JPH07504496A - 悪性腫瘍の検出のための免疫学的方法およびその方法を実施するためのキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 悪性腫瘍の検出のための免疫学的方法およびその方法を実施するためのキット 技術分野 本発明は、悪性腫瘍を検出しそして患者の血清−免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の 特徴によって腫瘍塊を測定する方法に関する。

背景技術 悪性腫瘍を持つ患者には、血清−ＩｇＧの範囲内で（ジチオニトロベンゾエート 反応によって測定された）スルフヒドリルまたはジスルフィド基の量に重大な変 化を検出できることが数年間にわたって知られてきた。スルフヒドリル対ジスル ヒド基の比率に対する実験測定値はΣＳ値を意味する。それによってΣＳ値の変 化の理由は最近まで不明であった。

この領域のさらに進んだ研究の間に、ΣＳ値の変化は他のサブクラス（例えばＩ ｇＧ２）に対するサブクラスＩｇＧ１の比率の変位を追跡することができること が示された。

この相関関係は新しく、基本的な科学的知識に加えて、診断学にその現象を利用 する可能性を当業者に提供する。

それらと無関係に、この分野における研究は、新鮮な血液または血清試料の測定 値は短期間内に比較的強く変化することを繰り返して示した。それゆえ、未処理 血液または血清試料についてＩｇＧに対するさまざまな分析手順を実施すること は、再現可能で計画可能な結果を与えるものではない。

発明の開示 それゆえ、本発明の目的は、患者の悪性腫瘍の起りうる存在および大きさおよび 発育に関して、少なくとも１日という目的にかなった時間の間に、再現性のある 結果を提供することである。

これは、患者の新鮮な血液または血清試料はラジカル抑制剤、好ましくはベルオ キシドジムターゼ（ＳＯＤ）によって安定化されること、および変位は標準の比 率と比べた、ＩｇＧサブクラスの和に対するＩｇＧサブクラスの少なくとも１種 類の比率について試料の血清にて決定されることで達成される。

好ましくは、サブクラスＩｇＧ１および／またはサブクラスＩｇＧ２の比率の変 位は、標準の比率に比べた、ＩｇＧサブクラスの和に対する安定化された試料の 血液で決定される。

血清試料が空気にさらされて耐えているとき、血清のＩｇＧ１濃度の強い損失を 示すマンシーニ（Ｍａｎ　ｃ　ｉ　ｎ　ｉ）による放射免疫拡散法（ＲＩ　Ｄ） の使用によってＩｇＧ１値の安定性に関する実験を未処理試料について行った。

この効果は血液回収の実質的に直後に続いて起こり、それは平均して７時間後２ ０％であり、３６時間後少なくとも２５％である。なお、測定は両性の健康な供 給者の血液試料を使用して行った。

効果の程度は、とりわけ、最初の値の高さによって決まる。

高いＩｇＧ１値を持つ試料は普通はその値の強い減少を示すが、予備的結果によ って、あたかも他の因子もまた含まれるように見える。

前記のことは、血液の血清中のＩｇＧ１濃度の正確な定量は効果的な安定化なし には臨床的環境においては不可能であることは既に明瞭であるが、そのような安 定化は、ＩｇＧサブクラス間の比率の変位が本発明による方法において腫瘍のマ ーカーとして癌患者の血液中で評価されるとき絶対的に必要なことになる。

ラジカル抑制剤による安定化は非常にうまく行きそうに思われるが、明らかに最 善の結果はいままでのところＳＯＤの添加によって達成されてきた。ＳＯＤは新 鮮な完全血液試料または血球物質が分離された後の血清試料に添加してもよい。

非常に有利な安定化結果が、ＳＯＤによる血清の安定化が１００〜ｌ、０００、 好ましくは３００〜４００国際単位ＳＯＤ／ｍｌ血清の質量比で行なわれるとき に得られる。

したがって、５．０００〜ｉｏ、ｏｏｏ国際単位ＳＯＤ／ｍｌの濃度を有する溶 液にてＳＯＤを血清試料に添加することが好都合である。このやり方で安定化さ れる試料は、続いて普通の比率と比較して、ＩｇＧサブクラスの和に対するサブ クラスＩｇＧ１の比率の変位について試験される。

血液の血清中の互いに対するＩｇＧサブクラスの比率の変化は、非常に驚くべき ことに、悪性腫瘍の出現および身体中に存在する腫瘍塊の数および広がりにさえ 結び付き、その結果悪性腫瘍に関する定性的のみならず定量的な情報をも提供す ることができる。

