鏡像状態にある１ つまたはそれ以上の金属配位成分を含む、配位金属イオンの存在下では、表面領 域は、吸着剤表面の配位成分と予め選択された巨大分子の表面のイミダシル残基 （例えばヒスチジン残基）との間にある空間的に多数の箇所で適合する金属配位 結合によって、予め選択された分子を他の分子に優先的に結合させる。この種類 の表面は、多数の露出ヒスチジン残基を有する蛋白と高い親和性で選択的に極め て良好に結合することができる。

また別の観点では、本発明は、多数の疎水性小区画を介して選択的に結合する領 域からなる結合表面を形作る固体材を提供する。この結合表面上の各領域は、親 水性表面で囲まれ、結合表面に結合した多数の疎水性成分からなり、これらは該 領域内に空間的に離れた位置関係で配置された、予め選択された分子表面の少な くとも小群の疎水性小区画に対して鏡像状態にある。

そのような画像化領域は、空間的に適合する疎水性反応によって、予め選択され た化合物の分子表面を他のものに優先的に結合させる。

これらの作用の種々の組み合わせを利用する多数の領域、および特に１０００平 方人またはそれ以上の表面積に広がる領域を含む画像化表面は、免疫系の結合分 子の識別能力に近いか、または同等か、それを越えることすらある強力で安定な 結合系を提供する。

これら分子画像化表面を製作する好ましい方法はまた本発明の重要な特徴を含む 、大まかに言えば、標的巨大分子を選択後、固体表面上の分子画像の合成は、例 えばここで開示するように製造した特別に誘導された活性化表面と、予め選択し た巨大分子溶液とを接触させ、予め選択した分子表面上の一定の基と誘導された 表面との間の反応させるか、または誘導し、続いて誘導表面に残存する反応成分 を不活性形に変換することによって行われる０次に、画像分子と表面との間の共 有結合を切断するか、または予め選択した画像分子を消化し、一方、表面に共有 結合した巨大分子の残基を残す、続いて、残存する残基を適合基、共有結合的に 付加した基、荷電基、疎水基もしくは金属配位基に変換するか、または各切断点 に電荷を発生させることによって表面を“成長（ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ）″させる 。特定の巨大分子を画像化する最適方法は、ここに開示するようにコンピュータ ー化された蛋白および他の巨大分子の構造解析技術を用いて見つけることができ る。

より特異的、より適切に間隙を置いて配置されたイオン化可能基は、出発材料と してイオン化可能基と共有結合する表面層成分を有する固体を用意し、予め選択 したポリアミノ酸巨大分子をその分子のイオン化可能基が、少なくとも該イオン 化可能基のいくつかと該分子表面との間で共有結合を形成する多数の箇所で該表 面と反応する条件下で該表面層とを接触させ、続いて、強塩基または酵素的加水 分解によりペプチド結合を加水分解することによって該アミノ酸ポリマーを消化 し、該表面に共有結合したアミノ酸残基をイオン化可能基が反応した各部位に残 すことによって製造することができる０次に、結合アミノ酸の各々のアミノ基ま たはカルボン酸基が、ペプチド結合させた予め選択したアミノ酸ポリマー表面の イオン化可能基の電荷と符号的にも場所的にも反対の荷電を残すように誘導され る。これによって、該分子表面上のイオン化可能基の反応小群と反対の荷電をも ち、間隙を置いて分布する荷電基が鏡像状態にある表面がつくられる。

空間的に特異的な金属配位化合物を製造する試みは類イ以するが別個のものであ る。この場合には、窒素含有有機ポリカルボン酸金属配位化合物と共有結合する 成分を有する表層をもつ固体基材が必要である。この表層は、静電気的分子鏡像 表面を作製するために用いられる表層の種類と同じであってもよい、この物質は 、イミダシル残基および金属イオンを含む予め選択された分子を用い、予め選択 された巨大分子中のイミダシル基の少なくとも幾つかと該配位化合物分子との間 に配位金属イオン結合を多数形成する条件下で異種反応させ、固体材表面上の共 有結合反応成分の少なくとも小群と該配位化合物との間に共有結合を生成させる 。次に、金属イオンは反応混合物から、例えばキレート化によって除去され、こ の物質の表面に、その中に間隙を置いて配置された、該巨大分子上のイミダシル 残基と鏡像関係にある複数の共有結合した金属配位化合物分子を含む多数の領域 を生成する。

疎水性誘引によって巨大分子と反応できるように適切に配置された疎水性表面を 結合領域内に製造する方法は、予め選択された分子を両親媒性分子と予め反応さ せることを含む。本明細書で用いられるように、両親媒性分子という用語は、疎 水性成分（例えば炭化水素、ハロカーボンまたは芳香族残基で、これらは目的分 子の疎水性小区画に結合している）および共有結合反応基（例えばアミン、カル ボキシル、アルデヒドまたはエポキシ残基で、活性化表面と反応できるように調 整されている）を含む分子を指す、ここで、例えば、荷電または金属配位基を誘 導するために用いたのと同じ共有結合反応性親水性表面を有する出発材料を用意 し、この固体出発材料を疎水性−疎水性反応によって形成される両親媒性分子と 予め選択した分子との複合体と反応させる。この反応により疎水性結合反応部位 を含む吸着剤が造られるが、この部位は、予め選択された巨大分子の表面上の疎 水性小区画の少な（とも小群に結合し、固体結合表面の共有結合反応性成分およ び両親媒性分子の共有結合反応基を介して該表面と共有結合する。続いて予め選 択された分子を、疎水性−疎水性誘引を破壊することによって該表面から遊離さ せ、共有結合によって固定された複数の成分が、予め選択された巨大分子表面の 疎水性小区画と鏡像関係にある親水性区画内に、間隙を置いて配置されている領 域からなる表面を生成する。

本方法の好ましい局面では、高表面積固体材、例えば米国特許５０１９２７０号 で開示されたような還流性マトリックス材が用いられる。製造工程の第一段階は 、均一で粘着性親水性の誘導可能な被覆を、例えば米国特許５０３０３５２号に 開示された方法にしたがって、固体マトリックスの全表面の周囲に施すことであ る。次に、例えばアルデヒドまたはエポキシ基を含む反応性単量体のオリゴマー 鎖で被覆を誘導し、活性フィラメンＨＭ域をつくる。次に、画像化される巨大分 子の溶液をマトリックスの反応性誘導表面と接触させる０分子が誘導表面と接触 するにつれ、分子表面に露出した核性アミン基が、マトリックス表面上のエポキ シまたはアルデヒド基の小群と共有結合する。アルデヒドカップリングの場合は シッフ塩基が形成され、これは第二アミンに還元される。その後、支持体−蛋白 複合体は加水分解し、該蛋白中のアミノ酸に連結しているペプチド結合を、さら にエポキシ支持体マトリックスの塩基触媒氷解の場合には全ての残存エポキシ基 を破壊する。これによって、そのポリペプチドのアミンが活性表面と反応する各 箇所で遊離アミノ基および遊離カルボン酸基が生じるアミノ側鎖を介して表面に 共有結合するただ１つのアミノ酸が残される０画像化陰イオン表面を作製するた めには、結合アミノ酸のアミノ末端を、例えば無水化合物を用いてそれらをアミ デートに変換することによって誘導し、それによって該ポリペプチドの表面上の アミノ基に対応する表面の各箇所でカルボン酸基およびそれらの特徴的な陰性荷 電を生じる。

の関係にあり間隙を置いて配置された、共存結合した陽イオンを含む吸着剤は、 別の化学過程を用いてＭ似の方法を用いて製造することができる。この場合、例 えば隣接ヒドロキシル基をもつ末端アミノ基（−ＣＨＯＨ−ＣＨＩ−ＮＨ，）を 導入した表面を有する吸着剤を用いて開始する。水溶性カルボジイミド（例えば ニーエチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド）の存在下 で、画像化される分子をその表面に暴露スるとき、該巨大分子表面のカルボキシ レートイオンと該吸着剤表面のアミン基との間でアミド結合が形成される。過ヨ ウ素酸塩による酸化で残存する一ＣＨ０Ｈ−ＣＨＩ−ＮＨ，を切断し、結合アル デヒド（−ＣＨＯ’）基をつくる。この基は、吸着剤−巨大分子接触面に位置す る、巨大分子上のリジン、アルギニン、またはＮ−末端アミノ基のいずれとも反 応し、シッフ塩基を形成する。続いて、水素化硼素ナトリウム用いて、表面に残 存するアルデヒド基を第一アルコールに、さらにシッフ塩基を第二アミンに変換 する。次に、例えば水酸化カリウム中での加水分解によって、画像化される巨大 分子上の陰イオン性カルボン酸基と対抗する位置で吸着剤表面に共有結合した陽 イオン性アミン基を有する画像化吸着剤表面が生成する。陰イオン種による静電 気画像化は、過剰の陰イオン官能基をもつ分子を用いて実施される。この理由の ために、この方法では少数の陽イオン性アミノ酸しか表面に結合されず、陰イオ ン種の吸着には殆ど効果がないであろう。

疎水性−疎水性反応を誘導するために疎水状態の鏡像部分を製造するために、す なわち特異的結合逆相吸着剤を製造するためには、外部表面に１つまたはそれ以 上の疎水性小区画を有する画像化分子と、疎水性成分（例えば炭化水素またはハ ロカーボン）および反対の成分（上記の種類の活性化表面上共有結合する基を含 む）を含む両親媒性分子とを混合する０例えば、共有結合基はアミンまたはカル ボキシレート基でもよい６両親媒性分子と画像化される分子を比較的親水性の媒 体中で混合するとき、疎水性領域は結合してそれらの疎水性接触表面の間の水分 子を排除する。その後、この複合体は上記に開示したように反応して、合成体系 の最後に、各両親媒性分子の疎水性末端は共有結合を介して該吸着剤の表面から 伸び、さらに、画像化される分子の表面で疎水性小区画と相互に適合するように 間隙を置いて配置される。この技術は、該表面上の荷電によって分子が静電気的 に誘引されるとき、特に強力である。

表面にイミダシル残基をもつ巨大分子（例えば露出ヒスチジン残基をもつ蛋白） と選択的に結合する画像表面を有する吸着剤を製造する好ましい方法は、イミダ シル含有巨大分子を鋼または他の金属イオンの存在下で金属配位化合物（例えば イミノジ酢酸、Ｉ　ＤＡ）と反応させることを含む。これは、標的蛋白の表面上 のイミダシル成分とＩＤＡ成分との間に銅配位複合体を形成させることになる。