それゆえ、本発明による方法は、患者の腫瘍発育の外部（体外の）監視に好まし く利用される。そのような方法は、主として治療的処理の間にまたは続いて世話 をする（監視する）医師に特に興味を持たれる。本発明による方法はまた予防医 学に非常に首尾良く適用でき、それによって起こりつる腫瘍の発育に対する最初 の前兆を単純なやり方で得ることができる。

その方法は患者に少しも不便ではなくて、今までのところ得られた経験によれば 、現在利用できる他の方法よりも更に信頼できる。

それらに関して、現在量もしばしば使用されている方法は腫瘍マーカー法である 。

実際の状況に本発明による方法を適用することにおいて、上記に言及した比率の 計算はＩｇＧに対するこれまで知られた分析方法、特にクロマトグラフ法または 免疫学的方法に好都合に基づいていることが明らかになる。免疫−拡散−検定の 適用は、この状況において特に成功したことを証明した。単純な免疫−吸着カラ ム法もまた適用できる。

その上、液体吸着クロマトグラフィもまた利用され、それによって個々の成分間 の異常な選択性（分離識別）が達成できる。得られたフラクトグラムは定性的お よび定量的に説明することができる。

クロマトグラフ法の代わりに、測定値、すなわち免疫グロブリンＧ中のスルフヒ ドリル−ジスルフィド比の原因である値としてΣＳ値を測定することを望んでも よい。この比率はＩｇＧサブクラス間の比率に関係があるという認識に基づいて いるので、この測定値もまた本発明による方法を実施するために有用な手段であ る。

本発明による方法の状況においてΣＳ値を測定するための条件の試験において、 観測値は悪性腫瘍が高度の精度を持って良性腫瘍から区別できることを確認した 。

乳房の癌腫について、それはまた個々の段階に対し相関関係を確立することがで きる。例えば、Ｔ４段階においてほぼ６５％の陽性反応が生じ、Ｔ４段階で９１ ％に上昇する。他の腫瘍マーカー（例えばＣＥＡ）と比較したとき、それらはＴ ８段階において約５％の検出率を有するので、これは異常な増加である。これに 関しては、次の刊行物、Ｍ、Ｓｍｏｌａ、児　Ｅｓｔｅｌｂｅｒｇｅｒ、Ｍ。

Ｒｅ１ｔｅｒ、に、５ｃｈａｕｅｎｓｔｅｔｎ、ａｎｄ　Ｅ、５ｃｈａｕｅｎｓ ｔｅｉｎ；ｉｎ　ＣＡＮＣＥＲ，Ｖｏｌ、６８．Ｎｒ。

５、　１９９１；ｐａｇｅ　１０２６．　を参照した。

ΣＳ値は外科手術後正常化した。手術が成功したがどうかによって、その値は正 常のままでいるかまたは再び異常になった。Ｍ。

Ｌａｈｏｕｓｅｎ、Ｅ、５ｃｈａｕｅｎｓｔｅｉｎ、ｅｔ　ａｌ、。

Ｗｉｅｎｅｒ　Ｋ１１ｎ、Ｗｓｃｈｒ、１０１，８５８（１９８９）［Ｖｉｅｎ ｎａ　Ｃ１１ｎ、Ｗｅｅｋｌｙ　１０１］ｏ　したがって、ΣＳ値は体液性免疫 状態、すなわち免疫防御に対する基準であると推定される。

ｉｇＧサブクラス間の比率を測定する別の可能性は、放射免疫拡散（ＲＩ　Ｄ） の方法にある。

しかしながら、すべての方法について、結果は試料が予め安定化されていたとき だけ価値を有することが普通である。

例えばＲＩＤによって検出できない、非共有結合の凝集体の生成は、ＩｇＧ１１ 度の不安定性の理由であると推定される。この凝集体の生成が酸素含有ラジカル により開始されることを示した先の結果および、事実、ＳＯＤを使用した安定化 の試みは、特に好結果であることを証明した。

これらの実験を行うために、完全な凝結（凝固）まで同一の放置をさせておくこ とにより健康な供給者の完全血液から血清を得て、次いで遠心分離を行ない、そ の血清を直ちにまたは３６時間後にＳ　−ＯＤを使用してまたは使用せずにＩｇ Ｇ１について試験した。

これらの試験を第１の研究室の実験においてＲＩＤによって行なった。等初期濃 度のＩｇＧ１に関して、ＳＯＤを組合せた試料は３６時間後はぼ同じ濃度を保持 したが、一方非安定化試料は最初の値のほぼ半分に減った。

タンパク質−Ａ−セファロースを使用する最適化実験によりＩｇＧをその両分に 分離する結果は、９６〜ｌｏｏ％の免疫グロブリン成分の純度を得ることは、流 通速度を減少することにより主として可能であることを示した。

これらの研究結果に基づいて、本発明はまた、本発明による方法を実施するため の、安定化反応物ＳＯＤを有し、そしてサブクラスＩｇＧ１対他のＩｇＧサブク ラスの比率を測定するための系を有することを特徴とするキットを提供する。

次の実施例は、如何なるやり方においても本発明を限定することなく、本発明に よる方法の説明に役立つものである。

１０ｍ１の完全血液を健康な供給者の腕の静脈から抜き取った。

５〜１０分後凝結は完了した。遠心分離を４４０ｘｇで１ｎ分間行なった。血清 をピペットて抜き取り各０．１ｍｌの４個のアリコート： ２個の０時間の試料「０−」および「０＋」並びに２個の３６時間後に試験する ための試料ｒ３６−Ｊおよびｒ３６＋ｊに分けた。

試料「０＋」およびｒ３６＋Ｊは５μｌのＳＯＤ溶液（３５国際単位）（Ｂｉｏ ｔｒａｄｅ社を通じてＳｉｇｍａ社のロット番号１０ＯＨ９３１１の５ＯＤ）と 混合した。２種類の０試料をＲＩＤ緩衝液を使用してｌ　５０に希釈した（０． ０５Ｍ１−リス、Ｏ，］、００ＭＮａＣｌ；　ＩｇＮａＮｉ　／Ｉ　；ＨＣＩ希 釈にてｐＨ８，０に調整）。

試料ｒ３６＋Ｊおよびｒ３６−Ｊは、日光を中へ入れない状態で室温にて３６時 間非希釈貯蔵した。試料ｒＯ−Ｊおよび「０＋」は直ちにＲＩＤ板上に置き、そ れによってくぼみ当り３μ】挿入した。

ＲＩＤ板に対するアガロースゲル＝５ｍｌの１％アガロース溶液、０．５ｍｌの ＲＩＤ緩衝液、０．５抗１ｇＧ１血清（Ｂｉｎｄｉｎｇ　５ｉｔｅ社、ＰＥ０Ｏ ６）。標準血清（Ｂｉｎｄｉｎｇ　５ｉｔｅ社、ＰＢＯ６２）の希釈のために同 じ板上に適用した：希釈１：１Ｏ５１：１５、ｌ：２５およびｌ：５０゜ＲＩＤ 緩衝液で１＝５０に希釈後、試料ｒ３６−Ｊおよびｒ３６−Ｎもまた板上に置い た。「０−」および「Ｏ＋」並びに希釈標準血清の沈殿物の環の表面を測定し、 そして２日後に３６時間試料のそれを測定した。次いて標準血清の希釈液につい て測定した沈殿物の環の表面の値を既知ＩｇＧ１濃度の希釈液に対してグラフ表 示した。最後に、４種類の試料から得た沈殿物の環の表面をこのようにして得た 検定図中にグラフ表示し、ＩｇＧ１濃度を内挿によってそれらから決定した。

実施例　２ 実施例１の実験と類似した７時間の実験で次の結果を得た・表２ 今まで行なわれた全ての実験は、記述された条件下のＳＯＤの阻害効果は３６〜 ４０時間に限定される、すなわちＩｇＧ測定はいかなる場合においてもその時間 間隔の間に行なわれるべきであること時間線はＩｇＧ１とＩｇＧ２の濃度が５Ｏ Ｄ（３５０国際単位を有する５μｍ）の添加なしおよび添加後にＲＩＤによって 測定される各血清試料（０，１ｍ１）について認められた。評価は、いろいろな 時間の後で得られた測定値が最初の値のパーセントで表わされるようなやり方で 達成された。結果は、それぞれ添付の図１および２に示されるように時間にわた る挙動であった。

添付図面の図１〜４に関する考察 １．４８時間の待ち時間（密閉された、好気性の、室温）後のＲＩＤによって測 定できるＩｇＧ１の減少は平均３０％であった。

２．１ｇＧ１の減少の効果は明らかに直ちに続いて起こり、僅か７時間後に約２ ０％の減少に達する。動力学的挙動は指数因子をさし示し、実験はそれぞれの反 応量のＩｇＧ１の比較的一時的の減少はこのサブクラスに直接比例することを示 した。したがって、ミハ工り／メンテン関数に従う動力学的挙動は除外すること ができ、二次反応、多分それからより高い凝集体がそのあと生成する二量体の最 初の生成をここで生じることを推論することができる。また、熱凝集体がＲＩＤ で検出できる沈殿物の環を生成しないことを示すように、そのような凝集体の生 成はＲＩＤで検出できないことを説明する。