その後、イミノジ酢酸成分中の核性窒素は、上記に記載した反応体系にしたがっ て、アルデヒドまたはエポキシ基と反応して、合成終了時にＩＤＡ成分が、画像 化される巨大分子上のイミダシル残基に適合するように、間隔を置いて正確に配 置されるように該吸着剤の表面に共有結合される。またこの技術は、最も好まし くは荷電基マツチングとともに用いられるが、別個に使用することもできる。

分子画像化表面の合成のための重要な点は、吸着剤表面と向かい合った関係で標 的分子の適正な表面方向を定めることであることは理解されよう。本発明によれ ば、吸着剤表面に対する画像化分子の関係は、比較的無作為に得ることが可能で あり、その場合は“ポリクローナル（多クローン性）”吸着剤が得られるであろ う、すなわち、吸着剤表面の結合領域の多様性は、別個に提供された巨大分子の 鏡像を含む。しかしながら、画像化される分子のある面の画像をより高い頻度で もつ領域を有する吸着剤は、いくつかの方法を用いて製造できる。例えば、画像 化工程の初期段階で分子の方向性をより一定にするための工程を取るか、または 画像化しようとする巨大分子の表面領域のペプチド！！似体を用いることである 。したがって、例えばアンチカオトロピズム塩（例えば硫酸ナトリウム）が画像 化段階で溶液中に巨大分子とともに存在することによって、標的巨大分子のより 疎水性の面が活性化吸着剤表面と接触するようになるであろう、また別に、陰イ オンまたは陽イオン基を活性化表面に含ませ、それによって反対荷電成分に富む 巨大分子の表面を静電気的誘引によって°係留”することができる。

呈単星皿皿夏脱所 図ＩＡおよびＩＢは、それぞれ高密度および低密度陽イオン性表面（陰イオン交 換）への巨大分子の吸着状態を模式的に示した図である。

図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃは、蛋白または他の大型巨大分子とここで開示した画像 化表面との関係を表す図である。図２Ａおよび２Ｂは、分子画像化表面上に吸着 した蛋白を通して見た“見取図“である。図２Ｃは、分子画像化吸着剤およびそ れに吸着した蛋白の状態を示す横断図で、吸着剤表面から伸びるオリゴマーフィ ラメントが、どのようにして蛋白表面上の種々の分子構造を受け入れることがで きるかを示している。

図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃは、本発明の分子画像化表面の合成で出発点として有用 な種類の典型的な活性化表面を表している。

図４Ａ−４Ｅは、予め選択した蛋白上の陽イオン基と鏡像の関係で陰イオン基を 間隔を置いて配置させた分子画像化表面を、図３Ａで表した活性化表面から製造 する方法を説明するために有用な分子の図である。

図５Ａ−５Ｄは、図４と同じような分子図であるが、図３Ａの代わりに図３Ｂの 活性化表面を用いている点、および最後が予め選択された分子の分子画像中で適 切に間隙を置いて（基材に対して水平的にも垂直的にも）配置された陰イオン荷 電を含む画像化表面である点が異なる。

図６Ａ−６Ｅは、高密度の陰イオン基（カルボン酸基）を含み、それによって画 像化される分子が静電気力によって表面に対して一定方向をとる（すなわち、吸 着剤に対して最大の陽荷電表面を示す）活性化基材から分子画像化表面を製造す る方法を示す分子図である。

図７Ａ−７Ｅは、複数の、空間的に離れた陽イオン基を有する分子画像化吸着剤 を製造する方法を示す分子図であるが、合成の第一段階では表面に電気的に誘引 される複数の陰イオン基を有する画像化される巨大分子から始まっている。

図８Ａは、第一アミンと結合した疎水性領域を含む２つの両親媒性分子と結合し 、図３Ｂおよび５Ａで示した型の活性化表面と接触するように配置された、疎水 性小区画を有する巨大分子（例えば鎖式または芳香族側鎖をもつアミノ酸に富む 領域を有する蛋白）を表している０図８Ｂは、８Ａの出発点から得られた画像化 表面を示すが、これは、図８Ａで表した蛋白と鏡像関係に配置された陰イオン基 および疎水性小区画の両方を有している。

図９Ａは、１対のアミン側鎖基およびイミノジ酢酸部分と金属イオンを介して複 合体を形成しているイミダシル側鎖基を有する巨大分子を表し、この巨大分子と 複合体が図３Ａに示した型の活性化表面の近くに置かれている０図９Ｂは、図９ Ａの出発点から本明細書で開示した好ましい合成法にしたがって製造した分子画 像化表面を表している０図９０は、図９Ａの画像化表面を示し、これは該巨大分 子の表面のアミン基き鏡像の関係に配置された１対の陰イオン基、および画像化 される蛋白の表面に対して適切に配置されたイミノジ酢酸部分がらなり、そのイ ミダシル側鎖基とその多数箇所の静電気的誘引で金属配位結合を形成する。

図１０Ａ−１０Ｅは、画像化カラムの特性を示す溶出像である。各々の事例にお いて、斜線を付したピークは、画像化された分子（ここではリゾチーム）を表し ている。

図１１は、同じリゾチーム／チトクロームＣ混合物のりゾチーム画像化カラムと 強力な陽イオン交換カラムでの溶出像（ｐＨ＝６．２、Ｏ，Ｏ−１，０ＭのＮａ Ｃ１濃度勾配、５ｍｌ／分で５分）を重ね合わしたものを示している。

図１２は、コンピューター支援デザインの原理を用いた画像化表面の最適化の方 法を説明するために有用な工程図である。

それぞれの図中に引用した記号と同じように、数字は対応する部分を示している 。

の 生物学的分子と表面との間における最強の結合特異性は、現在のところ、例えば 抗体と抗原、レセプターとりガント、レクチンとそのレセプター、アビジンとビ オチン等の間における親和性相互作用を用いて達成される０強度と特異性の両方 がそのような特異的結合反応では重要である。親和性を基にした系は、多くの場 合１０’から１０”Ｍ−１の範囲の結合定数からなり、さらにＩＯＩＳＭ−１も の強さも可能である。予め選択した分子と特異的で強固に結合することができる 表面は、現在のところ、天然に存在する生物学的結合系を利用することによって 製造される。これらの系は、順に静電気反応、疎水性−疎水性反応、水素結合、 および立体特異的接触面適合の組み合わせを用い、親和性の高い選択的な結合を 達成する。

本出願は、抗体またはレセプターのような生物学的結合分子の製造、採集および 付加に顛ることなく、表面に特異的な結合部位を製造することができる方法を開 示する０本発明の吸着剤表面への結合は選択的であり（すなわち他の分子よりも 画像化分子を好むことを示し）、また可逆的である（すなわち共有結合を含まな い）。ここで用いられるように、選択的結合とは、表面が、他のものに優先して 画像化された巨大分子と結合することを意味する。ここで用いられるように、可 逆的結合とは、結合が共有結合を形成することなく達成されることを意味する。

本発明の化学的に特定された結合部位は、より安定で、表面から離脱しにくい傾 向があり、再生による合成が可能で、製造物を生物学的材料に曝す必要がなく、 製造物の精製に付随する生物学的分子による製造物の汚染の危険性を避けること ができる。

この合理的に表面をデザインするタイプの工程は、本明細書で°″画像化”表面 と呼ぶ特異的な結合吸着剤表面の創造を含み、この表面は、ここでは“画像化さ れる”分子と呼ぶ目的の分子の表面と相補的である。

分子の表面吸着は、該分子上の少なくとも幾つかの官能基と表面のそれとの間の 相補性の存在によるものである。上記で考察したように、図ＩＡおよびＩＢは、 強力な陽イオン樹脂（図ＩＡ）および弱い陽イオン樹脂（図ＩＢ）の表面１２へ の蛋白吸着の例である。これらから明らかなように、図ＩＡの高密度陽イオン吸 着剤は、蛋白表面の陰性基と吸着剤表面１２の陽性基との間に高頻度の多数箇所 静電気誘引が存在するので、より強固に吸着した蛋白を生じる。弱陽イオン交換 吸着剤も強陽イオン交換吸着剤も、一定のいずれの巨大分子に対して特異性を示 さない。

対照的に、図２Ａは、僅か５個の陽イオン基を含む吸着剤表面１２の９Ｎ域を表 している。しかし図示するように、これらの基は吸着剤表面１２に、蛋白１０の 表面上の５個の陰性荷電に対して空間的に向き合うように配置されている。この 表面領域の陽性荷電の分布は、蛋白１０の表面の陰性荷電に対して鏡像となって いるので、荷電分布が適合しない他の他の蛋白に優先して蛋白１０と特異的に結 合する。したがって、図２Ａの吸着剤表面１２の陽イオン成分の荷電密度は図Ｉ ＡまたはＩＢの荷電密度より低いが、蛋白１０は、図１の表面よりも図２Ａの画 像化表面とより強い親和性とはるかに強い特異性で吸着するであろう。

図２Ｂは、本明細書で開示する分子画像化技術のまた別の原理を示している。特 に図２Ｂでは、異なる蛋白１４が、１対の疎水性小区画１６．１６“、３個の陰 性荷電基およびヒスチジン表面残基を有するように描かれている。ヒスチジン残 基はイミダシル側鎖をを有し、周知のように、銅または亜鉛のような金属と複合 体を形成することによって金属配位化合物に吸着することができる０図２Ｂでは 、分子画像化表面１２は、対応する１対の疎水性小区画１７．１７″、３個の適 切に散らばった陽イオンおよび蛋白１４のヒスチジン残基部位に向き合って配置 された共有結合で連結されたイミノジ酢酸（Ｉ　ＤＡ）金属配位分子を含む。図 示するように、蛋白１４は、図２Ｂの画像化表面１２と強い特異性と親和性で結 合するであろう、蛋白が適切な方向性を得た場合、吸着剤１２の表面上に適切に 散らばった３個の陽性荷電、１対の疎水性小区画、および銅イオンの存在下で金 属配位結合の全てが同時に作用し、蛋白１４をその適正な位置で保持する。図２ Ｂの表面１２は、例えば巨大分子１４と巨大分子１０とを容易に識別するであろ うことは、たちどころに理解されよう。

図２０は、ここで開示する分子画像化技術のまた別の特徴を図示する。この図は 、画像化表面１２とまた別の蛋白（ここでは１８として描かれている）の横断面 を模式的に表している。

蛋白１８の底面２０は、山および谷、または分子の三次元構造によって特定され る分子の局所構造を含む、左から右に、蛋白の表面は第一番目の１対の陽イオン 基（例えばリジンまたはアルギニンアミノ酸残基のそれのような蛋白中のアミン 側鎖）、蛋白表面上の“谷”に配置されたヒスチジン残基、疎水性小区ｉｉ！ｊ １６、および陰イオン基（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸のような アミノ酸残基に存在するカルボン酸側鎖）を含む０図２０の吸着剤では、無作為 の長さのオリゴマー鎖“フィラメント”は、マトリックスもしくはマトリックス 上の吸着表面１２を含む付着被覆に直接結合しており、上方に伸び、蛋白工８の 面２０のそれらと符号が反対の付加荷電基を有し、金属キレート基がヒスチジン 残基と向き合って配置され、さらに、疎水性部分１７は蛋白１８の疎水性小区画 １６と向き合って配置されている。

前出の記載から、荷電、疎水性小区画、および金属配位基の適切な配置（吸着剤 表面１２の面内においても、当該面に対して多少の垂直方向においても）は、そ れらが実際の構造において具体化された場合、高い特異性と親和性をもつ化学的 （生物学的という言葉に対抗して）な結合部位を創出することができるというこ とは明白であろう。この場合、画像化表面は、標的分子のコピー、複製または肖 像であり、適合する反対荷電、適合する疎水性小区画および／または適合する金 属キレート化部位を有し、これらは−緒になって化学特異的に画像化された分子 と反応して、該分子と選択的可逆的に結合するか、または複雑な混合物から標的 分子と少なくとも顕著な優先性をもって吸着するであろう。

このような目的を達成するために幾つかの方法が考えられた。

現在好ましい方法は、標的分子を活性化表面と反応させ、相補的な官能基を後に 残すことを含む。明細書の以下の部分は、そのような分子画像化表面の製造およ び使用方法を開示し、そのような物質の一定の特性を考察する。

マド鵞・クスの 本発明にしたがって製造された分子画像化表面をもつ吸着剤は多くの用途を有す る。このうち主要なものは、親和性クロマトグラフィー精製法、混合物からの標 的分子の除去（例えば食物中の毒素）のための活性化吸着剤、および特異的結合 分析（例えば生物学的物質、毒素、夾雑物、薬物等のサンプル（例えば水、体液 並びに植物および動物性物質抽出物）中の存在および濃度を検出するために広く 用いられる）である。これらの用途の多（において、固体基材またはマトリック スは、表面積対体積の比が実用的な大きさであることが理想である。生物学的分 子（例えば蛋白、炭水化物、脂質、ステロイド等）を該表面と接触させるために 移送し、選択的に結合させ、または液相中の成分において化学変化を誘発させる ことが望まれることが多いので、画像化表面への対流による溶質の移送を可能に する、均質な親水性表面と幾何学構造を有する硬質の固体を用いることが多くの 場合有利である。硬質で高い機械強度をもつ物質は、圧縮破壊されることなく高 圧による液流を可能にする。還流性マトリックスが好ましい、還流性マトリック スの作り方、これら物質の性状および固有の幾何学構造、並びにそれらの種々の 利点は、米国特許５０１９２７０号（１９９１年５月２８日発効、本出願の所有 者に譲渡）で詳細に開示されている。還流性マトリックスを製造するために好ま しい物質は、ポリマー材、例えばポリスチレンジビニルベンゼンで、好ましくは 、上記に引用した米国特許で開示されたように粒状形で合成される。不活性で疎 水性のスチレンを基材とするマトリッス材の表面に、生物学的巨大分子の水溶液 との反応に適した親水性被覆を提供するいろいろな方法が存在する。現在のとこ ろ、そのような被覆を提供する好ましい方法は、米国特許５０３０３５２号（１ ９９１年７月９日発効、バーデユーリサーチ財団（Ｐｕｒｄｕｅ　Ｒｅ５ｅａｒ ｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｗｅｓｔ　Ｌａｆａｙｅｔｔｅ）　、イン ジアナに譲渡）に開示されている。この特許は、付着させた架橋親水性で容易に 誘導できる被覆を粒状マトリックス材および他のタイプのマトリックス材上に供 給する方法を開示している。該被覆は蛋白溶液に適合性があり、さらに融通性が 極めて高く、種々の型の活性基、オリゴマー、ポリマー鎖などを所望のままに表 面に固定することができる。前述の両文献は参照により本明細書に含まれる。

本発明の画像化表面の製造の出発点として適切な３つの典型的な活性化表面は、 図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃにそれぞれ開示されている。このうちの最初のものは、 固体マトリックス１２の一部分を横断面として表しているが、高密度のエポキシ 基を有し、これらは、上記に引用したバーデユー特許に開示された方法にしたが って、マトリックス材１２に付着させた親水性表面被覆に共有結合している。こ のタイプのマトリックス材は、ＰＯＲＯ３”ブランドのクロマトグラフィーマト リックス材（例えばＦＯＲＯ５”ＯＨ）から製造でき、パーセプテイブバイオシ ステム社（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｉｎｃ、＋ケンブ リッジ、マサチューセッツ）からＦ　ＯＲＯＳ”Ｂ　Ｐとして市販されている。

エポキシ基はアミン基と反応してアルコール基と第二アミン共有結合を生じる。

アルコール基は表面の親水性に寄与する。第二アミン結合は強力な共有結合を形 成し、これは下記に開示するように利用され、種々のタイプの分子画像化表面を つくる。

図３Ｂは、多くの事例において好ましい別のタイプの活性化表面を開示するが、 これはアクロレイン（アクリロイルアルデヒド）からなり、これは１つおきの炭 素原子から技分かれするアルデヒド基（ＣＨＯ）をもつ炭化水素骨格が特徴であ る。１から２０個の範囲のモノマーユニットをもつオリゴマーを有するこのタイ プの活性化表面（すなわちａ、、ｂ、ｃ、ｄおよびｅはおよそ１とおよそ２０の 間にある）は、ここに開示するようにパーセプテイブバイオシステム社から市販 されているＰＯＲＯ３ｌｌ−ＯＨから、セリウムの存在下でアクロレインと反応 させることによって製造することができる。アルデヒド基はまた、水素化硼素シ アンナトリウムの存在下で第一窒素原子と容易に反応して、第二窒素結合と水を 生じる。他のタイプのアルデヒド活性化表面は、例えば図３０に示したＦＯＲＯ ３ＩＡＬが市販されている。エポキシ基とアルデヒド基の両方をさらに誘導して 、例えばヒドロキシル、カルボン酸基、またはアミン基に慣用的な化学手法を用 いて形成することができる。これらは、ここに開示するように、分子画像化表面 を製造するための種々の合成系での出発物質として用いることができる。

図３Ｂの活性化表面１２の重要な特徴は、その表面には、非常に高密度の活性ア ルデヒド基が基材１２の全表面に存在するだけでなく表面から外へ伸びていると いうことである。各フィラメントは、柔軟な炭化水素鎖からつるされた一連のア ルデヒド側鎖基を含む０画像化される分子表面の反応成分は、該画像化される分 子の表面の形態によって書き写された通りに、フィラメント領域表面の近（また はその中に埋め込まれたアルデヒドと反応することができる。さらに、フィラメ ントは柔軟で側面に彎曲し、空間的な小さな調整をすることによって必要となる 形態を構成することができる。このタイプの活性化表面（すなわち表面から上方 に伸びるオリゴマーユニット上に配置された化学的に活性な基を有する表面）は 、図２０に図示したような画像化される巨大分子表面の山や谷に類似、または適 合する分子画像化表面を合成することができる。それはまた、荷電基または他の 基を多数の箇所で形成することを保証する。

図３に示したエポキシおよびアルデヒド基は実例であって、好ましいものである が、用いることができるのはそのような基だけではないことは留意されるべきで あろう、以下の開示から明らかなように、活性化表面の基の性状は、画像化表面 の製造に用いられる特定の化学的画像化手法にしたがい、広範囲に変動させるこ とが可能である。

これら出発物質の重要な化学的特徴の１つは、表面に固定された活性基の表面密 度である。例えば、画像化される巨大分子表面に配置された１対の電荷が５入超 れている場合、吸着剤表面の活性基は、分子画像化処理において有用であるため には、少なくともこのように接近している必要がある。他方、１００平方人につ き９または１０個の活性基を有する出発物質は、例えば２０００平方人の分子表 面を画像化する場合に多分最適ではないが、実施できるけれども、電荷は分散し 、即ち少なくとも１０−２０人離れた物の表面特徴を伴う、したがって、画像化 可能な表面の活性基の表面の間隔は、写真表面の粒子サイズに全（類似し、必要 とされる解析に応じて種々の表面密度を用いることができるということは理解さ れよう。

百１止血九五分子 実質的にいずれの巨大分子もここに開示される方法にしたがって画像化すること ができる。ここで用いられているように“巨大分子”という用語は、少なくとも ５０平方人の画像化可能な表面積を有する分子を指す、現在のところ蛋白が好ま しい。

より小さなペプチドもまた用いることができ、さらに、ここに開示されるある種 の方法を用いて、糖蛋白、多Ｉｉ類、ポリ核酸および他の大型分子を生成するこ とができる。一般に、画像化表面と画像化される分子との接触面積（すなわち、 吸着剤と被吸着物質との間の接触面積）は、少なくとも約５０平方人、より好ま しくは１００人であるべきで、多くの場合１０００人を越えるであろう。

−ａに、ある合成で画像化されるある巨大分子上の一定表面の数を限定するのが 好ましい、これは、巨大分子の表面のｌ〇−２０個の異なる画像を作製すること が可能であろうということと、各々は異なる結合定数をもつであろうという理由 による。

蛋白の場合は特に、画像化工程で高濃度の有機溶媒、極端なｐＨ５または温度上 昇は避けるべきである。これら全ては、蛋白または他の画像化される生物学的分 子の三次元構造を変化させ、誤った分子画像をつくりその天然の性状を反映しな いこととなる。

それ故、分子画像化の重要な特徴は、画像化される表面に対して画像化される分 子が一定の方向をとることを必要とする。

ここで開示する共有結合固定による合成経路を用いる場合、分子の一定方向化は 、硫酸ナトリウムのようなアンチカオトロピズム塩を用い、蛋白を表面へ押しや り、疎水性反応を促進することによって達成できる。また別に、荷電基を表面に 含ませることによって、画像化される分子の方向を自然の状態で最も好ましい結 合構成（すなわち反対荷電に富む分子面を示す）で一定にすることができる。