３，１２〜２４時間の間に、さらなる反応が系の中間の自己安定化に到達するか 、それが測定点のバラツキであるかどうか安全に決定することができない。ただ 反応過程行程が後で連続的に継続することだけが明白である。

４、ＳＯＤによる凝集反応の阻害は、それが多分Ｏラジカルにより引き起こされ た自己凝集であることを示唆する。Ｗｉｃｈｅｎｓｅｔ　ａｌ、（Ｂｉｏｃｈｉ ｒｎ、Ｂｉｏｐｈｉｓ、Ａｃｔａ、Ｖｏｌ、７４２：６０７−６１６．１９８３ ）によれば、少線量の紫外線による照射は自己凝集を引き起こし、ところで、活 性白血球により引き起こされるそのような凝集体は、沈殿物の線に実質的な減少 を示す。

図１から、ＩｇＧ１の濃度は平均して２４時間以内に約１５％、３６時間以内に 約２２％減少することが続いて来る。この時間範囲内で、減少はＳＯＤの添加に よって実質的に完全に抑制できた。この結果の重要性は、図１に平均減少パーセ ントがグラフで示されていることおよび別個の試料について測定した個々の減少 がある特定の場合に、次の表３に示されるように実質的に大きくなりうることを 考えるならば明白になる。

実施例　４ この実施例において、健康な供給者の１６種類の血清試料を試験した。最初にＩ ｇＧ１と１ｇＧ２の濃度をＲＩＤによって測定した。

このようにして得た値を次の表４に示す。

その上、本発明者等は表５に示される６個の別の値を再参照することができた。

このようにして得た平均値を平均するとき、２２の健康な供給者の血清に対する 結果は、８．３３±０．４８ｍｇＩｇＧ１および３゜０４±０．２５ｍｇ１ｇＧ ２／ｍｌ血清であった。

癌血清のＩｇＧ１濃度は平均して正常な血清よりも２３〜２４％低く、その結果 有効な阻害の無条件の必要性が明白である。ＳＯＤはこの必要条件を満たすが、 しかしながら約４０時間という血清の保存時間までだけである。しかしながら、 これは大部分の場合に十分である。

図１に示されるように、明確に限定された時間効果がＩｇＧ１に対してだけ起こ り、一方策２の主成分、１ｇＧ２は不規則な変動を示した。しかしながら、これ もまたＳＯＤにより阻害された（図２）。ＳＯＤはＲＩＤにおいて示されたＩｇ Ｇ１の減少を阻害し、そしてこのサブクラスだけ分子内に反応性のジスルフィド 架橋Ｓ８１を含有するから、ＳＯＤはまた、８５％までのＳＳ８に対する項から なるΣＳ値の測定のための安定剤として利用できる。

実施例　５ タンパク質−Ａ−セファロースカラムでのＩｇＧサブクラスｌおよび２の分離 緩衝液の組成： ０．０５Ｍリン酸塩・クエン酸塩緩衝液ｐＨ４，７，０，０８６Ｍリン酸塩・ク エン酸塩緩衝液ｐＨ４，３、流速は７０７０−１Ｏ／ｈに変化した。

関係があるピークＢおよびＣにおいて、成分に対してそれぞれ９５％までおよび １００％純度が達成される、添付のフラクトグラム（図３および４）を得た。

実施例　６ 一方においてタンパク質−八−セファロースを有するアフィニティクロマトグラ フィーによる、他方において参照のためにＲＩＤを使用するＩｇＧ１およびＩｇ Ｇ２各濃度の測定２種類の方法を比較する目的のために、２０人の健康な供給者 の血清および卵巣の、子宮頚管部の、および結腸癌腫を持つ４０人の女性患者の 血清を使用したが、血液試料は手術に先立って採血した。

血液試料（２〜１０ｍ１）は採血直後に４４０ｘｇで１０分間遠心分離し、血清 をピペットで抜き取り、ＲＩＤ緩衝液で１：５０に希釈し、ＲＩＤ板に適用した 。沈殿物の環を２日後に測定し、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２濃度を標準血清（マン シー二技法）を使用して測定した。