吸着剤表面の均質な画像化結合領域を促進するまた別の方法は、画像化される分 子として標的蛋白の表面領域のペプチド類似体を用いることである。したがって 、画像化される蛋白の消化サンプル、または無作為につ（りだしたペプチドを、 例えば単クローン性抗体を用いて、またはここで開示するように製造した画像化 表面を用いて親和性クロマトグラフィーによってスクリーニングし、画像化され る蛋白の荷電または他の表面の造作の分布にｍＷ（Ｇする、短い（例えば５−２ ０のアミノ酸）ペプチドを得ることができる。そのようなペプチドを得る方法は 当該技術分野では既知である。また別に、急激に増大している重要な種々の巨大 分子のＸ線回折およびＮＭＲデータベース、およびそのようなデータやアミノ酸 配列情報を基にした蛋白などの画像を表示するプログラムも、与えられた巨大分 子の表面構造に類似するペプチドの配列を決定するために用いることができる。

画像化される分子としてそのようなペプチドの使用は、大量の画像化吸着剤を合 成する場合、コストについて好ましい。

それらはまた、触媒表面の製造に有用な一時的中間体類似体の原料を提供し、さ らに、本発明の吸着剤の製造において、画像化に利用できる表面の数を著しく減 少させることによって、何れの場合にも画像均質性を促進する手段を提供する。

イオン　の 一つの具体例では、分子画像化表面は、複数の露出リジンまたはアルギニン残基 （その特徴的な第一アミン側鎖を有する）を含む蛋白と、図３Ａに示したような エポキシド表面、または図３Ｂもしくは３Ｃのアルデヒド基誘導表面とを接触さ せることによって製造される。アルデヒドもしくはエポキシドとアミン基との反 応の後、蛋白は強塩基または蛋白分解酵素（プロナーゼ等）の混合物を用いて酵 素的に消化し、蛋白内のこれら残基の正確な相対位置に対応するリジンもしくは アルギニンアミノ酸のみを残す、陽性荷電アミンは、アクリル化によって中和さ れ、画像化される蛋白上の陽性荷電アミンの正確な位置に陰性荷電のカルボキシ ル基を残す０表面のヒドロキシル基（これはアクリル化段階でエステル化される であろう）は、加水分解によってヒドロキシル形に戻すことができる。そのよう な画像化表面は、多数の箇所の静電気誘引によって画像化される分子に選択的、 可逆的に結合し、一方法の全ての蛋白は、あたかも非常に弱い陰イオン表面と向 き合っているかのように極めて弱く反応するだけである。

前述の合成技術をどのように実施するかの詳細は、図４Ａから４Ｅに示す０図を 参考に、図４Ａは、複数のエポキシ基を導入した活性化表面１２と、さらに溶液 中に入れられ、表面１２に接近して一定の方向を有する蛋白（ここでは本発明の 技術を示すために、介在アミノ酸配列が側面にある中央のアルギニン残基と１対 のりジン残基を含むアミド結合アミノ酸として描かれている）を表している０図 示するように、リジン残基はＣ４Ｈ，−ＮＨ，から成る側鎖基を含み；アルギニ ン残基はまた、ＮＨ，基で終わる側鎖を有する。この合成方法の目的は、表面１ ２の方々に間隙を置いて配置された陰性荷電成分を提供し、それらが、画像化さ れる蛋白表面の一部分を構成するリジンとアルギニン残基の側鎖からぶら下がっ ているＮＨ！基の位置と適合するようにすることである。説明を容易にするため に、図４Ｂおよび以後、蛋白の骨組みは、水平に伸びる線で簡単に表し、側鎖基 のみを明らかにする。

図４Ｂに示すように、アミン基は隣接するエポキシ基と反応して、表面１２およ び蛋白と結合している第二アミンを介して共有結合を形成する０例えば燐酸ナト リウムのような弱い塩基の存在下（ｐＨ：９）では、未反応エポキシ基は開いて 、親水性ジヒドロキジル化合物を形成する０次に、蛋白を完全に加水分解させる ために、ＫＯＨのような強塩基で反応混合物を処理する。１から３規定の水酸化 カリウムがこの工程に適切である。

蛋白分解酵素もまた用いることができる。結果を図４０に示すが、ここでは、２ つのりジン残基と１つのアルギニン残基が残っている。表面１２から伸びる共有 結合鎖の末端の分子構造は、アミノ酸の特徴であるアミノ基とカルボキシル基か らなっていることは留意されるべきである。次に図４０に示した画像化表面中間 体を、ピリジンのような適切な溶媒中で、例えば無水酢酸（ＣＨｚＣＯ）ｚｏで 処理してアミン基をアシル化する。図４Ｄに示したように、これによってアミノ 酸の陽性荷電領域の誘導と除去がもたらされ、画像化工程を開始するために最初 に用いた蛋白上のアミン基と正確に向き合う位置に陰性荷電カルボン酸基を残す 。

図４Ｅは画像化表面の作用を示している０図示したように、溶液中に他の溶質と ともに存在する画像化される蛋白は、画像化表面に遭遇するとき、リジンおよび アルギニン側鎖のアミン基が静電気誘引によってカルボン酸基で“緊密される” ので優先的に結合する。したがって、分子画像化表面と画像化される蛋白との関 係は、図２Ａに示したようなものである。すなわち、画像化表面１２と画像化さ れる分子の表面にそれぞれ付着した空間的に適合する陰イオン基と陽イオン基の 力によって、選択的吸着が生じる。

表面１２は複数のＯＨ基で覆われていることは図４Ｅでも認められる。これらは 、水素結合で役割を果たし、画像化される巨大分子と画像化表面との間の親和性 結合定数を高めることができる。

図５Ａから５Ｄを参考に、図４で説明したものと類似するまた別の一連の分子図 が示されているが、これは、基材１２が、図３Ｂに図示したアルデヒド誘導開始 物質タイプであるという点で図４と異なる。図５Ａに示すように、例えばリジン 側鎖のアミン基は、基材１２からいくぶん離れたフィラメントからぶら下がって いるアルデヒド基と接触するとき、図５Ｂに示すように表面蛋白と第二アミン結 合を形成する。残存するアルデヒド基は水素化硼素ナトリウムによって第一アル コールに還元される。強塩基の存在下では、蛋白のアミノ酸を連結しているペプ チド結合はともに加水分解される。これによって図５Ｃに示した様な構造が生じ 、ここでは、蛋白がアミン側鎖をもつ各場所では、アミノ酸残基はその特徴的な アミン基とカルボン酸基とともに残留する。この構造は、次に、無水酢酸のよう なアシル化試薬を用いてアミン基をアシル化するために処理され、画像化される 蛋白の露出した側鎖の種々のアミン基と適合する位置に、表面１２の上の陰性荷 電カルボン酸をもつ図５Ｄの構造を生じる。

上記に記載したように、画像化反応工程前または工程時の画像化される分子の方 向一定化は、疎水性反応または静電気誘引のいずれかによって達成される。静電 気反応の利点は、合成に含まれる接触面の荷電部位の数を最大にする方向の一定 化を行わせることにある。図６は、複数の空間的に離れた陰イオンを含む画像化 表面の製造で、静電気的に方向を一定化した画像化反応を可能にする、反応工程 タイプの例を示している。

図６Ａは、表面１２から上方に伸びるα−カルボキシルβ−ヒドロキシルフィラ メントを含んでいる反応性表面１２と繋がる蛋白（ここではアミノ側鎖基で終わ る直線として単純に示しである）を表す、カルボキシル基の陰性荷電極性と蛋白 上のアミン基の陽性荷電極性とが反応して、画像化工程中に、活性化基材表面に 蛋白の分子表面を定着させる。アミン基とエポキシもしくはアルデヒド基間の接 触に際して実質的に即時反応が生じる先の具体例と異なり、この例では、反応は 自動的に起こるのではな（、画像化される分子と画像化されるべき表面との間に 平衡が生じ、比較的少数の互いに離れた分子表面画像の製造を促進する。すなわ ち、全ての結合領域をさらにそれらの荷電分布に近似させ、さらに吸着剤と接触 するもっとも陽性に荷電された表面を有する画像化される分子を一定の方向に並 べることができる。

図６Ｂに示すように、ＥＤＡＣの存在下では、アミン基と吸着剤表面のカルボン 酸基との間にペプチド結合が形成される。

過ヨウ素酸塩の存在下では、遊離カルボン酸基はアルデヒド基に変換され（図６ Ｃ）、続いて、水素化硼素ナトリウムの存在下でアルコール基に変換される（図 ６０）。次に、Ｋ　ＯＨのような強塩基を用い、すべてのペプチド結合を加水分 解し、この画像化された表面に共有結合し、画像化された蛋白上のアミン側鎖基 と鏡像関係で周辺に散らばるカルボン酸基を残す。

イオン　の晋 図７Ａから７Ｅは、本発明の画像化表面のまた別の具体例の製造方法を示す。こ の事例では、画像化される分子は、静電気力によって、蛋白の画像化される表面 が最も陰イオン性の部分となるように表面に向けられる。蛋白が、図７Ａの左か ら右に、例えば陰イオン性カルボン酸側鎖をもつアスパラギン酸、また別のカル ボン酸側鎖をもつグルタミン酸のようなアミノ酸、およびその側鎖に陽イオン性 アミン基をもつリジンを含からなるように示されるとき、表面の形成が開始され る。

繰り返せば、画像化される蛋白は、その側鎖のカルボキシレート基がマトリック ス１２またはマトリックスに結合させた被覆に直接共有結合した第一アミン基に よって静電気的に誘引されるように表面と平衡させる。アミン基部分を含む活性 化表面は種々の技術を用いて合成することができる。また別に、慣用的な市販の ポリイミンまたはポリアミン陽イオン交換樹脂を用いることができる。

蛋白表面の陰性荷電は、活性化表面上の陽性荷電に誘引される０図７Ａの右の両 端矢印で示したように、接触するアミン基は互いに反発するであろう、ＥＤＡＣ を用いる反応系による処理で、図７Ｂに示したように吸着剤上のカルボン酸側鎖 基とアミン基との間にアミド結合化じる。過ヨウ素酸塩（Ｉ　Ｏ，）中での強酸 化によって、図７０で示したように表面からメチルアミンが遊離し、末端アルコ ールをアルデヒド基に変換される。

アミン基が極めて接近できるようにアルデヒド基の密度が十分高いことを条件と して、生じたアルデヒド基とリジン側鎖上の第一アミン基との間でシッフ塩基が 生成する。図７Ｄに示したように、水素化硼素ナトリウムによる処理に際して、 アルデヒド基はアルコール基に変換されシッフ塩基は第二アミンに変換される。

次に、図７已に示したように、強塩基で全てのペプチド結合を加水分解し、表面 １２に共有結合し、画像化される蛋白の側鎖のカルボキシレート基と向き合って 位置するアミン基を残す。画像化される蛋白が本来アルギニンまたはりジン残基 を持つ場合、それは画像化表面と結合する。

図８Ａおよび８Ｂは、分子表面上に複数の陽イオンと疎水性小区画をもつ蛋白を 共同して誘引できるように、吸着剤表面に共有結合し配置された陰イオンと疎水 基とをもつ画像化吸着剤の合成方法を示している。図８Ａは、図３Ｂに示したタ イプの活性化表面１２を示すが、これは、その表面から伸びるフィラメントを含 み、その各々は複数の突出したアルデヒド基を有する。ここで画像化される蛋白 は、リジンとアルギニン残基との間に位置する疎水性小区画１６を有するものと して記載されている。

アルデヒド活性化表面と蛋白とを一緒に混合して画像化工程を開始する前に、両 親媒性分子（ここでは疎水性（ここでは炭化水素）尾部１７と共有結合したアミ ン基を有するアミン石鹸として図示されている）を、石鹸分子の疎水性部分が結 合し、蛋白表面の疎水性小区画１６に埋め込まれる条件下で混合する。

その後、画像表面の画像化とその後の合成は、実質的に図５Ａから５Ｄについて 上記に記載したように実施される。結果は図８Ｂに示す。

図示したように、合成の結果、表面１２に共有結合した陰イオンが、画像化され る蛍白の表面の陽イオンと反応する位置に配置され、疎水基が、蛋白の疎水性小 区画と疎水性−疎水性誘引によって反応するように配置される。疎水性両親媒性 分子は、リジンまたはアルギニン残基と正確に同じ方法で第二アミン結合を介し て表面に結合される。両親媒性分子は、例えば式Ｒ−Ｘの化合物を含むことがで きる。ここで、Ｒは疎水基で、例えば環状、分技若しくは直鎖のいずれかの飽和 もしくは不飽和炭化水素、ハロカーボン、またはアリール基または複素環核で、 Ｘは、適切な活性化表面と結合し、共有結合を形成することができる反応基であ る。Ｘは、例えば、上記の例のようなアミン基またはカルボキシレート基である 。活性化表面がアミン基部分を含むとき、Ｘはエポキシまたはアルデヒド基でも よい。この工程は、荷電基の並行的形成とともに用いることもでき、または単独 でも用いることができる。それはまた、予め選択された巨大分子種と適合する多 数箇所の疎水性反応によって選択的に結合する、画像化逆相マトリックス材を製 造するためにも用いることができる。

図９Ａ−９Ｃは、金属の存在下で１ｍ１ｄｉｚｏｌｅ　（イミダシル）側鎖と金 属配位結合を形成するようにデザインした箇所で、金属配位化合物（ここではイ ミノジ酢酸）を吸着剤表面に配置させるための合成工程を開示する。図９Ａは、 画像化工程前にイミノジ酢酸と金属イオン（例えば銅）と混合し、図９Ａの中央 に示した１ＩＩｌｉｄｉｚｏｌｅ　（イミダシル）とＩＤＡ基との間に金属配位 複合体を形成する蛋白と繋がる活性化表面を示す（ここで番よ図３Ａのタイプの エポキシ表面として例示）。ｉ＋ｍ１ｄｉｚｏｌｅ　（イミダシル）側鎖基をも つ中央のヒスチジン残基に隣接するものは、１対のりジン残基である０画像化表 面の形成は、図４Ａカ・ら４Ｅに示したような反応工程を用いて行われるが、配 位金属を除くために、蛋白の加水分解の後ＥＤＴＡのようなキレート剤を反応混 合物に加え、それによって図９Ｂに示したように蛋白上のヒスチジン残基の位置 から間隙を置いて反対側にイミノジ酢酸残基を残すという点が異なる。図９０は 、９Ｂの画像表面を画像化される分子と反応させる方法を模式的に示してしする 。

図示したように、蛋白表面の陽イオンと吸着剤表面の陰イオンとが静電気誘引に よって反応するのと同じときに、１ｍ１ｄｉｚｏｌｅ（イミダシル）残基とイミ ノジ酢酸残基との間で、銅のような金属の存在下で（Ｍ’と図９０に示す）金属 配位結合が形成される。この方法はまた、上記のように多数箇所の金属配位結合 をもつ画像化金属配位マトリックス材を製作するために、または疎水性反応官能 基の同時生成とともに用いることができる。

本発明は、以下の非制限的実施例からさらに理解されよう。

前述の記載から、特定の画像化表面を製造するための多くの別の方法が存在する ことは理解されよう。さらに、画像化される特定の巨大分子に対する選択性と親 和性を最適なものとするために、多くの合成を利用できるが、各合成の後で次の 繰り返しを誘導するために分析を行い、それによって所望の吸着特性により近い ものを得ることができることは理解されるところである。この一般的なアプロー チの説明は以下の実施例から明らかになる。

コンピューター支援デザインが、特定の画像化表面の開発を促進するうえで重要 な役割を果たすであろうということは、本発明の意図するところである。蛋白お よび他の巨大分子構造の構造分析用ソフトの有利な開発方法の例は、図１２に示 す０図示するように、与えられた巨大分子（ここでは“蛋白Ｘ”）は、ここで開 示されたように簡単に反応性画像形成に付され、“原型”画像化表面を生じる。

この表面を低容量工程に用いる場合は（例えば分析）、原型で十分であろう。し かし、蛋白Ｘの構造データが既知の場合、その三次元構造および関連する表面特 性は、市販の分子構造分析ソフトを用いて汎用コンピューターで明瞭に理解する ことができる。したがって、例えば問題の巨大分子の利用可能なデータにしたが い、巨大分子の特定表面上の１つまたはそれ以上の疎水性小区画、ヒスチジン残 基、または荷電アミノ酸の少なくともその存在、およその間隙、および相対的な 位置を知ることができる。この情報は、どの方法が良くて、どの方法が悪いかを 決定するとき化学者に役立ち、必要な実験を大きく減少させる０例えば、金属キ レート化を用いるべきか、疎水性小区画の画像化だけで良いか、アンチカオトロ ピズム塩を画像化工程で用いるべきか、もしそうならば、分子のどの面が画像化 されるべきか、さらにどんな造作がその面上にあるか、全てはモデリングによっ て決定することができる。

したがって、多くの工学的状みの場合のように、コンピューター支援デザイン技 術は、デザイン工程を能率化し、短縮する識見を与えることができる。

大容量の吸着剤が必要とされる場合、または高度に“単クローン性”画像化吸着 剤を所望する場合、本発明にしたがい、まず理解し、分析し、続いて所望の巨大 分子の表面と類似する構造を有するペプチドを合成し、そして、反応性画像形成 工程で該ペプチドを用いることができる。この試みを実行するまた別の方法は図 １２に開示されている。したがって、部分的に加水分解された蛋白Ｘから生成さ れたペプチド、その他の蛋白源、または合成ペプチド混合物を、原型画像化表面 との結合について、例えば濃度勾配溶離液による分画溶出で親和性クロマトグラ フィーを用いてスクリーニングし、原型表面と結合するペプチドを同定すること ができる。続いて、このペプチドそれ自体を用いて、第二の表面を製造すること ができる。これを順次蛋白Ｘとの結合について調べる。新規な表面が所望の結合 特性を有する場合は、大量の画像化されるペプチドを合成し、画像製造量の画像 化吸着剤に用いることができる。そうでない場合は、別のペプチドを画像化し、 さらに工程を繰り返すことができる。

また繰り返せば、ＣＡＤはこの方法に利点を与える。したがって、表面ペプチド 配列の分析は、表面模倣ペプチドを明らかにすることができる。続いてそれを配 列決定し、合成し、場合によって原型画像化表面をスクリーニングし、反応性画 像形成に用いて新規な表面を製造することができる。この新規な表面は、同定ペ プチド、または他のペプチド同様、蛋白Ｘを用いて再び検査することができる。

繰り返せば、所望の特性をもつ表面が一旦得られれば、画像化された巨大分子と してペプチドを用いて大量に複製することができ、選択的に、さらに所望の親和 性で蛋白Ｘに結合するであろう。

ス」１例」−、リゾチーム画像化 ＦＯＲＯ３Ｉ−ＯＨ（バーセプテイブバイオシステム、ケンブリッジ、ＭＡ）を 、エビクロロヒドリン−グリシドール共重合体を用いて米国特許５０３０３５２ 号にしたがって調製し、続いて架橋して表面ヒドロキシル基に冨むマトリックス を製造した。この物質をＰ　Ｂ　ｒ　ｓで臭素化し、続いて強塩基の存在下でソ ルビトールで誘導した。得られた表面を（ジオールに冨む）ＮａｌＯａで酸イビ し、その後リゾチーム（３０ｍｇ／ｇビーズ）を用いて、１．６ＭＮａｚＳＯ４ ，０，１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ９，０）の存在下で２０時間、Ｎ　ａ　ＣＮ　Ｂ　 Ｈ３の存在下で画像化した。反応の終了後、過剰のアルデヒド基はＮａＢＨ，で 還元した。結合蛋白は４ＭＫＯＨで１６時間加水分解し、続いて無水酢酸で２時 間アシル化した。過剰のエステル基は０．５ＭＫＯＨで２時間加水分解した。結 果は図４已に示したタイプの画像吸着剤で、これはりゾチーム表面のアミン含有 側鎖基と鏡像関係にある間隙を置いて配置された陰イオンをその表面に有する。

フーリエ変換赤外線分光分析（ＦＴＩＲ）を用いて、反応系の進行を分析した。

したがって、リゾチーム単独、ソルビトール活性化表面に固定されたりゾチーム 、基材マトリックスのスペクトルを差し引いた固定リゾチーム、加水分解後の基 材マトリックスの表面、およびアシル化後の表面マトリックスのスペクトルの全 てを比較した。予想した通り、リゾチーム単独および基材マトリックス上のりゾ チームは非常に類似していた。加水分解後のスペクトルは、特徴的な最大バンド が３３００．１６５０、および１５５０ｃｍ−’から消失し、リゾチームが存在 しないことを明瞭に示した。また、アシル化後の支持体のスペクトルは、酢酸エ ステルの存在に対応する１７５０と１２００ｃ　ｍ”の位置に一対のバンドを示 した。最後に、画像化支持体はＯ，ＩＭＫＯＨで５マイクロリツトルづつ増加さ せながら定量した。該吸着剤の表面には測定可能なイオン容量は検出することは できなかった、予想されたとおりこれは陰イオン荷電密度が極端に低いことを示 している。