０．３ｍｌの血清をタンパク質−Ａ−セファロースによってＩｇＧ１および１ｇ Ｇ２の単離のためにカラム（Ｋ９／１５）に適用し、０．１６Ｍリン酸塩・クエ ン酸緩衝液ｐＨ７，０および１０ｍ１／ｈの流速を使用して溶離させた。それに よりＩｇＧはＦｃ部分によってタンパク質−Ａに結合し、他の血清タンパク質は 非結合状態で溶離された。ＩｇＧのほかに、ＩｇＭおよびＩｇＡもまたタンパク 質−Ａに結合した。基線に到達後、緩衝液交換を達成した：最初に、１ｇＧ２を ０．０５Ｍリン酸塩・クエン酸塩緩衝液ｐＨ４，７で、次いでＩｇＧ１を０．０ ８６Ｍリン酸塩・クエン酸塩緩衝液ｐＨ４，３で溶離した。それからゲルを０． １Ｍクエン酸塩緩衝液で清浄化し、次いでクエン酸塩緩衝液を出発緩衝液（０， １６Ｍリン酸塩・クエン酸塩緩衝液ｐＨ７，０）と交換した。ＩｇＧ１およびＩ ｇＧ２の溶離液をｌＮＮａＯＨでｐＨ７，０まで滴定し、タンパク質濃度を２７ ８ｎｍで光度測定法で定量した。吸光係数ε′はｌ、５８であり、さらにはまた 濃度の定量ができる。

表６に、ＲＩＤおよびタンパク質−Ａを使用して測定した、血清試料（±ｓｅｍ ）のＩｇＧ１およびＩｇＧ２濃度の平均値を示す。

比率Ｇ１．／Ｇ２を次いでこれら２つの値から決定できる。

表６ｂ ＲＩＤを使用して測定した、健康な供給者と腫瘍患者との間のＩｇＧ１濃度の平 均値は、非常にいちじるしく　（Ｐ＝０．００５）相違し、それにより２７．５ ％の間違った負のおよび２５％の間違った正の結果を得た。タンパク質−Ａを使 用したＩｇＧ１の単離も同様の結果：Ｐ＝０．００５および３０％の間違った負 のおよび３５％の間違った正の結果を示した。

０　１２　２４　３６　４Ｅｌ　５Ｃ 図１ 時間（時間ｌ ＋ＳＯＯなしの１ＱＧ２　ΔＳＯＯ共存のＩＱＧ２図２ 図３ 図４ 国際調査報告 、　ｐ訂ｌ＾Ｔ　９３１０叩３２ フロントページの続き （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ 、ＴＤ。

ＴＧ）、ＡＴ、ＡＵ、ＢＢ、ＢＧ、ＢＲ，ＣＡ、ＣＨ。

ＣＺ、ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、Ｆｌ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　Ｌ Ｕ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎ。

、ＮＺ、ＰＬ、ＰＴ、ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ、ＳＥ、ＳＫ。

ＵＡ、　ＵＳ （７２）発明者　シャウエンスタイン、コンラードオーストリア国　グラフ、カ ーネリーガーセ２０ （７２）発明者　ダハ、フランツ オーストリア国　ガルネウキルヒエン、スパテンドルフ　１０

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. １．患者の新鮮な血液または血清試料がラジカル抑制剤、好ましくはペルオキシ ドジムターゼ（ＳＯＤ）によって安定化されること、および試料の血清における 変位が標準の比率と比較した、ＩｇＧサブクラスの和に対するＩｇＧサブクラス の少なくとも１種類の比率から決定されることを特徴とする、患者の血清免疫グ ロブリンＧ（ＩｇＧ）の特徴によって悪性腫瘍を検出またはそれらの腫瘍塊を測 定する方法。
2. ２．標準の比率と比較した、ＩｇＧサブクラスの和に対するサブクラスＩｇＧ１ および／またはサブクラスＩｇＧ２の比率の変位が、安定化された試料の血清に おいて決定される請求の範囲第１項に記載の方法。
3. ３．比率の前記変位がΣＳ値を測定することにより決定される請求の範囲第１項 または第２項に記載の方法。
4. ４．比率の前記変位が本質的に知られているＩｇＧに対する分析方法、特にクロ マトグラフ法または免疫学的方法の結果から計算される請求の範囲第１項または 第２項に記載の方法。
5. ５．比率の前記変位が免疫拡散検定によって決定される、請求の範囲第４項に記 載の方法。
6. ６．血清の安定化が１００〜１０００、好ましくは３００〜４００国際単位／ｍ ｌ血清の質量比のＳＯＤによって達成される請求の範囲第１項〜第５項のいずれ か１項記載の方法。
7. ７．患者の腫瘍発育の体外測定のための請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１ 項記載の方法の使用。
8. ８．安定化試薬、好ましくはＳＯＤ、およびＩｇＧサブクラスの和に対する少な くとも１種類のＩｇＧサブクラスの比率を決定するための組体を有することを特 徴とする請求の範囲第１項〜第７項のいずれか１項記載の方法を実施するための キット。