続いて吸着剤を４．６Ｘ１００ｍｍカラムに充填し、塩化ナトリウムを０からＩ ＭまでＰＨ６で濃度を上昇させながら、チトクロームＣとリゾチームを表面に添 加した。チトクロームＣのピークは、非常に低いイオン強度でカラムから溶出し 、続いてほんの少し高い濃度で別のピークが続き、これはりゾチームの溶出を示 している。

画像化表面へのやや弱いリゾチーム結合を示しているこの実験の結論は、陽イオ ン交換表面ばカラムの１１様およびＦＴＩＲによって示されるように良好に製造 されたが、一方、濃度勾配モードでリゾチームを溶出させるために必要な塩濃度 がやや低い（はぼ０．３Ｍ）ことによって、出発物質の表面の活性基の密度がお そらく低すぎ、リゾチームと吸着剤の結合領域との間のイオン反応点が極めてわ ずかしか産生されなかったことを示している。したがって、親和性を改良するた めに、出発物質表面のより高い密度の活性基を用いて実験を繰り返した。

災ｍ。

ポリスチレンジビニルベンゼンＦＯＲＯ３”吸着剤を再びエビクロロヒドリン− グリシドール共重合体で処理し、還流性粒状物質の表面の周りにヒドロキシル基 領域を製造した。この出発物質を続いて７５０ミリリツトルの水に懸濁し、真空 状態と窒素でガス抜きし、２５ｍ１のアクロレインと１２．５ｇの硫酸セリウム を加えた。混合物を窒素下で８時間室温で攪拌し、続いて水、硫酸、水、さらに アセトンでビーズを洗浄し、真空オーブン中で６０℃で乾燥させた。この工程に よって、図３Ｂに示したタイプのアルデヒド活性化フィラメント表面が得られた 。利用可能な基の表面密度は、図３Ａと実施例１のエポキシ活性化表面よりはる かに高い。なぜならば、アルデヒドはＰＯＲＯ３ＩＩ支持体の表面だけでなく、 ポリマーフィラメントからも伸びているからである。

３０ｍｇのリゾチームを０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ９，０）２．５ｍｌに溶解し た０次に、０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ９）中の２．０Ｍ硫酸ナトリウム１２．６ ｍｌをリゾチームと混合し、この溶液を２ｇのアクロレイン活性化ビーズ調製物 に加えた。この混合物を室温で３時間振とうし、続いて１００ｍｇの水素化硼素 ナトリウムを加えさらに１時間振とうした。その後、ビーズを水で洗浄し、５０ ｍ１の４ＭＫＯＨに懸濁し、還流で１６時間攪拌した。続いてビーズを水とアセ トンで洗浄し、６０′Ｃの真空オーブンで乾燥させた０次に、２５ｍ１のピリジ ンに懸濁し、その後２５ｍ１の無水酢酸を添加した。混合物を還流下でさらに２ 時間攪拌し、続いてビーズを水とアセトンで洗浄してから乾燥させた。

合成の推移はＦＴＩＲで再び追跡した。実施例１について上記で考察したように 同様な一連の赤外線スペクトルを得た。しかし、０．１ＫＯＨによる力価測定で は、イオン容量は約１μｍ／ｍｌであることが分かった。

コントロールとして、アクロレイン誘導表面を、いずれの画像化剤も含まない上 記の反応系に曝した。このクイズの物質における溶出実験は、実質的にコントロ ール表面にリゾチームが保持されないことを示した。リゾチームはＮａＣｌの１ １００ｎ未満で溶出するであろう。

画像化表面のクロマトグラフィー性能は、上記に開示したように製造した物質を ４．６Ｘ１００ｍｍＯカラムに充填して評価した。ｐＨ８におけるリゾチームの 濃度勾配溶出の表を図１ＯＡに示す、このカラムに、ｐＨ８のトリス緩衝液で平 衡化した１ｍｇ／ｍ＋のりゾチームの注入液１００μｌを添加した。

ＩＭＮａＣｌ　（２７ｍＳ、伝導率）まで３分の濃度勾配では、結合リゾチーム は約１７ｍＳで溶出する。

このリゾチーム画像化カラムの性能は、高容量の強陽イオン交換カラムとの比較 によってもっとも良く示される０図１０Ｂは、市販の陽イオン交換カラム（Ｐ　 ＯＲＯＳ”Ｂ　３７Ｍ）でのりゾチームとチトクロームＣの濃度勾配分離を示し ている。リゾチームは０．５５ＭＮａＣｌ　（１５ｍＳ）で溶出し、一方チトク ロームＣは０．４２ＭＮａＣｌ　（１１ｍＳ、この場合２７ｍ５はＩＭＮａＣＩ にほぼ等しい）で溶出する。対照的に、図１０Ｃは、リゾチーム画像化カラムを 用いて同じ試験を示している。この場合、リゾチームは０．６ＭＮａＣｌ　（１ ６ｍＳ）で溶出し、一方チトクロームＣは０．１５ＭＮａＣ１（４ｍＳ）で溶出 する。これら２つの表面の相違は、リゾチームは両方に強力に結合するが、チト クロームＣはリゾチーム画像化カラムに弱く結合することである。この画像化カ ラムの同じ分離像は、リゾチームを他の蛋白と混合したときに示される０図１０ Ｄは、キモトリプシノーゲンは弱く結合し、一方リゾチームは強固に結合するこ とを示している０図１０Ｅは、リゾチームは強固に結合し、一方リボヌクレアー ゼは弱く結合することを示している。

さらにその他の実験は、これらの結果はＰＨ６，２で再生できることを提唱する 。しかし、画像化表面の官能基は弱い陰イオン基すなわちカルボキシルであるの で、カラムは低いｐＨでその能力を失うであろうと考えられる。予想されたよう に、ｐＨ４，５では画像化カラムはリゾチームを良く結合せず、濃度勾配の開始 時に溶出し、一方チトクロームＣは完全に保持されない。これは、ｐＨ４，５で 両蛋白と良（結合する、図１０Ｂで用いた強力な陽イオン交換体と対照的である 。

オン／オフ親和性モードでリゾチーム画像化カラムを用いたいと考える場合は、 少量の塩化ナトリウムをサンプルおよび洗浄用緩衝液に含ませることができる。

この場合、供給液が１００ｍＭの塩化ナトリウムを含むことを条件に、画像化カ ラムはりゾチームおよびチトクロームＣの混合物から選択的に、実質的に専らリ ゾチームと結合する。その後、溶出は塩化ナトリウム濃度を１．０モルまで上昇 させることによって実施される。

図１１は、リゾチーム画像化カラム（上段）および強力な陽イオン交換体（ＳＣ Ｘ）カラム（Ｐ　ＯＲＯＳ”Ｈ３７Ｍ）で正確に同じ条件下で実施した、リゾチ ームとチトクロームＣとの間の勾配溶出を直接比較したものを示す。リゾチーム は両表面に強力に結合し、一方チトクロームＣ（ｐ１９Ｈよ画像化表面に弱く結 合する。

イオン交換カラムへの蛋白吸着モデルはレニエら（Ｒｅｇｎｉｅｒら、クロマト グラフ反応における蛋白構造の役割（Ｔｈｅ　Ｒｏｌｅｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　 ５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｉｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ　Ｂｅｈａｖｉｏ ｒ　５ｃｉｅｎｃｅ）、２３８巻、３１９ページ、１９８７年１０月１６日）に よって開発された。このモデルは、溶質の保持を溶離液の濃度と次の式によって 相関Ｚ 式中に゛は容量分析クロマトグラフ保持因数で、Ｎよ結合定数と相関する定数で 、Ｄは溶離液として用いた塩の濃度で、２番ま蛋白と表面との間の反応部位の数 を反映する定数である。

強陽イオン交換体と画像化カラムとにおけるリゾチームおよびチトクロームＣの 保持態様を調べるために同種実験（１ｓｏｃｒａｔｉｃ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ）を実施した。リゾチームとチトクロームＣの１ｏｇｋ’対りを作図し、その後 、直線回帰分析を行うことＧこよって、以下の表に示す定数ＩおよびＺの概数を 得ることができた。

表１ リゾチーム　チクロームＣ 画像化　ＳＣＸ　画像化　５ＣＸ １　０．２５　０．０３　０．００６　０．００３Ｚ２．５　５．０　２．５　 ４．５ 表に示したように、リゾチームは、強陽イオン交換表面（ＳＣＸ）とは５個の部 位を介して、画像化表面とは２．５個の部位を介してのみ反応する。これは、対 応する表面上の異なる領域を介して結合するか（リゾチームを塩で沈澱させる画 像化工程でアンチカオトロピズム塩の使用に一致する）、または分子の横断面積 につき２から３個の部位をもつ低荷電密度で結合するかのいずれかであることを 示唆している。後者は、同様な大きさの他の溶質はせいぜい２．５個の部位を介 してこの表面と反応するはずだということを示唆している。この予想は、少なく ともチトクロームＣの場合（抗リゾチーム画像化カラムでＺ数が２．５である） には実証される。

リゾチームは、慣用的な強陽イオン交換カラムと比較して、画像化表面の多くの 部位の半分としか結合しないが、画像化表面との結合定数は、強陽イオン交換体 上のそれの約１０倍である。このことは、画像化表面との協調釣結合のための強 力な証拠となる。この発見は、画像化表面（１μＭ／ｍｌ）と強陽イオン交換表 面（５０μＭ／ｍｌ）との間のイオン受容力の大きな相違によってさらに強化さ れる。最後に、２つの表面の相対的結合強度を比較することができる０強陽イオ ン交換体では、リゾチームは等しい数の部位を介してチトクロームＣの場合の１ ０倍の強さで結合する。リゾチームは、チトクロームＣより４０倍強く画像化表 面に結合する。前端添加実験によって、リゾチームと画像化表面との間の結合定 数は、この結合過程についてラングミュア等温式を仮に当てはめると、約２Ｘ１ ０”Ｍ伺である。抗体抗原反応と比較して、この最終点は低い。しかし、２．５ 個の部位を含むということを考えれば、それはむしろ強力な反応を示している。

裏旌■主 ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）は、ｐｔが５．７である。ｐＨ６または８で、し たがってその表面は陰性に荷電する。ＢＳＡは、実施例２で述べたように反応画 像化工程で用いることができる表面アミンを有し、一方静電気的反発は、そのよ うな画像化表面とのＢＳＡの吸着を干渉すると予想される。これを前提として、 ＢＳＡは実施例２の工程にしたがって画像化された。

反応系のＦＴＩＲスペクトルは、画像化工程が期待通りに処理されたことを示し ている。この物質のイオン受容量は約１．７μＭ／ｍｌと測定された。

このＢＳＡ画像化表面のクロマトグラフィーによる評価を、実施例３で述べたも のと類似の態様で実施した。この表面からのりゾチームとチトクロームＣの溶出 像は、リゾチームは弱く保持され、溶出には約０．２ＭのＮａＣＩＬか必要とし ないが、一方チトクロームＣは保持されない。予想通り、ＢＳＡはこのＢＳＡ画 像化表面と弱く結合する。静電気的反発がこの反応の理由であると考えられる。

したがって弱陽イオン交換を介してリゾチームと結合し、チオクロームＣとは結 合せず、さらに上記の力学的な説明でその標的と弱く結合する、陽イオン交換表 面が形成される。

保持図は、このＢＳＡ画像化表面へのリゾチームおよびチトクロームＣの結合の 特徴を知るために、上記の実施例２で説明したものと同様な方法で作製された。

この表面へのチトクロームＣの結合は、あまりに弱くＺまたはＩの信輔できる概 算はできなかった。リゾチームのＺ数は４．２で、一方■数は、それぞれ（１， ００４および０．００３であった。より高い荷電密度（リゾチームに特異的では ないけれども）は反応部位を４．２まで増加させるようである。ＢＳＡ画像化表 面へのりゾチームの結合定数は、リゾチーム画像化表面へのチトクロームＣのそ れと較べて当然低い。

結合強度は反応部位の数に部分的に由来する。上記で考察したように、全体的な 結合強度数（１）は、溶質と表面リガンドとの間の結合定数（Ｋ）と相関する。

実施例２では、Ｋはリゾチームとりゾチーム画像化表面では２　Ｘ　１０’Ｍ− ’と測定された。この測定値におよび種々の表面に対する■値の比率に基づき、 他の関連する表面に対するに値を決定することができる。

全体的な結合定数は個々の反応定数の産物であると仮定すると、以下の表で示し 泥ように、さらに単一部位の平均結合定数（ｋ”′りを産出することができる。

表ＩＩ リゾチームに対する単一部位結合定数の概数：ＳＣＸ　１１５ リゾチ一ム画像化　３３０ ＢＳＡ画像化　１２ 前述の分析は、リゾチーム画像化表面へのりゾチームの協調的結合を示している 。ＢＳＡ画像化表面とＳＣＸ表面が同様な態様を有する一方、リゾチーム画像化 表面は反応部位につき３０倍強く結合する。

本発明は他の特異的な形態で具体化できる。したがって、他の具体例も以下の請 求の範囲に含まれる。

特表千７−５０５３３５　（１８） Ｆｉｇ、　７Ａ Ｆｉｇ、　９Ａ Ｆｉｇ、　９Ｂ Ｆｉｇ、　９Ｃ Ｆｉｇ、　ＩＯＡ ′”　Ｆｉｇ、　ＩＯＢ 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成６年９月２９日

Claims (55)

【特許請求の範囲】
1. １．分子表面の方々に間隙を置いて配置された複数のイオン化可能な基を有する 予め選択された有機分子を選択的に結合する、多数の領域を含む結合表面を形作 る固体材であって、該各領域が、該結合表面に結合し、さらに該イオン化可能基 の少なくとも小群と鏡像の状態で、かつ逆の荷電で該領域内に空間的に離れた関 係で配置された複数の荷電成分を含み、それによって該領域が、空間的に適合す る静電気的誘引によって、他の分子より該予め選択された分子の表面と優先的に 結合する、結合表面を形作る固体材。
2. ２．　多数の結合領域を含む結合表面を形作る固体材、および該結合領域に空間 的に適合する多数箇所の静電気誘引によって結合する多数の有機分子を含む物質 の構成であって、該各有機分子が、その分子表面の方々に間隙を置いて配置され た複数のイオン化可能基を形作り、 該結合領域が、該結合表面に結合し、さらに該イオン化可能基の少なくとも小群 と鏡像の状態で、かつ逆の荷電で該領域内に空間的に離れた関係で配置された複 数の荷電成分を含むものである物質の構成。
3. ３．　該結合表面が、該固体材の表面に付着させた被覆からなる請求の範囲第１ 項または第２項の発明。
4. ４．　該固体材が有機ポリマー粒状物質からなる請求の範囲第１項または第２項 の発明。
5. ５．　該固体材が還流性マトリックスからなる請求の範囲第１項または第２項の 発明。
6. ６．　該結合表面が、該有機分子のイオン化可能基と結合する荷電成分より多く 結合荷電成分を実質的に含まない請求の範囲第１項または第２項の発明。
7. ７．　該荷電成分が、カルボキシレート、スルホネート、ホスフェート、および ホスホネート成分から成る群から選ばれる陰性荷電成分からなる請求の範囲第１ 項または第２項の発明。
8. ８．　該荷電成分がカルボキシル基からなる請求の範囲第１項または第２項の発 明。
9. ９．　該荷電成分が、第一アミン、第二アミン、第三アミンおよび第四アンモニ ウムから成る群から選ばれる陽性荷電成分からなる請求の範囲第１項または第２ 項の発明。
10. １０．　該荷電成分が柔軟な成分を介して該結合表面に結合し、さらに空間的に 離れた荷電成分が構造的に従順な荷電表面を形作る、請求の範囲第１項または第 ２項の発明。
11. １１．　該柔軟な成分が長さが様々なオリゴマーからなり、それによって、該個 々の荷電成分が該結合表面から様々な距離で配置される、請求の範囲第１０項の 発明。
12. １２．　該予め選択された有機分子が該分子表面に疎水性小区画を形作り、さら に、該領域の少なくとも小群が、該予め選択された分子が多数箇所の静電気誘引 によって該領域に結合するとき、該小区画と接触するように配置した該領域内の 場所に疎水性成分を含む、請求の範囲第１項の固体材。
13. １３．　該有機分子がさらに該分子表面内に疎水性小区画を含み、さらに、該結 合領域が該小区画と接触する疎水性成分を含む、請求の範囲第２項の物質の構成 。
14. １４．　該予め選択された有機分子が該分子表面にイミダゾル残基を含み、さら に、その場合該領域の少なくとも小群が金属配位成分をさらに含み、該金属配位 成分が配位金属イオンの存在下で該イミダゾル残基と該配位成分との間で金属配 位結合を形成するように配置された該領域内の場所で該結合表面と結合している 、請求の範囲第１項または第１２項の固体材。
15. １５．　該配位成分がイミノジ酢酸成分からなる請求の範囲第１４項の固体材。
16. １６．　該有機分子が、該領域の表面と結合した金属配位化合物と、金属イオン を介して複合体を形成するイミダゾル残基を該分子表面に含む、請求の範囲第２ 項または第１３項の物質の構成。
17. １７．　該結合領域の小群が、該有機分子の第二の分子表面の方々に間隙を置い て配置されたイオン化可能基の少なくとも小群と鏡像状態で、かつ逆に荷電して いる荷電成分の立体的パターンを含む、請求の範囲第１項または第２項の発明。
18. １８．　該有機分子がペプチド結合アミノ酸ポリマーからなる請求の範囲第１項 または第２項の発明。
19. １９．　該分子表面および該領域が、少なくとも約５０平方オングストロームの 接触面積を有する、請求の範囲第１項または第２項の発明。
20. ２０．　該分子表面および該領域が、少なくとも約５００平方オングストローム の接触面積を有する、請求の範囲第１項または第２項の発明。
21. ２１．　該有機分子が有機反応中間体の類似体または巨大分子の表面領域のポリ ペプチド類似体を含む、請求の範囲第１項または第２項の発明。
22. ２２．　該結合表面が酸素に富むポリマーの親水性表面である、請求の範囲第１ 項または第２項の発明。
23. ２３．　その分子表面にイミダゾル残基をもつ予め選択された有機分子と選択的 に結合する多数の領域を含む結合表面を形作る固体材であって、 該各領域が、該表面に結合し、さらに該残基と鏡像の状態で該領域に配置された 金属配位成分を含み、それによって、該イミダゾル残基と該配位成分との間の少 なくとも１つの金属配位結合を含む、多数箇所の空間的に適合する誘引によって 、該領域が、配位金属イオンの存在下で、他の分子より該予め選択された分子の 表面と優先的に結合する固体材。
24. ２４．　該結合表面が該分子の残基と結合する金属配位成分より多く結合金属配 位成分を実質的に含まない、請求の範囲第２３項の固体材。
25. ２５．　該金属配位成分がイミノジ酢酸成分である、請求の範囲第２３項の固体 材。
26. ２６．　該有機分子が該分子表面に疎水性小区画を形作り、該領域が、該予め選 択されたポリマーが該固体材の該領域と結合するとき、該小区画と接触するよう に配置された該領域内の場所に疎水性成分をさらに含む、請求の範囲第２３項の 固体材。
27. ２７．　該予め選択された有機分子が該分子表面にイオン化可能基を含み、さら に該領域が、該予め選択された分子が該固体材の領域と結合するとき、該イオン 化可能基と向かい合う場所で該結合表面と結合した荷電成分を含む、請求の範囲 第２３項または第２６項の固体材。
28. ２８．　該領域が、有機反応中間体の類似体または巨大分子の表面領域のポリペ プチド類似体と結合する、請求の範囲第２３項または第２６項の固体材。
29. ２９．　該有機分子が複数のイミダゾル残基を有し、該各領域が複数の該金属配 位成分を含む、請求の範囲第２３項の固体材。
30. ３０．　その分子表面に疎水性小区画を有する予め選択された有機分子と選択的 に結合する、多数の領域を含む結合表面を形作る固体材であって、 該領域の各々が、親水性表面によって囲まれ、該結合表面に結合し、さらに、該 疎水性小区画と鏡像の位置で該領域内に配置された少なくとも１つの疎水性成分 を含み、それによって、該領域が、少なくとも１つの疎水性一疎水性反応を含む 空間的に適合した誘引によって、他の分子よりも該予め選択した化合物の分子表 面と優先的に結合する固体材。
31. ３１．　該予め選択された有機分子がその分子表面にイミダゾル残基を含み、か つ、該領域の少なくとも小群が、さらに配位金属イオンの存在下で該イミダゾル 残基と該配位成分との間に金属配位結合を形成するように配置された該領域内の 場所で該結合表面と結合した金属配位成分を含み、該予め選択された分子が該領 域と結合するとき、該イミダゾル残基と該配位成分との間に金属配位結合を形成 する、請求の範囲第３０項の固体材。
32. ３２．該予め選択された有機分子がその分子表面にイオン化可能基を含み、かつ 、該領域が、該予め選択された分子が該固体材の領域と結合するとき、そのイオ ン化可能基と向かい合う場所で該結合表面と結合した荷電成分を含む、請求の範 囲第３０項または第３１項の固体材。
33. ３３．　該有機分子が、その分子表面の方々に間隙を置いて配置された複数の疎 水性小区画を有し、該領域の少なくとも小群が、該小区画と結合するように鏡像 となる場所に複数の該疎水性成分を含む、請求の範囲第３０項の固体材。
34. ３４．　該領域が有機反応中間体の類似体または巨大分子の表面領域のポリペプ チド類似体と結合する、請求の範囲第３０項の固体材。
35. ３５．　イオン化可能成分、疎水性小区画およびイミダゾル残基から成る群から 選ばれ、その分子表面の方々に間隙を置いて配置された、少なくとも２つの表面 造作の１つまたはそれ以上を有する予め選択された巨大分子と選択的に結合する 多数の領域を含む結合表面を形作る固体材であって、該領域の各々が、親水性領 域では、荷電成分、疎水性成分、金属配位成分およびその組み合わせから成る群 から選ばれる複数の成分を含み、これら成分が、該結合表面と結合し、かつ、該 少なくとも２つの表面造作の少なくとも小群と鏡像状態で該領域内に空間的に離 れた関係で配置されており、それによって、ａ）該イオン化可能成分と該荷電成 分との間の空間的に適合する静電気誘引、ｂ）配位金属イオンの存在下における 該イミダゾル残基と該金属配位成分との間の金属配位、およびｃ）該疎水性小区 画と該疎水性成分との間の疎水性一疎水性反応のうち少なくとも２つによって、 該領域が、他の分子より該予め選択した巨大分子表面と優先的に結合する固体材 。
36. ３６．　混合物中の個々の溶質と特異的に結合するマトリックスの中を混合物を 通過させ、続いて該マトリックスに結合した溶質を脱離させることを含む混合物 中の溶質を分離する方法であって、 予め選択された有機分子が該混合物中の標的溶質である請求の範囲第１項、第２ ３項または第３６項の固体材を含むマトリックスを用意し；そして、 該マトリックスの中を該混合物を通過させて該表面と接触させ、該結合領域に該 標的溶質を優先的に結合させることからなる溶質分離方法の改良。
37. ３７．　該マトリックスが還流性マトリックスからなる請求の範囲第３６項の方 法。
38. ３８．　分析物の存在または濃度を、サンプル中の分析物を不溶性支持体の表面 に結合させることによって決定する特異的結合分析であって、 該固体支持体が、請求の範囲第１項、第２３項、第３０項または第３６項の物体 からなり、かつ、該分析物が該予め選択された分子を含む、特異的結合分析の改 良。
39. ３９．　その分子表面の方々に間隙を置いて配置された複数のイオン化可能基を 有する、予め選択された巨大分子と優先的に結合する表面を形作る固体材を製造 する方法であって、該方法が、 （Ａ）該イオン化可能基と共有結合する表層成分を有する固体材を用意し； （Ｂ）該表層成分と該予め選択された巨大分子とを、該分子表面の該イオン化可 能基の少なくとも小群と該反応性成分との間で多数の箇所で共有結合を形成させ ることによって該巨大分子のイオン化可能基を該表面に結合させるに充分な条件 で、接触させ； （Ｃ）該表面物質に残存する反応性成分を、該イオン化可能基と偶発的に反応し ない非荷電状態に変換し；（Ｄ）工程（Ｂ）で生じた共有結合の各々を切断して 、該表面から該予め選択した巨大分子を遊離させ；（Ｅ）各切断点において該イ オン化可能基の荷電と間隙を置いて、それと反対の荷電を生じ、それによって該 分子表面の該イオン化可能基の小群と逆の荷電で、鏡像状態にある空間的に分散 する荷電基を該表面に生じるという工程を含む、固体材の製造方法。
40. ４０．　その分子表面の方々に間隙を置いて配置された複数のイオン化可能基を 有する、予め選択された巨大分子と優先的に結合する表面を形作る固体材を製造 する方法であって、該方法が、 （Ａ）該イオン化可能基と共有結合する表層成分を有する固体材を用意し； （Ｂ）該表層成分と該予め選択された巨大分子とを、該分子表面の該イオン化可 能基の少なくとも小鮮と該反応性成分との間で多数の箇所で共有結合を形成させ ることによって該巨大分子のイオン化可能基を該表面に結合させるに充分な条件 で、接触させ； （Ｃ）ペプチド結合を加水分解することによってアミノ酸ポリマーを消化し、工 程（Ｂ）で生じた各共有結合にアミノ酸残基を残し； （Ｄ）該アミノ酸残基のアミノ基またはカルボン酸基を除去または誘導し、該イ オン化可能基の荷電と離れ、かつ符号が反対の荷電を残し、それによって該分子 表面の該イオン化可能基の小群と逆の荷電で、鏡像状態にある空間的に分散する 荷電基を該表面に生じるという工程からなる固体材の製造方法。
41. ４１．　該表面層がイオン化可能基の該小群と符号が反対の荷電基を含み、さら に該予め選択されたポリマーの分子表面が該表面層に静電気的に誘引された後で 、該接触工程（Ｂ）が生じる、請求の範囲第３９項または４０項の方法。
42. ４２．　工程（Ｂ）がアンチカオトロピズム塩の存在下で実施される、請求の範 囲第３９項または４０項の方法。
43. ４３．　該表面層の共有結合性成分がエポキシまたはアルデヒド基を含み、該イ オン化可能基がアミノ側鎖を含む、請求の範囲第４０項の方法。
44. ４４．　該表面層の共有結合性成分がカルボキシル残基またはアミン残基を含む 、請求の範囲第３９項の方法。
45. ４５．　該予め選択された巨大分子がその分子表面にイミダゾル残基を有する、 請求の範囲第４０項の方法であって、該方法が、該予め選択された巨大分子を、 工程（Ｃ）の前に、金属イオンおよび共有結合性の基を含む金属配位化合物と反 応させ、その後金属イオンを除去して、該表面層に共有結合した金属配位成分を 残すという付加工程を含む、請求の範囲第４０項の方法。
46. ４６．　該予め選択された巨大分子が該分子表面に疎水性小区画を有する請求の 範囲第４０項の方法であって、該方法が、工程（Ｃ）の前に、該予め選択された 巨大分子と、疎水性分子成分および共有結合性の基を含む両親媒性分子とを反応 させ、それによって疎水性成分が該表面層に共有結合するという付加工程を含む 、請求の範囲第４０項の方法。
47. ４７．　その分子表面にイミダゾル残基を有する予め選択された巨大分子と優先 的に結合する表面を形作る固体材の製造方法であって、該方法が、 （Ａ）有機の、窒素含有ポリカルボン酸金属配位化合物と共有結合する成分の表 面層を有する固体材を用意し；（Ｂ）該配位化合物を該予め選択した巨大分子、 金属イオンおよび該表面と、該予め選択した巨大分子のイミダゾル残基と該配位 化合物との間に配位金属イオン結合および該配位化合物と該共有結合性成分の１ つとの間に共有結合を形成する条件下で、反応させ； （Ｃ）工程（Ｂ）の産物から金属イオンを除去し、その分子表面が可逆的に該固 体材の表面に吸着するとき、該予め選択された巨大分子の分子表面のイミダゾル 残基と金属配位複合体を形成するために配置した該領域内に、共有結合した金属 配位化合物分子を該表面に生成させる工程を含む固体材の製造方法。
48. ４８．　該配位化合物がイミノジ酢酸である、請求の範囲第４７項または４５項 の方法。
49. ４９．　該予め選択された巨大分子がその分子表面に複数のイミダゾル残基を有 し、工程（Ｂ）および（Ｃ）の間に、複数の共有結合金属配位分子が生成する、 請求の範囲第４７項の方法。
50. ５０．疎水性小区画を形作る予め選択された巨大分子の分子表面と選択的に結合 する領域を形作る、その周辺に間隙を置いて配置された疎水性成分を有する親水 性表面を形作る固体材を製造する方法であって、該方法が、 （Ａ）共有結合性成分の親水性表面層を有する固体材を用意し；（Ｂ）該表面、 該巨大分子並びに、連結された疎水性成分および共有結合性の基を含む両親媒性 分子を、該予め選択された巨大分子表面の疎水性小区画と該両親媒性分子の疎水 性成分との間に疎水性一疎水性結合および該両親媒性分子の共有結合性の基と該 表面の該共有結合性成分との間に共有結合を形成する条件下で、反応させ； （Ｃ）工程（Ｂ）で生じた疎水性一疎水性誘引を破壊することによって表面から 巨大分子を脱離させ、該分子が該固体材の表面に可逆的に吸着するとき、該ポリ マーの該分子表面の疎水性小区画と接触するように配置された、親水性領域内の 疎水性成分を含む多数の領域を該表面に生成させる工程を含む固体材の製造方法 。
51. ５１．　該予め選択された巨大分子がその分子表面に複数の疎水性小区画を有し 、工程（Ｂ）および（Ｃ）で、干渉するように配置された複数の疎水性成分を生 成する、請求の範囲第５０項の方法。
52. ５２．　該領域が、有機反応中間体の類似体または該巨大分子表面領域のポリペ プチド類似体と結合する、請求の範囲第３９項、第４０項、第４７項、または第 ５０項の方法。
53. ５３．　空間的に適合した静電気誘引、金属配位結合形成、疎水性一疎水性反応 、またはそれらの組み合わせによって、予め選択された分子と非共有結合する、 固体材の特異的結合表面の製造方法であって、該方法が、 該予め選択された分子の表面領域を模倣するペプチドを識別し；さらに 請求の範囲第３９項、第４０項、第４７項または第５０項の方法で該ポリペプチ ドを用いる工程を含む、特異的結合表面の製造方法。
54. ５４．　該識別工程が、無作為に合成されるか、または蛋白の部分的消化によっ て製造されるペプチド混合物をスクリーニングすることによって実施される、請 求の範囲第５３項の方法。
55. ５５．　該識別工程が、該分子の生理化学的検査によって測定された構造データ を基にコンピューターモデリングによって、該分子表面の造作を分析することに よって実施される、請求の範囲第５３項の方法。